CN101795671A - 用于体内施用硼酸化合物的脂质体组合物 - Google Patents

用于体内施用硼酸化合物的脂质体组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN101795671A
CN101795671A CN200880105576A CN200880105576A CN101795671A CN 101795671 A CN101795671 A CN 101795671A CN 200880105576 A CN200880105576 A CN 200880105576A CN 200880105576 A CN200880105576 A CN 200880105576A CN 101795671 A CN101795671 A CN 101795671A
Authority
CN
China
Prior art keywords
liposome
phospholipid
boronic acid
acid compounds
bortezomib
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN200880105576A
Other languages
English (en)
Inventor
Y·张
A·黄
B·罗
J·王
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Alza Corp
Original Assignee
Alza Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alza Corp filed Critical Alza Corp
Publication of CN101795671A publication Critical patent/CN101795671A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A61K9/1278—Post-loading, e.g. by ion or pH gradient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/69—Boron compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/009—Neutron capture therapy, e.g. using uranium or non-boron material
    • A61K41/0095—Boron neutron capture therapy, i.e. BNCT, e.g. using boronated porphyrins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明描述了用于施用硼酸化合物的脂质体制剂。所述脂质体由具有两个酰基链的磷脂和包封于所述脂质体中的硼酸化合物构成，其中每条链具有20-22个碳原子。在优选的实施例中，所述硼酸化合物为与葡甲胺形成络合物的形式。

Description

用于体内施用硼酸化合物的脂质体组合物
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2007年8月21日提交的美国临时专利申请序列No.60/957,045的优先权，藉此将该专利以引用的方式并入本文。
技术领域
本文所描述的主题涉及具有被包封的硼酸化合物的脂质体制剂。更具体而言，本主题涉及用可改善肽硼酸化合物在脂质体内的装载和滞留的组分制备的脂质体。
背景技术
脂质体(或脂质双层小泡)是由可包封水相的同心有序脂质双层构成的圆形小泡。脂质体可作为包含于水相或脂质双层中的治疗和诊断剂的递送载体。以脂质体包封形式递送药物可提供许多优势，视药物而定，包括例如降低药物毒性、改变药代动力学或提高药物溶解度。脂质体在被配制成包括亲水聚合物链的表面包衣，即所谓的
Figure GPA00001043159500011
或长循环脂质体时，可提供另一优势即长的血液循环寿命，这部分归因于单核吞噬细胞系统对脂质体的清除减少。通常，延长的寿命是必要的，以使脂质体从注射部位到达它们的理想靶区域或细胞。
理想的是，可制备这类脂质体以包括被包封的治疗或诊断化合物，其(i)具有高的载药效率，(ii)被包封化合物的浓度高，和(iii)处于稳定的形式，即在储存期间几乎没有化合物渗漏。
发明内容
下文描述和图解的以下方面及其实施例仅为示例性和说明性的，而不限制范围。
在一方面，本发明提供包含由具有两条酰基链(各链具有20-22个碳原子)的磷脂构成的脂质体和包封在该脂质体中的硼酸化合物的脂质体制剂。该硼酸化合物是以与葡甲胺形成络合物的形式。
在一个实施例中，磷脂为不对称磷脂。在另一个实施例中，磷脂为对称磷脂。
在一个实施例中，磷脂具有20个碳原子。
在又一个实施例中，磷脂为饱和磷脂。
在另一个实施例中，磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸和磷脂酰肌醇。
在一个优选的实施例中，磷脂为1，2-花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)或1，2-二山嵛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)。
在另一个实施例中，脂质体还包括与亲水聚合物共价连接的磷脂。一种示例性的亲水聚合物为聚乙二醇。
在又一个实施例中，与亲水聚合物共价连接的磷脂为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇。
在一个实施例中，硼酸化合物为肽硼酸化合物。在又一个实施例中，硼酸化合物为硼替佐米。
在另一个实施例中，制剂包含进一步包含被包封的乙酸的脂质体。
在另一方面，本发明提供制备含有被包封的硼酸化合物的脂质体的方法。该方法包括提供由具有两个酰基链(各链具有20-22个碳原子)的磷脂构成的脂质体，该脂质体具有包封于其中的葡甲胺；并在硼酸化合物存在的情况下在低于该磷脂相变温度的温度孵育该脂质体。孵育可有效实现摄取硼酸化合物进入脂质体中。
在一个实施例中，脂质体由选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸和磷脂酰肌醇的磷脂组成。
在另一个实施例中，孵育可有效实现摄取多于90％的硼酸化合物进入脂质体中。
在又一个方面，本发明提供了制备脂质体组合物的改进方法，该脂质体组合物由具有两条酰基链(各链具有20-22个碳原子)的磷脂和包封在脂质体中的硼酸化合物构成。所述改进包括通过在低于相变温度的温度下孵育脂质体和硼酸化合物而将硼酸化合物装载至脂质体内。
在一个实施例中，所述改进还包括在所述孵育之前形成脂质体，该脂质体包含包封于其中的葡甲胺。
在所述改进的另一个实施例中，磷脂为1，2-花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)，并且载药是在约25-50℃
的温度下进行。在又一个实施例中，磷脂为1，2-二山嵛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)，并且所述载药是在约25-50℃的温度进行。
除了上述的示例性方面和实施例，通过参照附图和下文描述的试验，本发明其他方面和实施例将变得显而易见。
附图说明
图1A-1H示出了示例性的硼酸化合物的结构。
图2示出了在内部较高/外部较低的pH梯度下装载硼酸化合物至脂质体中以在脂质体内与多元醇形成硼酸酯化合物；
图3A-3C示出了多元醇山梨醇(图3A)、α-葡庚糖酸(也称作glucoheptonate或gluceptate；图3B)和葡甲胺(图3C)的结构；
图4A示出了包含被包封的葡甲胺的脂质体(HSPC/CHOL/mPEG-DSPE 50∶45∶5mol/mol)在硼替佐米的存在下在65℃孵育30分钟(菱形)、60分钟(方形)或120分钟(三角形)的柱级分在270nm的吸光度，级分10的峰对应于未包封的药物；
图4B  示出了包含被包封的葡甲胺的脂质体(HSPC/CHOL/mPEG-DSPE 50∶45∶5mol/mol)在硼替佐米第存在下在20-25℃孵育的柱级分在270nm的吸光度，级分4的峰对应于脂质体包封的药物。
