KR20100095507A - 보론산 화합물의 생체내 투여를 위한 리포좀 조성물 - Google Patents

보론산 화합물의 생체내 투여를 위한 리포좀 조성물 Download PDF

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Abstract

보론산 화합물의 투여를 위한 리포좀 제형이 개시되어 있다. 리포좀은, 각각의 사슬 내에 20 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 2개의 아실 사슬을 갖는 인지질로 이루어지며, 보론산 화합물이 상기 리포좀 내에 포획된다. 바람직한 실시 형태에서, 보론산 화합물은 메글루민과의 복합체 형태이다.

Description

보론산 화합물의 생체내 투여를 위한 리포좀 조성물{LIPOSOME COMPOSITIONS FOR IN VIVO ADMINISTRATION OF BORONIC ACID COMPOUNDS}
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은, 본 명세서에 참고로 포함된, 2007년 8월 21자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/957,045호에 대한 우선권을 주장한다.
본 명세서에 기재된 요지는 포획된 보론산 화합물을 갖는 리포좀 제형에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 요지는 리포좀 내에서의 펩티드 보론산 화합물의 로딩(loading) 및 체류(retention)를 개선시키는 성분들로부터 제조된 리포좀에 관한 것이다.
리포좀 또는 지질 이중층 소포는 수상을 캡슐화하는 동심원상으로 배치된(concentrically ordered) 지질 이중층으로 이루어진 구형 소포이다. 리포좀은 수상 또는 지질 이중층 내에 포함된 치료제 및 진단제의 전달 비히클(delivery vehicle)로서의 역할을 한다. 리포좀-포획된 형태의 약물의 전달은, 그 약물에 따라, 예를 들어 감소된 약물 독성, 변경된 약동학적 특성(pharmacokinetics), 또는 개선된 약물 용해성을 비롯한 다양한 이점을 제공할 수 있다. 친수성 중합체 사슬의 표면 코팅을 포함하도록 조제된 경우의 리포좀, 소위 스틸스(STEALTH) (등록상표), 또는 장기 순환 리포좀은, 부분적으로 단핵 식세포계에 의한 리포좀의 감소된 제거로 인하여 장기 혈액 순환 수명이라는 추가의 이점을 제공한다. 리포좀이 주입 부위로부터 그의 원하는 표적 영역 또는 세포에 도달하기 위해서는 흔히 연장된 수명을 필요로 한다.
이상적으로는, 그러한 리포좀은 (i) 고 로딩 효율을 가지며, (ii) 포획된 화합물이 고농도이며, (iii) 안정한 형태로 있는, 즉 보관 동안 화합물 누출이 거의 없는, 포획된 치료 화합물 또는 진단 화합물을 포함하도록 제조될 수 있다.
이하에 설명되고 예시되는 하기의 그의 태양 및 실시 형태는 예시적이고 설명적인 것으로 의도되며, 범주를 제한하지 않는다.
일 태양에서, 각각의 사슬 내에 20 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 2개의 아실 사슬을 갖는 인지질로 이루어진 리포좀 및 리포좀 내에 포획된 보론산 화합물을 포함하는 리포좀 제형이 제공된다. 보론산 화합물은 메글루민과의 복합체 형태이다.
일 실시 형태에서, 인지질은 비대칭 인지질이다. 다른 실시 형태에서, 인지질은 대칭 인지질이다.
일 실시 형태에서, 인지질은 20개의 탄소 원자를 갖는다.
또 다른 실시 형태에서, 인지질은 포화 인지질이다.
또 다른 실시 형태에서, 인지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티드산, 및 포스파티딜이노시톨로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시 형태에서, 인지질은 1,2-아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DAPC) 또는 1,2-다이베헤노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DBPC)이다.
다른 실시 형태에서, 리포좀은 친수성 중합체에 공유 결합에 의해 부착된 인지질을 추가로 포함한다. 예시적인 친수성 중합체로는 폴리에틸렌 글리콜이 있다.
또 다른 실시 형태에서, 친수성 중합체에 공유 결합에 의해 부착된 인지질은 다이스테아로일포스파티딜에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜이다.
일 실시 형태에서, 보론산 화합물은 펩티드 보론산 화합물이다. 또 다른 실시 형태에서, 보론산 화합물은 보르테조밉(bortezomib)이다.
다른 실시 형태에서, 제형은 포획된 아세트산을 추가로 포함하는 리포좀을 포함한다.
다른 태양에서, 포획된 보론산 화합물을 갖는 리포좀의 제조 방법이 제공된다. 본 방법은 각각 20 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 2개의 아실 사슬을 갖는 인지질로 이루어지며, 내부에 포획된 메글루민을 갖는 리포좀을 제공하는 단계; 및 인지질의 상 전이 온도보다 더 낮은 온도에서 보론산 화합물의 존재 하에서 리포좀을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 상기 인큐베이션은 리포좀 내로의 보론산 화합물의 흡수를 달성하기에 효과적이다.
일 실시 형태에서, 리포좀은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티드산, 및 포스파티딜이노시톨로 이루어진 군으로부터 선택되는 인지질로 이루어진다.
다른 실시 형태에서, 인큐베이션은 리포좀 내로의 보론산 화합물의 90% 초과의 흡수를 달성하기에 효과적이다.
또 다른 태양에서, 각각의 사슬 내에 20 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 2개의 아실 사슬을 갖는 인지질로 이루어진 리포좀 및 리포좀 내에 포획된 보론산 화합물로 이루어진 리포좀 조성물의 제조 방법에 있어서의 개선이 제공된다. 당해 개선은 상 전이 온도 미만의 온도에서 리포좀 및 보론산 화합물을 인큐베이션함으로써 리포좀 내로의 보론산 화합물을 로딩하는 것을 포함한다.
일 실시 형태에서, 개선은, 상기 인큐베이션에 앞서, 내부에 포획된 메글루민을 포함하는 리포좀을 형성하는 것을 추가로 포함한다.
개선의 다른 실시 형태에서, 인지질은 1,2-아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DAPC)이며, 상기 로딩은 약 25 내지 50℃의 온도에서 행해진다.
또 다른 실시 형태에서, 인지질은 1,2-다이베헤노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DBPC)이며, 상기 로딩은 약 25 내지 50℃의 온도에서 행해진다.
상기에 기재된 예시적인 태양 및 실시 형태에 더하여, 추가의 태양 및 실시 형태가 도면을 참고함으로써 그리고 하기 설명을 검토함으로써 명백하게 될 것이다.
<도 1a 내지 도 1h>
도 1a 내지 도 1h는 예시적인 펩티드 보론산 화합물의 구조를 도시한다.
<도 2>
도 2는 리포좀 내부에서 폴리올을 이용하여 보론산 에스테르 화합물을 형성하기 위한, 보다 높은 내부/보다 낮은 외부 pH 구배에 역행하여 리포좀 내로 예시적인 펩티드 보론산이 로딩되는 것을 예시한다.
<도 3a 내지 도 3c>
도 3a 내지 도 3c는 폴리올 소르비톨 (도 3a), 알파-글리코헵톤산 (글루코헵토네이트 또는 글루셉테이트라고도 불림; 도 3b), 및 메글루민 (도 3c)의 구조를 도시한다.
<도 4a>
도 4a는 30분 동안(마름모), 60분 동안(사각형), 또는 120분 동안(삼각형) 65℃에서 보르테조밉의 존재 하에서 인큐베이션된 포획된 메글루민을 함유하는 리포좀(50:45:5 (몰/몰)의 HSPC/CHOL/mPEG-DSPE)의 컬럼 분획물에 대한 270 ㎚에서의 흡광도를 도시하며, 분획물 번호 10에서의 피크는 미포획된 약물에 상응한다.
<도 4b>
도 4b는 20 내지 25℃에서 보르테조밉의 존재 하에서 인큐베이션된 포획된 메글루민을 함유하는 리포좀(50:45:5 (몰/몰)의 HSPC/CHOL/mPEG-DSPE)의 컬럼 분획물에 대한 270 ㎚에서의 흡광도를 도시하며, 분획물 번호 4에서의 피크는 리포좀 포획된 약물에 상응한다.
<도 5>
도 5는 20 내지 25℃에서 보르테조밉의 존재 하에서 인큐베이션된 포획된 메글루민 및 아세트산을 함유하는 리포좀의 젤-여과 컬럼 분획물에 대한 270 ㎚에서의 흡광도를 도시하며, 분획 번호 14 내지 18 사이의 피크는 리포좀 포획된 약물에 상응하며, 분획물 35 내지 50은 미포획된 약물 분획에 상응한다.
<도 6>
도 6은 복합체 형성제(complexing agent)로서 메글루민/아세트산을 갖는, HSPC/콜레스테롤/mPEG-DSPE (50:45:5 (몰/몰))로 이루어진 리포좀 내에 포획된 보르테조밉의 투여 후, 시간 (hr)의 함수로서 생쥐의 혈장 내의 보르테조밉의 농도 (ng/㎖)를 도시하며, 여기서 보르테조밉은 0.53 ㎎/㎖ (삼각형), 1.04 ㎎/㎖ (사각형) 및 2.13 ㎎/㎖ (삼각형)의 용량으로 투여되었다.
