CN110123830A - 用于抑制Eg5和VEGF基因的表达的脂质配制的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在液体颗粒制剂中含有双链核糖核酸(dsRNA)的组合物，利用该组合物抑制Eg5/KSP和VEGF的表达的方法，以及利用该组合物治疗由Eg5/KSP和VEGF表达介导的病理过程例如子宫内膜癌的方法。

Description

用于抑制Eg5和VEGF基因的表达的脂质配制的组合物和方法

本案是申请日为2011年11月9日、题为《用于抑制Eg5和VEGF 基因的表达的脂质配制的组合物和方法》的中国发明专利申请 201180064603.2的分案申请。

本申请要求于2010年11月9日提交的美国临时申请第61/411,761 号和于2011年6月3日提交的美国临时申请第61/493,197号的权益，其 每一个通过引用以其整体并入本文。

发明领域

本发明涉及施用含有双链核糖核酸(dsRNA)的脂质配制的组合物，以 抑制人类驱动蛋白家族成员11(Eg5/KSP)和血管内皮生长因子(VEGF)基 因的表达，和该组合物治疗由Eg5/KSP和VEGF表达介导的病理过程(例 如癌症，如子宫内膜癌)的用途。

发明背景

生物体内细胞群体的维持是由细胞分裂和细胞程序化死亡的细胞生 理过程支配的。在正常的细胞中，与每个过程的启动和完成相关的细胞事 件被高度调控。在增殖性疾病如癌症中，这些过程中的一个或全部都可能 被扰乱。例如，由于正调控的过度表达或者负调控的遗失，也许是通过突 变，癌细胞可能已经失去了其对细胞分裂周期的调控(检查点控制)。可选 地，癌细胞由于负调控因子的过度表达可能已经失去了经受程序性细胞死亡的能力。因此，有必要开发恢复癌症细胞检查点控制和程序性细胞死亡 过程的新的化疗药物。

治疗人类癌症的一个途径是靶向细胞周期进程必不可少的蛋白质。为 了使细胞周期从一个阶段进行到下一个，必须完成某些前提事件。在细胞 周期内有执行事件和阶段的正确的顺序的检查点。一个这样的检查点，是 发生在有丝分裂中期的纺锤体检查点。靶向在有丝分裂中具有必不可少的 功能的蛋白质的小分子可以起始纺锤体检查点而将细胞阻滞在有丝分裂 中。将细胞阻滞在有丝分裂中的小分子当中，那些在临床实验中显示抗肿瘤活性的也诱导细胞凋亡，与程序性细胞死亡相关的形态学变化。因此用 于治疗癌症的有效的化疗可能是引起检查点控制和程序性细胞死亡的。不 幸的是，很少有化合物可用于控制细胞内的这些过程。已知会导致有丝分 裂阻滞和细胞凋亡的大多数化合物起到微管蛋白结合剂的作用。这些化合 物改变微管的动态不稳定性和间接地改变有丝分裂纺锤体的功能/结构， 从而导致有丝分裂阻滞。因为这些化合物的大多数特异性靶向作为所有微 管的组成部分的微管蛋白，它们也可能会影响在其中微管有一定作用的许 多正常细胞过程中的一个或更多。因此，也需要更特异性地靶向与细胞增 殖有关的蛋白质的试剂。

人类驱动蛋白家族成员11，例如Eg5或KSP，是位于有丝分裂纺锤 体并已知是双极有丝分裂纺锤体的形成和/或功能所需要的的类驱动蛋白 的马达蛋白之一。有扰乱有丝分裂纺锤体的两极性的小分子的报道 (Mayer，T.U.等1999.Science 286(5441)971-4，通过引用并入本文)。更具 体地，小分子诱导异常的有丝分裂纺锤体的形成，其中从中央的一对中心 体产生微管的单星排列，有染色体依附在微管的末端。单星阵列后小分子 被称为“单星素(monastrol)”。这一单星阵列表现型先前已在Eg5马达蛋白 被免疫剔除的有丝分裂细胞中观察到。这种独特的单星阵列表型有利于将 单星素鉴定为潜在的Eg5抑制剂。事实上，单星素进一步显示了在体外 试验中抑制微管的Eg5马达驱动的自动力。Eg5抑制剂单星素对有关的驱 动蛋白马达或对负责细胞内高尔基体运动的马达没有明显的影响。显示单 星阵列表型的细胞通过Eg5免疫剔除或者Eg5的单星素抑制在细胞周期 的M阶段阻滞。然而，由于Eg5的免疫剔除或者抑制诱导的有丝分裂阻 滞是短暂的(Kapoor，T.M.，2000.J CellBiol 150(5)975-80)。单星阵列表 型和单星素诱导的有丝分裂中的细胞周期阻滞都是可逆的。细胞恢复到形 成正常的双极纺锤体，完成有丝分裂并且通过细胞周期和正常的细胞增 殖。这些数据表明，引起短暂的有丝分裂阻滞的Eg5抑制剂可能对治疗 癌细胞增殖无效。

血管内皮生长因子(VEGF)，又称为血管通透性因子(VPF)，是一种刺 激血管生成、上皮细胞增殖和内皮细胞存活的多功能的细胞因子。VEGF 可以由广泛种类的组织产生，并且其过度表达或异常的表达可导致多种疾 病，包括癌症和如年龄相关性黄斑变性的视网膜疾病及其它血管发生疾 病。

因此，有必要探索利用调节Eg5/KSP和VEGF二者表达的化合物， 来治疗人类疾病，例如，癌症。

近来，已经证明双链RNA分子(dsRNA)在以被称为RNA干扰(RNAi) 的高度保守的调控机制阻碍基因表达。WO 99/32619(Fire等)公开了利用 至少25个核苷酸长度的dsRNA抑制线虫(C.elegans)中基因的表达。在其 它的生物体，包括植物(见，例如，WO 99/53050，Waterhouse等；和WO 99/61631，Heifetz等)、果蝇属(Drosophila)(见，例如，Yang，D.,等，Curr. Biol.(2000)10：1191-1200)和哺乳动物(见WO 00/44895，Limmer；和DE 101 00586.5，Kreutzer等)中，也已经证明dsRNA降解靶RNA。现在这种自 然机制已经成为开发治疗由异常的或有缺陷的基因调控引起的疾病的新 药剂的焦点。

靶向VEGF的siRNA序列，包括AD-3133，被描述于US专利公布 第2006/0094032和2006/0223770号中

靶向Eg5/KSP的siRNA序列(包括AD-12115)被描述于US专利第 7,718,629号和US专利公布第2011/0015250号中。

包括AD-3133的靶向VEGF的siRNA的制剂和包括AD-12115的靶 向Eg5/KSP的siRNA的脂质制剂，包括包含DLinDMA的制剂，描述于 US专利公布第2010/0087508号)和国际公布WO 2009/111658中。

包括AD-3133的靶向VEGF的siRNA和包括AD-12115的靶向 Eg5/KSP的siRNA的脂质制剂也被描述US公布第2010/0267806号)和国 际公布第WO 2010/105209和WO 2011/034798号中。

为了所有的目的，这些申请的内容通过引用并入本文。特别地，为了 所有的目的，通过引用并入这些申请中公开的siRNA序列，例如，表1 和2。

发明概述

本发明人已发现与肝脏累及相关的癌症例如子宫内膜癌可通过施用 包括阳离子型脂质(例如DLinDMA)、中性脂质(例如DPPC)、PEG化脂质 (例如PEG2000-C-DMA)、胆固醇和核酸混合物(例如靶向Eg5/KSP的 siRNA和靶向VEGF的siRNA的组合)的脂质颗粒制剂被有效地治疗。 例如，脂质颗粒可以是ALN-VSP02。

因此，一方面，本发明涉及治疗有相应需要的受试者的子宫内膜癌的 方法，包括每2周一次地向该受试者施用至少约0.1mg/kg(优选至少0.7 mg/kg)的包含DLinDMA、DPPC、PEG2000-C-DMA、胆固醇、靶向Eg5/KSP 的siRNA和靶向VEGF的siRNA的组合物。(剂量量基于每kg体重的 siRNA总量。)例如，剂量可选自约0.1、0.2、0.3、0.4、0.7、1.0、1.25、 1.5、1.7、2.0、3.0和6.0mg/kg。在一个实施方案中，受试者之前未能对 至少一种癌症治疗作出应答。

在另外实施方案中，靶向Eg5/KSP的siRNA为AD12115且靶向VEGF 的siRNA为AD3133(例如，以1:1摩尔比)。

在一个实施方案中，约1.0mg/kg的组合物每两周施用一次。在一个 实施方案中，约1.25mg/kg的组合物每两周施用一次。在另一个实施方案 中，约0.7mg/kg的组合物每两周施用一次。

在一个实施方案中，通过静脉内(IV)输注施用组合物(例如，如，每两 周一次约15分钟)。在一个优选的实施方案中，进行15分钟至1小时(例 如，30、45或60分钟)的静脉内输注。

在另一个实施方案中，本发明涉及在有相应需要的受试者中施用靶向 Eg5/KSP的siRNA和靶向VEGF的siRNA的方法，包括每2周一次地通 过静脉内(IV)输注向该受试者施用至少0.1mg/g的包含DLinDMA、 DPPC、PEG2000-C-DMA、胆固醇、靶向Eg5/KSP的siRNA和靶向VEGF 的siRNA的组合物，其中该组合物具有与剂量成比例的最大浓度(C_max)和 曲线下面积(AUC)，如可在受试者血浆中测量。在一个实施方案中，该受 试者罹患可用靶向Eg5/KSP的siRNA和/或靶向VEGF的siRNA治疗的 病症。

在一个实施方案中，本发明涉及治疗有相应需要的受试者的子宫内膜 癌的方法，包括每2周一次地向该受试者施用约1.0mg/kg的剂量。在另 一个实施方案中，本发明涉及治疗有相应需要的受试者的子宫内膜癌的方 法，包括每2周一次地向该受试者施用约1.25mg/kg的剂量。在一个实施 方案中，受试者之前未能对至少一种癌症治疗作出应答。

在一个实施方案中，本发明涉及治疗有相应需要的受试者的癌症(例 如，子宫内膜癌)的方法，包括向该受试者施用包含靶向Eg5/KSP的siRNA 和靶向VEGF的siRNA的组合物(例如本文所述的那些，包括 ALN-VSP02)，其于1.0mg/kg剂量提供下面表18中所示的药代动力学 参数中的一个或多个的。在另一个实施方案中，本发明涉及治疗有相应需 要的受试者的癌症(例如，子宫内膜癌)的方法，包括向该受试者施用于1.25 mg/kg剂量提供表18中所示的药代动力学参数中的一个或多个的剂型。

在一个实施方案中，本发明涉及治疗有相应需要的受试者的癌症(例 如，子宫内膜癌)的方法，包括向该受试者施用于1.0mg/kg剂量的供表 19中所示的药代动力学参数中的一个或多个的剂型。在另一个实施方案 中，本发明涉及治疗有相应需要的受试者的癌症(例如，子宫内膜癌)的方 法，包括向该受试者施用于1.25mg/kg剂量提供表19中所示的药代动力 学参数中的一个或多个的剂型。

在另外实施方案中，向受试者第一次施用1mg/kg的组合物后KSP siRNA的AUC_0-最后在15393.10±6002.12ng*小时/mL的约80％至约125％ 内。在另外实施方案中，向受试者第二次施用1mg/kg的组合物后KSP siRNA的AUC_0-最后在9984.02±2517.30ng*小时/mL的约80％至约125％ 内。

在另外实施方案中，向受试者第一次施用1mg/kg的组合物后KSP siRNA的C_max在15314.98±5347.86ng/mL的约80％至约125％内。在另 外实施方案中，向受试者第二次施用1mg/kg的组合物后KSP siRNA的 C_max在12440.80±9615.15ng/mL的约80％至约125％内。

在另外实施方案中，向受试者第一次施用1mg/kg的组合物后VEGF siRNA的AUC_0-最后在16404.33±7280.14ng*小时/mL的约80％至约125％ 内。在另外实施方案中，向受试者第二次施用1mg/kg的组合物后VEGF siRNA的AUC_0-最后在9563.98±2173.22ng*小时/mL的约80％至约125％ 内。

在另外实施方案中，向受试者第一次施用1mg/kg的组合物后VEGF siRNA的C_max在15843.73±7014.77ng/mL的约80％至约125％内。在另 外实施方案中，向受试者第二次施用1mg/kg的组合物后VEGF siRNA的 C_max在12681.94±8811.54ng/mL的约80％至约125％。

在另外实施方案中，向受试者第一次施用1.25mg/kg的组合物后KSP siRNA的AUC_0-最后在33929.01±18334.75ng*小时/mL的约80％至约125％ 内。在另外实施方案中，向受试者第二次施用1.25mg/kg的组合物后KSP siRNA的AUC_0-最后在28833.57ng*小时/mL的约80％至约125％内。

在另外实施方案中，向受试者第一次施用1.25mg/kg的组合物后KSP siRNA的C_max在21937.49±7642.00ng/mL的约80％至约125％内。在另 外实施方案中，向受试者第二次施用1.25mg/kg的组合物后KSP siRNA 的C_max在17897.05ng/mL的约80％至约125％内。

在另外实施方案中，向受试者第一次施用1.25mg/kg的组合物后 VEGF siRNA的AUC_0-最后在33442.95±18558.98ng*小时/mL的约80％至 约125％内。在另外实施方案中，向受试者第二次施用1.25mg/kg的组合 物后VEGF siRNA的AUC_0-最后在31072.98ng*小时/mL的约80％至约125％ 内。

在另外实施方案中，向受试者第一次施用1.25mg/kg的组合物后 VEGF siRNA的C_max在21578.94±6798.07ng/mL的约80％至约125％内。 在另外实施方案中，向受试者第二次施用1.25mg/kg的组合物后VEGF siRNA的C_max在18230.74ng/mL的约80％至约125％内。

本发明人还已发现，共施用皮质类固醇和/或在IV施用期间使用较缓 慢的输注速率将减少在施用本文所述的组合物期间受试者的不良输注反 应的发生。

因此，在进一步的实施方案中，本文所述的方法进一步包括在施用该 组合物之前或与施用该组合物的同时向受试者施用皮质类固醇。在又进一 步的实施方案中，每次IV输注的持续时间为约15分钟至约1小时或约 30分钟至约1小时，或为约30分钟、45分钟、约60分钟。

又一个实施方案是用于治疗有相应需要的受试者的方法，其包括每2 周一次地通过静脉内(IV)输注向受试者施用一定剂量的包含DLinDMA、 DPPC、PEG2000-C-DMA、胆固醇、靶向Eg5/KSP的siRNA和靶向VEGF 的siRNA的组合物(例如包含ALN-VSP02的组合物)。又一个实施方案是 用于治疗有相应需要的受试者的方法，其包括向该受试者施用包含DLinDMA、DPPC、PEG2000-C-DMA、胆固醇、靶向Eg5/KSP的siRNA 和靶向VEGF的siRNA的组合物(例如包含ALN-VSP02的组合物)，其中 所述组合物通过以选自至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.7、1.0、1.25、1.5、1.7、 2.0、3.0和6.0mg/kg的剂量静脉内输注来施用。在一个优选的实施方案 中，剂量为约1.0mg/kg。在另一个实施方案中，剂量为约1.25mg/kg。 在又一个实施方案中，剂量为约1.5mg/kg。受试者可罹患癌症，例如具 有肝脏累及的晚期癌症。

本发明的另一个实施方案是用于治疗有相应需要的受试者的方法，其 包括每2周一次地通过静脉内(IV)输注向该受试者施用一定剂量的包含ALN-VSP02的组合物。

又一个实施方案是用于治疗有相应需要的受试者的方法，其包括通过 以选自约0.1、0.2、0.3、0.4、0.7、1.0、1.25、1.5、1.7、2.0、3.0和6.0mg/kg 的剂量静脉内输注ALN-VSP02来施用。在一个优选的实施方案中，剂量 为约1.0mg/kg。在另一个实施方案中，剂量为约1.25mg/kg。在又一个 实施方案中，剂量为约1.5mg/kg。

在一个实施方案中，本发明涉及治疗有相应需要的受试者的癌症的方 法，包括每2周一次地向该受试者施用约1.0mg/kg的剂量。在另一个实 施方案中，本发明涉及治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，包括每2 周一次地向该受试者施用约1.25mg/kg的剂量。

在上述指定剂量下，所施用的剂型可提供KSP和VEGF siRNA的C_max和AUC_0-最后值。

附图简述

图1是显示在Hep3B小鼠模型中施用SNALP-siRNA后以体重百分 比计的肝脏重量的图。

图2A-2D是显示在Hep3B小鼠模型中SNALP-siRNA对体重的影响 的图。

图3是显示在Hep3B小鼠模型中SNALP-siRNA对体重的影响的图。

图4是显示未处理对照动物的体重的图。

图5是显示在Hep3B小鼠模型中对照的荧光素酶-SNALP siRNA对 体重的影响的图。

图6是显示在Hep3B小鼠模型中VSP-SNALP siRNA对体重的影响 的图。

图7A是显示在Hep3B小鼠模型中SNALP-siRNA对于对小鼠GAPDH水平标准化的人GAPDH水平的影响的图。

图7B是显示在Hep3B小鼠模型中通过血清ELISA测量的 SNALP-siRNA对血清AFP水平的影响的图。

图8是显示在Hep3B小鼠模型中SNALP-siRNA对于对小鼠GAPDH 水平标准化的人GAPDH水平的影响的图。

图9是显示在Hep3B小鼠模型中SNALP-siRNA对于对人GAPDH水 平标准化的人KSP水平的影响的图。

图10是显示在Hep3B小鼠模型中SNALP-siRNA对于对人GAPDH 水平标准化的人VEGF水平的影响的图。

图11A是显示在Hep3B小鼠模型中SNALP-siRNA对于对人GAPDH 水平标准化的小鼠VEGF水平的影响的图。

图11B是一组显示在Hep3B小鼠模型中SNALP-siRNA对人GAPDH 水平和血清AFP水平的效应的图。

图12A-12C是显示在Hep3B小鼠模型中SNALP-siRNA对肿瘤KSP、 VEGF和GAPDH水平的影响的图。

图13A和图13B是显示在具有肝脏肿瘤的小鼠中SNALP-siRNA对 存活率的影响的图。在肿瘤细胞接种后18天(图13A)和26天(图13B)开 始治疗。

图14是显示SNALP-siRNA对血清甲胎蛋白(AFP)水平的影响的图。

图15A和图15B是施用2mg/kg的SNALP-VSP(A)或2mg/kg的 SNALP-Luc(B)的荷瘤动物(Hep3B细胞植入后3周)的H&E染色切片的图 像。24小时后，对荷瘤的肝叶进行组织学分析。箭头表示单星体。

图16是表明ALN-VSPDS01的制备过程的流程图。

图17是ALN-VSP02的低温透射电子显微镜(低温-TEM)图像。

图18是表明ALN-VSP02的制备过程的流程图。

图19是表明施用SNALP配制的siRNA和索拉非尼对存活率的影响 的图。

图20是说明腹膜内HCC小鼠模型的ALN-VSP处理对肿瘤中有丝分 裂象(单星体(monoaster))形成的影响的图表。

图21是说明肝内植入HCT116(结肠直肠癌细胞)的小鼠的ALN-VSP 处理对肿瘤中hKSP mRNA水平的影响的图表。

图22是说明肝脏内植入HCT116(结肠直肠癌细胞)的小鼠的 ALN-VSP处理对肝脏(图22A)和淋巴结(图22B)中有丝分裂象(例如，单星 体)形成的影响的图表。

图23是说明负荷原位Hep3B肿瘤的小鼠的ALN-VSP处理对肿瘤出 血(图23左)和肿瘤微脉管密度(图23右)的影响的图表。

图24是说明负荷原位Hep3B肿瘤的小鼠的SNALP-VEGF单独处理 对肿瘤出血(图24左)和肿瘤微血管密度(图24右)的影响的图表。

图25是说明ALN-VSP处理肝内结肠直肠癌肿瘤的单星体形成小鼠 模型的效应的图表。显示肝脏(图25A)、肺(图25B)、淋巴结和皮下转移(图 25C)的结果。

发明详述

本发明提供了通过静脉内输注施用具有两个siRNA(一个靶向 Eg5/KSP基因和一个靶向VEGF基因)的脂质配制的组合物的治疗方法， 例如，治疗肝癌的方法。在一些实施方案中，该组合物是ALN-VSP02， 如本文所述。可以每两周一次地施用该组合物，例如每两周一次持续至少 8周。可以以至少0.4mg/kg或至少0.7mg/kg的剂量施用该组合物。所描 述的治疗方法在患者中耐受性良好。施用该组合物后，血浆中的siRNA 浓度的测量显示与剂量成比例的Cmax和AUC而没有药物累积的证据。