图5示出了包含被包封的葡甲胺和乙酸的脂质体在硼替佐米的存在下在20-25℃孵育的凝胶过滤柱级分在270nm的吸光度，级分14-18之间的峰对应于脂质体包封的药物，级分35-50对应于未包封的药物级分；
图6示出了施用包封于由HSPC/胆固醇/mPEG-DSPE(50∶45∶5mol/mol)构成的脂质体(葡甲胺/乙酸作为络合剂)中的硼替佐米后，小鼠血浆中的硼替佐米浓度(ng/mL)对时间(小时)的函数，其中硼替佐米是以0.53mg/mL(三角形)、1.04mg/mL(方形)和2.13mg/mL(三角形)的剂量施用；
图7示出了对于由脂质卵鞘磷脂/胆固醇(圆形)、卵鞘磷脂/胆固醇/mPEG-DSPE(三角形)或卵鞘磷脂(菱形)构成的脂质体，硼替佐米在体外全血中的浓度(μg/mL)对时间(小时)的函数。
图8A-8B示出了对于由HSPC/mPEG-DSPE(95/5，三角形)或1，2-花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C20:0PC)/mPEG-DSPE(95/5，菱形)构成的脂质体，硼替佐米于17℃(图8A)或37℃(图8B)在体外全血中的浓度(μg/mL)对时间的(小时)函数。
图9示出了给小鼠静脉内施用由C20:0PC/mPEG-DSPE(95/5，方形)、1，2-二山嵛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C22:0PC/mPEG-DSPE(95/5，三角形)、1，2-二二十四酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C24:0PC/mPEG-DSPE(95/5，三角形和方形))构成的脂质体后或施用游离药物后(菱形)，硼替佐米在血浆中的浓度(μg/mL)对时间的(小时)函数。
图10A示出了当在5℃(菱形)或在25C(方形)下储存时，硼替佐米在由C22:0PC/mPEG-DSPE(95/5)构成的脂质体中的包封百分比对时间(周)的函数；
图10B示出了当储存于4℃(菱形和三角形)或在25℃下储存时，硼替佐米在由C22:0PC/mPEG-DSPE(95/5，菱形、方形)或C24:0PC/mPEG-DSPE(95/5，三角形、圆形)构成的脂质体中的包封百分比对时间(周)的函数；
图11A-11C示出了给小鼠静脉内施用后，硼替佐米的浓度(μg/mL)对时间的(小时)函数，游离形式(菱形)或包封于脂质体(C22:0PC/mPEG95∶5)(方形)中的药物在血浆(图11A)、全血(图11B)和肿瘤(图11C)中的浓度。
图12示出了给小鼠静脉内施用脂质体包封的形式(C22:0PC/mPEG95∶5)(实心圆形)或游离形式(空心圆形)的硼替佐米后其血药浓度(μg/mL)对时间的(小时)函数；
图13示出了给正常大鼠施用制剂4和5(实例6)后，全血中保留的硼替佐米百分比对时间(小时)的函数。
图14示出了在用游离药物(三角形)、脂质体载体安慰剂(方形)、硼替佐米脂质体制剂4和5(分别为倒三角形、圆形，实例6)和另一种脂质体制剂(菱形)治疗(在由沿时间轴的箭头指示的时间点每周给药一次，持续四周)的小鼠中，荷载异种移植物CWR22肿瘤的小鼠的肿瘤大小对时间(天)的函数。
具体实施方式
I.定义
“多元醇”意指每个分子具有多于一个羟基(-OH)基团的化合物。该术语包括含有醇羟基基团的单体或多聚体化合物，例如糖类、甘油、聚醚类、二元醇类、聚酯类、多元醇类、碳水化合物类、儿茶酚类、乙烯醇和乙烯胺的共聚物类等。
“肽硼酸化合物”意指下式化合物：
Figure GPA00001043159500051
其中R1、R2和R3为相同或不同的独立选择部分，n是1-8，优选1-4。
“亲水聚合物”意指在室温下在水中具有一定量溶解度的聚合物。示例性的亲水聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟丙基酯、聚丙烯酸羟乙基酯、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙二醇、聚天冬酰胺和亲水性肽序列。这些聚合物可作为均聚物或作为嵌段共聚物或无规共聚物使用。优选的亲水聚合物链为聚乙二醇(PEG)，优选分子量为500-10,000道尔顿的PEG链，更优选为750-10,000道尔顿，还更优选为750-5,000道尔顿。
“内部较高/外部较低的pH梯度”指脂质体内部(较高pH)和脂质体悬浮于其中的外部介质(较低pH)之间的跨膜pH梯度。通常，脂质体内部pH至少比外部介质pH大1个pH单位，并优选大2-4个单位。
“脂质体包封的”意指隐蔽在脂质体中心的水性隔室中、脂质体脂质双层之间的水性空间，或双层本身内的化合物。
II.脂质体制剂
在一个方面，本发明提供具有被包封的肽硼酸化合物的脂质体组合物。该脂质体包括可增强脂质体中化合物的装载和滞留的组分。这部分描述了脂质体组合物和制备方法。
A.脂质体组分
脂质体制剂由包含被包封的肽硼酸化合物的脂质体构成。肽硼酸化合物是在肽序列的酸性末端或C末端包含α-氨基硼酸的肽。一般而言，肽硼酸化合物的形式如下：
Figure GPA00001043159500061
其中R1、R2和R3为相同或不同的独立选择部分，n是1-8，优选1-4。还可以考虑具有以硼酸作为侧链的天冬氨酸残基或谷氨酸残基的化合物。
优选的是，R1、R2和R3独立地选自氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷基、芳烷氧基、环烷基或杂环；或R1、R2和R3中任意一者可与肽骨架中的相邻氮原子形成杂环。烷基包括烷氧基、芳烷基和芳烷氧基中的烷基组分，优选为1至10个碳原子，更优选1至6个碳原子，并且可为直链或支链。芳基包括芳氧基、芳烷基和芳烷氧基中的芳基组分，优选为单核或双核(即两个稠环)，更优选为单核，例如苄基、苯甲氧基或苯基。芳基还包括杂芳基，即在环中具有一个或多个氮、氧或硫原子的芳香环，例如呋喃基、吡咯、吡啶、吡嗪或吲哚。环烷基优选为3-6个碳原子。杂环指在环中具有一个或多个氮、氧或硫原子的非芳香环，优选具有3-6个碳原子的5元至7元环。这类杂环包括(例如)吡咯烷、哌啶、哌嗪和吗啉。环烷基或杂环可与烷基组合；例如环己基甲基。
上述任何基团(不包括氢)可被一个或多个选自以下的取代基取代：卤素，优选氟或氯；羟基；低级烷基；低级烷氧基，例如甲氧基或乙氧基；酮；醛；羧酸、酯、酰胺、碳酸酯或氨基甲酸酯；磺酸或酯；氰基；伯、仲或叔胺；硝基；脒基；和硫基或烷硫基。优选的是，该基团包括最多两个这类取代基。
示例性的肽硼酸化合物显示于图1A-1H中。R1、R2和R3的具体例子在图1A-H中示出，包括正丁基、异丁基和新戊基(烷基)；苯基或吡唑基(芳基)；4-((叔-丁氧基羰基)氨基)丁基、3-(硝基脒基)丙基和(1-环戊基-9-氰基)壬基(经取代的烷基)；萘基甲基和苄基(芳烷基)；苯甲氧基(芳烷氧基)；和吡咯烷(R2与相邻的氮原子形成杂环)。
一般而言，肽硼酸化合物可为单肽、二肽、三肽或更高级的肽化合物。其他示例性的肽硼酸化合物在美国专利No.6,083,903、No.6,297,217和No.6,617,317中有所描述，将所述专利以引用的方式并入本文。
根据图2示出的操作，将肽硼酸化合物装载至脂质体中，以形成脂质体制剂，其中所述肽硼酸化合物以肽硼酸酯的形式包封于脂质体中。图2示出了具有脂质双层膜(由单实线12表示)的脂质体10。应当理解，在多室脂质体中脂质双层膜由具有居间的水性空间的多个脂质双层构成。脂质体10悬浮于外部介质14中，其中外部介质的pH约7.0，通常在5.5-8.0之间，更通常在6.0-7.0之间。脂质体10具有由脂质双层膜限定的内部水性隔室16。包封在内部水性隔室中的是多元醇18。该多元醇优选为具有顺式1，2-或1，3-二醇官能的部分，并且在优选的实施例中该多元醇为葡甲胺。内部的水性隔室的pH优选大于约8.0，更优选大于9，还更优选大于10。
也包封在脂质体中的有肽硼酸化合物，在图2中由硼替佐米代表。在通过脂质双层膜之前，硼替佐米也显示在外部的水性介质中。在外部水性介质中，该化合物通常不带电荷，因为pH显著低于硼酸基团的pKa＝9.7(由6.0版本的ACD/labs计算得到)。在其不带电状态下，该化合物可自由渗透穿过脂质双层，因为该化合物是亲脂性的(log P＝2.45±1.06，由6.0版本的ACD/labs计算得到)。硼酸酯的形成将使该平衡改变而引起更多化合物从外部介质渗透通过脂质双层，导致该化合物在脂质体中的积聚。在另一个实施例中，外部混悬介质中较低pH和脂质体内部较高pH，结合脂质体内部的多元醇，诱导药物积聚在脂质体的水性内部隔室中。一旦进入脂质体，该化合物与多元醇反应而形成硼酸酯。硼酸酯基本不能跨过脂质体双层，从而硼酸酯形式的药物化合物积聚在脂质体内部。硼酸酯络合物的稳定性随着pH增加而增加。