<도 7>
도 7은 난(egg) 스핑고마이엘린/콜레스테롤 (원), 난 스핑고마이엘린/콜레스테롤/mPEG-DSPE (삼각형), 또는 난 스핑고마이엘린 (마름모)의 지질로 이루어진 리포좀에 있어서, 인큐베이션 시간 (hr)의 함수로서 시험관내에서 전혈 중의 보르테조밉의 농도 (㎍/㎖)를 도시한다.
<도 8a 및 도 8b>
도 8a 및 도 8b는 HSPC/mPEG-DSPE (95/5, 삼각형) 또는 1,2-다이아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (C20:0 PC)/mPEG-DSPE (95/5, 마름모)로 이루어진 리포좀에 있어서, 인큐베이션 시간 (hr)의 함수로서 시험관내에서 전혈 중의 보르테조밉의 농도 (㎍/㎖)를 도시한다.
<도 9>
도 9는 C20:0PC/mPEG-DSPE (95/5, 사각형), 1,2-다이베헤노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (C22:0PC/mPEG-DSPE (95/5, 삼각형)), 1,2-다이리그노세로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (C24:0PC/mPEG-DSPE (95/5, 삼각형 및 사각형))으로 이루어진 리포좀의 생쥐에의 정맥내 투여 후, 또는 유리 약물 (마름모)의 투여 후, 시간 (hr)의 함수로서 혈장 중의 보르테조밉의 농도 (㎍/㎖)를 도시한다.
<도 10a>
도 10a는 5℃ (마름모) 또는 25℃ (사각형)에서 보관될 때, 시간 (주)의 함수로서 C22:0PC/mPEG-DSPE (95/5)로 이루어진 리포좀 내의 보르테조밉 캡슐화 %를 도시한다.
<도 10b>
도 10b는 4℃ (마름모, 삼각형) 또는 25℃ (사각형, 원)에서 보관될 때, 시간 (주)의 함수로서 C22:0PC/mPEG-DSPE (95/5, 마름모, 사각형) 또는 C24:0PC/mPEG-DSPE (95/5, 삼각형, 원)로 이루어진 리포좀 내의 보르테조밉 캡슐화 %를 도시한다.
<도 11a 내지 도 11c>
도 11a 내지 도 11c는 생쥐에의 정맥내 투여 후, 시간 (hr)의 함수로서 보르테조밉의 농도 (ng/㎖)를 도시하는데, 유리 형태의 약물 (마름모) 또는 리포좀 내에 포획된 약물 (C22:0 PC/mPEG 95:5) (사각형)에 있어서 혈장 중 약물 농도 (도 11a), 혈액 중 약물 농도 (도 11b) 및 종양 중 약물 농도 (도 11c)를 도시한다.
<도 12>
도 12는 리포좀 내에 포획된 형태 (C22:0 PC/mPEG 95:5) (채워진 원) 또는 유리 형태 (빈 원)로 생쥐에의 정맥내 투여 후, 시간 (hr)의 함수로서 보르테조밉의 혈장 농도 (ng/㎖)를 도시한다.
<도 13>
도 13은 정상 쥐에 제형 4 및 제형 5 (실시예 6)의 투여 후, 시간 (hr)의 함수로서 혈장 내에 남아 있는 보르테조밉의 %를 도시한다.
<도 14>
도 14는 유리 약물 (삼각형), 리포좀 비히클 위약 (사각형), 보르테조밉 리포좀 제형 번호 4 및 5 (역삼각형, 원, 각각 실시예 6), 및 다른 리포좀 제형 (마름모)을, 시간 축을 따라 화살표로 나타낸 시점에서 4주 동안 매주 투여하여 처리된 생쥐에서, 시간 (일)의 함수로서 이종이식(xenograft) CWR22 종양을 가진 생쥐의 종양 크기를 도시한다.
I. 정의
"폴리올"은 분자당 하나 초과의 하이드록실(-OH) 기를 갖는 화합물을 의미한다. 이 용어는 알코올성 하이드록실 기를 함유하는 단량체 화합물 및 중합체 화합물, 예를 들면 당류, 글리세롤, 폴리에테르, 글리콜, 폴리에스테르, 폴리알코올, 탄수화물, 카테콜, 비닐 알코올과 비닐 아민의 공중합체 등을 포함한다.
"펩티드 보론산 화합물"은 하기 형태의 화합물을 의미한다:
Figure pct00001
여기서, R1, R2 및 R3은 서로 동일하거나 상이할 수 있는 독립적으로 선택된 부분이고, n은 1 내지 8, 바람직하게는 1 내지 4이다.
"친수성 중합체"는 실온에서 물에서 약간의 양의 용해도를 갖는 중합체를 의미한다. 예시적인 친수성 중합체에는 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐메틸에테르, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리하이드록시프로필옥사졸린, 폴리하이드록시프로필메타크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리다이메틸아크릴아미드, 폴리하이드록시프로필메타크릴레이트, 폴리하이드록시에틸아크릴레이트, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아스파르트아미드 및 친수성 펩티드 서열이 포함된다. 당해 중합체는 단일중합체로서 또는 블록 또는 랜덤 공중합체로서 이용될 수 있다. 바람직한 친수성 중합체 사슬은 폴리에틸렌글리콜(PEG)이며, 바람직하게는 분자량이 500 내지 10,000 Da, 더욱 바람직하게는 750 내지 10,000 Da, 더욱 더 바람직하게는 750 내지 5000 Da인 PEG 사슬로서의 것이다.
"보다 높은 내부/보다 낮은 외부 pH 구배"는 리포좀의 내부 (보다 높은 pH)와, 리포좀이 현탁되는 외부 매질 (보다 낮은 pH) 사이의 막통과(transmembrane) pH 구배를 말한다. 전형적으로, 내부 리포좀 pH는 외부 매질 pH보다 적어도 1 pH 단위가 더 크며, 바람직하게는 2 내지 4 단위가 더 크다.
"리포좀 포획된"은 리포좀의 중앙의 수성 구획 내에, 리포좀 지질 이중층들 사이의 수성 공간 내에, 또는 이중층 자체의 내부에 격리되어 있는 화합물을 의미한다.
II . 리포좀 제형
일 태양에서, 포획된 펩티드 보론산 화합물을 갖는 리포좀 조성물이 제공된다. 리포좀은 리포좀 내에 화합물의 로딩 및 체류를 향상시키는 성분들을 포함한다. 리포좀 조성물 및 제조 방법이 본 섹션에서 설명된다.
A. 리포좀 성분
리포좀 제형은 포획된 펩티드 보론산 화합물을 함유하는 리포좀으로 이루어진다. 펩티드 보론산 화합물은 펩티드 서열의 산성 말단 또는 C-말단에 α-아미노보론산을 함유하는 펩티드이다. 일반적으로, 펩티드 보론산 화합물은 하기 형태의 것이다:
Figure pct00002
여기서, R1, R2 및 R3은 서로 동일하거나 상이할 수 있는 독립적으로 선택된 부분이고, n은 1 내지 8, 바람직하게는 1 내지 4이다. 측쇄로서 보론산을 갖는 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기를 갖는 화합물이 또한 고려된다.
바람직하게는, R1, R2 및 R3은 독립적으로 수소, 알킬, 알콕시, 아릴, 아릴옥시, 아르알킬, 아르알콕시, 사이클로알킬 또는 복소환으로부터 선택되거나; 또는 R1, R2 및 R3 중 임의의 것은 펩티드 골격 내의 인접한 질소 원자와 복소환식 고리를 형성할 수 있다. 알콕시, 아르알킬 및 아르알콕시의 알킬 성분을 포함하는 알킬은 바람직하게는 탄소 원자가 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 탄소 원자가 1 내지 6개이며, 선형 또는 분지형일 수 있다. 아릴옥시, 아르알킬 및 아르알콕시의 아릴 성분을 포함하는 아릴은 바람직하게는 단핵 또는 이핵 (즉, 2개의 융합된 고리), 더욱 바람직하게는 단핵, 예를 들면 벤질, 벤질옥시, 또는 페닐이다. 아릴은 또한 헤테로아릴, 즉 고리 내에 하나 이상의 질소, 산소 또는 황 원자를 갖는 방향족 고리, 예를 들면 푸릴, 피롤, 피리딘, 피라진, 또는 인돌을 포함한다. 사이클로알킬은 바람직하게는 탄소 원자가 3 내지 6개이다. 복소환은 고리 내에 하나 이상의 질소, 산소 또는 황 원자를 갖는 비-방향족 고리, 바람직하게는 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 5원 내지 7원 고리를 말한다. 그러한 복소환에는, 예를 들어 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진, 및 모르폴린이 포함된다. 사이클로알킬 또는 복소환 중 어느 하나는 알킬과 조합될 수 있으며, 예컨대 사이클로헥실메틸일 수 있다.
임의의 상기 기 (수소는 제외함)는 할로겐, 바람직하게는 플루오로 또는 클로로; 하이드록시; 저급 알킬; 저급 알콕시, 예를 들면 메톡시 또는 에톡시; 케토; 알데히드; 카르복실산, 에스테르, 아미드, 카르보네이트, 또는 카르바메이트; 설폰산 또는 설폰산 에스테르; 시아노; 1차, 2차, 또는 3차 아미노; 니트로; 아미디노; 및 티오 또는 알킬티오로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 당해 기는 2개 이하의 그러한 치환기를 포함한다.