定义

为方便起见，下面提供用于说明书、实施例和所附的权利要求中的某 些术语和短语的含义。如果一个术语在本说明书的其他部分的用法与本节 提供的定义之间存在明显的差异，则以本节中的定义为准。

“G”、“C”、“A”和“U”一般各分别代表包含作为碱基的鸟嘌呤、胞嘧 啶、腺嘌呤和尿嘧啶的核苷酸。“T”和“dT”在本文可以互换使用，并且是 指其中核苷碱基是胸腺嘧啶的脱氧核糖核酸，如脱氧核糖胸腺嘧啶 (deoxyribothymine)。但是，可以理解的是术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也 可以指修饰的核苷酸(如下面进一步详述的)或代用的替换部分。熟练的技 术人员清楚地知道鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以被其他部分替换 而基本上不改变包含具有这样的替代部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配 对性质。例如，但非限制，包含肌苷(inosine)作为其碱基的核苷酸可以与 包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此，含有尿嘧啶、鸟 嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可能在本发明的核苷酸序列中被含有例如肌苷的 核苷酸替换。在另一个实例中，寡核苷酸中任何地方的腺嘌呤和胞嘧啶可以分别被鸟嘌呤和尿嘧啶替换，以与靶mRNA形成G-U摇摆碱基配对。 包含这样的替换部分的序列是本发明的实施方案。

如本文所用，“Eg5”指人驱动蛋白家族成员11，也称为KIF11、Eg5、 HKSP、KSP、KNSL1或TRIP5。Eg5序列可以作为NCBI GeneID：3832、 HGNC ID：HGNC：6388和RefSeq ID号：NM_004523而被找到。术语“Eg5” 和“KSP”和“Eg5/KSP”可以互换使用。

如本文所用，血管内皮生长因子(VEGF)，也被称为血管通透性因子， 是一种血管生成生长因子。VEGF是一种同型二聚的45kDa的糖蛋白，其 至少以三种不同的同种型(isoform)存在。VEGF同种型在内皮细胞中表达。 VEGF基因包含表达189氨基酸的蛋白质同种型的8个外显子。165个氨 基酸的同种型缺乏由外显子6编码的残基，而121个氨基酸的同种型缺乏 由外显子6和7编码的残基。VEGF145是预测包含145个氨基酸且缺乏 外显子7的同种型。VEGF可以通过结合内皮酪氨酸激酶受体(如 Flt-1(VEGFR-1)或KDR/flk-1(VEGFR-2))作用于内皮细胞。VEGFR-2在内 皮细胞中表达，并参与内皮细胞分化和血管生成。第三种受体，VEGFR-3， 参与淋巴生成(lymphogenesis)。

各种同种型具有不同的生物活性和临床意义。例如，VEGF145诱导 血管生成，且类似于VEGF189(但与VEGF165不同)，VEGF145通过不依 赖于细胞外基质相关的硫酸肝素的机制有效地结合细胞外基质。VEGF在 体外显示作为内皮细胞有丝分裂原和化学引诱物的活性，并在体内诱导血 管通透性和血管生成。VEGF由各种癌细胞类型分泌，并通过诱导肿瘤相 关的脉管系统的发生促进肿瘤的生长。VEGF功能的抑制已被证明限制原 发性实验肿瘤的生长以及免疫功能低下小鼠中转移的发生。

如本文所用，“靶序列”指在Eg5/KSP和/或VEGF基因转录过程中形 成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括作为初级转录产物的 RNA加工产物的mRNA。

如本文所用，术语“包含序列的链”指包含由使用标准的核苷酸命名法 指称的序列描述的核苷酸链的寡核苷酸。

如本文所用，除非另有说明，术语“互补的”用来描述与第二核苷酸序 列相关的第一核苷酸序列时，指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷 酸在一定条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形 成双链体结构的能力，如熟练的技术人员所理解的。这些条件可以是，例 如，严格条件，其中，严格条件可能包括：400mM NaCl、 40mMPIPES pH 6.4、1mM EDTA、50℃或70℃持续12-16小时，接着清 洗。可以应用其他条件，如可能在生物体内遇到的生理相关条件。熟练的 技术人员能够根据杂交核苷酸的最终应用确定最适合测试两个序列的互 补性的一组条件。

这包括含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与含第二核苷酸序 列的寡核苷酸或多核苷酸在第一和第二核苷酸序列的全长上碱基配对。本 文中这种序列可以称为彼此“完全互补”。然而，本文中当第一序列称作与 第二序列“基本互补”时，所述两个序列可以为完全互补，或它们可以在杂 交时形成一个或多个但通常不超过4、3或2个错配碱基对，而同时保留 在与它们的最终应用最相关条件下杂交的能力。然而，在两个寡核苷酸设 计成在杂交时形成一个或多个单链突出端的情况中，在确定互补性时这种 突出端不应该被认作是错配。例如，根据本发明的目的，包含21个核苷 酸长度的一个寡核苷酸和23个核苷酸长度的另一个寡核苷酸的 dsRNA(其中所述较长的寡核苷酸包含与所述较短寡核苷酸完全互补的21 个核苷酸的序列)也可以称为“完全互补”。

如本文所使用的，“互补”序列也可以包括非Watson-Crick碱基对和/ 或由非天然核苷酸和修饰核苷酸形成的碱基对，或完全由非Watson-Crick 碱基对和/或由非天然核苷酸和修饰核苷酸形成的这些碱基对形成，只要 满足上述与它们的杂交能力有关的要求。这种非Watson-Crick碱基对包 括但不限于G:U Wobble或Hoogstein碱基配对。

如从它们的使用背景中所理解的，本文中术语“互补”、“完全互补”和 “基本互补”可以用于dsRNA的正义链与反义链之间或dsRNA的反义链与 靶序列之间的碱基匹配。

如本文所使用的，与信使RNA(mRNA)的“至少一部分基本互补”的多 核苷酸指与感兴趣的mRNA(如编码Eg5/KSP和/或VEGF的mRNA)的连 续部分(包括5’UTR、开放阅读框(ORF)或3′UTR)基本互补的多核苷酸。 例如，如果多核苷酸序列与编码Eg5的mRNA的非间断部分基本互补， 则该多核苷酸与Eg5mRNA的至少一部分互补。

如本文所使用的，术语“双链RNA”或“dsRNA”指具有包含两个反向 平行且如上所定义的基本互补的核酸链的双链体结构。形成双链体结构的 两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分，或者它们可以是单独的 RNA分子。当两条链为一个较大分子的部分且因此通过形成双链体结构 的一条链的3’末端和对应的另一条链的5’末端之间的不间断核苷酸链而 连接时，连接RNA链被称为“发夹环”。当两条链通过形成双链体结构的 一条链的3’末端和对应的另一条链的5’末端之间的不间断核苷酸链之外 的其他方式共价连接时，此连接结构称为“接头(linker)”。RNA链可以具 有相同或不同的核苷酸数目。碱基对的最大数目为dsRNA的最短链的核 苷酸数目减去双链体中存在的任何突出端。除了双链体结构外，dsRNA 可以包含一个或多个核苷酸突出端。一般来说，各条链的大多数核苷酸是 核糖核苷酸，但如本文详细描述的，各条链或两条链也可以包含至少一个 非核糖核苷酸，例如，脱氧核糖核酸和/或修饰的核苷酸。此外，如在本 说明书中所用的，“dsRNA”可能包括对核糖核苷酸的化学修饰，包括多个 核苷酸的实质性的(substantial)修饰和包括本文所公开或本领域已知的所 有修饰类型。出于本说明书和权利要求的目的，“dsRNA”包括(如在siRNA 型分子中使用的)任何这样的修饰。

如本文所使用，“核苷酸突出端”指未配对的核苷酸或当dsRNA的一 条链的3’末端超出另一条链的5’末端或反之时从dsRNA的双链体结构突 出的核苷酸。“平端”(“Blunt”或“blunt end”)表示在dsRNA的该末端没有未 配对核苷酸，即没有核苷酸突出端。“平端的”(“blunt ended”)dsRNA是在 其整个长度上都是双链的dsRNA，即分子的任一端都没有核苷酸突出端。 在一些实施方案中，dsRNA可以在双链体的一端具有突出端和在另一端 具有平端。

术语“反义链”指包含与靶序列基本互补的区域的dsRNA的链。如本 文所使用的，术语“互补区域”指反义链上与本文所定义的序列(如靶序列) 基本互补的区域。当互补区域不与靶序列完全互补时，分子的内部或末端 区域中可以存在错配。一般最可容忍的错配通常在末端区域中，例如5’ 和/或3’末端的6、5、4、3或2个核苷酸内。

如本文所使用的，术语“正义链”指包含与反义链的区域基本互补的区 域的dsRNA链。

如本文所使用的，术语“SNALP”指稳定的核酸-脂质颗粒。SNALP表 示包被含核酸(如iRNA剂或iRNA剂由其转录的质粒)的低水性内部的脂 质囊泡。

当“引入细胞”是指dsRNA时，其如本领域的技术人员所理解的表示 有利于摄取或吸收进入细胞。dsRNA的吸收或摄取可以通过非协助的扩 散性或主动的细胞过程进行或通过辅助试剂或装置进行。该术语的含义并 不限于体外的细胞；dsRNA也可以被“引入细胞”，其中所述细胞是活的 生物体的一部分。在这种情况下，引入细胞包括向生物体的递送。例如， 对于体内递送而言，dsRNA可以被注射到组织位点或全身性地施用。体 外引入细胞包括本领域已知的方法，如电穿孔和脂质转染。

当术语“沉默”和“阻止表达”、“下调表达”、“抑制表达”等用于描述Eg5 和/或VEGF基因时，它们在本文中是指Eg5和/或VEGF基因表达的至少 部分抑制，如通过与同第一细胞或细胞群基本相同但没有进行处理的第二 细胞或细胞群(对照细胞)相比，可以从第一细胞或细胞群(其中Eg5和/ 或VEGF基因被转录且已进行处理以使得Eg5和/或VEGF基因的表达被 抑制)中分离的Eg5mRNA和/或VEGF mRNA量的减少所表明的。抑制程 度通常用以下式表示：

可选择地，抑制程度可以以与Eg5和/或VEGF基因的表达功能关联 的参数降低的方式给出，例如，细胞所产生的由Eg5和/或VEGF基因编 码的蛋白的量，或呈现某种表型(如细胞凋亡)的细胞的数目。理论上，靶 基因沉默可以或者组成性地或者通过基因工程并通过任何合适的测定法 在表达该靶的任何细胞中测定。然而，当需要参照以确定给定的dsRNA 是否抑制Eg5和/或VEGF基因的表达达到特定程度并由此是否包括在本 发明内时，以下实施例中提供的测定法将作为这种参照。

例如，在某些情况下，通过施用本发明的双链寡核苷酸，Eg5和/或 VEGF基因的表达被抑制至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、 40％、45％或50％。在一些实施方案中，通过施用本发明的双链寡核苷酸，Eg5和/或VEGF基因被抑制至少约60％、70％或80％。在其他实施方案 中，通过施用本发明的双链寡核苷酸，Eg5和/或VEGF基因被至少抑制 约85％、90％或95％。下面的实施例提供了利用各种不同浓度的各种Eg5 和/或VEGFdsRNA分子抑制表达的值。

如本文在Eg5和/或VEGF表达的上下文中所使用的，术语“治疗”、“处 理”等指由Eg5和/或VEGF表达介导的病理过程的减轻或缓和。在本发明 的背景中只要涉及本文以下所列举的其他任意状况(由Eg5和/或VEGF表 达介导的病理过程之外的病况)，术语“治疗”、“处理”等表示减轻或缓和 与这种病况相关的至少一种症状，或减缓或逆转这种病况的发展，如减缓 和逆转肝癌的发展。

如本文所使用的，短语“治疗有效量”指在由Eg5和/或VEGF表达介 导的病理过程或由Eg5和/或VEGF表达介导的病理过程的外显症状的治 疗或控制中产生治疗效益的量。治疗有效的特定量可以由普通医疗专业人 员很容易地确定，并且可以根据本领域已知的因素进行变化，如由Eg5 和/或VEGF表达介导的病理过程的类型、患者的病史和年龄、由Eg5和/ 或VEGF表达介导的病理过程的阶段和施用其他对抗由Eg5和/或VEGF 表达剂介导的病理过程的药剂。

如本文所使用的，“药物组合物”包含药学有效量的dsRNA和药学上 可接受的载体。如本文所使用的，“药学有效量”、“治疗有效量”或简称为 “有效量”指有效地产生期望的药理或治疗结果的RNA量。例如，如果当 与疾病或病症相关的可测量参数降低至少25％时给定的临床治疗被认为 是有效的，那么用于该疾病或病症治疗的药物的治疗有效量是实现该参数 至少25％的降低所需的量。

术语“药学上可接受的载体”指用于施用治疗剂的载体。如下文详细描 述的，这类载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇 及其组合。该术语特别地排除细胞培养基。对于口服给药的药物而言，药 学上可接受的载体包括但不限于药学上可接受的赋形剂，如惰性稀释剂、 崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、芳香剂、着色剂和防腐剂。合适的惰 性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙以及乳糖，而玉米淀粉和 藻酸是合适的崩解剂。粘合剂可以包括淀粉和明胶，而润滑剂(如果存在) 通常为硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。如果需要，片剂可以用如单硬脂酸甘油 酯或二硬脂酸甘油酯的物质进行包衣以延迟在胃肠道中的吸收。

如本文所使用的，“转化的细胞”是其中已经引入可以由其表达dsRNA 分子的载体的细胞。

术语“ALN-VSP02”是指SNALP配制的组合物，包含两种siRNA：靶 向Eg5/KSP的siRNA(AD12115)和靶向VEGF的siRNA(AD3133)。下面 在实施例9中给出了ALN-VSP02的详细说明。各个ALN-VSP02siRNA 的序列如下：

注：A、G、C、U-核糖核苷酸；c、u-2'-O-Me核糖核苷酸；s-硫逐磷 酸酯。

SNALP制剂如下：

用于此表中所述的比例的相应mol％如下：57.1/7.1/34.4/1.4(DLinDMA/DPPC/胆固醇/PEG2000-C-DMA)。

本文所使用的术语“静脉内(IV)输注”是指将组合物直接施用到患者 的静脉中的方法。静脉内输注允许将组合物直接施用到患者的血流中。这 可以通过例如经由皮下或皮内输注进行。可以通过许多方式进行静脉内输 注，包括通过使用注射针、或可能地利用输液泵。它能够以例如连续输注、 间歇输注、患者自控输注或日周期输注的形式提供。

本文所使用的术语“曲线下面积”或者“AUC”是指用药后血流中药物 的总体量。其根据施用药物后血浆药药浓度的积分计算。通过在施用一定 剂量组合物后直至血浆中组合物的量可以忽略的时间的多个时间点收集 血液样品来获得AUC。

术语“C_max”是指施用组合物后组合物的峰值血浆浓度。

应理解，任何特定药代动力学值(包括C_max和AUC_0-最后)的公开包括该 值的80％至125％的范围的公开。

本文所使用的术语“与剂量成比例的”描述与向患者施用的组合物的 量具有线性关系的量，即依赖于剂量的量的增加或减少幅度与剂量的增加 或减少幅度大致是相同的。例如，如果约2倍的剂量增加与约2倍的AUC 增加相关联，那么AUC是与剂量成比例的。

本文所使用的术语“血浆”是指微粒成分例如ALN-VSP02组合物悬浮 于其中的血液的流体部分。它可以通过血液的沉降或离心而获得。血浆约 占血液总量的50％，并含有葡萄糖、蛋白质、氨基酸和其它的营养物质； 尿素和其它排泄产物；以及激素、酶、维生素、矿物质等。

术语“血液血浆浓度”或“血浆浓度”是指受试者或者患者群体的血液 的血浆成分中的组合物(如ALN-VSP02或ALN-VSP02的dsRNA中的任 何一个)的浓度。应当理解，由于涉及新陈代谢和/或与其它治疗剂的可能 的相互作用的变异性，受试者之间的组合物(如ALN-VSP02)的血浆浓度 可能会有明显的不同。

双链核糖核酸(dsRNA)

如下文更详细描述的，本发明提供用于抑制细胞或哺乳动物中Eg5 和/或VEGF基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子和使用该dsRNA治疗 的方法。所述dsRNA包含具有与Eg5和/或VEGF基因表达中形成的 mRNA的至少一部分互补的互补区域的反义链，并且其中所述互补区域 长度小于30个核苷酸，通常为19-24个核苷酸长度，并且其中所述dsRNA 在与表达所述Eg5和/或VEGF基因的细胞接触时抑制所述Eg5和/或 VEGF基因的表达。

ALN-VSP02是脂质配制的组合物，其包括两种dsRNA，一个靶向 Eg5/KSP和一个靶向VEGF。该两种dsRNA的序列如下：

注：A、G、C、U-核糖核苷酸；c、u-2'-O-Me核糖核苷酸；s-硫逐磷 酸酯。

可以如下文进一步讨论的通过本领域已知的标准方法合成dsRNA， 例如，通过使用自动化的DNA合成仪，例如可从Biosearch， Applied Biosystems，Inc购买的仪器。另外的合成方法如下所述。

也可以预期另外的siRNA，例如，靶向Eg5和/或VEGF的dsRNA。 2005年3月11日提交的第11/078,073号美国专利申请(美国专利公布号 2006-0094032)和2006年01月25日提交的第12/754,110号美国部分继续 专利申请(美国专利申请公布号2006-0223770)中描述了靶向VEGF的 siRNA序列，包括AD-3133。2007年3月30日提交的第11/694,215号美 国专利申请(现在的美国专利号7,718,629)中描述了靶向Eg5/KSP的siRNA序列，包括AD-12115。为了所有的目的，这些申请的内容通过引 用并入本文。特别是，为了所有的目的，在这些申请中公开的siRNA序 列，例如，表1和2，通过引用并入本文。

另外的dsRNA可以被设计并描述如下。

dsRNA包含两个充分互补以杂交形成双链体结构的链。dsRNA的一 条链(反义链)包含与源自在Eg5和/或VEGF基因的表达过程中形成的 mRNA序列的靶序列基本互补且通常完全互补的互补区域，另一条链(正 义链)包含与反义链互补的区域，以使在适当条件下结合时两条链杂交并 形成双链体结构。一般来说，双链体结构的长度为15至30个，更通常为18至25个，但更通常为19至24个，和最通常为19至21个碱基对。在 其他实施方案中，双链体结构的长度为25-30个碱基对。

在一个实施方案中，双链体的长度为19个碱基对。在另一个实施方 案中，双链体的长度为21个碱基对。当两个不同的siRNA组合使用时， 双链体长度可以相同或不同。例如，组合物可以包括具有19个碱基对的 双链体长度的靶向Eg5的第一dsRNA和具有21个碱基对的双链体长度 的靶向VEGF的第二dsRNA。

类似地，与靶序列互补的区域的长度为15至30个，更通常为18至 25个，但更通常为19至24个，最通常为19至21个核苷酸。在其他实 施方案中，互补区域长度为25-30个核苷酸。在一个实施方案中，互补区 域长度是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或24个核苷酸。

在一个实施方案中，互补区域的长度为19个核苷酸。在另一个实施 方案中，互补区域的长度为21个核苷酸。当两个不同的siRNA组合使用 时，互补区域的长度可以相同或不同。例如，组合物可以包括具有19个 核苷酸的互补区域的靶向Eg5的第一dsRNA和具有21个核苷酸的互补 区域的靶向VEGF的第二dsRNA。