脂质体内部多元醇的浓度优选为使得带电的基团(例如羟基基团)的浓度显著高于硼酸化合物的浓度。例如，在药物终浓度为25mM(内部药物浓度为0.2mg/mL总药物浓度)的组合物中，聚合物带电基团的内部化合浓度至少为这么大，优选是药物浓度的数倍。
多元醇以高-内部/低-外部的浓度存在；换言之，存在跨越脂质体脂质双层膜的多元醇浓度梯度。如果在外部体相中存在大量的多元醇捕集剂，则该多元醇与外部基质中的肽硼酸化合物反应，减慢化合物在脂质体内部的积聚。因此，优选的是，如下文所述制备脂质体，以使得该组合物在体相(水相之外)中基本不含多元醇捕集剂。
在本文所述的支持性试验中，将示例性化合物硼替佐米装载至具有捕集剂(也称作络合剂)山梨醇、葡庚糖酸或葡甲胺的脂质体中。这些化合物的结构分别显示于图3A-3C中。如实例1-3所示，在水合缓冲液中使用这些络合剂之一来制备脂质体。在通过透析移除任何未包封的络合剂后，通过在不同温度下将脂质体与药物溶液孵育不同时间而将硼替佐米装载至脂质体中。当山梨醇或葡庚糖酸存在于脂质体中作为络合剂并在60-65℃下进行载药时，未将可检测到的药物装载至脂质体。当葡甲胺用作络合剂并在65℃下进行载药时，观察到相似的结果。这一点可由图4A示出的数据说明，该图显示了包含被包封的葡甲胺的脂质体在硼替佐米存在的情况下于65℃孵育30分钟(圆形)、60分钟(方形)或120分钟(三角形)时G10脱盐柱级分在270nm的吸光度。级分10的峰对应未包封的药物。然而，如图4B所示，当在约20-25℃的室温下孵育时，硼替佐米被装载并滞留在脂质体中，如级分4的峰所证明的。
在实例4中所描述的另一个试验中，在脂质体内存在葡甲胺和乙酸所建立的离子梯度下硼替佐米被装载至脂质体中。将乙酸加入内部水合介质导致硼替佐米的包封效率很高，如图5所示。在图5中，级分14-18之间的峰对应脂质体包封的药物，并且显示约95％的总药物通过远距离装载而被包封于脂质体中。
制备含有在葡甲胺/乙酸梯度下装载的被包封的硼替佐米的脂质体以使药物浓度达到0.5mg/mL、1.0mg/mL和2.1mg/mL，如实例5所述。用这三种制剂以1.6mg/kg的剂量注射小鼠并测定硼替佐米血药浓度对时间的函数。图6显示了以0.53mg/mL(三角形)、1.04mg/mL(方形)和2.13mg/mL(三角形)的药物浓度施用包封于脂质体中的硼替佐米后，小鼠血浆中的硼替佐米浓度(ng/mL)对时间(小时)的函数。在体内施用时，药物快速从脂质体渗出，并且在三小时的时间点血浆药物浓度与体内施用游离硼替佐米所预计的浓度大约相同。
进行进一步的试验以得到硼酸化合物体内滞留改善的脂质体组合物。如实例6所述，用不同脂质组合物制备脂质体并在使用大鼠全血的体外释放测定法中检测。制备具有由卵鞘磷脂/胆固醇(95/5)、卵鞘磷脂/胆固醇/mPEG-DSPE(50/45/5)或卵鞘磷脂构成的脂质双层的脂质体并装载硼替佐米(实例6A)。用采用大鼠全血的体外释放测定法分析药物从脂质体的释放。如图7所示，药物快速从由卵鞘磷脂/胆固醇(圆形)、卵鞘磷脂/胆固醇/mPEG-DSPE(三角形)或卵鞘磷脂(菱形)构成的脂质体释放。
制备具有由磷脂磷酸胆碱构成的脂质双层的脂质体，该磷酸胆碱具有酰基链长度为18、20、22或24个碳原子(实例6B)。图8A-8B示出了在17℃(图8A)或37℃(图8B)时硼替佐米从由氢化大豆磷酸胆碱(C18:0；HSPC)/胆固醇/mPEG-DSPE(50∶45∶5，三角形)或1，2-花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(20:0PC)/mPEG-DSPE(95/5，菱形)构成的脂质体中的释放。图8A-8B的数据显示，相对于用C18:0PC脂质制备的脂质体，当在全血中孵育较长时间时用C20:0PC脂质制备的脂质体可明显更好地滞留药物。
通过静脉内注射将根据实例6B制备的脂质体施用给小鼠。注射后四小时采集血样并分析硼替佐米的浓度。图9显示了施用由20:0PC/mPEG-DSPE(95/5，制剂4，方形)、C22:0PC/mPEG-DSPE(95/5，制剂6，三角形)、C24:0PC/mPEG-DSPE(95/5，制剂7和8，分别为空心和实心圆形)构成的脂质体后药物的浓度(μg/mL)。对照组动物接受静脉注射游离形式的硼替佐米(菱形)。相对于游离药物的血液循环寿命，当药物包封于具有由磷酸胆碱磷脂构成的双层的脂质体中时，硼替佐米的血液循环寿命显著增加。特别是，包括C22:0PC作为主要双层组分的脂质体提供长的血液循环时间，略优于具有C24:0PC脂质的脂质体所提供的时间。
图10A-10B示出了包封于由C22:0PC/mPEG-DSPE(95/5)或C24:0PC/mPEG-DSPE(95/5)构成的脂质体中的硼替佐米的滞留。更具体地讲，图10A示出了当在5℃(菱形)或在25℃(方形)下储存时，硼替佐米在由C22:0PC/mPEG-DSPE(95/5)构成的脂质体中的包封百分比对时间(周)的函数。在5℃时，制剂可保持稳定至少三个月，基本没有可检测量的药物损失。当在25℃下保存时，约2周储存后药物开始从脂质体渗漏。
图10B示出了当在4℃(菱形和三角形)或在25℃下储存时，硼替佐米在由C22:0PC/mPEG-DSPE(95/5，菱形、方形)或C24:0PC/mPEG-DSPE(95/5，三角形、圆形)构成的脂质体中的包封百分比对时间(周)的函数。在这个温度下由C22:0链长度的磷酸胆碱构成的脂质体均比由C24:0链长度的磷酸胆碱构成的脂质体均提供更好的药物滞留。
因此，在一个实施例中，还可以考虑由具有20、21或22个碳原子的磷脂组成的脂质体。该脂质可为其中两个酰基链具有不同的碳链长度的不对称脂质，或为其中两个酰基链具有相同数目的碳原子的对称脂质。在其中脂质为非对称的实施例中，当两个酰基链之一具有20、21或22个碳原子时该磷脂具有20、21或22个碳原子。在优选的实施例中，相对的链的碳原子数目的差异小于4，更优选小于2个碳原子。
磷脂为本领域已知的小泡形成脂质，因为它们在水中可自发形成双层小泡，其中疏水部分(酰基链)与内部(双层膜的疏水区)接触，而头部基团部分朝外部(双层的极性表面)取向。有许多合成的小泡形成脂质和天然的小泡形成脂质，包括磷脂类，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇，其中两条烃链的长度通常为约14-22个碳原子，并且具有不同程度的不饱和度。
在某一相变温度或Tm下形成小泡的液体经历从液晶相向流动性更强的相的转变，这取决于脂质的结构。在一个实施例中，脂质体用具有某一Tm的脂质形成，并通过在低于脂质(通常为脂质双层的主要脂质组分)Tm的温度在离子梯度下，在药物存在的情况下孵育该脂质体而将药物装载至脂质体中。下面大致示出了该制备方法，并通过如实例3-6所述制备的脂质体制剂来举例说明，其中在室温下实现了远距离装载硼替佐米至脂质体中。
在一个实施例中，硼酸化合物的远距离装载是用预形成的包含葡甲胺的脂质体进行。葡甲胺是仲胺化合物，并且以其二醇官能团与硼酸化合物形成硼酸酯。在扩散穿越脂质体脂质双层膜后，葡甲胺中的多个邻位顺式二醇与硼酸化合物反应，形成硼酸酯，从而将硼酸化合物包封在脂质体中。
在一个实施例中，该过程由pH驱动，其中脂质体外部pH较低(例如pH 6-7)而脂质体内部pH稍高(pH 8.5-10.5)，加上多元醇的存在，诱导了该化合物的积聚和装载。在该实施例中，通过配制具有内部较高/外部较低的多元醇梯度的脂质体制备组合物。如上文所述选择的多元醇的水溶液以所需的浓度制备(如上文所述确定)。优选的是，该多元醇溶液具有适于脂质水合的粘度。当采用缓冲剂来生成内部的高pH时，多元醇水溶液的pH优选大于约8.0。含有乙酸(或其他可渗透膜的弱酸)的水合溶液的pH通常为中性的，并在这种情况下高内部pH在透析或渗滤过程中产生。
多元醇水溶液用于使干燥的脂质膜水合，该脂质膜是用小泡形成脂质、非小泡形成脂质(例如胆固醇、DOPE等)、脂质聚合物例如mPEG-DSPE和任何其他需要的脂质双层组分制备。干燥的脂质膜可这样制备：将所选的脂质溶解于适当的溶剂中，通常为挥发性有机溶液，并使溶剂挥发以留下干燥膜。用包含多元醇的溶液使脂质膜水合，调节至所需的pH以形成脂质体。