예시적인 펩티드 보론산 화합물이 도 1a 내지 도 1h에 예시되어 있다. 도 1a 내지 도 1h에 예시된 R1, R2 및 R3의 구체적인 예에는 n-부틸, 아이소부틸, 및 네오펜틸 (알킬); 페닐 또는 피라질 (아릴); 4-((t-부톡시카르보닐)아미노)부틸, 3-(니트로아미디노)프로필, 및 (1-사이클로펜틸-9-시아노)노닐 (치환된 알킬); 나프틸메틸 및 벤질 (아르알킬); 벤질옥시 (아르알콕시); 및 피롤리딘 (R2는 인접한 질소 원자와 함께 복소환식 고리를 형성함)이 포함된다.
일반적으로, 펩티드 보론산 화합물은 모노-펩티드, 다이-펩티드, 트라이-펩티드, 또는 보다 고차인 펩티드 화합물일 수 있다. 다른 예시적인 펩티드 보론산 화합물들은 본 명세서에 참고로 포함된, 미국 특허 제6,083,903호, 제6,297,217호 및 제6,617,317호에 개시되어 있다.
도 2에 예시된 절차에 따라, 펩티드 보론산 화합물이 리포좀 내로 로딩되어, 펩티드 보론산 화합물이 펩티드 보로네이트 에스테르 형태로 리포좀 내에 포획된 리포좀 제형을 생성한다. 도 2는 단일 실선(12)으로 표시된 지질 이중층 막을 갖는 리포좀(10)을 도시한다. 다중라멜라형(multilamellar) 리포좀에서는, 지질 이중층 막이, 수성 공간이 개재되어 있는 다수의 지질 이중층으로 이루어져 있음이 이해될 것이다. 리포좀(10)은 외부 매질(14)에 현탁되어 있는데, 여기서 외부 매질의 pH는 약 7.0, 일반적으로는 약 5.5 내지 8.0, 더욱 일반적으로는 6.0 내지 7.0이다. 리포좀(10)은 지질 이중층 막에 의해 한정되는 내부 수성 구획(16)을 갖는다. 내부 수성 구획 내에 포획된 것은 폴리올(18)이다. 폴리올은 바람직하게는 시스 1,2- 또는 1,3-다이올 작용기를 갖는 부분이며, 바람직한 실시 형태에서, 폴리올은 메글루민이다. 내부 수성 구획의 pH는 바람직하게는 약 8.0보다 더 크며, 더욱 바람직하게는 9보다 더 크며, 더욱 더 바람직하게는 10보다 더 크다.
또한, 리포좀에 포획되는 것은 펩티드 보론산 화합물이며, 이는 도 2에 보르테조밉으로 나타내어져 있다. 보르테조밉은 또한 지질 이중층 막을 가로질러 통과하기에 앞서, 외부 수성 매질에서 보여지고 있다. 외부 수성 매질에서, 이 화합물은 대부분 비하전되는데(uncharged), 이는 pH가 보론산 기에 있어서의 pKa = 9.7 (ACD/labs 버전 6.0에 의해 계산됨)보다 상당히 더 낮기 때문이다. 당해 화합물은, 그의 비하전된 상태에서, 지질 이중층을 가로질러 자유로이 침투할 수 있는데, 이는 당해 화합물이 오히려 친유성 (log P = 2.45 ± 1.06, ACD/labs 버전 6.0에 의해 계산됨)이기 때문이다. 보로네이트 에스테르의 형성은 평형을 이동시켜, 추가적인 화합물이 외부 매질로부터 지질 이중층을 가로질러 침투하게 하여, 당해 화합물이 리포좀 내에 축적되게 한다. 다른 실시 형태에서는, 외부 현탁 매질에서의 보다 낮은 pH와 리포좀 내부 상에서의 다소 더 높은 pH는, 리포좀 내부의 폴리올과 조합되어, 리포좀의 수성 내부 구획 내로의 약물 축적을 유도한다. 당해 화합물은, 일단 리포좀 내부에 있으면, 폴리올과 반응하여 보로네이트 에스테르를 형성한다. 보로네이트 에스테르는 본질적으로 리포좀 이중층을 횡단할 수 없어서 보로네이트 에스테르 형태의 약물 화합물은 리포좀 내부에 축적된다. 보론산 에스테르 복합체의 안정성은 pH가 증가하면 증가된다.
리포좀 내부의 폴리올의 농도는 하전된 기, 예를 들면 하이드록실 기의 농도가 보론산 화합물의 농도보다 상당히 더 큰 것이 바람직하다. 최종 약물 농도가 25 mM (0.2 ㎎/㎖의 총 약물 농도의 내부 약물 농도)인 조성물에서, 예를 들어 중합체 하전 기의 내부 화합물 농도는 전형적으로 적어도 이 크기, 바람직하게는 상기 약물 농도의 수 배가 될 것이다.
폴리올은 고 내부/저 외부 농도로 존재하는데; 즉, 리포좀 지질 이중층 막을 가로질러 폴리올의 농도 구배가 있다. 폴리올 포획제가 외부 벌크상(bulk phase)에 상당량으로 존재할 경우, 폴리올이 외부 매질 중 펩티드 보론산 화합물과 반응하여, 리포좀 내부에의 그 화합물의 축적을 둔화시킨다. 따라서, 바람직하게는 리포좀은, 후술되는 바와 같이, 조성물이 벌크상 (외부 수상)에 실질적으로 폴리올 포획제가 없도록 제조된다.
본 명세서에 기재된 연구를 뒷받침함에 있어서, 예시적인 화합물 보르테조밉을 포획제(복합체 형성제)로서 소르비톨, 글루셉테이트, 또는 메글루민을 갖는 리포좀 내로 로딩하였다. 이들 화합물의 구조는 도 3a 내지 도 3c에 각각 예시되어 있다. 실시예 1 내지 실시예 3에 설명된 바와 같이, 수화 완충액 중 이들 복합체 형성제 중 하나를 사용하여 리포좀을 제조하였다. 투석에 의해 임의의 미포획된 복합체 형성제의 제거 후, 다양한 시간 동안 다양한 온도에서 약물의 용액과 함께 리포좀을 인큐베이션함으로써 리포좀 내로 보르테조밉을 로딩하였다. 소르비톨 또는 글루셉테이트가 복합체 형성 시약으로서 리포좀에 존재하고, 로딩이 60 내지 65℃에서 수행되었을 때, 리포좀 내로 검출가능한 약물이 로딩되지 않았다. 메글루민을 복합체 형성제로서 사용하고, 로딩을 65℃에서 수행했을 때, 유사한 결과가 관찰되었다. 이는 도 4a에 나타낸 데이터에 의해 설명되는데, 도 4a는 30분 동안 (원), 60분 동안 (사각형), 또는 120분 동안 (삼각형) 65℃에서 보르테조밉의 존재 하에서 인큐베이션된 포획된 메글루민을 함유하는 리포좀의 G10 탈염 컬럼 분획물들에 있어서의 270 ㎚에서의 흡광도를 나타낸다. 분획물 번호 10에서의 피크는 미포획된 약물에 상응한다. 그러나, 도 4b에서 알 수 있는 바와 같이, 인큐베이션이 약 20 내지 25℃의 실온에서 수행되었을 때에는, 분획물 번호 4에서의 피크에 의해 명백한 바와 같이, 보르테조밉이 리포좀 내에 로딩 및 보유되었다.
실시예 4에 기재된 다른 연구에서는, 리포좀 내부의 메글루민 및 아세트산의 존재에 의해 확립된 이온 구배에 역행하여 리포좀 내로 보르테조밉이 로딩되었다. 내부 수화 매질에의 아세트산의 첨가는 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 보르테조밉의 고 캡슐화 효율로 이어진다. 도 5에서, 분획물 번호 14 내지 18 사이의 피크는 리포좀 포획된 약물에 상응하며, 원격 로딩에 의해 총 약물의 약 95%가 리포좀 내에 포획되었음을 보여준다.
메글루민/아세트산 구배에 역행하여 로딩함에 의해 포획된 보르테조밉을 갖는 리포좀을 실시예 5에 기재된 바와 같이, 약물 농도가 0.5 ㎎/㎖, 1.0 ㎎/㎖, 및 2.1 ㎎/㎖이 되도록 제조하였다. 3가지의 제형을 1.6 ㎎/㎏의 약물 용량으로 생쥐 내에 주입하고, 보르테조밉의 혈장 농도를 시간의 함수로서 결정하였다. 도 6은 0.53 ㎎/㎖ (삼각형), 1.04 ㎎/㎖ (사각형) 및 2.13 ㎎/㎖ (삼각형)의 약물 농도로 리포좀 내에 포획된 보르테조밉의 투여 후, 시간 (hr)의 함수로서 생쥐의 혈장 내의 보르테조밉의 농도 (ng/㎖)를 도시한다. 생체내 투여시, 약물이 급속히 리포좀으로부터 누출되었으며, 3시간의 시점에서, 혈장 약물 농도는 유리 보르테조밉의 생체내 투여에 대하여 예상되는 것과 대략 동일하였다.