本发明的dsRNA的各链长度一般是15至30个、或18至25个、或 18、19、20、21、22、23或24个核苷酸。在其他实施方案中，各链的长 度为25-30个碱基对。双链体的各链可以具有相同或不同的长度。当两个 不同的siRNA组合使用时，各个siRNA的各链的长度可以相同或不同。 例如，组合物可以包括具有21个核苷酸的正义链和21个核苷酸的反义链 的靶向Eg5的dsRNA和具有21个核苷酸的正义链和23个核苷酸的反义 链的靶向VEGF的第二dsRNA。

本发明的dsRNA可以包含一个或多个核苷酸的一个或多个单链突出 端。在一个实施方案中，dsRNA的至少一个末端具有1至4个，一般1 或2个核苷酸的单链核苷酸突出端。在另一实施方案中，dsRNA的反义 链在3′端和5′端各具有超出正义链的1-10个核苷酸的突出端。在进一步 的实施方案中，dsRNA的正义链在3′端和5′端各具有超出反义链的1-10 个核苷酸的突出端。

具有至少一个核苷酸突出端的dsRNA可具有意想不到的比它们的平 端对应物更优异的抑制性能。在一些实施方案中，仅一个核苷酸突出端的 存在就可增强dsRNA的干扰活性，而不影响它的整体稳定性。已经证明 仅具有一个突出端的dsRNA在体内以及在各种细胞、细胞培养基、血液 和血清中是特别稳定和有效的。通常，单链突出端位于反义链的3’末端或 者，可选择地，位于正义链的3’末端。dsRNA也可以有平端，通常位于 反义链的5’端。这种dsRNA可以具有提高的稳定性和抑制活性，因此允 许低剂量施用，即少于每天5mg/kg接受者体重。通常，dsRNA的反义链 在3’端具有核苷酸突出端，且5’端为平端。在另一个实施方案中，突出 端中的一个或多个核苷酸用核苷硫代磷酸酯(nucleosidethiophosphate)替 换。

如本文更详细地描述的，本发明的组合物包括靶向Eg5的第一dsRNA 和靶向VEGF的第二dsRNA。第一和第二dsRNA可以具有相同的突出端 构成，例如，各链上核苷酸突出端的数目，或者各个dsRNA可以具有不 同的构成。在一个实施方案中，靶向Eg5的第一dsRNA在各链的3′端包 括2个核苷酸的突出端，且靶向VEGF的第二dsRNA在反义链的3′端包 括2个核苷酸的突出端和在反义链的5′端(例如，正义链的3′端)包括平端。

熟练的技术人员清楚地知道，包含20至23个(但特别是21个)碱基 对的双链体结构的dsRNA已被认为在诱导RNA干扰方面特别有效 (Elbashir等人，EMBO 2001，20：6877-6888)。然而，其他人发现，更长 或更短的dsRNA也是有效的。可以合理地预期，包含在一个或两个末端 仅减去几个核苷酸的ALN-VSP02的一个序列的较短dsRNA相比于上述 dsRNA可以同样有效。因此，本发明考虑包含来自ALN-VSP02的一个序 列的至少15、16、17、18、19、20个或更多的连续核苷酸的部分序列， 并且其在本文所描述的测定中抑制Eg5和/或VEGF基因表达的能力与包 含全序列的dsRNA的抑制相差不超过5％、10％、15％、20％、25％或30％。 使用ALN-VSP02序列和提供的靶序列可以很容易地制备在ALN-VSP02 的靶序列中切割的另外的dsRNA。

此外，ALN-VSP02识别对于易受基于RNAi的切割的Eg5mRNA中 的位点和VEGF基因中的位点。因此，本发明还包括靶向于由ALN-VSP02 靶向的序列内的RNAi剂，例如，dsRNA。如本文所使用的，如果第二 RNAi剂在与第一RNAi剂的反义链互补的mRNA中的任何位置剪切该信 使，则说第二RNAi剂靶向于第一RNAi剂的序列内。这样的第二试剂通 常由从ALN-VSP02序列中的一个到取自Eg5/KSP和/或VEGF基因中邻 近于选择序列的区域的另外的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸组成。

本发明的dsRNA可以包含与靶序列的一个或多个错配。在优选的实 施方案中，本发明的dsRNA包含不超过3个错配。如果dsRNA的反义链 包含与靶序列的错配，优选错配的区域不是位于互补区域的中心。如果 dsRNA反义链包含与靶序列的错配，优选错配限于距任一末端的5个核 苷酸，例如，距离互补区域的5′或3′端的5、4、3、2或1个核苷酸。例 如，对于与Eg5基因的区域互补的23个核苷酸的dsRNA链，该dsRNA 通常在中间的13个核苷酸内不含有任何错配。本发明所述的方法可以用 来确定包含与靶序列的错配的dsRNA是否有效抑制Eg5/KSP和/或VEGF 基因的表达。考虑具有错配的dsRNA在抑制Eg5/KSP和/或VEGF基因的表达中的效果是重要的，特别是如果Eg5/KSP和/或VEGF基因中的特 定互补区域已知在群体中具有多态性序列变异。

修饰

ALN-VSP02序列包括化学修饰。在其它的实施方案中，本方法中所 使用的靶向Eg5/KSP和/或VEGF的dsRNA包括与ALN-VSP02相同的一 级序列，但或者没有修饰、ALN-VSP02序列修饰的子集和/或另外的修饰。 所述的方法中可以使用具有本文引用的专利申请中找到的序列的靶向 Eg5/KSP和/或VEGF的另外的dsRNA。这些dsRNA可以进行化学修饰。

在一些实施方案中，对dsRNA进一步进行化学修饰以增强稳定性。 本发明的核酸可以通过本领域已建立的方法合成和/或修饰， 如″Current protocols in nucleic acidchemistry″，Beaucage，S.L.等人(编辑)， John Wiley&Sons，Inc.，New York，NY，USA中所描述的那些方法， 该文献通过引用并入本文。本发明中有用的优选的dsRNA化合物的具体实例包括含有修饰的骨架或没有天然的核苷间连接的dsRNA。如本说明 书中所定义的，具有修饰骨架的dsRNA包括在骨架中保留磷原子的那些 dsRNA和在骨架中不具有磷原子的那些dsRNA。出于本说明书的目的并 且如有时在本领域中所指的，在核苷间骨架中不含磷原子的修饰dsRNA 也可以被认为是寡聚核苷(oligonucleoside)。

优选的修饰dsRNA骨架包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二 硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基磷酸酯(包 括3′-亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯)、亚膦酸酯(phosphinate)、氨基磷酸酯(包 括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯 (thionophosphoramidate)、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯，以及具 有正常的3’-5’键的硼烷磷酸酯(boranophosphate)、它们的2’-5’键的类似物 和那些具有相反极性的化合物(其中相邻的核苷单元对由3’-5’至5’-3’连接 或由2’-5’至5’-2’连接)。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。

教导制备以上含磷连接的代表性的美国专利包括但不限于美国专利 3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,195、5,188,897、5,264,423、 5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、 5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,316、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361和5,625,050，其各通过引用并入本文。

优选的其中不含磷原子的修饰dsRNA骨架具有由短链烷基或环烷基 核苷间连接、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接、或者一个或多个 短链杂原子或杂环核苷间连接形成的骨架。这些包括具有吗啉连接(部分 地由核苷的糖部分形成)的那些；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架， formacetyl和thioformacetyl骨架；亚甲基formacetyl和thioformacetyl骨 架；含链烯的骨架；氨基磺酸酯(sulfamate)骨架；亚甲基亚胺基和亚甲基 肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺(sulfonamide)骨架；酰胺骨架和其他具有混合 的N、O、S和CH2成分部件的骨架。

教导制备以上寡聚核苷的代表性的美国专利包括但不限于美国专利 5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,64,562、 5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、 5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、 5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439，其各通过引用并入本文。

在其他优选的dsRNA模拟物中，核苷酸单元的糖和核苷间连接(即骨 架)被新的基团替换。保持碱基单元以与适当的核酸靶化合物杂交。一种 这样的寡聚化合物(已经证明具有优异的杂交特性的dsRNA模拟物)称作 肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，dsRNA的糖骨架被含酰胺的骨架，尤 其氨基乙基甘氨酸骨架取代。核苷碱基被保留并直接或间接地结合骨架酰 胺部分的氮杂氮原子。教导制备PNA化合物的代表性的美国专利包括但 不限于美国专利第5,539,082、5,714,331和5,719,262号，其各通过引用并 入本文。PNA化合物的进一步教导可见于Nielsen等人，Science，1991， 254，1497-1500中。

本发明最优选的实施方案为具有硫代磷酸酯骨架的dsRNA和具有杂 原子骨架的寡聚核苷，尤其是上述引用的美国专利第5,489,677号的 --CH₂--NH--CH₂--、--CH₂--N(CH₃)--O--CH₂--[称为亚甲基(甲基亚胺基)或 MMI骨架]、--CH₂--O--N(CH₃)--CH₂--、--CH₂--N(CH₃)--N(CH₃)--CH₂--和 --N(CH₃)--CH₂--CH₂--[其中天然的磷酸二酯骨架表示为--O--P--O--CH₂--]， 以及上述引用的美国专利第,602,240号的酰胺骨架。还优选上述引用的美 国专利第5,034,506号的含有吗啉代骨架结构的dsRNA。

修饰的dSRNA还可以包含一个或多个取代的糖部分。优选的dsRNA 在2’位置包含下述基团之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-链 烯基；O-、S-或N-炔基；或者O-烷基-O-烷基，其中烷基、链烯基和炔基 可以是取代或未取代的C₁至C₁₀烷基或C₂至C₁₀链烯基和炔基。尤其优 选的是O[(CH₂)_nO]_mCH₃、O(CH₂)_nOCH₃、O(CH₂)_nNH₂、O(CH₂)_nCH₃、 O(CH₂)_nONH₂和O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃)]₂，其中n和m为1至约10。其 他优选的dsRNA在2’位置包含下述基团之一：C₁至C₁₀低级烷基、取代 的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH₃、OCN、 Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、 杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、多聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、 RNA切割基团、报道基团、嵌入基团(intercalator)、提高dsRNA的药代动 力学性质的基团或提高dsRNA药效学性质的基团、以及其他具有类似特 性的取代基。优选的修饰包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O--CH₂CH₂OCH₃，也称 作2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(Martin等人，Helv.Chim.Acta，1995， 78，486-504)，即烷氧基-烷氧基基团。进一步优选的修饰包括如本文以下 实例中描述的2′-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH₂)₂ON(CH₃)₂基团，也 称作2′-DMAOE，以及如本文以下实例中描述的2′-二甲基氨基乙氧基乙 氧基(在本领域中也称作2′-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2′-DMAEOE)，即 2′-O--CH₂--O--CH₂--N(CH₂)₂。

其他优选的修饰包括2′-甲氧基(2′-OCH₃)、2’-氨基丙氧基 (2′-OCH₂CH₂CH₂NH₂)和2’-氟(2′-F)。类似的修饰也可以在dsRNA的其他 位置完成，尤其是3’末端核苷酸上糖的3’位置或者在2′-5′连接的dsRNA 中，和5’末端核苷酸的5’位置。DsRNA还可以具有糖模拟物，如取代戊 呋喃糖(pentofuranosyl sugar)的环丁基部分。教导制备这种修饰的糖结构的代表性美国专利包括但不限于美国专利第4,981,957、5,118,800、 5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、 5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633和5,700,920号，其中某些是本申请共有 的，并且其各通过引用整体并入本文。

dsRNA也可以包括核苷碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或 取代。如本文所使用的，“未修饰的”或“天然的”核苷碱基包括嘌呤碱基腺 嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。 修饰的核苷碱基包括其他合成的和天然的核苷碱基如5’-甲基胞嘧啶 (5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤 和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他 烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和 胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶， 5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫烷基、 8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代、尤其是5-溴代、5-三氟 甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8- 氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟 嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其他核苷碱基包括公开于美国专利3,687,808中的 那些；在The Concise EncyclopediaOf Polymer Science And Engineering， 第858-859页，Kroschwitz，J.L编.John Wiley&Sons，1990中公开的那 些；由Englisch等人，Angewandte Chemie，InternationalEdition，1991， 30，613中公开的那些；以及由Sanghvi，Y S.，第15章， DsRNA Researchand Applications，第289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu， B.编，CRC Press，1993公开的那些。这些核苷碱基中的某些对提高本发 明的寡聚化合物的结合亲和性是特别有利的。它们包括5-取代的嘧啶、6- 氮杂嘧啶和N-2、N-6以及0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5- 丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经表明5-甲基胞嘧啶取代提高核酸 双链体的稳定性0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编， DsRNA Research andApplications，CRC Press，Boca Raton，1993，第 276-278页)，并且是目前优选的碱基取代，甚至更加特别地在与2′-O-甲 氧基乙基糖修饰组合时。

教导制备某些以上所提到的修饰核苷碱基以及其他修饰核苷碱基的 代表性的美国专利包括但不限于以上提到的美国专利第3,687,808，还有 美国专利No.4,845,205、5,130,30、5,134,066、5,175,273、5,367,066、 5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、 5,587,469、5,594,121，5,596,091、5,614,617和5,681,941号，其各通过引 用并入本文，以及美国专利No.5,750,692，其也通过引用并入本文。

偶联物

本发明的dsRNA的另一种修饰涉及化学性地连接到dsRNA上的一个 或多个部分或偶联物，其增强dsRNA的活性、细胞分布或细胞摄取。这 样的部分包括但不限于脂质部分，如胆固醇部分(Letsinger等人，Proc.Natl. Acid.Sci.USA，199，86，6553-6556)、胆酸(Manoharan等人，Biorg.Med. Chem.Let.，1994 4 1053-1060)、硫醚(如绿玉基(beryl)-S-三苯甲基硫 醇)(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660，306-309；Manoharan 等人，Biorg.Med.Chem.Let.，1993，3，2765-2770)、巯基胆固醇(Oberhauser 等人，Nucl.Acids Res.，1992，20，533-538)、脂族链(如十二烷二醇或十 一烷基残基)(Saison-Behmoaras等人，EMBO J，1991，10，1111-1118； Kabanov等人，FEBS Lett.，1990，259，327-330；Svinarchuk等人，Biochimie， 1993，75，49-54)、磷脂(如二-十六烷基-外消旋-甘油基或三乙基-铵1,2- 二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-磷酸)(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654；Shea等人，Nucl.Acids Res.， 1990，18，3777-3783)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人， Nucleosides&Nucleotides，1995，14，969-973)或金刚烷乙酸(Manoharan 等人，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654)、棕榈基部分(Mishra等人， Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229-237)、或十八烷基胺或己氨基-羰基羟胆固醇部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277， 923-937)。

教导制备这种dsRNA偶联物的代表性的美国专利包括但不限于美国 专利第4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、 5,552,538、5,578,717，5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、 5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、 4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5,112,963、5,214,136、 5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、 5,371,241、5,391,723、5,416,203、5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、 5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、 5,599,923、5,599,928和5,688,941号，其各通过引用并入本文。

没有必要对给定化合物中的所有位置进行一致地修饰，并且事实上前 述修饰中多于一种的修饰可以加入到单个化合物中或者甚至是dsRNA内 的单个核苷上。本发明还包括为嵌合复合物的dsRNA复合物。在本发明 的上下文中，“嵌合的”dsRNA化合物或“嵌合体”为含两个或多个化学上截 然不同的区域的dsRNA复合物，尤其是dsRNA，所述区域各由至少一个 单体单元(即在dsRNA复合物的情况中的核苷酸)构成。这些dsRNA通常 包含至少一个其中对所述dsRNA进行修饰以赋予dsRNA提高的核酸酶降 解抗性、提高的细胞摄取和/或提高的对靶核酸的结合亲和性的区域。 dSRNA的另外的区域可以用作能够剪切RNA:DNA或RNA:RNA杂合体 的酶的底物。例如，RNA酶H是剪切RNA:DNA双链体的RNA链的细 胞内切酶。因此RNA酶H的激活引起RNA靶的剪切，由此极大地增强 dsRNA抑制基因表达的效率。因此，与杂交至同一靶区域的硫代磷酸酯 脱氧dsRNA相比，当使用嵌合dsRNA时通常可以用较短的dsRNA获得 相当的结果。RNA靶的剪切可以通过凝胶电泳以及如果需要的话通过本 领域已知的相关核酸杂交技术常规地检测。

在某些情况下，dsRNA可以通过非配体基团进行修饰。许多非配体 分子已经被偶联至dsRNA以增强dsRNA的活性、细胞分布或细胞摄取， 并且进行这种偶联的过程可在科学文献中得到。这种非配体部分包括脂质 部分，如胆固醇(Letsinger等人，Proc.Natl.Acid.Sci.USA，1989，86：6553)、 胆酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.，1994，4：1053)、硫醚(如 己基-S-三苯甲基硫醇)(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660： 306；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3：2765)、巯基 胆固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.，1992，20，533)、脂族链(如 十二烷二醇或十一烷基残基)(Saison-Behmoaras等人，EMBO J，1991，10： 111；Kabanov等人，FEBS Lett.，1990，259：327；Svinarchuk等人，Biochimie， 1993，75：49)、磷脂(如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-铵1,2-二-O- 十六烷基-外消旋-甘油-3-H-磷酸)(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.， 1995，36：3651；Shea等人，Nucl.Acids Res.，1990，18：3777)、聚胺 或聚乙二醇链(Manoharan等人，Nucleosides&Nucleotides，1995，14：969) 或金刚烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，36：3651)、棕 榈基部分(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264：229)、或十 八烷基胺或己胺基-羰基羟胆固醇部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp. Ther.，1996，277：923)。教导制备这种dsRNA偶联物的代表性的美国专 利已经在上文列出。典型的偶联方案包括合成在序列的一个或多个位置带有氨基接头(aminolinker)的dsRNA。然后氨基基团利用合适的偶合或活化 试剂与将要被偶联的分子反应。偶联反应可以用仍然结合在固体载体上的 dsRNA进行或者在液相中剪切dsRNA后进行。用HPLC纯化dsRNA偶 联物通常提供纯的偶联物。

在某些情况下，配体可以是多功能的和/或dsRNA可以偶联至多于一 个配体。例如，dsRNA可以偶联到用于提高摄取的一个配体和用于提高 释放的第二配体。

含有dsRNA的药物组合物

在一个实施方案中，本发明提供了包含如本文所述的dsRNA和药学 上可接受的载体的药物组合物以及施用该药物组合物的方法。包含 dsRNA的药物组合物用于治疗与Eg5/KSP和/或VEGF基因的表达或活性 相关的疾病或病症，如由Eg5/KSP和/或VEGF表达介导的病理过程(如肝 癌)。这类药物组合物根据递送方式进行配制。

剂量

以足以抑制Eg5/KSP和/或VEGF基因的表达的剂量施用组合物，例 如，ALN-VSP02。除非另有说明，剂量是指总dsRNA的剂量。如果同时 施用多于一种dsRNA，剂量是指全部dsRNA的剂量。例如，ALN-VSP02 包括两种不同的dsRNA，ALN-VSP02的剂量是指两种dsRNA的总剂量。

一般地，dsRNA的适当剂量将在每天每千克受者体重0.01至200.0 毫克dsRNA的范围内，通常在每天每千克体重1至50毫克的范围内。在 一些实施方案中，合适的dsRNA剂量是在0.1至2.0mg/kg的范围内。

例如，可以以基于siRNA(以mg计)/kg体重的总重约0.1、约0.2、 约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.05、 约1.1、约1.15、约1.2、约1.25、约1.3、约1.35、约1.4、约1.45、约 1.5、约1.55、约1.6、约1.65、约1.7、约1.75、约1.8、约1.85、约1.9、约1.95或约2.0mg/kg的剂量施用dsRNA。

剂量可以是约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.7、约1.0、约1.25、 约1.5、约1.7、约2.0、约3.0或约6.0mg/kg。

剂量可以是约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.7、约1.25、约1.5、 约1.7或约6.0mg/kg。

剂量可以是约0.1、约0.2、约0.4、约0.7、约1.0、约1.25、约1.50 或约1.70mg/kg。

剂量可以是约0.1、约0.2、约0.4、约0.7、约1.0、约1.25或约1.50 mg/kg。

在一个实施方案中，剂量为约0.7、约1.0、约1.25或约1.5mg/kg。

在一个实施方案中，剂量至少是约0.4mg/kg。在另一个实施方案中， 剂量至少是约0.7mg/kg。在另一个实施方案中，剂量至少是约1.0mg/kg。

在优选的实施方案中，剂量为约1.0mg/kg。在另一个优选的实施方 案中，剂量为约1.25mg/kg。

在一些实施方案中，该方法包括每两周一次施用组合物，例如，ALN-VSP02。施用的疗程可以是2周、4周、6周、8周、10周、12周、 14周或更长。患者可以接受1-20、或1-10、或1-5剂。患者可以接受1、 2、3、4、5、6、7、8、9或10剂或更多剂。