脂质体形成后，可对脂质体进行整粒以得到具有基本均一大小范围的脂质体群体，通常在约0.01至0.5微米之间，更优选在0.03-0.40微米之间，并且甚至更优选在0.08-0.2微米之间。一种用于REV和MLV的有效整粒方法涉及将脂质体的含水混悬液挤压透过具有所选择的均一孔径(在0.8至0.05微米的范围内，通常为0.8、0.4、0.2、0.1、0.08和/或0.05微米)的一系列聚碳酸酯膜。该膜的孔径大致对应于由挤压透过该膜，尤其是两次或更多次挤压透过相同膜进行制备时而产生的脂质体的平均大小。均化方法也可用于减小脂质体至大小为100nm或更小(Martin，F.J.，Specialized Drug Delivery Systems-Manufacturing andProduction Technology，P.Tyle(编辑)，Marcel Dekker，New York，第267-316页(1990))。
整粒后，通过适当的技术(例如透析、渗滤、离心、尺寸排阻色谱法或离子交换)移除未包封的体相，以得到具有内部高浓度多元醇且优选外部几乎没有多元醇的脂质体混悬液。同样在脂质体形成后，通过滴定、透析等调节脂质体的外部相至低于pH 7.0。
接着将硼酸化合物加入脂质体混悬液中以主动装载至脂质体中。加入的硼酸化合物的量可根据待包封药物的总量，假设100％的包封率，即加入的化合物最终全部以硼酸酯的形式装载进脂质体中来确定。
将化合物和脂质体分散体的混合物优选在低于形成该脂质双层的脂质混合物中的主要脂质成分的相变温度下孵育。摄取化合物直至脂质体中化合物浓度是主体介质中化合物浓度的数倍是所需的，并通常可通过脂质体中形成沉淀来证明。后者可通过(例如)标准的电子显微镜或X-射线衍射技术来确认。例如，对于具有Tm为55℃的高相变脂质，可在20-45℃下进行孵育。孵育时间可在数分钟至几十分钟至数小时或多至12小时或更长时间内变化，这取决于孵育温度和脂质体中络合剂的强度。载药时间也部分取决于加入脂质体中用于装载的药物的形式。例如，当加入被增溶的药物时需要较短的时间。
在该孵育步骤结束时，可进一步处理混悬液以移除游离的(未包封的)化合物，例如使用上文提及的用于从含有被包封的多元醇的起始脂质体分散体中移除游离聚合物的任何方法。
脂质体可任选包括与亲水聚合物共价连接的小泡形成脂质。如美国专利No.5,013,556已描述的，在脂质体组合物中包括这样一种聚合物衍生的脂质可在脂质体周围形成亲水聚合物链的表面包衣。与缺少这种包衣的脂质体相比，亲水化合物链表面包衣可有效增加该脂质体的体内血液循环寿命。由甲氧基(聚乙二醇)(mPEG)和磷脂酰乙醇胺(例如二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)或二油酰磷脂酰乙醇胺)构成的具有各种mPEG分子量(350、550、750、1,000、2,000、3,000、5,000道尔顿)的聚合物衍生的脂质可购自Avanti Polar Lipids，Inc.(Alabaster，AL)。mPEG-神经酰胺的脂质聚合物也可购自Avanti Polar Lipids，Inc。脂质-聚合物缀合物的制备也在文献中有所描述，参见美国专利No.5,631,018、No.6,586,001和No.5,013,556；Zalipsky，S.等人，Bioconjugate Chem.8：111(1997)；Zalipsky，S.等人，Meth.Enzymol.387：50(2004)。这些脂质聚合物可制备成具有高纯度和最小分子量分散度的明确定义的均相材料(Zalipsky，S.等人，Bioconjugate Chem.8：111(1997)；Wong，J.等人，Science 275：820(1997))。脂质聚合物也可为“中性”脂质聚合物，例如聚合物-二硬脂酰缀合物，如美国专利No.6,586,001中所述，将该专利以引用的方式并入本文。
当脂质体中包含脂质-聚合物缀合物时，通常将1-20摩尔百分比的脂质-聚合物缀合物掺入总体脂质混合物中(参见，例如，美国专利No.5,013,556)。
脂质体可另外包含经改性而包括配基的脂质聚合物，形成脂质-聚合物-配基缀合物，本文中也称作“脂质聚合物-配基缀合物”。该配基可为治疗分子，例如药物或具有体内活性的生物分子，可为诊断分子，例如造影剂或生物分子，或对结合配偶体(优选细胞表面的结合配偶体)具有结合亲和力的靶向分子。优选的配基对细胞表面具有结合亲和力并辅助脂质体通过细胞内化作用进入胞质。存在于包括该脂质聚合物-配基的脂质体中的配基从脂质体表面朝外取向，并因此可与其同源受体相互作用。
将配基连接至脂质聚合物的方法是已知的，其中该聚合物可经官能化以用于和所选配基的后续反应(美国专利No.6,180,134；Zalipsky，S.等人，FEBS Lett.353：71(1994)；Zalipsky，S.等人，Bioconjugate Chem.4：296(1993)；Zalipsky，S.等人，J.Control.Rel.39：153(1996)；Zalipsky，S.等人，Bioconjugate Chem.8(2)：111(1997)；Zalipsky，S.等人，Meth.Enzymol.387：50(2004))。官能化的聚合物-脂质缀合物，例如末端官能化的PEG-脂质缀合物也可以商购获得(Avanti Polar Lipids，Inc.)。配基和聚合物之间的键合可以是稳定的共价键合或可响应刺激(例如pH变化或还原剂存在)而裂解的可释放键合。
配基可以是对细胞受体或对循环于血液中的病原体具有结合亲和力的分子。配基也可为治疗或诊断分子，特别是当以游离形式施用时具有较短血液循环寿命的分子。在一个实施例中，配基为生物配基，并优选为对细胞受体具有结合亲和力的配基。示例性生物配基为对以下分子的受体具有结合亲和力的分子：CD4、叶酸、胰岛素、LDL、维生素、转铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白、选择蛋白(例如E、L和P选择蛋白)、Flk-1，2、FGF、EGF、整联蛋白特别是α4β1、αvβ3、αvβ1、αvβ5、αvβ6整联蛋白、HER2，以及其他。优选的配基包括蛋白质和肽，包括抗体和抗体片段，例如F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv(由重链和轻链可变区组成的片段)和scFv(其中的轻链和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子)等。配基也可为小分子模拟肽。应当理解，细胞表面受体或其片段可作为配基。其他示例性靶向配基包括但不限于维生素分子(例如生物素、叶酸、氰钴胺素)、寡肽、寡糖。其他示例性的配基在美国专利No.6,214,388；No.6,316,024；6,056,973；和No.6,043,094中示出，将这些专利以引用的方式并入本文。
包括脂质-聚合物-配基靶向缀合物的脂质体制剂可通过多种方法制备。一种方法涉及制备包括末端官能化的脂质-聚合物衍生物的脂质小泡；即，其中游离聚合物末端为反应性的或“活化的”的脂质-聚合物缀合物(参见例如美国专利No.6,326,353和No.6,132,763)。这种活化缀合物包括在脂质体组合物中并且在脂质体形成后活化的聚合物末端可与靶向配基反应。在另一方法中，脂质-聚合物-配基缀合物在脂质体形成时包括于脂质组合物中(参见美国专利No.6,224,903和No.5,620,689)。在又一方法中，将脂质-聚合物-配基缀合物的胶束溶液与脂质体混悬液孵育并将脂质-聚合物-配基缀合物插入预形成的脂质体中(参见，例如，美国专利No.6,056,973和No.6,316,024)。
III.使用方法
具有以硼酸酯形式包封的肽硼酸化合物的脂质体制剂可用于治疗患有肿瘤的患者。硼酸化合物属于被称作蛋白酶体抑制剂的一类药物。蛋白酶体抑制剂可通过它们抑制细胞蛋白酶体活性的能力诱导细胞凋亡。更具体而言，在真核细胞中，泛素-蛋白酶体途径是胞内蛋白质的蛋白降解的中心途径。通过连接多聚泛素链蛋白质首先被靶向以进行蛋白水解，接着通过蛋白酶体快速降解成小肽并释放和回收泛素。
将如本文所述制备的脂质体制剂体内施用给小鼠。如实例7所述，制备由22:0PC/mPEG-DSPE(95/5)构成并包含被包封是硼替佐米的脂质体并静脉内施用给荷瘤小鼠。用以商品名
Figure GPA00001043159500141
销售的硼替佐米(其为硼替佐米在甘露糖醇中的混合物)治疗对照组小鼠。图11A-11C显示了游离形式(菱形)或包封于脂质体中(方形)的药物在血浆(图11A)、全血(图11B)和肿瘤(图11C)中的硼替佐米浓度(ng/mL)。当以脂质体包封形式施用时硼替佐米在血浆、全血和肿瘤中的浓度在所有时间点均高于以游离药物施用。这一试验显示了脂质体制剂提供的肿瘤内药物积聚的增强。