추가의 연구를 수행하여 보론산 화합물의 생체내 체류가 개선된 리포좀 조성물에 도달하였다. 실시예 6에 기재된 바와 같이, 리포좀을 상이한 지질 조성물들로부터 제조하고, 쥐 전혈을 사용하여 시험관내 방출 분석에서 시험하였다. 난 스핑고마이엘린/콜레스테롤 (95/5), 난 스핑고마이엘린/콜레스테롤/mPEG-DSPE (50/45/5), 또는 난 스핑고마이엘린으로 이루어진 지질 이중층을 갖는 리포좀을 제조하고, 보르테조밉을 로딩시켰다 (실시예 6A). 쥐 전혈을 사용하여 시험관내 방출 분석을 이용하여 리포좀으로부터의 약물의 방출을 분석하였다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 약물은 난 스핑고마이엘린/콜레스테롤 (원), 난 스핑고마이엘린/콜레스테롤/mPEG-DSPE (삼각형), 및 난 스핑고마이엘린 (마름모)으로 이루어진 리포좀으로부터 급속히 방출되었다.
인지질 포스포콜린으로 이루어진 지질 이중층을 갖는 리포좀을 제조하였는데, 상기 포스포콜린은 18, 20, 22, 또는 24개의 탄소 원자의 아실-사슬 길이를 가졌다 (실시예 6B). 도 8a 및 도 8b는 17℃ (도 8a) 또는 37℃ (도 8b)에서 수소화 대두 포스포콜린 (C18:0; HSPC)/콜레스테롤/mPEG-DSPE (50:45:5, 삼각형) 또는 1,2-다이아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (20:0PC)/mPEG-DSPE (95/5, 마름모)로 이루어진 리포좀으로부터의 보르테조밉의 방출을 도시한다. 도 8a 및 도 8b의 데이터는 C20:0PC 지질을 사용하여 제조된 리포좀이, 보다 오랜 시간 동안 혈액 내에서 인큐베이션될 때, C18:0PC 지질을 사용하여 제조된 리포좀에 비하여, 약물을 현저히 더 우수하게 보유하였음을 보여준다.
실시예 6B에 따라 제조된 리포좀을 정맥내 주사를 통해 생쥐에 투여하였다. 주사 후 4시간의 기간에 걸쳐 혈액 샘플을 채취하고, 보르테조밉의 농도에 대하여 분석하였다. 도 9는 20:0PC/mPEG-DSPE (95/5, 제형 번호 4, 사각형), C22:0PC/mPEG-DSPE (95/5, 제형 번호 6, 삼각형), C24:0PC/mPEG-DSPE (95/5, 제형 번호 7 및 8, 각각 빈 원 및 채워진 원)로 이루어진 리포좀의 투여시 약물의 농도 (㎍/㎖ )를 도시한다. 동물들의 대조군은 유리 형태의 보르테조밉 (마름모)의 정맥내 주사를 받았다. 보르테조밉의 혈액 순환 수명은, 그 약물이 포스포콜린 인지질로 이루어진 이중층을 갖는 리포좀 내에 포획되었을 때, 유리 약물 혈액 순환 수명에 비하여 상당히 증가하였다. 특히, 1차 이중층 성분으로서 C22:0PC를 함유하는 리포좀은, C24:0PC 지질을 갖는 리포좀에 의해 제공된 것보다 약간 더 우수한 장기 혈액 순환 시간을 제공하였다.
도 10a 및 도 10b는 C22:0PC/mPEG-DSPE (95/5) 또는 C24:0PC/mPEG-DSPE (95/5)로 구성된 리포좀 내에 포획된 보르테조밉의 체류를 도시한다. 더욱 구체적으로, 도 10a는 5℃ (마름모) 또는 25℃ (사각형)에서 보관될 때, 시간 (주)의 함수로서 C22:0PC/mPEG-DSPE (95/5)로 구성된 리포좀 내의 보르테조밉 캡슐화 %를 도시한다. 5℃에서는, 제형이 적어도 3개월 동안은 안정하였으며, 이때 본질적으로 측정가능한 양의 약물 손실은 없었다. 25℃에서 보관했을 때에는, 약 2주의 보관 후 리포좀으로부터 약물이 누출되기 시작하였다.
도 10b는 4℃ (마름모, 삼각형) 또는 25℃ (사각형, 원)에서 보관될 때, 시간 (주)의 함수로서 C22:0PC/mPEG-DSPE (95/5, 마름모, 사각형) 또는 C24:0PC/mPEG-DSPE (95/5, 삼각형, 원)로 이루어진 리포좀 내의 보르테조밉 캡슐화 %를 도시한다. C22:0의 사슬 길이를 갖는 포스포콜린으로 구성된 리포좀은 둘 모두의 온도에서, C24:0 사슬 길이를 갖는 포스포콜린으로 구성된 리포좀보다 더 우수한 약물 체류를 제공하였다.
따라서, 일 실시 형태에서, 20, 21, 또는 22개의 탄소 원자를 갖는 인지질로 이루어진 리포좀이 고려된다. 지질은 2개의 아실 사슬이 상이한 탄소 사슬 길이를 갖는 비대칭 지질이거나, 2개의 아실 사슬이 동일한 개수의 탄소 원자를 갖는 대칭 지질일 수 있다. 지질이 비대칭인 실시 형태에서는, 2개의 아실 사슬 중 하나가 20, 21, 또는 22개의 탄소 원자를 가질 때, 인지질이 20, 21, 또는 22개의 탄소 원자를 갖는 것으로 여겨진다. 바람직한 실시 형태에서, 그 상대 사슬은 4개 미만, 더욱 바람직하게는 2개 미만의 탄소 원자만큼 상이한 개수의 탄소 원자를 갖는다.
인지질은 이중층 막의 내부 소수성 영역과 접촉된 소수성 부분(아실 사슬)과, 이중층의 외부 극성 표면을 향해 배향된 헤드 기 부분에 의해, 물에서 이중층 소포로 자발적으로 형성되기 때문에, 소포-형성 지질인 것으로 당업계에 알려져 있다. 다양한 합성 소포-형성 지질 및 자연-발생 소포-형성 지질이 있으며, 이는 인지질, 예를 들면 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티드산, 포스파티딜이노시톨을 포함하며, 여기서 2개의 탄화수소 사슬은 전형적으로 길이가 약 14 내지 22개의 탄화수소이며, 다양한 불포화도를 갖는다.
소포-형성 지질은, 지질의 구조에 좌우되는 소정의 상 전이 또는 Tm 에서, 액정상으로부터 더 많은 유체상으로의 전이를 겪는다. 일 실시 형태에서, 리포좀은 소정의 Tm을 갖는 지질로부터 형성되며, 그 지질 - 이는 전형적으로 지질 이중층 내의 1차 지질 성분임 - 의 Tm 미만의 온도에서 약물의 존재 하에서 리포좀을 인큐베이션함으로써 이온 구배에 역행하여 리포좀 내로 로딩된다. 이러한 제조 방법이 이하에 일반적으로 개시되어 있고, 실시예 3 내지 실시예 6에 기재된 바와 같이 제조된 리포좀 제형에 의해 예시되는데, 여기서 리포좀 내로의 보르테조밉의 원격 로딩은 실온에서 달성되었다.
일 실시 형태에서, 보론산 화합물의 원격 로딩은 메글루민을 함유하는 사전-형성된 리포좀을 사용하여 수행된다. 메글루민은 2차 아민 화합물이며, 그의 다이올 작용기에 의해 보론산 화합물과 보로네이트 에스테르를 형성한다. 메글루민 내의 다수의 인접한 시스(cis) 다이올들이, 보론산 화합물이 리포좀 지질 이중충 막을 가로질러 확산한 후, 보론산 화합물과 반응하여 보로네이트 에스테르를 형성하고, 그에 의해 리포좀 내에 보론산 화합물이 포획되게 된다.
일 실시 형태에서, 상기 과정은 pH에 의해 구동되는데, 여기서 리포좀 외부의 보다 낮은 pH (예를 들면, pH 6 내지 7)와 리포좀 내부 상의 다소 더 높은 pH (pH 8.5 내지 10.5)는, 폴리올의 존재와 조합되어, 당해 화합물의 축적 및 로딩을 유도한다. 이 실시 형태에서는, 폴리올의 더 높은 내부/더 낮은 외부 구배를 갖는 리포좀을 조제함으로써 조성물이 제조된다. 상기에 기재된 바와 같이 선택된 폴리올의 수용액이, 상기에 기재된 바와 같이 결정된 원하는 농도로 제조된다. 폴리올 용액은 지질 수화에 적합한 점도를 갖는 것이 바람직하다. 완충 시약이 높은 내부 pH를 생성하도록 이용될 때, 폴리올 수용액의 pH는 바람직하게는 약 8.0보다 크다. 아세트산 (또는 기타 막 침투성 약산)을 함유하는 수화 용액의 pH는 통상 중성이며, 이 경우에, 투석 또는 정용여과 (diafiltration)의 과정 동안 높은 내부 pH가 생성된다.
소포-형성 지질, 소포 비-형성 지질 (예를 들면, 콜레스테롤, DOPE 등), 지질중합체(lipopolymer), 예를 들면 mPEG-DSPE, 및 임의의 다른 원하는 지질 이중층 성분의 원하는 혼합물로부터 제조된 건조된 지질 필름의 수화를 위하여 폴리올 수용액이 사용된다. 건조된 지질 필름은 적합한 용매, 전형적으로는 휘발성 유기 용매에 선택된 지질을 용해시키고, 그 용매를 증발시켜 건조된 필름을 남김으로써 제조된다. 지질 필름을 원하는 pH로 조정된 폴리올을 함유하는 용액으로 수화하여 리포좀을 형성한다.