在一个实施方案中，组合物每隔一周以单一剂量施用，持续四周，共 两剂。在另一个实施方案中，组合物每隔一周以单一剂量施用，持续八周， 共四剂。

熟练的技术人员可以理解某些因素可能影响有效治疗受试者所需要 的剂量和时机，所述因素包括但不限于疾病或病症的严重度、先前的治疗、 受试者的一般健康情况和/或年龄以及其他存在的疾病。另外，利用治疗 有效量的组合物对受试者进行治疗可以包括单一治疗或一系列的治疗。如 本文其他地方所阐述的，可以利用常规的方法或者在利用合适的动物模型 进行的体内检测的基础上评估本发明所涵盖的单独dsRNA的有效量和体 内半衰期。

施用

本发明的组合物可以根据是否需要局部或全身治疗以及根据要治疗 的区域以多种方式施用。施用可以是局部的、肺部的例如通过吸入或吹入 粉末或气溶胶，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和透皮、及皮下、 经口或肠道外例如皮下施用。

在一个实施方案中，组合物例如ALN-VSP02通过肠胃外方式全身施 用。肠胃外施用包括静脉内(IV)、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或 灌注；或颅内，如脑实质内(intraparenchymal)、鞘内或腔室内施用。例如， 可以向患者静脉内施用ALN-VSP02。

静脉内输注或注射可以进行约15分钟。可施用静脉内输注或注射约 30分钟。可施用静脉内输注或注射约60分钟。也可施用静脉内输注或注 射约1至约5分钟、约5至约10分钟、约10至约20分钟、约20至约 30分钟、或更长的时间。

在一个实施方案中，施用输注或注射约15至约30分钟的时间。在另 一个实施方案中，施用输注或注射约30至约60分钟的时间。

在某些情况下，通过静脉内输注施用siRNA治疗可引起急性不良反 应。因此，在本发明的一个实施方案中，如果观察到或预测到患者对siRNA 治疗已经有或将有急性不良反应，则延长静脉内输注的持续时间。在一个 方面，静脉内输注的持续时间被延长至超过15、30、45或60分钟。在另 一个方面，静脉内输注的持续时间被延长至超过1、2、3或4小时。在特定的实施方案中，在急性输注反应的情况中，静脉内输注的持续时间被延 长至最多3个小时。为此，可以将dsRNA分子配制成组合物，例如，无 菌和非无菌的水溶液、在一般溶剂(如醇类)中的非水溶液、或在液体或固 体油基质中的溶液。这类溶液还可以包含缓冲剂、稀释剂及其他合适的添 加剂。对于肠胃外、鞘内或腔室内施用，dsRNA分子可以配制成组合物如无菌水溶液，其还可以包含缓冲剂、稀释剂和其他适当的添加剂(例如， 渗透增强剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体)。本文中更详细地 描述了制剂。

可以以靶向特定的组织如肝脏(例如，肝脏的肝细胞)的方式来递送组 合物，例如，ALN-VSP02。

本领域的技术人员熟知，在某些情况下，siRNA治疗可以产生偏靶 (off-target)的全身性或急性炎性反应，导致可能的有害炎症、毒副作用和 不适。当在siRNA治疗前使用时，几种化合物能够减轻有害的炎性或疼 痛反应。

因此，在本发明的一些实施方案中，在组合物，例如，ALN-VSP02 的施用之前，施用至少一种能够减轻炎性反应的化合物。在一个实施方案 中，该化合物选自地塞米松、H1和H2阻滞剂及对乙酰氨基酚组成的组。

可以在施用siRNA治疗的同时、刚好在此之前或之前几分钟施用减 轻有害的偏靶效应的化合物。在一个实施方案中，在施用siRNA治疗前 超过约10、15、30、45或60分钟施用化合物以减轻有害的偏靶效应。

制剂

可以根据制药行业熟知的传统技术制备方便地以单位剂量形式存在 的本发明的药物制剂。这些技术包括使活性成分和药用载体或赋形剂结合 的步骤。在一般情况下，通过以下步骤制备制剂：使活性成分和液体载体 或细碎的固体载体或这两种均匀且密切地结合，且然后，如有必要，使产 品成形。

本发明的组合物可以配制成任意多种可能的剂型，例如但不限于片 剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软胶囊、栓剂和灌肠剂。本发明的组合 物还可以制成水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一 步包含提高悬浮液粘度的物质，包括但不限于羧甲基纤维素钠、山梨醇和 /或葡聚糖。悬浮液还可以包含稳定剂。

本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂和含脂质体的制剂。这 些组合物可以从多种成分生成，所述成分包括但不限于预制液体、自乳化 的固体和自乳化的半固体。本发明的一个方面是在治疗肝脏病症(如高脂 血症)时靶向肝脏的制剂。

此外，靶向EG5/KSP和/或VEGF基因的dsRNA可以配制成含有与 其他分子、分子结构或核酸混合物混合、包封、偶联或以其他方式结合的 dsRNA的组合物。例如，含有一种或多种靶向EG5/KSP和/或VEGF基因 的dsRNA剂的组合物可以包含其他治疗剂，例如其他癌症治疗剂或一种 或多种靶向非EG5/KSP和/或VEGF基因的dsRNA化合物。

口服、肠胃外、局部和生物制剂

用于口服施用的组合物和制剂包括粉末或颗粒、微米颗粒、纳米颗粒、 在水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、扁囊剂、片剂或 小片(minitablet)。可能需要增稠剂、芳香剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂 或粘合剂。在一些实施方案中，口服制剂是其中本发明描述的dsRNA与 一种或多种渗透增强剂、表面活性剂和螯合剂一起施用的制剂。合适的表 面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆酸和/或其盐。合适的胆酸/盐包括 鹅脱氧胆酸(CDCA)和熊脱氧胆酸(ursodeoxychenodeoxycholic acid， UDCA)、胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、甘胆酸(glucholic acid)、甘氨胆酸 (glycholic acid)、甘氨脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺-24,25- 二氢-梭链孢酸钠和甘氨二氢梭链孢酸钠(sodiumglycodihydrofusidate)。合 适的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉 豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油 单油酸酯(monoolein)、二月桂精、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚 -2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱、或甘油单酯、甘油二酯或其药学上可接 受的盐(如钠盐)。在一些实施方案中，可以使用渗透增强剂的组合，如脂 肪酸/盐与胆酸/盐的组合。一个示例性的组合是月桂酸、辛酸和UDCA的 钠盐。其他渗透增强剂包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-十六烷基 醚。本发明描述的dsRNA可以以包括喷射干燥的颗粒的颗粒形式经口递 送或复合以形成微米或纳米颗粒。dsRNA复合剂包括聚氨基酸，聚亚胺， 聚丙烯酸酯，聚烷基丙烯酸酯、聚氧乙烷(polyoxethane)、聚烷基氰基丙烯 酸酯，阳离子化的明胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀 粉，聚烷基氰基丙烯酸酯，DEAE衍生的聚亚胺、短梗霉多糖、纤维素和 淀粉。合适的复合剂包括壳聚糖、N-三甲基壳聚糖、聚-L-赖氨酸、聚组 氨酸、聚鸟氨酸、聚精胺、鱼精蛋白、聚乙烯基吡啶、聚硫代二乙基氨基 甲基乙烯P(TDAE)、聚氨基苯乙烯(如对-氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、 聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异丁基氰基丙烯酸酯)、 聚(异己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白和DEAE-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚 己基丙烯酸酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)、藻酸 盐和聚乙二醇(PEG)。dsRNA的口服制剂以及它们的制备在美国专利 6,887,906、美国专利公布20030027780和美国专利6,747,014中进行了详 细描述，其各通过引用并入本文。

用于肠胃外、脑实质内(进入大脑)、鞘内、腔室内或肝内施用的组合 物和剂型可以包括无菌水溶液，其还可能包含缓冲剂、稀释剂及其他合适 的添加剂(例如但不限于，渗透增强剂、载体化合物及其他药学上可接受 的载体或赋形剂)。

用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗液、 乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规的药物载体、水性 的、粉末或油性基质、增稠剂等也可能是必需的或期望的。合适的局部制 剂包括其中本发明描述的dsRNA与局部递送剂(如脂类、脂质体、脂肪酸、 脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂)混合的制剂。合适的脂类和脂 质体包括中性的(如二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱 (DMPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴离子型的(如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油 DMPG)和阳离子型的(如二油酰基四甲基氨基丙烷DOTAP和二油酰基磷 脂酰基乙醇胺DOTMA)。可以将本发明描述的dsRNA包封在脂质体内或 者可以与其形成复合物，尤其是与阳离子型脂质体形成复合物。可选择地， dsRNA可以与脂质复合，尤其是与阳离子型脂质复合。合适的脂肪酸和 酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆 蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单 油酸酯、二月桂精、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉 毒碱、酰基胆碱、或C_1-10烷基酯(如肉豆蔻酸异丙酯IPM)、甘油单酯、甘 油二酯或它们的药学上可接受的盐。局部制剂在美国专利6,747,014中进 行了详细描述，其通过引用整体并入本文。

此外，可以以例如美国专利第6,271,359号中所描述的生物或非生物 的方法向哺乳动物施用dsRNA分子。非生物递送可以通过包括但不限于 以下的多种方法实现：(1)用本发明提供的dsRNA核酸分子加载脂质体， 和(2)将dsRNA分子与脂质或脂质体复合，以形成核酸-脂质或核酸-脂质 体复合物。脂质体可以由通常用于体外转染细胞的阳离子性和中性脂质构 成。阳离子型脂质可以与带负电荷的核酸复合(例如，电结合)以形成脂质 体。阳离子型脂质体的实例包括但不限于：lipofectin、lipofectamine、 lipofectace和DOTAP。形成脂质体的方法是本领域公知的。例如，可以 从磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆 蔻酰磷脂酰甘油或二油酰磷脂酰乙醇胺形成脂质体组合物。可商购许多亲 脂性物质，包括Lipofectin^TM(Invitrogen/Life Technologies，Carlsbad，Calif.) 和Effectene^TM(Qiagen，Valencia，Calif.)。此外，可以使用可商购的阳离 子型脂质(如DDAB或DOTAP)优化全身性递送方法，阳离子型脂质可以 各与中性脂质(如DOPE或胆固醇)混合。在某些情况下，可以使用如 Templeton等人(Nature Biotechnology，15：647-652(1997))中描述的脂质 体。在其他实施方案中，可以使用聚阳离子(如聚乙烯亚胺)以实现体内和 离体递送(Boletta等人，J.Am Soc.Nephrol.7：1728(1996))。可以在美国 专利第6,271,359号、PCT公布WO 96/40964及Morrissey，D.等人2005. Nat Biotechnol.23(8)：1002-7中找到关于脂质体用于递送核酸的进一步的 信息。

可以通过包括但不限于使用病毒载体的各种方法实现生物递送。例 如，病毒载体(如腺病毒和疱疹病毒载体)可以用于向肝细胞递送dsRNA 分子。标准分子生物学技术可以用于将本发明提供的一种或多种dsRNA 引入以前开发的用于将核酸递送至细胞中的许多不同的病毒载体中的一 种。这些获得的病毒载体可以用来通过例如感染向细胞递送一种或多种 dsRNA。

脂质体制剂

在本发明中使用的组合物可以为脂质体制剂的形式。如本发明中所使 用的，术语“脂质体”是指由排列成球形的一个或多个双层的两性脂质组成 的囊泡。脂质体是具有由亲脂性物质形成的膜和水性内部的单层或多层的 囊泡。水性部分包含将要递送的组合物。阳离子型脂质体具有能够与细胞 壁融合的优势。非阳离子型脂质体虽然不能同样有效地与细胞壁融合，但 其在体内由巨噬细胞摄取。

为了跨越完整的哺乳动物皮肤，脂质囊泡必须在受合适的透皮梯度的 影响下穿过一系列的微细孔，其各具有小于50nm的直径。因此，理想的 是使用高度可变形并能够穿过这种微细孔的脂质体。

脂质体的其他优势包括：由天然磷脂获得的脂质体是生物相容的和生 物可降解的；脂质体可以掺入宽范围的水溶性和脂溶性的药物；且脂质体 能够防止包封在其内腔中的药物被代谢和降解(Rosoff， in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(主编)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第245页)。在脂质体制剂的制备中的重要考虑因素是脂质表面电荷、囊泡大小和脂质体的水性容 积。

脂质体可用于将活性成分转移和递送至作用位点。因为脂质体膜与生 物膜在结构上相似，因此当将脂质体应用于组织时，脂质体就会开始与细 胞膜融合并且随着脂质体和细胞的融合，脂质体的内容物就会注入活性物 质可以发挥作用的细胞中。

脂质体制剂作为多种药物的递送模式已经成为深入研究的焦点。越来 越多的证据表明对于局部施用，脂质体与其他剂型相比具有几种优势。这 些优势包括与所施用药物的高系统性吸收相关的副作用降低，所施用的药 物在预期靶标处的积累提高，和向皮肤内施用宽范围的亲水性和疏水性药 物的能力。

几篇报告已经详细叙述了脂质体向皮肤内递送物质(包括高分子量 DNA)的能力。已经将包括镇痛剂、抗体、激素和高分子量DNA的化合 物向皮肤施用。大多数应用会导致靶向上表皮。

脂质体分成两大类。阳离子型脂质体是带正电的脂质体，其与带负电 的DNA分子相互作用以形成稳定的复合物。带正电的DNA/脂质体复合 物结合带负电的细胞表面，并内化到内体中。由于内体中的酸性pH，脂 质体破裂，从而它们的内容物释放至细胞质中(Wang等人，Biochem. Biophys.Res.Commun.，1987，147，980-985)。

pH敏感的或带负电荷的脂质体捕获DNA，而不是与其复合。由于 DNA和脂质两者具有类似的带电性，它们发生排斥而不是形成复合物。 然而，一些DNA被捕获至这些脂质体的水性内部中。pH敏感性脂质体 已经用于向培养物中的细胞单层递送编码胸苷激酶基因的DNA。在靶细 胞中检测到外源基因的表达(Zhou等人，Journal of Controlled Release，1992，19，269-274)。

脂质体组合物的一个重要类型包括天然衍生的磷脂酰胆碱以外的磷 脂。例如，中性脂质体组合物可以由二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二 棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)形成。阴离子型脂质体组合物通常由二肉豆蔻 酰磷脂酰甘油形成，而阴离子融合脂质体主要由二油酰磷脂酰乙醇胺 (DOPE)形成。另一种类型的脂质体组合物由卵磷脂(PC)形成，如大豆PC 和蛋黄PC。另一类型由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。

几项研究评价了脂质体药物制剂向皮肤的局部递送。包含干扰素的脂 质体应用于豚鼠皮肤上导致皮肤疱疹溃疡减轻，而通过其他方式(例如， 作为溶液或乳剂)递送干扰素则是无效的(Weiner等人， Journal of Drug Targeting，1992，2，405-410)。另外，另一项研究测试了 作为脂质体制剂的一部分施用的干扰素相对于利用水性系统施用干扰素的效率，并得出结论：脂质体制剂优于水性施用方式(du Plessis等人， AntiviralResearch，1992，18，259-265)。

还检验了非离子脂质体系统，尤其是包含非离子型表面活性剂和胆固 醇的系统，以确定它们在药物向皮肤递送中的用途。使用包含 Novasome^TM I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)和 Novasome^TM II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子 脂质体制剂向小鼠皮肤的真皮内递送环孢菌素A。结果表明，这种非离子脂质体系统在促进环孢素A沉积到不同的皮肤层中方面是有效的(Hu等 人S.T.P.Pharma.Sci.，1994，4，6，466)。

脂质体还包括“空间稳定化的”脂质体，本文使用的该术语指包含一种 或多种特殊脂质的脂质体，当其掺入脂质体中时导致与没有这种特殊脂质 的脂质体相比具有提高的循环寿命。空间稳定化的脂质体的实例是其中脂 质体的形成囊泡的脂质部分的一部分(A)包含一种或多种糖脂(如单唾液 酸神经节苷脂G_M1)，或(B)由一种或多种亲水聚合物(如聚乙二醇(PEG)部 分)衍生的脂质体。不希望受任何特定理论的限制，在本领域中认为，至少对于包含神经节苷脂、鞘磷脂或PEG衍生的脂质的空间稳定化脂质体， 这些空间稳定化的脂质体的循环半衰期增加是由于减少网状内皮系统 (RES)的细胞中的摄取而产生的(Allen等人，FEBS Letters，1987，223， 42；Wu等人，Cancer Research，1993，53，3765)。

包含一种或多种糖脂的各种脂质体是本领域已知的。Papahadjopoulos 等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.，1987，507，64)报告了单唾液酸神经节苷脂 G_M1、硫酸半乳糖脑苷脂和磷脂酰肌醇提高脂质体的血液半衰期的能力。 Gabizon等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1988，85，6949)对这些发现进 行了详细说明。Allen等人的美国专利第4,837,028号和WO88/04924公开 了包含(1)鞘磷脂和(2)神经节苷脂G_M1或半乳糖脑苷脂硫酸酯的脂质体。 美国专利第5,543,152号(webb等人)公开了包含鞘磷脂的脂质体。 WO 97/13499(Lim等人)中公开了包含1,2-sn-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的脂 质体。

本领域内已知许多包含用一种或多种亲水聚合物衍生的脂质的脂质 体和它们的制备方法。Sunamoto等人(Bull.Chem.Soc.Jpn.，1980，53， 2778)描述了包含非离子型清洁剂2C_1215G的脂质体，其包含PEG部分。 Illum等人(FEBS Lett.，1984，167，79)注意到聚苯乙烯颗粒的聚二醇类的 亲水涂层会引起血液半衰期的显著增长。Sears(美国专利第4,426,330和 4,534,899号)描述了通过与聚亚烷基二醇(如PEG)的羧基基团结合而修饰 的合成磷脂。Klibanov等人(FEBS Lett.，1990，268，235)描述了表明包 含用PEG或PEG硬脂酸酯衍生的磷脂酰乙醇胺(PE)的脂质体血液循环半 衰期显著提高的试验。Blume等人(Biochimica et Biophysica Acta，1990， 1029，91)将这种发现扩展至其他PEG衍生的磷脂，如DSPE-PEG，其由 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和PEG的组合形成。在其外表面上具有共 价结合的PEG部分的脂质体在Fisher的欧洲专利EP 0 445 131 B1和 WO 90/04384中进行了阐述。Woodle等人(美国专利第5,013,556和 5,356,633号)和Martin等人(美国专利第5,213,804号和欧洲专利 EP 0 496 813 B1)描述了包含用PEG衍生的1-20摩尔百分比的PE的脂质 体组合物以及它们的使用方法。包含许多其他脂质-聚合物偶联物的脂质 体在WO91/05545和美国专利第5,225,212号(两者都属于Martin等人)和 WO 94/20073(Zalipsky等人)中进行了描述。在WO 96/10391(Choi等人) 中描述了包含PEG修饰的神经酰胺脂类的脂质体。美国专利第5,540,935 号(Miyazaki等人)和美国专利5,556,948(Tagawa等人)描述了包含PEG的 脂质体，其还可以在它们表面上进一步用功能部分衍生。

本领域已知许多的包含核酸的脂质体。Thierry等人的WO 96/40062 公开了将高分子量核酸包封到脂质体中的方法。Tagawa等人的美国专利 第5,264,221号公开了蛋白质结合的脂质体并声称这种脂质体的内容物可 以包括dsRNA。Rahman等人的美国专利第5,665,710号描述了将寡聚脱 氧核苷酸包封到脂质体中的特定方法。Love等人的WO97/04787公开了 包含靶向raf基因的dsRNA的脂质体。