药代动力学参数总结于表1中。
表1
Figure GPA00001043159500151
*用T1/2α相估算Vss和CL。
脂质体包封的硼替佐米的血浆曲线下面积比游离形式的药物的曲线下面积高132倍；脂质体包封的硼替佐米的血浆半衰期比游离形式的药物的血浆半衰期高8倍；脂质体包封的硼替佐米的全血Cmax和AUC分别比游离形式的药物的Cmax和AUC的高6.2倍和10倍；肿瘤中脂质体包封的硼替佐米的Cmax和AUC分别比游离形式的药物的Cmax和AUC高1.5倍和1.9倍。
在另一试验中，给小鼠施用脂质体包封的硼替佐米并测定药代动力学参数。这些脂质体由22:0PC/mPEG-DSPE构成并如实例7所述制备。图12示出了脂质体包封的硼替佐米(实心圆形)和游离硼替佐米(空心圆形)的血浆药代动力学曲线，并且药代动力学参数总结于表2。
表2
  硼替佐米制剂  在5分钟时的浓度(ng/mL)  AUC(0-24h)(hr·ng/mL)   Vss(mL)   CL-obs*(mL/hr)
  游离药物  423.3±33.6  271   370   53.8
  脂质体包封  14067±513  29138   1.53   0.55
因此，在一个实施例中，包含肽硼酸化合物的脂质体制剂用于治疗癌症，更具体而言用于治疗癌症患者中的肿瘤。
多发性骨髓瘤是一种不可治愈的恶性肿瘤，在美国每年约15,000人被诊断出该疾病(Richardson，P.G.等人，Cancer Control.10(5)：361(2003))。它是一种血液恶性肿瘤，其特征通常在于同源浆细胞在骨髓的多个位点积聚。大部分患者可响应化疗和放射的初步治疗，然而由于抗性肿瘤细胞的增殖绝大多数最终会复发。在一个实施例中，本发明提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法通过施用包含硼酸酯形式的包封的肽硼酸化合物的脂质体制剂。
该脂质体制剂还可有效用于乳腺癌治疗，该治疗是通过帮助克服癌细胞抵抗化疗作用的一些主要途径。例如，通过NF-kB(凋亡调节剂)的信号转导和p44/42分裂素活化蛋白激酶途径可以抗凋亡。因为蛋白酶体抑制剂可阻断这些途径，所以这些化合物可激活凋亡。因此，本发明提供了用于治疗患乳腺癌的受试者的方法，该方法是通过施用包含肽硼酸化合物的脂质体。此外，因为化疗药物例如紫杉烷类和蒽环类已显示可激活这些途径之一或二者，蛋白酶体抑制剂与常规化疗药物结合使用可增强药物例如紫杉醇和多柔比星的抗肿瘤活性。因此，在另一个实施例中，本发明提供一种治疗方法，其中游离形式或脂质体包封形式的化疗药物与脂质体包封的肽硼酸化合物联合使用。
脂质体制剂的剂量和给药方案取决于所治疗的癌、癌阶段、患者的体型大小和健康状况以及对医护人员而言显而易见的其他因素。此外，用蛋白酶体抑制剂硼替佐米、Pyz-Phe-boroLeu(PS-341)进行的临床研究提供了适当剂量和给药方案的充分指导。例如，每周一次或两次静脉内给药，实体瘤患者的最大耐受剂量为1.3mg/m2(Orlowski，R.Z.等人，Breast Cancer Res.5：1-7(2003))。在另一试验中，在为期3周的周期的第1、4、8和11天静脉内推注硼替佐米表明最大耐受剂量为1.56mg/m2(Vorhees，P.M.等人，Clinical Cancer Res.9：6316(2003))。
通常肠胃外施用脂质体制剂，优选静脉内施用，另一优选为皮下施用。应当理解，制剂可包括辅助递送的任何必要的或需要的药用辅料。
在上文描述的治疗方法中，优选的蛋白酶体抑制剂为硼替佐米(Pyz-Phe-boroLeu；Pyz：2，5-吡嗪酸；PS-341)，其具有以下结构：
硼替佐米已显示对各种癌组织包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌以及对各种肿瘤例如胰腺瘤、淋巴瘤和黑素瘤具有活性。(Teicher，B.A.等人，Clin Cancer Res.，5(9)：2638-45(1999)；Adams，J.，Semin.Oncol.，28(6)：613-19(2001)；Orlowski，R.Z.；Dees，E.C.，Breast Cancer Res5(1)：1-7(2002)；Frankel等人，Clin.Cancer Res.6(9)：3719-28(2000)；和Shah，S.A.等人，J Cell Biochem，82(1)：110-22(2001))。
IV.实例
以下实例进一步说明了本文描述的发明并且不以任何方式具有限制性。
实例1
使用山梨醇作为络合剂将硼替佐米装载至脂质体中
将氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE，PEG分子量2,000Da，Avanti Polar Lipids，Birmingham，AL)的混合物以摩尔比50∶45∶5溶解于乙醇中。然后用含400mM山梨醇和100mM Tris缓冲液，pH8.5的水合缓冲液水合该脂质。最终的水合脂质混悬液含有10％(w/v)的乙醇。在压力下将脂质分散体挤压透过两个叠加的孔径为0.2μm的Nucleopore(Pleasanton，CA)膜。
外部的缓冲液通过透析与150mM NaCl/100mM羟乙基哌嗪乙磺酸钠(HEPES)，pH 7.0交换。
向该脂质混悬液中加入粉末状硼替佐米至浓度3.4mg/mL，并在65℃振摇孵育该混合物不同的时间，范围从10分钟到7小时。
在孵育期之后，在Sepharose CL-4B(Pharmacia，Piscataway，NJ)上通过凝胶色谱法检测脂质体以确定硼替佐米包封程度。脂质体中未包封任何可检出量的药物。
实例2
用葡庚糖酸作为络合剂将硼替佐米装载至脂质体中
除水合缓冲液由300mM葡庚糖酸和200mM Tris，pH 8.5组成外，脂质体的制备如实例1所述。
以2.5mg/mL硼替佐米/20mM脂质的比例向脂质体混悬液中加入硼替佐米，在65℃振摇孵育该混合物不同的时间，范围从30分钟到2小时。
在孵育期之后，检测脂质体以确定被包封的硼替佐米的量值。约0.15mg/mL的药物装载至脂质体，包封率为约7％。
实例3
用葡甲胺作为络合剂将硼替佐米装载至脂质体中
除水合缓冲液由300mM葡甲胺和100mM Tris，pH8.5组成外，脂质体的制备如实例1所述。
以2.5mg/mL硼替佐米/20mM脂质的比例向脂质体混悬液中加入硼替佐米，室温下振摇孵育该混合物30分钟、60分钟和120分钟(65℃)或3天。
孵育后，检测脂质体以确定被包封的硼替佐米的量值。结果在图4A-4B中示出。在65℃进行孵育时未检测到药物装载(图4A)。室温下与药物孵育的脂质体含有约0.3mg/mL的包封药物，包封率约16％(图4B)。
实例4
将硼替佐米装载至含有葡甲胺和乙酸的脂质体中
除水合缓冲液由300mM葡甲胺和300mM乙酸，pH7组成外，脂质体的制备如实例1所述。向脂质体混悬液中加入粉末状硼替佐米至终浓度为在大约100mM脂质(挤压时的脂质浓度，装载药物前未测定)中含1.88mg/mL硼替佐米，并在室温(22-25℃)下振摇孵育该混合物(大约16小时)。
孵育后，检测脂质体以确定被包封的硼替佐米的量值。结果显示于图5中，其中获得了约95％的包封率。
实例5
含有硼替佐米的脂质体的药物代谢动力学表征
除调整组分浓度以提供下表列出的药物/脂质摩尔比外，脂质体制剂的制备如实例4所述。
  制剂号   装载驱动力/水合缓冲液   药物/脂质摩尔比   药物浓度(mg/mL)   包封率(％)
  1   葡甲胺/乙酸   65   0.525   98％
  2   葡甲胺/乙酸   33   1.041   98％
  3   葡甲胺/乙酸   16   2.132   99％
对三组小鼠(n＝9)静脉注射脂质体制剂1、2或3。注射后5分钟、3小时和24小时从每组的三只小鼠抽取全血样品。分析全血中的硼替佐米浓度。结果在图6中示出。
实例6
具有不同脂质组成的脂质体的表征
A.卵鞘磷脂脂质体制剂
除用含300mM葡甲胺和300mM乙酸，pH7.0的水合溶液水合卵鞘磷脂和胆固醇(55∶45)、卵鞘磷脂/胆固醇/mPEG-DSPE(50∶45∶5)或仅卵鞘磷脂的脂质混合物外，脂质体的制备如实例1所述。水合后脂质浓度约为100mM。
各脂质体混悬液的外部缓冲液与150mM NaCl/100mM HEPES，pH7.0的透析缓冲液交换。