리포좀 형성 후에는, 리포좀을 크기에 따라 분류하여, 실질적으로 균일한 크기 범위, 전형적으로 약 0.01 내지 0.5 마이크로미터, 더욱 바람직하게는 0.03 내지 0.40 마이크로미터, 그리고 더욱 더 바람직하게는 0.08 내지 0.2 마이크로미터를 갖는 리포좀 집단을 얻을 수 있다. REV 및 MLV에 대한 하나의 효과적인 크기에 따른 분류법(sizing method)은 0.8 내지 0.05 마이크로미터, 전형적으로는 0.8, 0.4, 0.2, 0.1, 0.08 및/또는 0.05 마이크로미터 범위의 선택된 균일한 기공 크기를 갖는 일련의 폴리카르보네이트 막을 통해 리포좀의 수성 현탁물을 압출하는 것을 포함한다. 막의 기공 크기는 막을 통한 압출에 의해, 특히 제제가 동일한 막을 통해 2회 이상 압출되는 경우에 생성된 리포좀의 평균 크기에 대략적으로 상응한다. 균질화법(homogenization method)은 또한 리포좀을 100 ㎚ 이하의 크기로 축소시키는 데 유용하다 (문헌[Martin, F.J., in Specialized Drug Delivery Systems - Manufacturing and Production Technology, P. Tyle, Ed., Marcel Dekker, New York, pp. 267-316 (1990)]).
크기에 따른 분류 후에는, 투석, 정용여과, 원심분리, 사이즈 배제 크로마토그래피 또는 이온 교환과 같은 적합한 기술에 의해 미캡슐화된 벌크상 폴리올을 제거하여, 내부에 고농도의 폴리올을 가지며, 바람직하게는 외부에 폴리올이 거의 없거나 전혀 없는 리포좀 현탁물을 달성한다. 또한, 리포좀 형성 후에는, 리포좀의 외부 상을 적정, 투석 등에 의해 약 7.0 미만의 pH로 조정한다.
그 다음에, 리포좀 내로의 능동 로딩을 위해 리포좀 분산물에, 포획될 보론산 화합물을 첨가한다. 첨가되는 보론산 화합물의 양은 100% 캡슐화 효율, 즉 첨가된 모든 화합물이 결국에는 보로네이트 에스테르 형태로 리포좀 내로 로딩되는 것으로 가정하여, 캡슐화될 약물의 총량으로부터 결정될 수 있다.
화합물과 리포좀 분산물의 혼합물은 바람직하게는, 지질 이중층을 형성하는 지질 혼합물 내의 1차 지질 성분의 상 전이 온도보다 낮은 온도에서 인큐베이션된다. 벌크 매질 내의 화합물 농도의 수 배가 되는 리포좀 중 화합물 농도까지의 화합물의 흡수가 요구되며, 이는 흔히 리포좀 내의 침전물의 형성에 의해 증명된다. 리포좀 내의 침전물의 형성은, 예를 들어 표준 전자 현미경법 또는 X-선 회절 기술에 의해 확인될 수 있다. Tm이 55℃인 높은 상 전이 지질의 경우, 예를 들어 인큐베이션은 20 내지 45℃에서 수행될 수 있다. 인큐베이션 시간은, 인큐베이션 온도 및 리포좀 내부의 복합체 형성 시약의 강도에 따라, 수분으로부터 수십분까지, 수시간까지 또는 최대 12시간 미만까지 또는 그 이상으로 달라질 수 있다. 약물 로딩 시간은 또한 로딩을 위해 리포좀에 첨가되는 약물의 형태에 일부 좌우된다. 예를 들어, 가용화된 약물이 첨가될 때에는 보다 짧은 시간이 요구된다.
이 인큐베이션 단계의 마지막에, 현탁물을 추가로 처리하여, 예를 들어 포획된 폴리올을 함유하는 초기 리포좀 분산물로부터 유리 중합체를 제거하기 위한, 상기에 언급된 임의의 방법을 이용하여, 유리 (비-캡슐화) 화합물을 제거할 수 있다.
리포좀은 친수성 중합체에 공유 결합된 소포-형성 지질을 선택적으로 포함할 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,013,556호에 개시된 바와 같이, 리포좀 조성물 내에 그러한 중합체-유도체화된 지질을 포함시키면 리포좀 둘레에 친수성 중합체 사슬의 표면 코팅이 형성된다. 친수성 중합체 사슬의 표면 코팅은, 그러한 코팅이 결여된 리포좀과 비교할 때, 리포좀의 생체 내 혈액 순환 수명을 증가시키는 데 효과적이다. 메톡시(폴리에틸렌글리콜)(mPEG) 및 포스파티딜에탄올아민 (예를 들면, 다이미리스토일 포스파티딜에탄올아민, 다이팔미토일 포스파티딜에탄올아민, 다이스테아로일 포스파티딜에탄올아민(DSPE) 또는 다이올레오일 포스파티딜에탄올아민)으로 이루어진 중합체-유도체화된 지질은 다양한 mPEG 분자량 (350, 550, 750, 1,000, 2,000, 3,000, 5,000 Da)으로 아반티 폴라 리피즈, 인크.(Avanti Polar Lipids, Inc.) (미국 앨라배마주 앨러배스터 소재)로부터 획득될 수 있다. mPEG-세라미드의 지질중합체가 또한 아반티 폴라 리피즈, 인크.로부터 구매될 수 있다. 지질-중합체 콘쥬게이트의 제조가 또한 문헌에 개시되어 있다 (미국 특허 제5,631,018호, 제6,586,001호 및 제5,013,556호; 문헌[Zalipsky, S. et al., Bioconjugate Chem., 8: 111(1997)]; 문헌[Zalipsky, S. et al., Meth. Enzymol. 387:50 (2004)] 참조). 이들 지질중합체는 최소 분자량 분산도를 갖는 고순도의 명확한 균질 물질로서 제조될 수 있다 (문헌[Zalipsky, S. et al., Bioconjugate Chem., 8: 111 (1997)]; 문헌[Wong, J. et al., Science, 275: 820 (1997)]). 지질중합체는 또한 "중성" 지질중합체, 예를 들면 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제6,586,001호에 개시된 바와 같은 중합체-다이스테아로일 콘쥬게이트일 수 있다.
지질-중합체 콘쥬게이트가 리포좀에 함유될 때, 전형적으로 지질-중합체 콘쥬게이트의 1 내지 20 몰%가 총 지질 혼합물 내로 혼입된다 (예를 들어, 미국 특허 제5,013,556호 참조).
리포좀은 리간드를 포함하여 지질-중합체-리간드 콘쥬게이트 - 지질중합체-리간드 콘쥬게이트라고도 불림 - 를 형성하도록 개질된 지질중합체를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 리간드는 치료 분자, 예를 들어 약물 또는 생체내에서 활성을 갖는 생물학적 분자, 진단 분자, 예를 들면 조영제 또는 생물학적 분자, 또는 결합 파트너, 바람직하게는 세포 표면 상의 결합 파트너에 대하여 결합 친화성을 갖는 표적화 분자일 수 있다. 바람직한 리간드는 세포 표면에 대한 결합 친화성을 가지며, 내재화(internalization)를 통하여 세포의 세포질 내로의 리포좀의 진입(entry)을 촉진시킨다. 그러한 지질중합체-리간드를 포함하는 리포좀에 존재하는 리간드는 리포좀 표면으로부터 바깥쪽을 향해 배향되어 있으며, 따라서 그의 동종 수용체(cognate receptor)와의 상호작용에 이용가능하다.
리간드를 지질중합체에 부착시키는 방법들이 알려져 있으며, 여기서 지질중합체는 선택된 리간드와의 후속 반응을 위해 작용화될 수 있다 (미국 특허 제6,180,134호; 문헌[Zalipsky, S. et al., FEBS Lett., 353: 71 (1994)]; 문헌[Zalipsky, S. et al., Bioconjugate Chem., 4: 296 (1993)]; 문헌[Zalipsky, S. et al., J. Control. Rel. 39: 153 (1996)]; 문헌[Zalipsky, S. et al., Bioconjugate Chem., 8(2): 111 (1997)]; 문헌[Zalipsky, S. et al., Meth. Enzymol., 387: 50 (2004)]). 작용화된 중합체-지질 콘쥬게이트, 예를 들면, 말단-작용화된 PEG-지질 콘쥬게이트 (아반티 폴라 리피즈, 인크.)가 또한 상업적으로 획득될 수 있다. 리간드와 중합체 사이의 결합은 안정한 공유 결합, 또는 pH 변화 또는 환원제의 존재와 같은 자극에 응답하여 절단되는 해제가능한(releasable) 결합일 수 있다.