传递体(transfersome)是再另一种类型的脂质体，且是高度变形的脂质 聚集体(它是药物递送媒介物的有吸引力的候选物)。传递体可以被描述成 脂滴，其可高度变形以至于它们能够轻易地穿透比该液滴小的小孔。传递 体可以适应它们所使用的环境，例如它们是自优化的(适应皮肤中小孔的 形状)、自修复的，通常不需要碎裂就能到达它们的靶标并且通常为自装 载的。为了制备传递体，有可能要向标准的脂质体组合物中加入表面边界活化剂，通常为表面活性剂。已经将传递体用于向皮肤递送血清白蛋白。 传递体介导的血清白蛋白的递送已经显示为与包含血清白蛋白的溶液的 皮下注射一样有效。

表面活性剂在制剂如乳剂(包括微乳剂)和脂质体中有广泛应用。对天 然的和合成的许多不同类型的表面活性剂的特性进行分类和分级的最常 见的方式是使用亲水/亲油平衡(HLB)。亲水基团(也称为“头部”)的性质提 供了为在制剂中使用的不同表面活性剂进行分类的最有用的方式(Rieger， 于Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.， 1988，第285页中)。

如果表面活性剂分子不是离子化的，则其归类为非离子型表面活性 剂。非离子型表面活性剂在药物和化妆品中有广泛的应用，并可以在宽范 围的pH值内使用。通常，根据它们的结构，它们的HLB值在2至约18 间变化。非离子型表面活性剂包括非离子型酯，如乙二醇酯、丙二醇酯、 甘油酯、聚甘油酯、山梨聚糖酯、蔗糖酯和乙氧基化酯。非离子型链烷醇酰胺和醚(如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段聚 合物)也包括在这一类中。聚氧乙烯表面活性剂是非离子型表面活性剂类 中最常用的成员。

如果表面活性剂分子在溶于水或分散在水中时带有负电荷，则表面活 性剂被归类为阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂包括羧酸酯(如皂 类)、酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺化合物、硫酸酯类(如烷基硫酸酯和 乙氧基化烷基硫酸酯)、磺酸酯(如烷基苯磺酸酯、酰基羟乙磺酸酯、酰基 牛磺酸酯和磺基琥珀酸酯以及磷酸酯。阴离子表面活性剂类的最重要的成 员为烷基硫酸酯和皂类。

如果表面活性剂分子在溶于水或分散在水中时带有正电荷，则表面活 性剂归类为阳离子型表面活性剂。阳离子型表面活性剂包括季铵盐和乙氧 基化胺。季铵盐是这个类别中最常使用的成员。

如果表面活性剂分子能够带有正电荷或者负电荷，则所述表面活性剂 归类为两性表面活性剂。两性表面活性剂包括丙烯酸衍生物、取代的烷基 酰胺化合物、N-烷基甜菜碱和磷脂。

已经综述了表面活性剂在药物产品、制剂中和乳剂中的应用(Rieger， 于Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.， 1988，第285页中)。

核酸脂质颗粒

在一个实施方案中，作为本发明特征的dsRNA被完全地包封在脂质 制剂中，例如，形成核酸-脂质颗粒。核酸-脂质颗粒通常包含阳离子型脂 质、非阳离子型脂质体、固醇和防止颗粒(例如，PEG-脂质偶联物)聚集的 脂质。核酸-脂质颗粒对全身性应用是非常有用的，因为它们在静脉内(i.v.) 注射后表现出延长的循环寿命并且在远端位点(例如，与施用位点物理分 离的位点)聚集。此外，当核酸存在于本发明的核酸-脂质颗粒中时，核酸 在水溶液中对核酸酶的降解有抗性。例如，美国专利在5,976,567、 5,981,501、6,534,484、6,586,410、6,815,432号和PCT公布WO 96/40964 公开了核酸-脂质颗粒及其制备方法。

核酸-脂质颗粒可以进一步包括一种或多种另外的脂质和/或其它成 分，如胆固醇。其它脂质可为多种目的而被包括在脂质体组成中，例如防 止脂质氧化或将配体连接到脂质体表面上。可能存在多种脂质的任何一 种，包括两性的、中性的、阳离子的和阴离子的脂质。这些脂质可单独地 或组合地使用。本文描述了可以存在的另外的脂质成分的具体实例。

核酸-脂质颗粒中可能存在的另外的成分包括：双层稳定成分例如聚 酰胺低聚物(见，例如，美国专利第6,320,017号)、肽、蛋白质、清洁剂、 脂质衍生物如与磷脂酰乙醇胺偶联的PEG和与神经酰胺偶联的PEG(见， 美国专利第5,885,613号)。

核酸-脂质颗粒可以包括一种或多种仲氨基脂质或阳离子型脂质、中 性脂质、固醇和经选择以减少形成过程中脂质颗粒的聚集的脂质，这可以 导致颗粒的空间稳定性(其防止形成过程中的电荷诱导的聚集)。

核酸-脂质颗粒包括，例如，SPLP、pSPLP和SNALP。术语“SNALP” 是指稳定的核酸脂质颗粒，包括SPLP。术语“SPLP”是指包含包封在脂质 囊泡内的质粒DNA的核酸-脂质颗粒。SPLP包括“pSPLP”，其包括如在 PCT公布WO 00/03683中给出的包封的缩合剂-核酸复合物。

本发明的核酸-脂质颗粒通常具有约50nm至约150nm的平均直径， 更通常约60nm至约130nm，更通常约70nm至约110nm，最通常约70nm 至约90nm，或约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或约 150nm的平均直径以使得该颗粒基本上是无毒的。

在一个实施方案中，脂质与药物的比(质量/质量比)(例如，脂质 -dsRNA比)在从约1：1至约50：1、从约1：1至约25：1、从约3：1至 约15：1、从约4：1至约10：1、从约5：1至约9：1或约6：1至约9： 1的范围内，或约6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1或33： 1。

阳离子型脂质

本发明的核酸-脂质颗粒通常包括阳离子型脂质。阳离子型脂质可能 是，例如，N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N- 二甲基溴化铵(DDAB)、N-(I-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化 铵(DOTAP)、N-(I-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、 N,N-二甲基-2,3-二油基氧基)丙胺(DODMA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲 基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二亚油基氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷 (DLin-C-DAP)、1,2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷 (DLin-DAC)、1,2-二亚油基氧基-3-吗啉丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基 -3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫基-3-二甲基氨基丙烷 (DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷 (DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐 (DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐 (DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪)丙烷(DLin-MPZ)或 3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二 醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷 (DLin-EG-DMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、 2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似 物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氢 -3aH-环戊并[d][1,3]二氧杂环环戊烯-5-胺(ALNY-100)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲氨基)丁酸酯(MC3)、 1,1′-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙 基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二基)二-十二烷-2-醇(C12-200)或它们的混合物。

除了上述具体地描述的那些外，在大致生理pH值下带净正电荷的其 它阳离子型脂质也可以被包含于本发明的脂质颗粒中。这种阳离子型脂质 包括但不限于，N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(“DODAC”)、N-(2,3-二油 基氧基)丙基-N,N,N-三乙基氯化铵(“DOTMA”)、N,N-双硬脂基-N,N-二甲 基溴化铵(“DDAB”)、N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵 (“DOTAP”)、1,2-二油基氧基-3-三甲基氨基丙烷盐酸盐(“DOTAP.Cl”)、 3β-(N-(N′,N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基)胆固醇(“DC-Chol”)、N-(1-(2,3- 二油基氧基)丙基)-N-2-(精胺甲酰胺基)乙基)-N,N-二甲基三氟醋酸铵 (“DOSPA”)、二-十八烷基酰胺甘氨酰基羧基精胺(“DOGS”)、1,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(“DOPE”)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(“DODAP”)、 N,N-二甲基-2,3-二油基氧基丙胺(“DODMA”)和N-(1,2-二肉蔻氧基丙-3- 基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(“DMRIE”)。此外，可以使用多种阳离子 型脂质的商业制剂，例如，LIPOFECTIN(包含DOTMA和DOPE，购自 GIBCO/BRL)和LIPOFECTAMINE(包含DOSPA和DOPE，购自 GIBCO/BRL)。在具体的实施方案中，阳离子型脂质是氨基脂质。

本文所使用的术语“氨基脂质”意在包括具有一个或两个脂肪酸或脂 族烷基链和氨基头基(包括烷基氨基或二烷基氨基基团)的那些脂质，其可 在生理pH下质子化以形成阳离子型脂质。

其它的氨基脂质包括具有可选择的脂肪酸基团和其它的二烷基氨基 基团的那些，包括其中的烷基取代基不同(例如，N-乙基-N-甲基氨基-、 N-丙基-N-乙基氨基-等等)的那些。对于其中R¹¹和R¹²均为长链烷基或酰 基基团的那些实施方案，它们可以是相同的或不同的。通常，具有较低饱 和的酰基链的氨基脂质更容易被设定大小，尤其是当复合物的大小为了过 滤灭菌的目的而必须被设定在约0.3微米以下时。含有碳链长度在C₁₄至 C₂₂范围内的不饱和脂肪酸的氨基脂质是优选的。其它骨架也可用于分离 氨基脂质的氨基基团和脂肪酸或脂族烷基部分。合适的骨架是本领域的技 术人员已知的。

在某些实施方案中，本发明的氨基或阳离子型脂质具有至少一个可质 子化或者可去质子化的基团，以使得脂质在处于或低于生理pH(如pH值 7.4)的pH值下带正电，而在第二pH值(优选地处于或高于生理pH)下是 中性的。当然可以理解，随pH值变化添加或去除质子是一个平衡的过程 且提到带电的或中性的脂质是指主要物质的性质，而并不要求所有的脂质 都以带电的或中性的形式存在。具有超过一个可质子化或者可去质子化的 基团的或为两性的脂质并不排除在本发明的应用之外。

在某些实施方案中，根据本发明的可质子化脂质具有约4至约11范 围内的可质子化基团的pKa。最优选的是约4至约7的pKa，因为这些脂 质在较低pH值的制剂阶段是阳离子型的，而颗粒在pH值7.4左右的生 理pH值下主要地(虽然不是完全地)被表面中和。这一pKa的益处之一是， 至少部分与颗粒外表面结合的核酸在生理pH下将失去其静电相互作用，并可以通过简单的透析移除，从而大大降低了颗粒对清除的易感性。

在一个实施方案中，阳离子型脂质是1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基 氨基丙烷(DLinDMA)。2009年4月15日提交的国际申请 PCT/CA2009/00496号中描述了包含DLinDMA的核酸-脂质颗粒的合成和 制备。

在一个实施方案中，使用阳离子型脂质XTC(2,2-二亚油基-4-二甲基 氨基乙基-[1,3]-二氧戊环)制备核酸-脂质颗粒。XTC的合成被描述于2008 年10月23日提交的61/107,998号美国临时专利申请中，其通过引用并入 本文。

在另一个实施方案中，使用阳离子型脂质MC3((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十 七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯)(例如，DLin-M-C3-DMA) 制备核酸-脂质颗粒。MC3的合成和含MC3的制剂被描述于例如，2009 年9月22日提交的美国临时申请序列号61/244,834和2009年6月10日 提交的美国临时申请序列号61/185,800中，其通过引用并入本文。

在另一个实施方案中，使用阳离子型脂质 ALNY-100((3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基) 四氢-3aH-环戊并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺)制备核酸-脂质颗粒。2009年 11月10日提交的国际专利申请PCT/US09/63933号中描述了ALNY-100 的合成，其通过引用并入本文。

在另一个实施方案中，使用阳离子型脂质1,1′-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基 十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二 基)二-十二烷-2-醇(C12-200)制备核酸脂质颗粒。C12-200也被称为 Tech G1。C12-200的合成和使用C12-200的制剂被描述于2010年5月5 日提交的国际专利申请PCT/US10/33777号和Love等(Love等 (2010)PNAS 107(5)；1864-69)中。

阳离子型脂质例如DLinDMA可以占颗粒中存在的总脂质的约 20mol％至约70mol％或约45-65mol％或约20、25、30、35、40、45、50、 55、60、65或约70mol％。在一个实施方案中，阳离子型脂质占存在的总 脂质的约57.1mol％。

非阳离子型脂质

本发明的核酸-脂质颗粒可以包括非阳离子型脂质。非阳离子型脂质 可以是阴离子型脂质或中性脂质。其实例包括但不限于，二硬脂酰磷脂酰 胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、 二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰 乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇 胺(POPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸 酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺 (DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基 PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇或其 混合物。

适合在本发明的脂质颗粒中使用的阴离子型脂质包括，但不限于，磷 脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰基 磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰基磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基磷脂酰乙醇胺、 赖氨酰磷脂酰甘油和与中性脂质结合的其它阴离子修饰基团。

当中性脂质存在于脂质颗粒中时，可以是在生理pH值下以不带电的 或中性的两性形式存在的多种脂质中的任何一种。这些脂质包括，例如， 二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷 脂、脑磷脂和脑苷脂。在本文所述的颗粒中使用的中性脂质的选择通常是 以，例如，脂质体的大小和血流中脂质体的稳定性的考虑为指导的。优选 地，中性脂质成分是具有两个酰基基团的脂质(即二酰基磷脂酰胆碱和二 酰基磷脂酰乙醇胺)。具有不同链长和饱和度的多种酰基链基团的脂质是 可获得的或者可以通过公知的技术分离或合成。在一组实施方案中，含碳 链长度在C₁₄至C₂₂范围内的含饱和脂肪酸的脂质是优选的。在另一组实 施方案中，使用具有碳链长度在C₁₄至C₂₂范围内的单-或二-不饱和脂肪 酸的脂质。此外，可以使用具有饱和与不饱和脂肪酸链的混合物的脂质。优选地，在本发明中使用的中性脂质是DOPE、DSPC、POPC或任何相 关的磷脂酰胆碱。本发明中使用的中性脂质也可以由鞘磷脂、二氢鞘磷脂 或者具有其它的头基团如丝氨酸和肌醇的磷脂组成。

在一个实施方案中，非阳离子型脂质是二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。 在另一个实施方案中，非阳离子型脂质是二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。

非阳离子型脂质，例如DPPC，可以为在颗粒中存在的总脂质的约 5mol％至约90mol％、约5mol％至约10mol％、约5、10、15、20、25、30、 35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或约90mol％。在一个实 施方案中，阳离子型脂质，例如DPPC，占核酸脂质颗粒的7.1mol％。

轭合的脂质

轭合的脂质可以用于核酸-脂质颗粒中以防止聚集，其包括聚乙二醇 (PEG)-修饰的脂质、单唾液酸神经节苷酯GM1和聚酰胺低聚物(“PAO”)， 如(在美国专利第6,320,017号中所描述的)。防止配制过程中聚集的其它 具有不带电荷的、亲水性的、立体屏障部分的化合物，如PEG、Gm1或 ATTA，也可以与脂质轭合以用于本发明的方法和组合物中。在例如，美国专利第6,320,017号中描述了ATTA-脂质，在例如，美国专利第 5,820,873、5,534,499和5,885,613号中描述了PEG-脂质轭合物。通常， 选择的用于减少聚集的脂质成分的浓度是约1至15％(以脂质的摩尔百分 比计)。

可用于本发明中的PEG-修饰的脂质(或脂质-聚氧乙烯轭合物)的具体 的实例可以具有多种“锚定”脂质部分使PEG部分固定在脂质囊泡的表面 上。适合的PEG-修饰的脂质的实例包括PEG-修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂 酸、在共同未决的USSN 08/486,214(本文通过引用并入)中所描述的PEG- 神经酰胺偶联物(例如，PEG-CerC14或者PEG-CerC20)、PEG-修饰的二烷 基胺和PEG-修饰的1,2-二酰氧基丙-3-胺。特别优选的是PEG-修饰的二酰 基甘油和二烷基甘油。

在其中空间上的大部分如PEG或ATTA与脂质锚轭合的实施方案中， 对脂质锚的选择取决于轭合物与脂质颗粒具有什么类型的结合。众所周 知，mePEG(mw2000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)保持与脂质体结 合直到颗粒从循环中清除，可能几天的时间。其它的轭合物，如 PEG-CerC20，具有类似的停留能力。然而在一些测定中，PEG-CerC 14 在暴露于血清时以不到60分钟的T_1/2迅速地交换到制剂外。如在美国专 利申请SN 08/486,214中所显示的，至少有三种特性影响交换率：酰基链 的长度、酰基链的饱和度和空间屏障头基的大小。具有这些特性的适当变 化的化合物可以用于本发明。对于一些治疗应用，可能优选的是在体内迅 速地与核酸-脂质颗粒脱离的PEG-修饰的脂质，且因此PEG-修饰的脂质将具有相对较短的脂质锚。在其它治疗应用中，可能优选的是表现出较长 的血浆循环寿命的核酸脂质颗粒，且因此PEG-修饰的脂质将拥有相对较 长的脂质锚。示例性的脂质锚包括具有约C₁₄至约C₂₂、优选地约C₁₄至约 C₁₆的长度的那些脂质锚。在一些实施方案中，PEG部分，例如mPEG-NH₂， 具有约1000、2000、5000、10,000、15,000或20,000道尔顿的大小。

应当注意的是防止聚集的化合物不一定要求脂质轭合以适当地发挥 功能。在溶液中的游离PEG或游离ATTA可能足以防止聚集。如果颗粒 在配制后是稳定的，PEG或ATTA可以在向受试者施用前被透析掉。

抑制颗粒聚集的轭合的脂质可以是，例如，聚乙二醇(PEG)-脂质，包 括但不限于PEG-二酰基甘油(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷 脂、PEG-神经酰胺(Cer)或其混合物。PEG-DAA轭合物可以是，例如PEG- 二月桂基氧基丙基(Ci₂)、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(Ci₄)、PEG-二棕榈基 氧基丙基(Ci₆)或PEG-二硬脂基氧基丙基(C]₈))。另外的偶联脂质包括聚乙 二醇-二(十四酰基)甘油 (polyethylene glycol-didimyristoyl glycerol)(C14-PEG或PEG-C14，其中 PEG平均分子量为2000Da)(PEG-DMG)；(R)-2,3-双(十八烷氧基)丙基1-(甲 氧基聚(乙二醇)2000)丙基氨基甲酸酯)(PEG-DSG)；PEG-氨基甲酰基-1,2- 二(十四烷氧基)丙胺，其中PEG的平均分子量为2000Da(PEG-cDMA)；N-乙酰半乳糖胺-((R)-2,3-二(十八烷氧基)丙基1(甲氧基聚(乙二醇)2000) 丙基氨基甲酸酯))(GalNAc-PEG-DSG)；和聚乙二醇-二棕榈酰基甘油 (PEG-DPG)。

在一个实施方案中，轭合的脂质是PEG-DMG或PEG-DSG。在另一 个实施方案中，轭合的脂质是PEG-cDMA。在再另一个实施方案中，轭 合的脂质是PEG-DPG。或者，轭合的脂质是GalNAc-PEG-DSG。

在一些实施方案中，防止颗粒聚集的轭合的脂质是颗粒中存在的总脂 质的0mol％至约20mol％或约0.5至约5.0mol％或约1.5mol％或约2.0 mol％。轭合的脂质可以是颗粒中存在的总脂质的约0.5、1.0、1.1、1.2、 1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或约5.0 mol％。在一个实施方案中，轭合的脂质如PEG-cDMA为1.4mol％。

脂质混合物的固醇成分(当存在时)可以是在脂质体、脂质囊泡或脂质 颗粒制备领域中常规使用的那些固醇中的任何一种。优选的固醇是胆固 醇。

在一些实施方案中，核酸-脂质颗粒还包括固醇，如胆固醇。固醇可 以为核酸-脂质颗粒的约10至约60mol％或约25至约40mol％。在一些 实施方案中，固醇为颗粒中存在的总脂质的约10、15、20、25、30、35、 40、45、50、55或约60mol％。固醇，如胆固醇，可以是颗粒中总脂质 的约34.3或34.4mol％。

脂蛋白

在一个实施方案中，本发明的制剂进一步包含载脂蛋白。本文中使用 术语“载脂蛋白”或“脂蛋白”是指本领域的技术人员已知的载脂蛋白及其 变体和片段且指如下所述的载脂蛋白激动剂及其类似物或片段。