向各脂质体混悬液中加入粉末状硼替佐米至1mg/mL的硼替佐米浓度。通过在20-25℃下振摇孵育过夜(10-12小时)进行药物装载。
孵育后，检测脂质体以确定被包封的硼替佐米的量值。所有三个制剂均获得至少99％的包封率。在90°时通过动态光散射测定，脂质体粒度为179nm(卵鞘磷脂/胆固醇/mPEG-DSPE)、266nm(卵鞘磷脂/甘油)和139nm(卵鞘磷脂)。各制剂的药物浓度为约0.9mg/mL。
以5/95v/v脂质体混悬液/全血的比例向大鼠全血中加入脂质体组合物。全血中的药物浓度为5.5μg/mL。在37℃下孵育全血/脂质体混合物，于1小时、3小时、6小时和24小时取样，在5,000rpm下离心，用LC-MS检测上清液的硼替佐米浓度。结果在图7中示出。结果表明，当与全血孵育时，包封的硼替佐米很容易从脂质体中渗出。
B.磷脂酰胆碱脂质体制剂
用各酰基链含20、22或24个碳原子的磷脂酰胆碱脂质制备脂质体。以下表格提供脂质的一些细节，包括用于比较的C18(HSPC)脂质。
  脂质缩写   脂质名称   分子量(道尔顿)   相转变(Tm，℃)
  18:0PC(HSPC)   1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱   790.1   55
  20:0PC   1，2-花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱   846.27   66
  22:0PC   1，2-二山嵛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱   902.37   75
  24:0PC   1，2-二二十四酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱   95848   80
制备具有下列脂质组成的脂质体制剂。
  制剂号   脂质组成   装载驱动力/水合缓冲液   载入粒度(nM)   制剂效价(mg/mL)   包封率(％)
  4   20:0PC/mPEG-DSPE(95/5)   300mM葡甲胺/300mM乙酸   141   0.42   94％
  5   22:0PC/mPEG-DSPE(95/5)   300mM葡甲胺/300mM乙酸   228   0.478   81％
  6   22:0PC/mPEG-DSPE(95/5)   400mM葡甲胺/400mM乙酸   104   0.48   99％
  7   24:0PC/mPEG-DSPE(95/5)   400mM葡甲胺/400mM乙酸   116   0.50   96.5％
  制剂号   脂质组成   装载驱动力/水合缓冲液   载入粒度(nM)   制剂效价(mg/mL)   包封率(％)
  8   24:0PC/mPEG-DSPE(95/5)   600mM葡甲胺/600mM乙酸   106   0.50   66％
将粉末状硼替佐米加入制剂4和5中，并将100mM HEPES和50mMNaCl，pH 6.5中增溶的硼替佐米溶液用于制剂6-8的载药。在20-25℃下振摇孵育混合物三天(制剂4)，在20-25℃下振摇孵育混合物三天加在50℃下振摇孵育混合物一小时(制剂5)，在45℃下振摇孵育混合物30分钟(制剂6)，50℃下振摇孵育混合物30分钟(制剂7和8)。
将16.5μL的脂质体制剂2(实例5)和20μL的脂质体制剂4分别加至950μL大鼠全血中，同时分别加入30μL或33.5μL的缓冲液(100mM HEPES，150mM NaCl，pH 7)。作为对照，将3.5mg/mL游离硼替佐米加入950μL大鼠全血中，同时加入45μL所述缓冲液。在17℃或37℃下孵育样品，并于24小时内的不同时间取出，以5,000rpm离心，并用LC-MS检测上清液中硼替佐米的浓度。结果在图8A-8B中示出。
向小鼠静脉注射制剂4、6、7和8。于注射后5分钟、30分钟、1小时、2小时和4小时抽取血样。分析血浆中硼替佐米的浓度。结果在图9中示出。
在一独立的试验中，在正常大鼠中评价制剂4和5的药物代谢动力学(以0.1mg/kg静脉推注，n＝3/组)。用LC-MS测定法测定血浆药物浓度，结果在图13中示出。在制剂注射后5分钟内第一时间点进行采集。结果表明，用20:0PC和22:0PC制备的脂质体制剂都具有相似的PK曲线。这一结果非常重要，因为从降低药物和脂质降解的角度来看，用20碳酰基链制备的脂质体制剂优于用22碳酰基链制备的那些，然而在脂质体制剂中使用20碳酰基链脂质并未对PK曲线产生不利影响。因此，可以采用更低的处理温度，并且用碳数目更少的酰基链制备的脂质体制剂容易放大。
在另一试验中，评价制剂4和5以及与制剂4相似但具有DS而不是DSPE与PEG连接的脂质体硼替佐米在荷载有异种移植物CWR22肿瘤的SCID小鼠中的抗肿瘤功效。药物剂量为0.6mg/kg(n＝10)，并且每周静脉注射四种剂量。测量肿瘤大小，结果在图14中示出。三种脂质体制剂(制剂4，倒三角形；制剂5，圆形；制剂22:0PC/mPEG-DS，菱形)的功效均显著高于游离硼替佐米(VELCADE，三角形)。这三种脂质体制剂之间不存在统计学差异。
实例7
脂质体包封的硼替佐米的体内活性
在乙醇中溶解C22:0PC和mPEG-DSPE(95/5摩尔比)的混合物。在80-85℃下用400mM葡甲胺、400mM乙酸的中性水合缓冲液将脂质溶液振摇水合30分钟以形成脂质体。在压力下将脂质分散体挤压透过两个叠加的孔径逐级下降至0.1μm的Nucleopore(Pleasanton，CA)膜。
脂质体混悬液的外部缓冲液通过透析与150mM NaCl/100mM羟乙基哌嗪乙磺酸钠(HEPES)，pH 7.0交换。
将硼替佐米在100mM HEPES和50mM NaCl，pH 6.5中的溶液以0.61mg/mL硼替佐米/50mM脂质的比例加入脂质体混悬液中，并在45℃下振摇孵育30分钟。测得包封率为约95％。过滤除菌后的最终药物效价为0.498mg/mL，并且通过磷测定法测得脂质浓度为52mM。在90°下通过动态光散射测定，装载药物后脂质体粒度为117nm。
将荷载CWR22肿瘤的雄性SCID小鼠随机分成两个测试组，以0.8mg/kg的剂量静脉施用硼替佐米或脂质体包封的硼替佐米进行治疗。在不同时间点取全血和肿瘤样品。通过LC-MS测定全血、血浆和肿瘤组织中硼替佐米的浓度。结果在图11A-11C中示出。
尽管上文描述了许多示例性方面和实施例，本领域技术人员将认识到某些修改、变更、添加和其亚组合。因此以下所附的权利要求书和下文引入的权利要求应理解为包括所有这些修改、变更、添加和亚组合，就如同其属于它们的真正精神和范围之内。

Claims (21)

1.一种脂质体制剂，包含由具有两条酰基链的磷脂构成的脂质体，其中每条链具有20-22个碳原子；包封于所述脂质体中的硼酸化合物，所述化合物为与葡甲胺形成络合物的形式。
2.根据权利要求1所述的制剂，其中所述磷脂为不对称磷脂或对称磷脂。
3.根据权利要求1所述的制剂，其中所述磷脂在至少一条所述酰基链中具有20个碳原子。
4.根据权利要求1所述的制剂，其中所述磷脂为饱和磷脂。
5.根据权利要求1所述的制剂，其中所述磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸和磷脂酰肌醇。
6.根据权利要求1所述的制剂，其中所述磷脂为1，2-花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)。
7.根据权利要求1所述的制剂，其中所述磷脂为1，2-二山嵛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)。
8.根据权利要求1所述的制剂，其中所述脂质体进一步包括与亲水聚合物共价结合的磷脂。
9.根据权利要求8所述的制剂，其中所述亲水聚合物为聚乙二醇。
10.根据权利要求8所述的制剂，其中所述与亲水聚合物共价结合的磷脂为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇。
11.根据权利要求1所述的制剂，其中所述硼酸化合物为肽硼酸化合物。
12.根据权利要求11所述的制剂，其中所述硼酸化合物为硼替佐米。
13.根据权利要求1所述的制剂，其中所述脂质体进一步包含被包封的乙酸。
14.一种制备具有被包封的硼酸化合物的脂质体的方法，包括：