리간드는 세포 수용체에 대하여, 또는 혈액 내에서 순환하는 병원체에 대하여 결합 친화성을 갖는 분자일 수 있다. 리간드는 또한 치료 분자 또는 진단 분자, 특히 유리 형태로 투여될 때 단기 혈액 순환 수명을 갖는 분자일 수 있다. 일 실시 형태에서, 리간드는 생물학적 리간드이며, 바람직하게는 세포 수용체에 대하여 결합 친화성을 갖는 것이다. 예시적인 생물학적 리간드는 CD4, 폴레이트, 인슐린, LDL, 비타민, 트랜스페린, 아시알로당단백질, 셀렉틴, 예를 들면 E, L 및 P 셀렉틴, Flk-1,2, FGF, EGF, 인테그린, 특히 α4β1 αvβ3, αvβ1 αvβ5, αvβ6 인테그린, HER2, 및 기타 물질의 수용체에 대하여 결합 친화성을 갖는 분자이다. 바람직한 리간드는 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv (중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 이루어진 단편), 및 scFv (경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단쇄 폴리펩티드 분자) 등과 같은 항체 및 항체 단편을 포함하는 단백질 및 펩티드를 포함한다. 리간드는 또한 소분자 펩티드 모방체(peptidomimetic)일 수 있다. 세포 표면 수용체 또는 그 단편이 리간드로서의 역할을 할 수 있음이 이해될 것이다. 다른 예시적인 표적화 리간드에는 비타민 분자 (예를 들면, 바이오틴, 폴레이트, 시아노코발아민), 올리고펩티드, 올리고당류가 포함되지만, 이로 한정되지 않는다. 다른 예시적인 리간드가 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제6,214,388호, 제6,316,024호, 제6,056,973호, 및 제6,043,094호에 제시되어 있다.
지질-중합체-리간드 표적화 콘쥬게이트를 포함하는 리포좀 제형은 다양한 접근법에 의해 제조될 수 있다. 한 접근법은 말단-작용화된 지질-중합체 유도체; 즉, 유리 중합체 말단이 반응성이거나 "활성화"된 지질-중합체 콘쥬게이트를 포함하는 지질 소포의 제조를 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 제6,326,353호 및 제6,132,763호 참조). 그러한 활성화된 콘쥬게이트는 리포좀 조성물에 함유되며, 활성화된 중합체 말단은 리포좀 생성 후 표적화 리간드와 반응한다. 다른 접근법에서는, 지질-중합체-리간드 콘쥬게이트가 리포좀 형성시에 지질 조성물에 함유된다 (예를 들어, 미국 특허 제6,224,903호 및 제5,620,689호 참조). 또 다른 접근법에서는, 지질-중합체-리간드 콘쥬게이트의 미셀 용액이 리포좀의 현탁물과 함께 인큐베이션되고, 지질-중합체-리간드 콘쥬게이트가 사전-형성된 리포좀 내로 삽입된다 (예를 들어, 미국 특허 제6,056,973호 및 제6,316,024호 참조).
III. 사용 방법
보로네이트 에스테르 형태로 포획된 펩티드 보론산 화합물을 갖는 리포좀 제형은 종양을 가진 환자의 치료에 사용된다. 보론산 화합물은 프로테아좀 억제제로 불리는 약물의 부류 내에 있다. 프로테아좀 억제제는 세포 프로테아좀 활성을 억제하는 그의 능력에 의해 세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유도한다. 더욱 구체적으로는, 진핵 세포에서, 유비퀴틴-프로테아좀 경로가 세포내 단백질의 단백질 분해에 있어서의 중추 경로이다. 폴리유비퀴틴 사슬의 부착에 의한 단백질 분해에 대하여 단백질이 초기에 표적화되며, 이어서 프로테아좀에 의해 작은 펩티드로 급속히 분해되며, 유비퀴틴이 방출되고 재순환된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 제조한 리포좀 제형을 생쥐에 생체내 투여하였다. 실시예 7에 기재된 바와 같이, 22:0PC/mPEG-DSPE (95/5)으로 이루어지고, 포획된 보르테조밉을 함유하는 리포좀을 제조하고 종양을 가진 생쥐에 정맥내 투여하였다. 생쥐의 대조군은 벨카데(VELCADE) (등록상표) - 이는 만니톨 중 보르테조밉의 혼합물임 - 라는 상표명으로 판매되는 보르테조밉으로 처리하였다. 도 11a 내지 도 11c는 유리 형태의 약물 (마름모) 또는 리포좀 내에 포획된 약물 (사각형)에 대한 혈장 내 (도 11a), 혈액 내 (도 11b) 및 종양 내 (도 11c)의 보르테조밉의 농도 (ng/㎖)를 도시한다. 혈장 내, 혈액 내 및 종양 내 보르테조밉의 농도는, 유리 약물로서 투여될 때보다 리포좀 내에 포획된 형태로 투여될 때, 모든 시점에서 더 높았다. 본 연구는 리포좀 제형에 의해 제공된 종양 내의 향상된 약물 축적을 보여준다.
약동학적 파라미터가 표 1에 요약되어 있다.
Figure pct00003
리포좀-포획된 보르테조밉에 있어서 곡선 아래 혈장 영역(area-under-the curve)은 약물의 유리 형태의 AUC보다 132배 더 컸으며; 리포좀-포획된 보르테조밉에 있어서의 혈장 반감기는 약물의 유리 형태에 있어서의 혈장 반감기보다 8배 더 높았으며; 리포좀-포획된 보르테조밉에 있어서의 전혈 Cmax 및 AUC는 약물의 유리 형태에 있어서의 Cmax 및 AUC보다 각각 6.2배 및 10배 더 높았으며; 리포좀-포획된 보르테조밉에 있어서의 종양에서의 Cmax 및 AUC는 약물의 유리 형태에 있어서의 Cmax 및 AUC보다 각각 1.5배 및 1.9배 더 높았다.
다른 연구에서는, 리포좀-포획된 보르테조밉을 생쥐에 투여하고, 약동학적 파라미터를 결정하였다. 리포좀은 22:0PC/mPEG-DSPE로 구성되었으며, 실시예 7에 기재된 바와 같이 제조하였다. 리포좀-포획된 보르테조밉(채워진 원) 및 유리 보르테조밉(빈 원)의 혈장중의 약동학적 프로파일이 도 12에 도시되어 있으며, 약동학적 파라미터가 표 2에 요약되어 있다.
Figure pct00004
따라서, 일 실시 형태에서, 펩티드 보론산 화합물을 포함하는 리포좀 제형이 암의 치료, 그리고 더욱 특별하게는 암 환자에서의 종양의 치료에 사용된다.
다발성 골수종은 미국에서 매년 약 15,000명의 사람에서 진단되는 불치성 악성 종양이다 (문헌[Richardson, P.G. et al., Cancer Control. 10(5):361 (2003)]). 이것은 전형적으로 골수 내 다수의 부위에서의 클론성 혈장 세포의 축적을 특징으로 하는 혈액학적 악성 종양이다. 대다수의 환자는 화학요법 및 방사선을 이용한 초기 치료에 응답하지만, 대부분은 결국에는 내성 종양 세포의 증식으로 인해 재발된다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 보로네이트 에스테르 형태로 포획된 펩티드 보론산 화합물을 포함하는 리포좀 제형을 투여함에 의해 다발성 골수종을 치료하는 방법을 제공한다.
리포좀 제형은 또한 암 세포가 화학요법의 작용에 저항하는 주 경로들의 일부를 극복하는 데 도움을 줌으로써 유방암 치료에 효과적이다. 예를 들어, 아폽토시스의 조절자인 NF-kB를 통한 시그널링 및 p44/42 미토겐-활성화 단백질 키나아제 경로가 항-아폽토시스 경로가 될 수 있다. 프로테아좀 억제제는 이들 경로를 차단하기 때문에, 당해 화합물들은 아폽토시스를 활성화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 펩티드 보론산 화합물을 포함하는 리포좀을 투여함에 의해, 유방암을 갖는 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 더욱이, 탁산 및 안트라사이클린과 같은 화학요법제는 이들 경로 중 하나 또는 둘 모두를 활성화시키는 것으로 밝혀져 있으므로, 프로테아좀 억제제를 통상적인 화학요법제와 조합하여 사용하는 것은 약물, 예를 들면 파클리탁셀 및 독소루비신의 항종양 활성을 향상시키는 작용을 한다. 따라서, 다른 실시 형태에서, 본 발명은 유리 형태 또는 리포좀-포획된 형태의 화학요법제를 리포좀-포획된 펩티드 보론산 화합물과 조합하여 투여하는 치료 방법을 제공한다.
리포좀 제형의 용량 및 투약 계획은 치료 중인 암, 암의 단계, 환자의 사이즈 및 건강, 그리고 담당의에게 자명한 기타 요인에 좌우될 것이다. 또한, 프로테아좀 억제제 보르테조밉, Pyz-Phe-boroLeu (PS-341)를 이용한 임상 연구는 적합한 투여량 및 투약 계획에 대한 충분한 지침을 제공한다. 예를 들어, 매주 1회 또는 2회 정맥내 투여할 경우, 고형 종양을 가진 환자에서의 최대 허용 용량이 1.3 ㎎/㎡이었다 (문헌[Orlowski, R.Z. et al., Breast Cancer Res. 5:1-7 (2003)]). 다른 연구에서는, 3주 주기의 1, 4, 8, 및 11일에 정맥내 볼루스로서 주어지는 보르테조밉은 1.56 ㎎/㎡의 최대 허용 용량을 제시하였다 (문헌[Vorhees, P.M. et al., Clinical Cancer Res. 9:6316 (2003)]).
리포좀 제형은 전형적으로 비경구 투여되며, 이때 정맥내 투여가 바람직하고, 바람직한 대안으로는 피하 투여가 있다. 당해 제형은 전달을 용이하게 하는 데 필요하거나 바람직한 임의의 약학적 부형제를 포함할 수 있음이 이해될 것이다.