合适的载脂蛋白包括，但不限于，ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoA-V 和ApoE及活性多态形式、同种型、变体和突变体及其片段或截短形式。 在某些实施方案中，载脂蛋白是含巯基的载脂蛋白。“含巯基的载脂蛋白” 指至少含有一个半胱氨酸残基的载脂蛋白、变体、片段或同种型。最常见 的含巯基的载脂蛋白是包含一个半胱氨酸残基的ApoA-IMilano(ApoA-I_M) 和ApoA-I Paris(ApoA-I_P)(Jia等，2002，Biochem.Biophys.Res.Comm.297： 206-13；Bielicki和Oda，2002，Biochemistry 41：2089-96)。ApoA-II、 ApoE2和ApoE3也是含巯基的载脂蛋白。分离的ApoE和/或其活性片段 和多肽类似物(包括其重组产生的形式)被描述于美国专利第5,672,685、 5,525,472、5,473,039、5,182,364、5,177,189、5,168,045、5,116,739号中， 其公开内容通过引用并入本文。Weisgraber 等，″Human E apoprotein heterogeneity： cysteine-arginineinterchanges in the amino acid sequence of the apo-E isoforms，″J.Biol.Chem.(1981)256：9077-9083和Rall 等，″Structural basis for receptor bindingheterogeneity of apolipoprotein E fr om type III hyperlipoproteinemicsubjects，″Proc.Nat.Acad.Sci.(1982)79： 4696-4700中公开了ApoE3(也参见GenBank登录号K00396)。

在某些实施方案中，载脂蛋白可以是其成熟的形式、其预处理载脂蛋 白(preproapolipoprotein)形式或其前体载脂蛋白(proapolipoprotein)形式。前 体ApoA-I和成熟ApoA-I(Duverger等，1996，Arterioscler.Thromb.Vasc. Biol.16(12)：1424-29)、ApoA-I Milano(Klon等，2000，Biophys.J.79： (3)1679-87；Franceschini等，1985，J.Biol.Chem.260：1632-35)、 ApoA-I Paris(Daum等，1999，J.Mol.Med.77：614-22)、ApoA-II(Shelness 等，1985，J.Biol.Chem.260(14)：8637-46；Shelness等，1984，J.Biol.Chem.259(15)：9929-35)、ApoA-IV(Duverger等，1991，Euro.J.Biochem.201(2)： 373-83)和ApoE(McLean等，1983，J.Biol.Chem.258(14)：8993-9000)的 同型或异型二聚体也可以在本发明的范围内利用。

在某些实施方案中，载脂蛋白可以是载脂蛋白的片段、变体或同种型。 术语“片段”是指具有比天然的载脂蛋白短的氨基酸序列的任何载脂蛋白， 且该片段保留了天然的载脂蛋白的活性，包括脂质结合特性。“变体”表示 载脂蛋白的氨基酸序列中的置换或改变，该置换或改变，例如，氨基酸残 基的增加和缺失，不消除天然载脂蛋白的活性，包括脂质结合特性。因此， 变体可以包含具有与本发明提供的天然载脂蛋白基本上相同的氨基酸序 列的蛋白质或肽，其中的一个或多个氨基酸残基已经被化学上相似的氨基 酸保守地取代。保守取代的实例包括将至少一个疏水残基，如异亮氨酸、 缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸取代为另一个。同样地，本发明考虑，例如，至 少一个亲水性残基，例如，精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之 间、甘氨酸和丝氨酸之间的取代(见美国专利第6,004,925、6,037,323和 6,046,166号)。术语“同种型”是指具有相同的、更强的或部分的功能和相 似的、相同的或部分的序列的蛋白质，且可以是或不是相同基因的产物和 通常为组织特异性的(见Weisgraber，1990，J.Lipid Res.31(8)：1503-11； Hixson和Powers 1991，J.Lipid Res.32(9)：1529-35；Lackner等，1985， J.Biol.Chem.260(2)：703-6；Hoeg等，1986，J.Biol.Chem.261(9)：3911-4； Gordon等，1984，J.Biol.Chem.259(1)：468-74；Powell等，1987，Cell 50(6)： 831-40；Aviram等，1998，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.18(10)：1617-24； Aviram等，1998，J.Clin.Invest.101(8)：1581-90；Billecke等，2000， DrugMetab.Dispos.28(11)：1335-42；Draganov等，2000，J.Biol.Chem. 275(43)：33435-42；Steinmetz和Utermann 1985，J.Biol.Chem.260(4)： 2258-64；Widler等，1980，J.Biol.Chem.255(21)：10464-71；Dyer等， 1995，J.Lipid Res.36(1)：80-8；Sacre等，2003，FEBS Lett.540(1-3)：181-7； Weers等，2003，Biophys.Chem.100(1-3)：481-92；Gong等，2002，J.Biol. Chem.277(33)：29919-26；Ohta等，1984，J.Biol.Chem.259(23)：14888-93 和美国专利No.6,372,886)。

在某些实施方案中，本发明的方法和组合物包括使用载脂蛋白的嵌合 构建体。例如，载脂蛋白的嵌合构建体可由具有与含缺血再灌注保护性能 的载脂蛋白结构域相关的高脂质结合能力的载脂蛋白结构域组成。载脂蛋 白嵌合构建体可以是包括载脂蛋白内的分离区域的构建体(即同源构建体) 或嵌合构建体可以是包括不同的载脂蛋白之间的分离区域的构建体(即异 源构建体)。包含嵌合构建体的组合物也可以包括作为载脂蛋白变种的片 段或设计为具有特定的性质的片段(例如，脂质结合、受体结合、酶学性 质、酶激活、抗氧化或氧化还原特性)(参见Weisgraber 1990，J.Lipid Res. 31(8)：1503-11；Hixson和Powers 1991，J.Lipid Res.32(9)：1529-35；Lackner 等，1985，J.Biol.Chem.260(2)：703-6；Hoeg等，1986，J.Biol.Chem.261(9)： 3911-4；Gordon等，1984，J.Biol.Chem.259(1)：468-74；Powell等，1987， Cell 50(6)：831-40；Aviram等，1998，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 18(10)：1617-24；Aviram等，1998，J.Clin.Invest.101(8)：1581-90；Billecke 等，2000，Drug Metab.Dispos.28(11)：1335-42；Draganov等，2000，J.Biol. Chem.275(43)：33435-42；Steinmetz和Utermann 1985，J.Biol.Chem. 260(4)：2258-64；Widler等，1980，J.Biol.Chem.255(21)：10464-71； Dyer等，1995，J.LipidRes.36(1)：80-8；Sorenson等，1999，Arterioscler. Thromb.Vasc.Biol.19(9)：2214-25；Palgunachari 1996，Arterioscler.Throb. Vasc.Biol.16(2)：328-38：Thurberg等，J.Biol.Chem.271(11)：6062-70； Dyer 1991，J.Biol.Chem.266(23)：150009-15；Hill1998，J.Biol. Chem.273(47)：30979-84)。

本发明中使用的载脂蛋白还包括重组的、合成的、半合成的或纯化的 载脂蛋白。本发明所使用的获得载脂蛋白或其等价物的方法是本领域公知 的。例如，载脂蛋白可以通过例如，密度梯度离心法或免疫亲和层析从血 浆或天然产物中分离，或者合成地、半合成地或利用该领域的技术人员已 知的重组DNA技术产生(参见，例如Mulugeta等，1998，J.Chromatogr. 798(1-2)：83-90；Chung等，1980，J.Lipid Res.21(3)：284-91；Cheung 等，1987，J.Lipid Res.28(8)：913-29；Persson，等，1998，J.Chromatogr. 711：美国专利第97-109；5,059,528、5,834,596、5,876,968和5,721,114 号；和PCT公布WO 86/04920和WO 87/02062)。

在本发明中利用的载脂蛋白进一步包括载脂蛋白激动剂，如模拟 ApoA-I、ApoA-IMilano(ApoA-I_M)、ApoA-I Paris(ApoA-I_P)、ApoA-II、 ApoA-IV和ApoE活性的肽和肽类似物。例如，载脂蛋白可以是在美国专 利第6,004,925、6,037,323、6,046,166和5,840,688号中所描述的那些中 的任何一种，这些专利的内容以其整体通过引用并入本文。

可以使用本领域已知的用于肽合成的任何技术合成或制造载脂蛋白 激动剂肽或肽类似物，例如，美国专利第6,004,925、6,037,323和6,046,166 号中描述的技术。例如，可使用最初由Merrifield(1963，J.Am.Chem.Soc. 85：2149-2154)描述的固相合成技术制备肽。可以在Bodanszky等， Peptide Synthesis，John Wiley&Sons，第2版，(1976)中和本领域的技术 人员可方便地获得的其它参考资料中找到其它的肽合成技术。可以在 Stuart和Young，Solid Phase Peptide.Synthesis，Pierce Chemical Company， Rockford，Ill.，(1984)中找到多肽合成技术的总结。也可以通过如 The Proteins，II卷，第3版，Neurath等编辑，105-237页，Academic Press， New York，N.Y.(1976)中所描述的溶液方法合成肽。在不同的肽合成中使 用的适当的保护基在上述文献以及在McOmie， Protective Groups inOrganic Chemistry，Plenum Press，New York，N.Y. (1973)中描述。本发明的肽也可以通过由例如载脂蛋白A-I的较大部分化 学或酶促裂解而制备。

在某些实施方案中，载脂蛋白可以是载脂蛋白的混合物。在一个实施 方案中，载脂蛋白可以是均质混合物，也就是，单一类型的载脂蛋白。在 另一个实施方案中，载脂蛋白可以是载脂蛋白的异质混合物，即两种或更 多种不同载脂蛋白的混合物。载脂蛋白的异质混合物的实施方案可以包 含，例如，来自动物来源的载脂蛋白和来自半合成来源的载脂蛋白的混合 物。在某些实施方案中，异质混合物可以包含，例如，ApoA-I和 ApoA-I Milano的混合物。在某些实施方案中，异质混合物可以包含，例 如，ApoA-I Milano和ApoA-I Paris的混合物。适合在本发明的方法和组 合物中使用的混合物对于本领域的技术人员是显而易见的。

如果载脂蛋白是从天然来源获得的，它可以从植物或动物来源获得。 如果载脂蛋白是从动物来源获得的，该载脂蛋白可以来自任何物种。在某 些实施方案中，载脂蛋白可从动物来源获得。在某些实施方案中，载脂蛋 白可以从人类来源获得。在本发明的优选实施方案中，载脂蛋白是源自于 与向其施用载脂蛋白的个体相同的物种。

其它成分

在众多的实施方案中，两性脂质被包括在本发明的脂质颗粒中。“两 性脂质”是指任何合适的材料，其中该脂质材料的疏水部分定向于疏水相 中，而亲水部分朝向水性相定向。这类化合物包括，但不限于，磷脂类、 氨基脂类和鞘脂类。代表性的磷脂包括鞘磷脂、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、 磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂 酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、 二硬脂酰磷脂酰胆碱或二亚油酰磷脂酰胆碱。也可使用其它的无磷化合 物，如鞘脂类、鞘糖脂家族、二酰甘油类、β-酰氧酸(acyloxyacid)。此外， 这类两性脂质可以很容易地与其它脂质，如甘油三酯和固醇混合。

可编程融合脂质也适于包含在本发明中的脂质颗粒中。这类脂质颗粒 几乎没有与细胞膜融合的趋势，并直到给定的信号事件出现才传递其载 荷。这使得脂质颗粒在注射到生物体或疾病位点后开始与细胞融合前更均 匀地分布。信号事件可以是，例如，pH值、温度、离子环境或时间的变 化。在后一种情况下，融合延迟或“掩饰”成分，如ATTA-脂质偶联物或 PEG-脂质偶联物，可以简单地随着时间交换到脂质颗粒膜外。示例性的 脂质锚包括长度从约C₁₄至约C₂₂、优选地约C₁₄至约C₁₆的那些。在一些 实施方案中，PEG部分，例如mPEG-NH₂，具有约1000、2000、5000、 10,000、15,000或20,000道尔顿的大小。

与核酸试剂偶联的脂质颗粒也可以包括靶向部分，例如，对于细胞类 型或组织特异性的靶向部分。在先已经描述了脂质颗粒利用多种靶向部 分，如配体、细胞表面受体、糖蛋白类、维生素(如核黄素)和单克隆抗体 的靶向(见，例如，美国专利第4,957,773和4,603,044号)。靶向部分可以 包括整个蛋白质或其片段。靶向机制通常需要靶向剂以使得靶向部分可用 于与靶标如细胞表面受体相互作用的方式定位在脂质颗粒的表面上。多种 不同的靶向剂和方法是本领域中已知的并且可获得的，包括被描述于，例 如，Sapra，P.和Allen，TM，Prog.Lipid Res.42(5)：439-62(2003)；和Abra， RM等，J.Liposome Res.12：1-3，(2002)中的那些。

已经提出利用具有亲水性聚合物链如聚乙二醇(PEG)链的表面涂层的 脂质颗粒(即脂质体)用于靶向(Allen等， Biochimica et Biophysica Acta 1237：99-108(1995)；DeFrees等， Journal of the American Chemistry Society 118：6101-6104(1996)；Blume等，Biochimica et Biophysica Acta 1149：180-184(1993)；Klibanov等， Journalof Liposome Research 2：321-334(1992)；美国专利第5,013556号； Zalipsky，Bioconjugate Chemistry 4：296-299(1993)；Zalipsky， FEBS Letters 353：71-74(1994)；Zalipsky，在Stealth Liposomes Chapter 9(Lasic和Martin编辑)CRC Press，Boca Raton Fl(1995)中)。在一 种途径中，用于使脂质颗粒靶向的配体，如抗体，被连接到形成脂质颗粒 的脂质的极性头基。在另一种途径中，靶向配体连接到形成亲水性聚合物涂层的PEG链的远端末端(Klibanov等，Journal of Liposome Research 2： 321-334(1992)；Kirpotin等，FEBS Letters 388：115-118(1996))。

可以使用用于偶联靶试剂的标准方法。例如，可以使用磷脂酰乙醇胺， 其可以被激活以用于靶试剂的连接，或衍生化的亲脂性化合物，如脂质衍 生的博莱霉素。可以使用，例如，整合蛋白A的脂质体构建抗体靶向的 脂质体(见，Renneisen等，J.Bio.Chem.，265：16337-16342(1990)和Leonetti 等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，87：2448-2451(1990)。美国专利第 6,027,726号中公开了抗体偶联的其它的实例，其教导通过引用并入本文。 靶向部分的实例还可以包括对细胞成分特异性的其它蛋白质，包括与赘生 物或肿瘤相关的抗原。用作靶向部分的蛋白质可通过共价键连接到脂质体 上(参见，Heath，CovalentAttachment of Proteins to Liposomes，149Methods in Enzymology 111-119(AcademicPress，Inc.1987))。其它的靶向方法包括 生物素-抗生物素蛋白系统。

核酸-脂质颗粒的制备

在一个实施方案中，本发明的核酸-脂质颗粒制剂是通过挤出法或在 线混合方法产生的。

挤出法(也称为预成型方法或批处理过程)是其中首先制备空脂质体 (即无核酸)，随后向空脂质体中加入核酸的方法。脂质体组合物通过小孔 的聚碳酸酯膜或不对称陶瓷膜挤出导致相对明确定义的粒度分布。通常， 悬浮液一次或多次地通过膜循环，直到获得所需的脂质体复合物的粒度分 布。脂质体可以被继续地通过更小孔径的膜挤出以获得脂质体大小的逐渐 减小。在某些情况下，形成的脂质-核酸组合物可不进行大小调整而使用。 这些方法被公开于US 5,008,050、US 4,927,637、US 4,737,323； Biochim BiophysActa.1979年10月19日；557(1)：9-23； Biochim Biophys Acta.1980年10月2日；601(3)：559-7； Biochim Biophys Acta.1986年6月13日；858(1)：161-8和Biochim.Biophys. Acta1985 812，55-65，其以其全文通过引用并入本文。

在线混合方法是其中脂质和核酸被平行添加到混合室中的方法。混合 室可以是简单的T型连接管或本领域技术人员已知的任何其它的混合室。 这些方法被公开于美国专利第6,534,018号和US 6,855,277、美国公布号 2007/0042031和PharmaceuticalsResearch，Vol.22，No.3，Mar.2005， 第362-372页中，其以其全文通过引用并入本文。

还应理解的是可以通过本领域的普通技术人员已知的任何方法制备 本发明的制剂。

核酸-脂质颗粒的表征

由标准的或无挤出的方法制备的制剂可以以类似的方式表征。例如， 制剂通常通过目视检查来鉴定。它们应该是不含聚集体或沉积物的发白的 半透明溶液。使用例如Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern，USA)通过光 散射测量脂质-纳米颗粒的颗粒大小和粒度分布。颗粒大小应约为 20-300nm，如40-100nm。颗粒的粒度分布应该是单峰的。使用染料排除 法评估制剂中的总siRNA浓度以及捕获分数。在制剂破坏表面活性剂(例 如，0.5％的Triton-X100)存在或不存在的情况下，配制的siRNA的样品可 以与RNA结合染料如Ribogreen(Molecular Probe)一起孵育。可以通过来 自含有表面活性剂的样品的信号相对于标准曲线确定制剂中的总siRNA。 通过从总siRNA含量减去“游离的”siRNA含量(如通过不存在表面活性剂 的情况下的信号所测量的)确定捕获分数。捕获siRNA的百分比通常＞ 85％。在一个实施方案中，本发明的制剂捕获至少75％、至少80％或至少 90％。

对于核酸-脂质颗粒制剂，颗粒大小为为至少30nm，至少40nm，至 少50nm，至少60nm，至少70nm，至少80nm，至少90nm，至少100nm， 至少110nm和至少120nm。合适的范围通常是约至少50nm至约至少 110nm、约至少60nm至约至少100nm或约至少80nm至约至少90nm。

LNP01

合成核酸-脂质颗粒的一个实例如下。使用类脂质(lipidoid) ND98·4HCl(MW1487)(式1)、胆固醇(Sigma-Aldrich)和PEG-神经酰胺 C16(Avanti Polar Lipids)合成核酸-脂质颗粒。这种核酸-脂质颗粒有时也被 称为LNP01颗粒。可以如下制备每一种在乙醇中的储备液：ND98， 133mg/mL；胆固醇，25mg/mL；PEG-神经酰胺C16，100mg/mL。ND98、 胆固醇和PEG-神经酰胺C16储备液然后可以以例如42：48：10的摩尔 比合并。合并后的脂质溶液可与水性siRNA(例如，在pH值5的醋酸钠中) 混合，以使得最终的乙醇浓度为约35-45％，且最终的醋酸钠浓度为约 100-300mM。脂质-siRNA纳米微粒通常在混合时自发形成。根据所需粒 度分布，例如，产生的纳米微粒混合物可以使用热桶(thermobarrel)挤出机 (如Lipex挤出机(Northern Lipids，Inc))通过聚碳酸酯膜(如100nm的截止 值)挤出。在某些情况下，挤出步骤可以省略。例如，可以通过透析或切 向流过滤实现乙醇去除和同时的缓冲液交换。缓冲液可以用例如pH值约 7如pH值约6.9、pH值约7.0、pH值约7.1、pH值约7.2、pH值约7.3 或pH值约7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)交换。

例如，在国际申请公开WO 2008/042973中描述了LNP01制剂，其通 过参考引入本文。

示例性的核酸-脂质颗粒制剂

下表中描述了另外的示例性核酸-脂质颗粒制剂。应当理解的是表中 的核酸脂质颗粒的名称并不意味着限制。例如，本文所使用的术语SNALP 是指包含阳离子型脂质DLinDMA的制剂。

在例如2009年4月15日提交的申请号PCT/CA2009/00496中描述了 包含DLinDMA的制剂，如在ALN-VSP02中所使用的，该申请通过引用 并入本文。

在例如2009年9月3日提交的美国临时申请序列号61/239,686中描 述了包含XTC的制剂，其通过引用并入本文。

在例如2009年9月22日提交的美国临时申请序列号61/244,834和 2009年6月10日提交的美国临时申请序列号61/185,800中描述了包含 MC3的制剂，其通过引用并入本文。

在例如，2009年11月10日提交的国际专利申请号PCT/US09/63933 中描述了包含ALNY-100的制剂，其通过引用并入本文。

在2010年5月5日提交的国际专利申请号PCT/US10/33777中和在 Love等(Love等(2010)PNAS 107(5)；1864-69)中描述了包含C12-200的制 剂，其通过引用并入本文。