提供由具有两条酰基链的磷脂构成的脂质体，每条酰基链具有20-22个碳原子，所述脂质体具有包封于其中的葡甲胺；
在存在硼酸化合物的情况时在低于所述磷脂的相变温度的温度下孵育所述脂质体；
藉此所述孵育可有效实现摄取所述硼酸化合物至所述脂质体中。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述提供包括提供由选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸和磷脂酰肌醇的磷脂构成的脂质体。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述提供包括提供由选自1，2-花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)和1，2-二山嵛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)的磷脂构成的脂质体。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述孵育包括在存在肽硼酸化合物的情况下孵育。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述肽硼酸化合物为硼替佐米。
19.根据权利要求14所述的方法，其中所述提供包括提供进一步包含与亲水聚合物共价结合的磷脂的脂质体。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述提供包含提供具有与磷脂结合的亲水聚合物聚乙二醇的脂质体。
21.根据权利要求14所述的方法，藉此所述孵育可有效实现摄取多于90％的所述硼酸化合物至所述脂质体中。
CN200880105576A 2007-08-21 2008-08-21 用于体内施用硼酸化合物的脂质体组合物 Pending CN101795671A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US95704507P 2007-08-21 2007-08-21
US60/957045 2007-08-21
PCT/US2008/073840 WO2009026427A2 (en) 2007-08-21 2008-08-21 Liposome compositions for in vivo administration of boronic acid compounds

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101795671A true CN101795671A (zh) 2010-08-04

Family

ID=39772942

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880105576A Pending CN101795671A (zh) 2007-08-21 2008-08-21 用于体内施用硼酸化合物的脂质体组合物

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20090092661A1 (zh)
EP (1) EP2190411A2 (zh)
JP (1) JP2010536874A (zh)
KR (1) KR20100095507A (zh)
CN (1) CN101795671A (zh)
AU (1) AU2008288917A1 (zh)
BR (1) BRPI0815613A2 (zh)
CA (1) CA2697042A1 (zh)
CO (1) CO6260056A2 (zh)
EA (1) EA201070296A1 (zh)
EC (1) ECSP109981A (zh)
MX (1) MX2010002100A (zh)
WO (1) WO2009026427A2 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103142509A (zh) * 2013-03-06 2013-06-12 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 一种注射用硼替佐米药物组合物
CN106265536A (zh) * 2016-08-24 2017-01-04 江苏豪森药业集团有限公司 硼替佐米药物组合物及其制备方法
CN109045272A (zh) * 2018-08-01 2018-12-21 厦门市壳聚糖生物科技有限公司 一种硼替佐米磷脂复合物及其制备方法与应用
WO2024067840A1 (zh) * 2022-09-30 2024-04-04 上海济煜医药科技有限公司 一种脂质体及其制备方法和应用
WO2024067849A1 (zh) * 2022-09-30 2024-04-04 上海济煜医药科技有限公司 一种脂质体药物组合物及其制备方法和应用

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2748921A1 (en) 2009-01-09 2010-08-12 Sun Pharma Advanced Research Company Limited Bortezumib containing pharmaceutical composition
US20110070294A1 (en) * 2009-09-23 2011-03-24 Javeri Indu Methods for the Administration of Drugs Using Liposomes
NZ602392A (en) * 2010-03-18 2014-03-28 Innopharma Inc Stable bortezomib formulations
US8263578B2 (en) 2010-03-18 2012-09-11 Innopharma, Inc. Stable bortezomib formulations
GB201020860D0 (en) * 2010-12-09 2011-01-26 Univ Wolverhampton Disulfiram formulation and uses thereof
EP2787977A4 (en) * 2011-12-09 2015-05-06 Univ California LIPOSOMAL ACTIVE INVERTING
WO2013128419A2 (en) * 2012-03-02 2013-09-06 Dr. Reddy's Laboratories Limited Pharmaceutical compositions comprising boronic acid compounds
JP2015524411A (ja) * 2012-07-18 2015-08-24 オニキス セラピューティクス， インク．Ｏｎｙｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． エポキシケトン系プロテアソーム阻害剤のリポソーム組成物
FI3922241T3 (fi) 2013-02-01 2023-11-28 Celator Pharmaceuticals Inc Niukasti liukoisten lääkkeiden etälataus liposomeihin
US10413509B2 (en) 2013-05-30 2019-09-17 Nanobiotix Pharmaceutical composition, preparation and uses thereof
EP3102585B1 (en) * 2014-02-03 2021-05-19 Ohio State Innovation Foundation Boronic acid esters and pharmaceutical formulations thereof
CN106999419A (zh) 2014-08-04 2017-08-01 佐尼奥尼制药股份有限公司 远程装载略微水溶性药物至脂质膜泡
SG11201704219UA (en) * 2014-11-25 2017-06-29 Nanobiotix Pharmaceutical composition, preparation and uses thereof