상기에 기재된 치료 방법에서, 바람직한 프로테아좀 억제제는 하기 구조를 갖는 보르테조밉, Pyz-Phe-boroLeu (Pyz: 2, 5-피라진카르복실산; PS-341)이다:
Figure pct00005
보르테조밉은 유방암, 난소암, 전립선암, 폐암을 비롯한 다양한 암 조직에 대하여 그리고 췌장 종양, 림프종 및 골수종과 같은 다양한 종양에 대하여 활성을 갖는 것으로 밝혀져 있다. (문헌[Teicher, B.A. et al., Clin Cancer Res., 5(9):2638-45 (1999)]; 문헌[Adams, J., Semin. Oncol., 28(6):613-19 (2001)]; 문헌[Orlowski, R.Z.; Dees, E.C., Breast Cancer Res 5(1):1-7 (2002)]; 문헌[Frankel et al., Clin. Cancer Res. 6(9):3719-28 (2000)]; 및 문헌[Shah, S.A. et al., J Cell Biochem, 82(1):110-22 (2001)]).
IV. 실시예
하기 실시예는 본 명세서에 기재된 본 발명을 추가로 예시하며, 어떤 식으로든 제한하려는 것은 아니다.
실시예 1
복합체 형성 시약으로서 소르비톨을 이용한 리포좀 내로의 보르테조밉의 로딩
수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 콜레스테롤, 및 폴리에틸렌 글리콜-다이스테아로일포스파티딜에탄올아민(PEG-DSPE, PEG 분자량 2,000 Da, 미국 앨라배마주 버밍햄 소재의 아반티 폴라 리피즈)의 50:45:5의 몰비의 혼합물을 에탄올에 용해시켰다. 이어서, 400 mM 소르비톨과 100 mM 트리스(Tris) 완충액 (pH 8.5)의 수화 완충액을 사용하여 이 지질을 수화하였다. 최종 수화된 지질 현탁물은 10% (w/v) 에탄올을 함유하였다. 지질 분산물을 가압 하에서 기공 크기 0.2 ㎛의 2개의 적층된 뉴클레오포어 (Nucleopore) (미국 캘리포니아주 플리샌튼 소재) 막들을 통해 압출하였다.
외부 완충액을 pH 7.0의 150 mM NaCl/100 mM 소듐 하이드록시에틸피페라진-에탄 설포네이트(HEPES)의 완충액으로 투석에 의해 교환하였다.
분말형 보르테조밉을 3.4 ㎎/㎖의 농도까지 리포좀 현탁물에 첨가하고, 이 혼합물을 10분 내지 7시간 범위의 다양한 시간 동안 진탕시키면서 65℃에서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 시간 후, 리포좀을 검사하여, 세파로스(Sepharose) CL-4B (미국 뉴욕주 피스카타웨이 소재의 파마시아(Pharmacia)) 상에서 젤 크로마토그래피에 의해, 포획된 보르테조밉의 정도를 결정하였다. 검출가능한 양의 약물은 리포좀 내에 포획되지 않았다.
실시예 2
복합체 형성 시약으로서 글루셉테이트를 이용한 리포좀 내로의 보르테조밉의 로딩
수화 완충액이 300 mM 글루셉테이트와 200 mM 트리스 (pH 8.5)로 이루어진 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 바와 같이 리포좀을 제조하였다.
보르테조밉을 2.5 ㎎/㎖ 보르테조밉/20 mM 지질의 비로 리포좀 현탁물에 첨가하고, 이 혼합물을 30분 내지 2시간 범위의 다양한 시간 동안 진탕시키면서 65℃에서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 시간 후, 리포좀을 분석하여 포획된 보르테조밉의 정도를 결정하였다. 약 0.15 ㎎/㎖의 약물이 리포좀 내로 로딩되었으며, 캡슐화 효율은 약 7%였다.
실시예 3
복합체 형성 시약으로서 메글루민을 이용한 리포좀 내로의 보르테조밉의 로딩
수화 완충액이 300 mM 메글루민과 100 mM 트리스 (pH 8.5)로 이루어진 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 바와 같이 리포좀을 제조하였다.
보르테조밉을 2.5 ㎎/㎖ 보르테조밉/20 mM 지질의 비로 리포좀 현탁물에 첨가하고, 이 혼합물을 30분, 60분, 및 120분 (65℃에서)의 다양한 시간 동안 또는 실온에서 3일 동안 진탕시키면서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 리포좀을 검사하여 포획된 보르테조밉의 정도를 결정하였다. 결과가 도 4a 및 도 4b에 도시되어 있다. 인큐베이션이 65℃에서 수행되었을 때 약물 로딩은 검출되지 않았다 (도 4a). 약물과 함께 실온에서 인큐베이션된 리포좀은 포획된 약물이 약 0.3 ㎎/㎖이었으며, 캡슐화 효율은 약 16%였다 (도 4b).
실시예 4
메글루민과 아세트산을 함유하는 리포좀 내로의 보르테조밉의 로딩
수화 완충액이 300 mM 메글루민과 300 mM 아세트산 (pH 7)으로 이루어진 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 바와 같이 리포좀을 제조하였다. 분말형 보르테조밉을 약 100 mM 지질 (압출시의 지질 농도이며 약물 로딩에 앞서 측정되지 않음) 중의 1.88 ㎎/㎖ 보르테조밉의 최종 농도로 리포좀 현탁물에 첨가하고, 이 혼합물을 하룻밤 동안 (약 16시간) 부드럽게 진탕시키면서 실온 (22 내지 25℃)에서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 리포좀을 검사하여 포획된 보르테조밉의 정도를 결정하였다. 결과가 도 5에 도시되어 있으며, 여기서 약 95%의 캡슐화 효율이 달성되었다.
실시예 5
보르테조밉을 함유하는 리포좀의 약동학적 특성화
하기 표에 설명된 약물/지질 몰비를 제공하도록 성분 농도를 조정한 것을 제외하고는, 실시예 4에 기재된 바와 같이 3가지의 리포좀 제형을 제조하였다.
Figure pct00006
생쥐 (n=9)의 세 군을 리포좀 제형 번호 1, 2 또는 3을 사용하여 정맥내 주사로 처리하였다. 주사 후 5분, 3시간, 및 24시간에 각각의 군 내의 세 마리의 생쥐로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 보르테조밉의 농도에 대하여 혈액을 분석하였다. 결과가 도 6에 도시되어 있다.
실시예 6
다양한 지질 조성을 갖는 리포좀의 특성화
A. 난 스핑고마이엘린 리포좀 제형
난 스핑고마이엘린과 콜레스테롤 (55:45), 난 스핑고마이엘린/콜레스테롤/mPEG-DSPE (50:45:5) 또는 난 스핑고마이엘린 단독의 액체 혼합물을 300 mM 메글루민과 300 mM 아세트산 (pH 7.0)의 수화 완충액으로 수화한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 바와 같이 리포좀을 제조하였다. 수화 후 지질 농도는 약 100 mM이었다.
각각의 리포좀 현탁물의 외부 완충액을 pH 7.0의 150 mM NaCl/100 mM HEPES의 투석 완충액으로 교환하였다.
분말형 보르테조밉을 1 ㎎/㎖의 보르테조밉 농도로 각각의 리포좀 현탁물에 첨가하였다. 하룻밤 (10 내지 12시간) 진탕시키면서 20 내지 25℃에서 인큐베이션에 의해 약물 로딩을 수행하였다.
인큐베이션 후, 리포좀을 검사하여 포획된 보르테조밉의 정도를 결정하였다. 3가지의 모든 제형에 대하여 적어도 99%의 캡슐화 효율을 달성하였다. 90°에서의 동적 광산란에 의해 측정된 리포좀 입자 크기는 179 ㎚ (난 스핑고마이엘린/콜레스테롤/mPEG-DSPE), 266 ㎚ (난 스핑고마이엘린/콜레스테롤) 및 139 ㎚ (난 스핑고마이엘린)였다. 각각의 제형의 약물 농도는 약 0.9 ㎎/㎖였다.
리포좀 조성물을 5/95 (v/v) 리포좀 현탁물/혈액 비로 쥐 전혈에 첨가하였다. 혈액 내 약물 농도는 5.5 ㎍/㎖였다. 혈액/리포좀 혼합물을 37℃에서 인큐베이션하고, 1시간, 3시간, 6시간, 및 24시간에 샘플을 채취하고 5,000 rpm에서 원심분리하고, LC-MS를 사용하여 보르테조밉 농도에 대하여 상청액을 분석하였다. 결과가 도 7에 도시되어 있다. 결과는 캡슐화된 보르테조밉이 전혈과 함께 인큐베이션될 때 즉시 리포좀 밖으로 누출되었음을 나타내었다.
B. 포스파티딜콜린 리포좀 제형
각각의 아실 사슬 내에 20, 22, 또는 24개의 탄소 원자를 갖는 포스파티딜콜린 지질을 사용하여 리포좀을 제조하였다. 하기 표는 이들 지질에 대한 다소 상세한 사항을 제공하며, 비교를 위해 C18 (HSPC) 지질을 포함한다.
Figure pct00007
하기의 지질 조성을 갖는 리포좀 제형을 제조하였다.
Figure pct00008
분말형 보르테조밉을 제형 번호 4 및 제형 번호 5에 첨가하고, pH 6.5의 100 mM HEPES와 50 mM NaCl 중의 가용화된 보르테조밉 용액을 제형 번호 6 내지 제형 번호 8의 로딩에 사용하였다. 이 혼합물을 진탕시키면서 20 내지 25℃에서 3일 동안 (제형 번호 4), 20 내지 25℃에서 3일 + 50℃에서 1시간 동안 (제형 번호 5), 45℃에서 30분 동안 (제형 번호 6), 50℃에서 30분 동안 (제형 번호 7 및 8) 인큐베이션하였다.