另外的制剂

乳剂

本发明的组合物可以制备并配制成乳剂。乳剂一般为一种液体以直径 通常超过0.1μm的小液滴形式分散在另一种液体中的异质体系(Idson，于 Pharmaceutical DosageForms，Lieberman，Rieger和Banker(编辑)，1988， Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第199页中；Rosoff， 于Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编辑)，1988， Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第245页中； Block inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编辑)， 1988，MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.，第2卷，第335页；Higuchi 等人，in Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton， Pa.，1985，第301页)。乳剂通常是包含彼此紧密混合并相互分散的2种 不混溶液相的双相系统。通常，乳剂可以为油包水(w/o)或水包油(o/w)的 种类。当水相细分并作为微小液滴分散到大块油相中时，所产生的组合物 被称为油包水(w/o)乳剂。可选择地，当油相细分并作为微小液滴分散到 大块水相中时，所产生的组合物被称为水包油(o/w)乳剂。除了分散相和 活性药物(其可以作为在水相、油相中的溶液，或者以其自身作为独立相 存在)外，乳剂还可以包含其他组分。如果需要，乳剂中也可以存在药物 赋形剂如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂。药物乳剂也可以为由多于两 种的相组成的多重乳剂，如油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳剂 的情况。这种复杂的制剂通常具有某些简单的二相乳剂所不具有的优势。 其中o/w乳剂的单个油滴还包有小水滴的多重乳剂构成w/o/w乳剂。同样 地，在油连续相中稳定的小水珠中包封小油滴的系统构成o/w/o乳剂。

乳剂特征在于具有较小或没有热力学稳定性。通常，乳剂的分散相或 不连续相很好地分散在外相或连续相中并通过乳化剂或制剂的粘性保持 这种形式。乳剂的任一相可以为半固体或固体，如在乳剂型软膏基质或乳 膏剂的情况中。其他稳定乳剂的方式需要使用可以引入到乳剂的任一相中 的乳化剂。乳化剂可以宽泛地分成四种类型：合成的表面活性剂、天然存 在的乳化剂、吸收基质和良好分散的固体(Idson，于 PharmaceuticalDosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(编辑)，1988， Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，第1卷，第199页中)。

已经发现合成的表面活性剂，也称为表面活性试剂，在乳剂制剂中有 广泛应用，并且已经在文献中进行了综述(Rieger，于 Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编辑)，1988， Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第285页中；Idson，于 Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编辑)， MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，第1卷，第199页中)。表 面活性剂通常是两性的，且包含亲水部分和疏水部分。表面活性剂的亲水 和疏水性的比率称为亲水/疏水平衡值(HLB)，它是制剂制备过程中分类和 选择表面活性剂的重要工具。表面活性剂可以根据亲水基团的性质分成不 同的类型：非离子型、阴离子型、阳离子型和两性离子型(Rieger，于Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和and Banker(编辑)， 1988，MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第285页中)。

用于乳剂制剂中的天然存在的乳化剂包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷 脂和阿拉伯树胶。吸收基质具有亲水特性，所以它们能够吸取水以形成 w/o乳剂并仍然保持它们的半固体稠度，如无水羊毛脂和亲水凡士林。细 分的固体也已经被用做优良的乳化剂，尤其是与表面活性剂组合和在粘性 制品中使用。这些包括极性无机固体如重金属氢氧化物，不溶胀的粘土如 斑脱土(bentonite)、绿坡缕石(attapulgite)、锂蒙脱石、高岭土、蒙脱石、 胶状硅酸铝和胶状硅酸镁铝，色素和非极性固体如碳或三硬脂酸甘油酯。

在乳剂剂型中还包含多种非乳化物质，它们影响乳剂的性质。这些非 乳化物质包括脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、湿润剂、亲水胶 体、防腐剂和抗氧化剂(Block，于Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman， Rieger和Banker(编辑)，1988，MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.， 第1卷，第335页中；Idson，于Pharmaceutical DosageForms，Lieberman， Rieger和Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第199页中)。

亲水胶体或水胶体包括天然存在的树胶和合成的聚合物如多糖(如阿 拉伯树胶、琼脂、褐藻酸、角叉菜胶、瓜耳胶、刺梧桐树胶和黄蓍胶)， 纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)和合成的聚合物(如卡波 姆、纤维素醚和羧基乙烯基聚合物)。这些物质在水中分散或溶胀以形成 胶状溶液，其通过在分散相小滴周围形成强的界面膜层并通过增强外相的 粘度来稳定乳剂。

由于乳剂通常包含多种可以容易地支持微生物生长的成分(如碳水化 合物、蛋白质、甾醇和磷脂)，所以这些制剂通常含有防腐剂。乳剂制剂 中包括的通常使用的防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、 季铵盐、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸酯和硼酸。通常也将抗氧化剂加入到乳 剂制剂中，以预防制剂的变质。所用的抗氧化剂可以为自由基清除剂如生 育酚、没食子酸烷基酯、丁基化的羟基茴香醚、丁基化的羟基甲苯，或还 原剂如抗坏血酸和偏亚硫酸氢钠，以及抗氧化剂协同剂如柠檬酸、酒石酸 和卵磷脂。

乳剂制剂通过皮肤的、口腔的和肠胃外途径的应用和它们的生产方法 已经在文献(Idson，于Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和 Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷， 第199页中)中进行了综述。因为配制简单并且在吸收和生物利用度方面 的效能，经口递送的乳剂制剂已经被广泛使用(Rosoff，于Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编辑)，1988， MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第245页中；Idson，于 Pharmaceutical DosageForms，Lieberman，Rieger和Banker(编辑)，1988， Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第199页中)。矿物油基 的缓泻药、油溶性的维生素和高脂营养制品属于通常作为o/w乳剂经口施 用的物质。

在本发明的一个实施方案中，dsRNA与核酸的组合物被制成微乳剂。 微乳剂可以定义为水、油和两亲物质的体系，它是单一的光学各向同性的 和热力学稳定的液体溶液(Rosoff，in Pharmaceutical Dosage Forms， Lieberman，Rieger和Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York， N.Y.，第1卷，第245页)。典型地，微乳剂是通过如下方法制备的体系， 首先将油分散到水性表面活性剂溶液中，然后加入足量的第四组分(通常 为中等链长度的醇)而形成透明体系。因此，微乳剂也被描述成由表面活 性分子的界面膜稳定的两种不混溶液体的热力学稳定的各向同胜的澄清 分散体(Leung和Shah，于：Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate Systems，Rosoff，M.编辑，1989，VCH Publishers，New York， 第185-215页中)。通常微乳剂通过3至5种组分的组合(包括油、水、表 面活性剂、辅助表面活性剂和电解质)来制备。微乳剂是油包水(w/o)型还是水包油(o/w)型取决于所使用的油和表面活性剂的性质以及表面活性剂 分子的极性头部和烃尾部的结构和几何包装(Schott，于 Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.，Easton，Pa.， 1985，第271页中)。

已经广泛地研究了利用相图的现象学方法，并且产生了对于本领域技 术人员来说容易理解的关于如何配制微乳剂的知识(Rosoff，于 Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编辑)，1988， Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第245页中；Block，于 Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编辑)，1988， Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第335页中)。与常规乳 剂相比，微乳剂的优点是能将水不溶性药物溶解到同时形成的热力学稳定 的液滴制剂中。

微乳剂制备中所使用的表面活性剂包括但不限于单独的或与辅助表 面活性剂组合使用的离子表面活性剂、非离子型表面活性剂、Brij 96、聚 氧乙烯油基醚、聚脂肪酸甘油酯、单月桂酸四甘油酯(ML310)、单油酸四 甘油酯(MO310)、单油酸六甘油酯(PO310)、五油酸六甘油酯(PO500)、单 癸酸十甘油酯(MCA750)、单油酸十甘油酯(MO750)、倍半油酸(sequioleate) 十甘油酯(SO750)、十油酸十甘油酯(DAO750)。所述辅助表面活性剂通常是短链醇(如乙醇、1-丙醇和1-丁醇)，其作用是通过渗透到表面活性剂膜 中并因此由于表面活性剂分子间产生的空余空间从而产生无序膜而提高 界面流动性。然而，微乳剂可以不用辅助表面活性剂进行制备，并且无醇 的自乳化微乳剂体系是本领域已知的。典型地，水相可以是(但不限于)水、 药物的水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇、以及乙二醇 的衍生物。油相可以包括但不限于如Captex 300、Captex 355、 Capmul MCM、脂肪酸酯、中等链(C8-C12)的单、二和三-甘油酯、聚氧乙 基化的甘油脂肪酸酯、脂肪醇，聚二醇化的甘油酯、饱和的聚二醇化的 C8-C10甘油酯、植物油和硅油。

从药物溶解度和增强的药物吸收方面看，微乳剂是特别令人感兴趣 的。已经提议使用基于脂质的微乳剂(o/w和w/o两者)以增强包括肽在内 的药物的口服生物利用度(Constantinides等人，Pharmaceutical Research， 1994，11，1385-1390；Ritschel，Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.，1993， 13，205)。微乳剂具有以下优势：提高药物溶解度，防止药物受到酶的水 解，可能由于表面活性剂导致的膜流动性和渗透性的改变而增强药物的吸 收，制备简单，比固体剂型更容易口服施用，临床效能提高和毒性降低(Constantinides等人，Pharmaceutical Research，1994，11，1385；Ho等人，J.Pharm.Sci.，1996，85，138-143)。通常，微乳剂可以在其成分在环境 温度下混合在一起时自发地形成。当配制热不稳定的药物、肽或dsRNA 时，这可能特别有利。在化妆品和药物应用领域中，微乳剂有效地用于透 皮递送活性组分。我们期望本发明的微乳剂组合物和制剂会有利于提高 dsRNA和核酸从胃肠道的系统吸收，并提高dsRNA和核酸的局部细胞摄取。

本发明的微乳剂还可以包含其他成分和添加剂如山梨聚糖单硬脂酸 酯(Grill3)、Labrasol和渗透增强剂，以提高制剂的性能并增强本发明的 dsRNA和核酸的吸收。本发明的微乳剂中使用的渗透增强剂可以分成五 大类中的一种：表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合的非表面 活性剂(Lee等人，Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems， 1991，第92页)。各个类型都已经在上文进行了讨论。

渗透增强剂

在一个实施方案中，本发明使用各种渗透增强剂以实现核酸、尤其是 dsRNA至动物皮肤的有效递送。大多数药物以离子和非离子的形式存在 于溶液中。然而，通常只有脂溶性的或亲脂的药物可容易地穿过细胞膜。 已经发现，如果用渗透增强剂处理要穿过的细胞膜，甚至连非亲脂性药物 都可以穿过细胞膜。除了帮助非亲脂药物穿过细胞膜的扩散外，渗透增强 剂也能增强亲脂性药物的渗透性。

渗透增强剂可以归类为属于5大类之一，即表面活性剂、脂肪酸、胆 汁盐、螯合剂和非螯合的非表面活性剂(Lee等人， Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems，1991，第92页)。在 下文对各类上文提及的渗透增强剂进行详细描述。

表面活性剂：在本发明的上下文中，表面活性剂(或“表面活性试剂”) 为化学实体，当其溶解在水性溶液中时，它降低溶液的表面张力或者水性 溶液和另一种液体之间的界面张力，结果是dsRNA通过粘膜的吸收得到 增强。除了胆汁盐和脂肪酸之外，这些渗透增强剂还包括例如月桂基硫酸 钠、聚氧乙烯基-9-月桂基醚和聚氧乙烯基-20-鲸蜡基醚(Lee等人， Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，第92页)，以 及全氟化合物乳剂如FC-43(Takahashi等人，J.Pharm.Pharmacol.，1988， 40，252)。

脂肪酸：用作渗透增强剂的各种脂肪酸和它们的衍生物包括，例如油 酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕桐酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻 酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油一油酸酯(1-单油酰-rac-甘油)、二月桂精、 辛酸、花生四烯酸、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉 毒碱、酰基胆碱、它们的C_1-10烷基酯(如甲基、异丙基和叔丁基酯)和它们 的甘油单酯和甘油二酯(即油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、豆蔻酸酯、棕榈 酸酯、硬脂酸酯、亚油酸酯等)(Lee等人， Critical Reviews in Therapeutic Drug CarryierSystems，1991，第92页； Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems，1990，7， 1-33；El Hariri等人，J.Pharm.Pharmacol.，1992，44，651-654)。

胆汁盐：胆汁盐的生理作用包括促进脂质和脂溶性维生素的分散和吸 收(Brunton，第38章：Goodman&Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第9版，Hardman等人编著，McGraw-Hill，New York， 1996，第934-935页)。各种天然胆汁盐和它们的合成衍生物作为渗透增 强剂起作用。因此术语“胆汁盐”包括任何胆汁中天然存在的成分和任何它 们的合成衍生物。合适的胆汁盐包括例如胆酸(或其药学上可接受的钠盐， 胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、甘胆酸(甘胆酸 钠)、甘氨胆酸(甘氨胆酸钠)、甘氨脱氧胆酸(甘氨脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸 (牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸 钠)、熊脱氧胆酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氢-梭链孢酸钠(STDHF)、甘氨二 氢梭链孢酸钠和聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，第92页；Swinyard，第39章 于：Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Gennaro编辑， MackPublishing Co.，Easton，Pa.，1990，第782-783页中；Muranishi， Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33； Yamamoto等人，J.Pharm.Exp.Ther.，1992，263，25；Yamashita等人， J.Pharm.Sci.，1990，79，579-583)。

螯合剂：如在本发明的背景中所用的，螯合剂可以定义为通过与金属 离子形成复合物将其从溶液中除去的化合物，结果是加强dSRNA通过粘 膜的吸收。关于它们在本发明中作为渗透增强剂的应用，因为大多数鉴定 的DNA核酸酶需要二价金属离子用于催化反应而因此受到螯合剂的抑 制，螯合剂还具有作为DNase抑剂剂的附加优势(Jarrett，J.Chromatogr.， 1993，618，315-339)。合适的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(如水杨酸钠、5-甲氧基水杨酸盐和高香草酸 盐)、胶原的N-酰基衍生物、月桂醇聚醚(laureth)-9和β-二酮的N-氨基酰 基衍生物(烯胺)(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，第92页；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33；Buur 等人，J.Control Rel.，1990，14，43-51)。

非螯合的非表面活性剂：如本文所使用的，非螯合的非表面活性剂渗 透增强化合物可以定义为显示出不显著的螯合剂或表面活性剂的活性但 是仍可增强dsRNA通过消化道粘膜的吸收的化合物(Muranishi， Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems，1990，7，1-33)。这 类渗透增强剂包括例如不饱和环脲、1-烷基-和1-链烯基氮杂环-烷酮衍生 物(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991， 第92页)，以及非甾族抗炎剂如双氯芬酸钠、吲哚美辛和苯基丁氮酮 (Yamashita等人，J.Pharm.Pharmacol.，1987，39，621-626)。

增强dsRNA在细胞水平上的摄取的试剂也可以加入到本发明的药物 组合物和其他组合物中。例如，已知阳离子型脂质如lipofectin(Junichi等 人，美国专利No.5,705,188)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子如聚赖 氨酸(Lollo等人，PCT申请WO 97/30731)也增强dsRNA的细胞摄取。

其他试剂也可以用于增强所施用的核酸的渗透，包括二醇类(如乙二 醇和丙二醇)、吡咯类(如2-吡咯)、氮酮类(azones)和萜类(如柠檬烯和薄荷 酮)。

载体

本发明的dsRNA可以配制成药学上可接受的载体或稀释剂。“药学上 可接受的载体”(本文也称为“赋形剂”)是药学上可接受的溶剂、悬浮剂或其 他任何药用惰性媒介物。药学上可接受的载体可以是液体或固体，且可以 考虑预计的给药方式对其进行选择以提供理想的体积、稠度以及其他相关 的转运和化学性质。典型的药学上可接受的载体包括(举例来说)，但不限 于：水，盐水溶液，粘合剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)， 填料(如乳糖和其他糖类、明胶或硫酸钙)，润滑剂(例如，淀粉、聚乙二醇 或醋酸钠)；崩解剂(如淀粉或淀粉乙醇酸钠)和润湿剂(如月桂基硫酸钠)。

本发明的某些组合物还在制剂中掺入载体化合物。如本文所使用的， “载体化合物”或“载体”可以指核酸或其类似物，它是惰性的(即本身不具 有生物活性)，但却被降低具有生物活性的核酸的生物利用度(例如通过降 解生物活性核酸或促进其从循环系统中除)的体内过程识别为核酸。核酸 和载体化合物的共同施用(典型的是后一种物质过量)能够导致从肝、肾或 其他循环外脏器中回收的核酸量显著减少，据推测原因是载体化合物和核 酸之间竞争共同的受体。例如，当与聚肌苷酸、葡聚糖硫酸酯、聚胞嘧啶 核苷酸(polycytidic acid)或4-乙酰胺基-4’-异硫氰基-芪-2,2’-二磺酸共同施 用时，可以减少部分地硫代磷酸酯化的dsRNA在肝组织中的回收(Miyao 等人，DsRNA Res.Dev.，1995，5，115-121；Takakura等人，DsRNA&Nucl. Acid Drug Dev.，1996，6，177-183)。

赋形剂

与载体化合物相比，“药物载体”或“赋形剂”是用于向动物递送一种或 多种核酸的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或任何其他药学惰性媒介物。所 述赋形剂可以是液体或固体，且考虑预计的给药方式进行选择以在与核酸 和特定药物组合物的其他组分组合时提供理想的体积、稠度等。典型的药 物载体包括但不限于粘合剂(如预胶化的玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮或 羟丙基甲基纤维素等)，填料(如乳糖和其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)，润滑剂(如硬脂酸镁、 滑石、二氧化硅、胶状二氧化硅、硬脂酸、硬脂酸金属盐、氢化植物油、 玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)，崩解剂(如淀粉、淀粉乙醇 酸钠等)，和湿润剂(如月桂基硫酸钠等)。

不与核酸发生有害反应的、适合于肠胃外施用的药学上可接受的有机 或无机赋形剂也可以用来配制本发明的组合物。合适的药学上可接受的载 体包括但不限于水、盐溶液、醇类、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、 硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等。

用于局部施用核酸的制剂可以包括在普通溶剂(如醇类)中的无菌或 非无菌的水性溶液、非水性溶液，或者核酸在液体或固体油基质中的溶液。 该溶液还可以包含缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂。可以使用不与核 酸发生有害反应的、适合于非肠胃外施用的药学上可接受的有机或无机赋 形剂。

合适的药学上可接受的赋形剂包括但不限于是：水、盐溶液、醇、聚 乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟 甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等。

其它成分

本发明的组合物可以另外包含以本领域熟知的使用水平在药物组合 物中常用的其他辅助组分。因此，例如组合物可以包含额外的、相容性的 药学活性物质如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可以包含可 用于物理配制本发明组合物的各种剂型的其他物质，如染料、芳香剂、防 腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当加入这类物质时， 它们不应当过度干扰本发明组合物的成分的生物活性。该制剂可以进行灭 菌，并且如果需要的话，可以与助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、 乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色物质、调味剂和/或芳香物 质等混合，它们不与制剂中的核酸发生有害的相互作用。

水性悬浮液可以包含提高悬浮液粘性的物质，包括例如羧甲基纤维素 钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液还可以包含稳定剂。

联合治疗

一方面，本发明的组合物例如，ALN-VSP02可以用于联合治疗。术 语“联合治疗”包括与其他生物活性成分(例如，但不限于，第二和不同的 抗肿瘤剂)和非药物疗法(例如，但不限于手术或放射治疗)进一步组合施 用主题化合物。例如，本发明的化合物可以与其他药学活性化合物、优选 能够提高本发明的化合物的效果的化合物组合使用。本发明的化合物可以 与其他药物治疗同时施用(作为单一制剂或单独的制剂)或顺序施用。一般 地，联合治疗包括在治疗的单个周期或疗程中施用两种或多种药物。