FI3229776T3 (fi) 2014-11-25 2023-08-15 Curadigm Sas Farmaseuttinen koostumus, joka yhdistää ainakin kaksi erillistä nanopartikkelia ja farmaseuttisen yhdisteen, sen valmistus ja käytöt
TW201628610A (zh) 2014-11-25 2016-08-16 奈諾生技公司 醫藥組合物、其製備及其用途
WO2016171446A1 (ko) * 2015-04-20 2016-10-27 동아에스티 주식회사 펩타이드 붕소산 화합물을 함유하는 안정화 약학 제제
BR112017025553A2 (pt) 2015-05-28 2018-08-07 Nanobiotix composição de vacina, e kit
CN112915094A (zh) * 2021-03-26 2021-06-08 东南大学 一种硼替佐米脂质体制剂的制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0661044A1 (en) * 1991-07-03 1995-07-05 NeXstar Pharmaceuticals, Inc. Drug-containing liposomes
WO1996032930A1 (en) * 1995-04-18 1996-10-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Liposome drug-loading method and composition
US7351427B2 (en) * 1998-06-18 2008-04-01 Busulipo Ab Pharmaceutical composition, a method of preparing it and a method of treatment by use thereof
WO2001085131A2 (en) * 2000-05-11 2001-11-15 Celator Technologies Inc. Lipid carrier compositions for improved drug retention
DE60305113T2 (de) * 2002-09-09 2006-12-07 Trigen Ltd. Borsäuresalze und deren Verwendung in der Bereitstellung von Medikamente für die Thrombosebehandlung
TW200618820A (en) * 2004-11-05 2006-06-16 Alza Corp Liposome formulations of boronic acid compounds

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103142509A (zh) * 2013-03-06 2013-06-12 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 一种注射用硼替佐米药物组合物
CN103142509B (zh) * 2013-03-06 2018-01-02 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 一种注射用硼替佐米药物组合物
CN106265536A (zh) * 2016-08-24 2017-01-04 江苏豪森药业集团有限公司 硼替佐米药物组合物及其制备方法
CN106265536B (zh) * 2016-08-24 2019-01-11 江苏豪森药业集团有限公司 硼替佐米药物组合物及其制备方法
CN109045272A (zh) * 2018-08-01 2018-12-21 厦门市壳聚糖生物科技有限公司 一种硼替佐米磷脂复合物及其制备方法与应用
WO2024067840A1 (zh) * 2022-09-30 2024-04-04 上海济煜医药科技有限公司 一种脂质体及其制备方法和应用
WO2024067849A1 (zh) * 2022-09-30 2024-04-04 上海济煜医药科技有限公司 一种脂质体药物组合物及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2190411A2 (en) 2010-06-02
JP2010536874A (ja) 2010-12-02
ECSP109981A (es) 2010-04-30
BRPI0815613A2 (pt) 2015-03-24
WO2009026427A2 (en) 2009-02-26
KR20100095507A (ko) 2010-08-31
CA2697042A1 (en) 2009-02-26
AU2008288917A1 (en) 2009-02-26
MX2010002100A (es) 2010-03-26
US20090092661A1 (en) 2009-04-09
EA201070296A1 (ru) 2010-08-30
WO2009026427A3 (en) 2009-09-24
CO6260056A2 (es) 2011-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101795671A (zh) 用于体内施用硼酸化合物的脂质体组合物
US20060159736A1 (en) Liposome formulations of boronic acid compounds
Alavizadeh et al. The influence of phospholipid on the physicochemical properties and anti-tumor efficacy of liposomes encapsulating cisplatin in mice bearing C26 colon carcinoma
ES2333400T3 (es) Composiciones y procedimientos para tratar linfonas.
CN101229127A (zh) 脂质体制剂
US20190328665A1 (en) Liposome compositions encapsulating modified cyclodextrin complexes and uses thereof
US20090092662A1 (en) Liposome formulations of boronic acid compounds
CN104739769A (zh) 一种脂质体的制备方法及其制备的产品
Marzban et al. Optimizing the therapeutic efficacy of cisplatin PEGylated liposomes via incorporation of different DPPG ratios: In vitro and in vivo studies
Li et al. Encapsulation of mitoxantrone into pegylated SUVs enhances its antineoplastic efficacy
Kawano et al. Antitumor efficacy and biodistribution of liposomal sepantronium bromide (YM155), a novel small-molecule survivin suppressant
JP7204744B2 (ja) ｃ（ＲＧＤ－ＡＣＰ－Ｋ）修飾血中滞留型リポソーム
Messerer Liposomal encapsulation of irinotecan and potential for the use of liposomal drug in the treatment of liver metastases associated with advanced colorectal cancer

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20100804