16.5 ㎕의 리포좀 제형 번호 2 (실시예 5) 및 20 ㎕의 리포좀 제형 번호 4 각각을 각각 30 ㎕ 또는 33.5 ㎕의 완충액 (100 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7)과 함께 950 ㎕의 쥐 전혈에 첨가하였다. 대조군으로서, 3.5 ㎎/㎖의 유리 보르테조밉을 45 ㎕의 상기 완충액과 함께 950 ㎕의 쥐 전혈에 첨가하였다. 샘플을 17℃ 또는 37℃에서 인큐베이션하고, 24시간에 걸쳐 다양한 시점에서 샘플을 채취하고, 5,000 rpm으로 원심분리하고, LC-MS를 사용하여 보르테조밉 농도에 대하여 상청액을 분석하였다. 결과가 도 8a 및 도 8b에 도시되어 있다.
제형 번호 4, 6, 7, 및 8을 생쥐에 정맥내 투여하였다. 주사 후 5분, 30분, 1시간, 2시간, 및 4시간에 혈액 샘플을 채취하였다. 보르테조밉의 농도에 대하여 혈장을 분석하였다. 결과가 도 9에 도시되어 있다.
별도의 연구에서, 제형 번호 4 및 5의 약동학적 특성을 정상 쥐 (0.1 ㎎/㎏의 정맥내 볼루스, n=3/군)에서 평가하였다. LC-MS 분석을 이용하여 혈장 약물 농도를 결정하였으며, 결과가 도 13에 제시되어 있다. 제1 시점은 제형 주사 후 5분 이내에 수집하였다. 이 결과는 20:0PC 및 22:0PC 둘 모두를 이용하여 제조된 리포좀 제형이 유사한 PK 프로파일을 가짐을 나타낸다. 이 결과는 20개의 탄소 아실 사슬을 사용하여 제조된 리포좀 제형이 22개의 탄소 아실 사슬을 사용하여 제조된 것보다 그의 감소된 약물 및 지질 분해의 관점에서 바람직하기 때문에 의미심장한 것이며, 또한 리포좀 제형에서의 20개의 탄소 아실 사슬 지질의 사용은 PK 프로파일에 악영향을 미치지 않는다. 따라서, 보다 낮은 처리 온도, 그리고 아실 사슬 내의 보다 적은 개수의 탄소를 사용하여 제조된 리포좀 제형이 규모 증대에 보다 용이하다.
다른 연구에서, 제형 4 및 5, 그리고 DSPE 대신에 PEG에 부착된 DS를 갖는 것 외에는 제형 4와 유사한 리포좀 보르테조밉의 항-종양 효능을 이종이식 CWR22 종양을 가진 SCID 생쥐에서 평가하였다. 약물 용량은 0.6 ㎎/㎏ (n=10)이었으며, 4가지의 용량에 대하여 매주 정맥내 투여하였다. 종양의 크기를 측정하였으며, 결과가 도 14에 도시되어 있다. 3가지의 모든 리포좀 제형 (제형 번호 4, 역삼각형; 제형 번호 5, 원; 22:0 PC/mPEG-DS를 함유하는 제형, 마름모)의 효능이 유리 보르테조밉 (벨카데, 삼각형)보다 상당히 더 우수하였다. 이들 3가지의 리포좀 제형 사이에 통계학적 차이는 없었다.
실시예 7
리포좀 -포획된 보르테조밉의 생체내 활성
C22:0PC와 mPEG-DSPE (95/5의 몰비)의 혼합물을 에탄올에 용해시켰다. 지질 용액을 중성의 400 mM 메글루민, 400 mM 아세트산의 수화 완충액과 함께 진탕시키면서 30분 동안 80 내지 85℃에서 수화하여 리포좀을 형성하였다. 지질 분산물을 가압 하에서 0.1 ㎛까지 기공 크기를 감소시킨 2개의 적층된 뉴클레오포어 (미국 캘리포니아주 플리샌튼 소재) 막들을 통해 압출하였다.
리포좀 현탁물의 외부 완충액을 pH 7.0의 150 mM NaCl/100 mM 소듐 하이드록시에틸피페라진-에탄 설포네이트(HEPES)의 완충액으로 투석에 의해 교환하였다.
100 mM HEPES와 50 mM NaCl (pH 6.5) 중 보르테조밉의 용액을 0.61 ㎎/㎖ 보르테조밉/50 mM 지질의 비로 리포좀 현탁물에 첨가하고, 이 혼합물을 30분 동안 진탕시키면서 45℃에서 인큐베이션하였다. 캡슐화 효율이 약 95%인 것으로 결정되었다. 살균 여과 후 최종 약물 효능은 0.498 ㎎/㎖이었으며, 인 분석에 의해 분석된 지질 농도는 52 mM이었다. 90°에서의 동적 광산란에 의해 측정된 약물 로딩 후 리포좀 입자 크기는 117 ㎚였다.
CWR22 종양을 가진 수컷 SCID 생쥐를 0.8 ㎎/㎏의 용량으로 정맥내 투여된 보르테조밉 또는 리포좀-포획된 보르테조밉에 의한 치료를 위한 2개의 시험 군으로 무작위로 분류하였다. 혈액 및 종양 샘플을 다양한 시점에서 채취하였다. 혈액 내, 혈장 내 및 종양 조직 내 보르테조밉 농도를 LC-MS에 의해 결정하였다. 결과가 도 11a 내지 도 11c에 도시되어 있다.
다수의 예시적인 태양 및 실시 형태가 상기에 논의되었지만, 당업자는 이들의 소정의 변형, 변경, 부가 및 하위-조합을 인식할 것이다. 그러므로, 하기에 첨부되는 특허청구범위 및 이후에 소개되는 청구항들을 이들의 진정한 사상 및 범주 내에 있는 모든 그러한 변형, 변경, 부가 및 하위-조합을 포함하는 것으로 해석하고자 한다.

Claims (21)

  1. 각각의 사슬 내에 20 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 2개의 아실 사슬을 갖는 인지질로 이루어진 리포좀과; 상기 리포좀 내에 포획된, 메글루민과의 복합체 형태인 보론산을 포함하는 리포좀 제형.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인지질은 비대칭 인지질 또는 대칭 인지질인 제형.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인지질은 상기 아실 사슬들 중 적어도 하나 내에 20개의 탄소 원자를 갖는 제형.
  4. 제1항에 있어서, 상기 인지질은 포화 인지질인 제형.
  5. 제1항에 있어서, 상기 인지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티드산, 및 포스파티딜이노시톨로부터 선택되는 제형.
  6. 제1항에 있어서, 상기 인지질은 1,2-아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DAPC)인 제형.
  7. 제1항에 있어서, 상기 인지질은 1,2-다이베헤노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DBPC)인 제형.
  8. 제1항에 있어서, 상기 리포좀은 친수성 중합체에 공유 결합에 의해 부착된 인지질을 추가로 포함하는 제형.
  9. 제8항에 있어서, 상기 친수성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜인 제형.
  10. 제8항에 있어서, 친수성 중합체에 공유 결합에 의해 부착된 상기 인지질은 다이스테아로일포스파티딜에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜인 제형.
  11. 제1항에 있어서, 상기 보론산 화합물은 펩티드 보론산 화합물인 제형.
  12. 제11항에 있어서, 상기 보론산 화합물은 보르테조밉(bortezomib)인 제형.
  13. 제1항에 있어서, 상기 리포좀은 포획된 아세트산을 추가로 포함하는 제형.
  14. 각각 20 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 2개의 아실 사슬을 갖는 인지질로 이루어지며, 내부에 포획된 메글루민을 갖는 리포좀을 제공하는 단계와;
    인지질의 상 전이 온도보다 낮은 온도에서 보론산 화합물의 존재 하에 리포좀을 인큐베이션하고, 이럼으로써 상기 인큐베이션이 리포좀 내로의 보론산 화합물의 흡수를 달성하기에 효과적이게 하는 단계를 포함하는, 포획된 보론산 화합물을 갖는 리포좀의 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 제공 단계는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티드산, 및 포스파티딜이노시톨로부터 선택되는 인지질로 이루어진 리포좀을 제공하는 것을 포함하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 제공 단계는 1,2-아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DAPC) 및 1,2-다이베헤노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DBPC)으로부터 선택되는 인지질로 이루어진 리포좀을 제공하는 것을 포함하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 인큐베이션 단계는 펩티드 보론산 화합물의 존재 하에서 인큐베이션하는 것을 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 펩티드 보론산 화합물은 보르테조밉인 방법.
  19. 제14항에 있어서, 상기 제공 단계는 친수성 중합체에 공유 결합에 의해 부착된 인지질을 추가로 포함하는 리포좀을 제공하는 것을 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 제공 단계는 인지질에 부착된 친수성 중합체 폴리에틸렌 글리콜을 갖는 리포좀을 제공하는 것을 포함하는 방법.
  21. 제14항에 있어서, 상기 인큐베이션 단계는 리포좀 내로 보론산 화합물의 90% 초과 흡수를 달성하기에 효과적인 방법.
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