在本发明的一个方面，主题化合物可以与调节涉及各种疾病状态的蛋 白激酶的一种或多种单独药剂组合施用。这种激酶的实例可以包括但不限 于：丝氨酸/苏氨酸特异性激酶、受体酪氨酸特异性激酶和非受体酪氨酸 特异性激酶。丝氨酸/苏氨酸激酶包括有丝分裂原激活的蛋白激酶 (MAPK)、减数分裂特异性激酶(MEK)、RAF和极光激酶(aurorakinase)。 受体激酶家族的实例包括表皮生长因子受体(EGFR)(例如，HER2/neu、 HER3、HER4、ErbB、ErbB2、ErbB3、ErbB4、Xmrk、DER、Let23)，成 纤维细胞生长因子(FGF)受体(例如，FGF-R1、GFF-R2/BEK/CEK3、 FGF-R3/CEK2、FGF-R4/TKF、KGF-R)，肝细胞生长/离散因子受体 (HGFR)(例如，MET、RON、SEA、SEX)、胰岛素受体(例如，IGFI-R)， Eph(例如，CEK5、CEK8、EBK、ECK、EEK、EHK-I、EHK-2、ELK、 EPH、ERK、HEK、MDK2、MDK5、SEK)，AxI(例如，Mer/Nyk、Rse)， RET和血小板源性生长因子受体(PDGFR)(例如，PDGFα-R、PDGβ-R、 CSFl-R/FMS、SCF-R/C-KIT、VEGF-R/FLT、NEK/FLK1、 FLT3/FLK2/STK-1)。非受体酪氨酸激酶家族包括但不限于BCR-ABL(例 如，p43^abl、ARG)，BTK(例如，ITK/EMT、TEC)，CSK、FAK、FPS、JAK、 SRC、BMX、FER、CDK和SYK。

在本发明的另一方面，主题化合物可以与调节非激酶的生物靶标或过 程的一种或多种试剂组合施用。这些靶标包括组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)、 DNA甲基转移酶(DNMT)、热休克蛋白(例如，HSP90)以及蛋白体。

在一个实施方案中，主题化合物可与抑制一种或多种生物靶标的抗肿 瘤药(例如，小分子、单克隆抗体、反义RNA和融合蛋白)组合，如伏立 诺他胶囊(Zolinza)、它赛瓦(Tarceva)、易瑞沙(Iressa)、泰克泊(Tykerb)、 格列卫(Gleevec)、索坦(Sutent)、扑瑞赛(Sprycel)、多吉美(Nexavar)、索拉 非尼(Sorafenib)、CNF2024、RG108、BMS387032、Affmitak、阿瓦斯汀 (Avastin)、赫赛汀(Herceptin)、爱必妥(Erbitux)、AG24322、PD325901、 ZD6474、PD 184322、Obatodax、ABT737和AEE788。这样的组合可以 获得与单独的任何试剂所取得的疗效相比增强的疗效，且可以防止或延缓 抗药性突变变种的出现。

在某些优选实施方案中，本发明的化合物与化疗药物组合施用。化疗 药物包括肿瘤领域内的宽范围的治疗性处理。出于缩小肿瘤、消灭手术后 剩余的残留癌细胞、诱导症状消退、维持症状消退和/或减轻与癌症或其 治疗相关的症状的目的，在疾病的不同阶段施用这些药剂。这类药剂的实 例包括但不限于：烷化剂如芥子气衍生物(氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、 美法仑、异环磷酰胺)、乙撑亚胺(ethylenimine)(噻替哌、六甲基蜜胺(hexamethylmelanine))、烷基磺酸酯(白消安)、肼和三嗪(克瘤灵 (Altretamine)、甲基苄肼、氮烯唑胺和替莫唑胺)、亚硝基脲(卡氮芥、洛 莫司汀和链脲菌素)、异环磷酰胺和金属盐(卡铂、顺铂、奥沙利铂)；植物 生物碱，例如鬼臼毒素(Podophyllotoxin)(依托泊苷和Tenisopide)、紫杉烷 类(紫杉醇和多西紫杉醇)、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、长春地辛和 长春瑞滨)和喜树碱(Camptothecan)类似物(伊立替康(Irinotecan)和拓扑替 康(topotecan))；抗肿瘤抗生素，如色霉素(更生霉素和普卡霉素 (Plicamycin))、蒽环类(多柔比星、柔红霉素、表柔比星、米托蒽醌、戊柔 比星(Valrubicin)和依达比星)和各种抗生素，如丝裂霉素、放线菌素和博 莱霉素；抗代谢物，如叶酸拮抗剂(甲氨蝶呤、培美曲塞(Pemetrexed)、雷 替曲塞(Raltitrexed)、氨基喋呤(Aminopterin))、嘧啶拮抗剂(5-氟尿嘧啶、 氟尿苷、阿糖胞苷、卡培他滨和吉西他滨)、嘌呤拮抗剂(6-巯基嘌呤和6- 硫鸟嘌呤)及腺苷脱氨酶抑制剂(克拉屈滨、氟达拉滨、巯嘌呤、氯法拉滨、 硫鸟嘌呤、奈拉滨(nelarabine)和喷司他丁)；拓扑异构酶抑制剂如拓扑异 构酶I抑制剂(伊立替康(ironotecan)、拓扑替康)和拓扑异构酶II抑制剂(安 吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷)；单克隆抗体(阿仑单抗、吉 妥珠单抗奥唑米星(Gemtuzumab ozogamicin)、美罗华、曲妥珠单抗 (trastuzumab)、替伊莫单抗(Ibritumomab Tioxetan)、西妥昔单抗、帕尼单抗(panitumumab)、托西莫单抗(Tositumomab)、贝伐单抗(bevacizumab)； 和各种抗肿瘤药，如核苷酸还原酶抑制剂(羟基脲)；肾上腺皮质类固醇抑 制剂(米托坦)；酶(天冬酰胺酶和培门冬酶)；抗微管药物(雌莫司汀)；和类 维生素A(蓓萨罗丁(Bexarotene)、异维A酸、维甲酸(ATRA))。在某些优 选的实施方案中，本发明的化合物与化疗保护剂组合施用。化疗保护剂发 挥作用以保护身体或减少化疗的副作用。这类药剂的实例包括但不限于阿 米福汀(amfostine)、美司钠(mesna)和右雷佐生(dexrazoxane)。

在本发明的一个方面，主题化合物与放射治疗结合施用。通常利用光 子(X射线或伽玛射线)或粒子辐射的机器从内部(靠近癌症位点植入放射 性材料)或从外部传送辐射。在联合治疗还包括放射治疗的情况中，可在 任何适当的时间进行放射治疗，只要由治疗药物和放射治疗的共同作用实 现有益的效果。例如，在合适的情况下，当暂时将放射治疗与治疗药物施 用分开(可能数天甚至数周)时，仍然取得有益的作用。

可以理解，本发明的化合物可以与免疫治疗剂组合使用。免疫治疗的 一种形式是通过在远离肿瘤的位置施用疫苗组合物产生宿主源的主动全 身性肿瘤特异性免疫反应。已经提出各种不同类型的疫苗，包括分离的肿 瘤抗原疫苗和抗个体基因型疫苗。另一种方法是利用来自待治疗的受试者 的肿瘤细胞或者这种细胞的衍生体(Schirrmacher等人(1995)J.Cancer Res. Clin.Oncol.121：487综述)。在美国专利第5,484,596号中，HannaJr.等人 要求保护用于处理可切除的癌以防止肿瘤复发或转移的方法：包括手术去 除肿瘤，用胶原酶分散细胞，照射细胞，并用至少三次约10⁷个细胞的连 续剂量对患者进行免疫。

可以理解的是本发明的化合物可以有利地与一种或多种辅助治疗药 物组合使用。合适的用于辅助治疗的药剂的实例包括：类固醇类，例如皮 质类固醇(包括但不限于安西缩松、倍他米松、倍他米松二丙酸酯、倍他 米松戊酸酯、布地奈德、氯倍他索、氯倍他索醋酸酯、氯倍他索丁酸酯、 氯倍他索17-丙酸酯、可的松、地夫可特、去羟米松、二氟米松戊酸酯、 地塞米松、地塞米松磷酸钠、地索奈德、糠酸酯、醋酸氟轻松、氟轻松、 哈西缩松、氢化可的松、氢化可的松丁酸酯、氢化可的松琥珀酸钠、氢化 可的松戊酸酯、甲基强的松龙、莫米松、泼尼卡酯、泼尼松龙、曲安西龙、 丙炎松和卤贝他索丙酸酯(HalobetasolPropionate))；5HTi激动剂，如曲坦 (triptan)(如舒马曲坦或那拉曲坦)；腺苷Al激动剂；EP配体；NMDA调 节剂，如甘氨酸拮抗剂；钠通道阻滞剂(如拉莫三嗪)；P物质拮抗剂(如 NKi拮抗剂)；大麻类物质；对乙酰氨基酚或非那西丁；5-脂氧合酶抑制 剂；白三烯受体拮抗剂；DMARD(如甲氨蝶呤)；加巴喷丁和相关化合物； 三环抗抑郁剂(如阿米替林)、神经元稳定抗癫痫药物；单胺能摄取抑制剂 (如文拉法辛)；基质金属蛋白酶抑制剂；一氧化氮合酶(NOS)抑剂剂，如 iNOS或nNOS抑制剂；肿瘤坏死因子α的释放或活性抑制剂；抗体治疗， 如单克隆抗体治疗；抗病毒剂，如核苷抑制剂(如拉米夫定)或免疫系统调 节剂(如干扰素)；阿片类止痛剂；局部麻醉剂；兴奋剂，包括咖啡因；H2- 拮抗剂(如雷尼替丁)；质子泵抑剂剂(如奥美拉唑)；抗酸剂(如氢氧化铝或 氢氧化镁)；抗气胀药(如二甲基硅油)、解充血剂(如苯肾上腺素、苯丙醇 胺、伪麻黄碱、羟甲唑啉、肾上腺素、萘唑啉、丁苄唑啉、丙己君(propylhexedrine)或左旋去氧麻黄碱)；镇咳药(如可待因、氢可酮、卡拉米 芬(carmiphen)、妥克拉司或右美沙芬)；利尿剂；或镇静和非镇静抗组胺 药。

在一个实施方案中，本发明的组合物与皮质类固醇组合施用。例如， 皮质类固醇可刚好在施用本发明的组合物(例如ALN-VSP02)之前施用。 在一个实施方案中，在施用siRNA的前一天晚上口服施用皮质类固醇， 且皮质类固醇与siRNA同一天静脉内施用。

本发明的化合物可以与靶向其他基因的siRNA共同施用。例如，本 发明的化合物可以与靶向c-Myc基因的siRNA共同施用。例如，AD-12115 可以与c-Myc siRNA共同施用。在美国专利申请12/373,039中公开了靶 向c-Myc的siRNA的实例，其通过引用并入本文。

药代动力学

本发明特别地涉及治疗有相应需要的受试者的方法，其中向受试者施 用组合物，例如ALN-VSP02，从而在受试者的血浆中产生可测量的C_max和AUC。本发明还涉及用于治疗有相应需要的受试者的组合物例如 ALN-VSP02，其中向受试者施用组合物例如ALN-VSP02在受试者的血浆 中产生可测量的C_max和AUC。对于组合物例如ALN-VSP02的VEGF和 KSP siRNA组分两者，例如对于siRNA AD-3133和AD-12115，C_max和 AUC是可测量的。

C_max被定义为施用剂量后药物的峰值血浆浓度。它是将组合物施用于 受试者后，组合物或者药物进入受试者血流的血浆中的生物利用度和吸收 率的指示。本领域的技术人员应了解，将组合物施用到受试者后，通过在 不同时间点获取患者血液的多个样品和测量各样品中组合物的血浆浓度 来测定C_max。在本发明的一个实施方案中，C_max与剂量浓度线性相关。在 一个方面，受试者血浆中VEGF或KSP siRNA的平均C_max是在0.4至 13μg/mL之间，该C_max范围与0.1至0.7mg/kg范围内的静脉内施用剂量 线性相关。在某些情况下，VEGF或KSP siRNA的平均C_max在约0.4至 1μg/mL、1.8至3μg/mL、2至5μg/mL或5至14μg/mL的范围内。在其它 情况下，VEGF或KSP siRNA的平均C_max值大于13μg/mL。

在另一方面，受试者血浆中KSP siRNA的平均C_max为0.4至13 μg/mL，和/或受试者血浆中VEGF siRNA的平均C_max为0.4至18μg/mL， C_max范围与0.1至1.0mg/kg范围内的静脉内施用剂量线性相关。在某些 情况下，KSP siRNA的平均C_max为约4.0至10.0μg/mL范围内。在其它 情况下，VEGF siRNA的平均C_max值为10至18μg/mL范围内。

下面的表格和实施例提供了在ALN-VSP02组合物的不同剂量下的平 均C_max值的值和范围。

AUC是指向患者施用剂量后，血流的血浆中药物或组合物的浓度随 时间变化的曲线的曲线下面积。它受药物或组合物吸收到患者血液的血浆 中的速率和从其中清除的速率的影响。如本领域的技术人员所知道的，可 以在施用组合物后，通过计算血浆组合物浓度的积分测定AUC。在另一 个方面，可以用下列公式预测AUC：

预测的AUC＝(D x F)/CL

其中D是剂量浓度，F是生物利用度的量度，和CL为预测清除率。 在本发明的一个实施方案中，对于静脉内给药的F约为1而在正常人体内 预测的平均CL约是1.21ml/(min*kg)。本领域的技术人员应理解，预测的 AUC值有±3-4倍范围的误差。

在一些实施方案中，施用组合物后，通过以各种不同的时间间隔从患 者获取血液样品来获得用于测定AUC的数据。在一个方面，施用组合物 例如ALN-VSP02后患者血浆中siRNA的平均AUC在约10至 1450μg*min/mL或约10至800μg*min/mL的范围内。在某些情况下，siRNA 的平均AUC在约10至50μg*min/mL、85至200μg*min/mL、160至 250μg*min/mL、300至800μg*min/mL或300至1450μg*min/mL的范围 内。在其它情况下，siRNA的平均AUC大于800μg*min/mL。

在另一方面，施用组合物例如ALN-VSP02后患者血浆中siRNA的平 均AUC为约10至1100μg*min/mL的范围内(对于KSP siRNA)和10至 1200μg*min/mL的范围内(对于VEGFsiRNA)。下面的表格和实施例提供 了在ALN-VSP02组合物的各种不同剂量下的平均AUC值的值和范围。

在一个实施方案中，对于受试者中以1.0mg/kg的剂量第一次施用组 合物例如ALN-VSP02，KSP siRNA的AUC_0-最后在15393.10±6002.12ng* 小时/mL的约80％至约125％内。对于受试者中以1.0mg/kg的剂量第二 次施用组合物例如ALN-VSP02，KSP siRNA的AUC_0-最后在约9984.02± 2517.30ng*小时/mL的80％至约125％内。

在一个实施方案中，对于受试者中以1.0mg/kg的剂量第一次施用组 合物例如ALN-VSP02，KSP siRNA的C_max在15314±5347.86ng/mL的约 80％至约125％内。在另一个实施方案中，对于受试者中以1.0mg/kg的剂 量第二次施用组合物例如ALN-VSP02，KSP siRNA的C_max在12440.80± 9615.15ng/mL的约80％至约125％内。

在一个实施方案中，对于受试者中以1.0mg/kg的剂量第一次施用组 合物例如ALN-VSP02，VEGF siRNA的AUC_0-最后在16404.33±7280.14ng* 小时/mL的约80％至约125％内。在另一个实施方案中，对于受试者中以 1.0mg/kg的剂量第二次施用组合物例如ALN-VSP02，VEGF siRNA的 AUC_0-最后在9563.98±2173.22ng*小时/mL的约80％至约125％内。

在一个实施方案中，对于受试者中以1.0mg/kg的剂量第一次施用组 合物例如ALN-VSP02，VEGF siRNA的C_max在15843.73±7014.77ng/mL 的约80％至约125％内。在另一个实施方案中，对于受试者中以1.0mg/kg 的剂量第二次施用组合物例如ALN-VSP02，VEGFsiRNA的C_max在 12681.94±8811.54ng/mL的80％至约125％内。

应该理解，由于涉及新陈代谢和/或与其它治疗药物的可能相互作用 方面的变异性，组合物如ALN-VSP02的血浆浓度在受试者之间可能会有 明显的变化。根据本发明的一个方面，化合物如ALN-VSP02的血浆药浓 度可能在受试者与受试者之间发生变化。同样，如最大血浆浓度(C_max)或 达到最大血浆浓度的时间(T_max)或者从时间零点到最后可测量浓度的时间 的曲线下面积(AUC_最后)或血浆浓度时间曲线下的总面积(AUC)的值在受 试者与受试者之间可能发生变化。由于这种变异性，构成“治疗有效量的” 化合物如ALN-VSP02所需的量在受试者与受试者之间可能发生变化。

用于治疗Eg5和VEGF基因表达引起的疾病的方法

本发明尤其涉及包含至少两种dsRNA(一种靶向Eg5/KSP基因，和一 种靶向VEGF基因)的组合物如ALN-VSP02等用于治疗癌症(例如肝癌) 的用途，例如用于抑制肿瘤生长和肿瘤转移。例如，组合物(如药物组合 物)可以用于治疗实体瘤如肝内肿瘤，例如可能发生在肝脏癌症中的肝内 肿瘤。

包含靶向Eg5/KSP的dsRNA和靶向VEGF的dsRNA的组合物也可 以用于治疗其他肿瘤和癌症，如乳腺癌、肺癌、头颈癌、脑癌、腹腔癌、 结肠癌、结肠直肠癌、食管癌、胃肠癌、神经胶质瘤、舌癌、神经母细胞 瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、威尔姆氏肿瘤、 多发性骨髓瘤，以及用于治疗皮肤癌如黑色素瘤，用于治疗淋巴瘤和血癌。 本发明还涉及包含Eg5dsRNA和VEGF dsRNA的组合物用于在不同类型 的癌症中抑制腹水液体和胸腔积液的聚积的用途，例如肝癌、乳腺癌、肺 癌、头部癌、颈部癌、脑癌、腹腔癌、结肠癌、结肠直肠癌、食管癌、胃 肠癌、神经胶质瘤、舌癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰癌、前列 腺癌、视网膜母细胞瘤、威尔姆氏肿瘤、多发性骨髓瘤、皮肤癌、黑色素 瘤、淋巴瘤和血癌。由于对Eg5和VEGF表达的抑制作用，根据本发明 的组合物或由其制备的药物组合物可以提高生活质量。

在一个实施方案中，治疗患有与AFP的表达相关的肿瘤或分泌AFP 的肿瘤(例如肝细胞瘤或畸胎瘤)的患者。在某些实施方案中，患者患有恶 性畸胎瘤、内胚窦瘤(卵黄囊癌)、神经母细胞瘤、肝胚细胞瘤、肝细胞癌、 睾丸癌或卵巢癌。

在再另一个方面，本发明提供了一种用于抑制哺乳动物中Eg5基因 和VEGF基因的表达的方法。该方法包括向哺乳动物施用具有本发明特 征的组合物以减少靶Eg5基因和靶VEGF基因的表达。

本发明还涉及dsRNA或其药物组合物例如，ALN-VSP02用于例如与 其他药物和/或其他治疗方法结合(如与已知的药物和/或已知的治疗方法， 如那些目前所应用于治疗癌症和/或用于防止肿瘤转移的方法结合)治疗 癌症或用于防止肿瘤转移的用途。优选的是与放射治疗和化疗剂如顺铂、 环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、柔红菌素或它莫西芬结合。

本发明还可以通过包括特定的RNAi剂，与另一种抗肿瘤化疗剂(如 任何常规化疗剂)组合实施。特定结合剂与这类其他药剂的组合可以加强 化学治疗方案。熟练的技术人员容易想到能引入到本发明的方法中的许多 化学治疗方案。可以使用任何化学治疗剂，包括烷化剂、抗代谢物、激素 和拮抗剂、放射性同位素以及天然物质。例如，本发明的化合物可以与抗 生素(如阿霉素)和其他蒽环类似物、氮芥类(如环磷酰胺)、嘧啶类似物(如 5-氟尿嘧啶)、顺铂、羟基脲、紫杉醇以及它的天然的和合成的衍生物等 一起施用。作为另一个实例，在其中肿瘤包括促性腺素依赖性细胞和非促 性腺素依赖性细胞的混合肿瘤(如乳腺的腺癌)的情况下，化合物可以与亮 丙瑞林或戈舍瑞林(LH-RH的合成肽类似物)联合施用。其他抗肿瘤方案包 括四环素化合物与另一种治疗方式(如手术、放射等)(本文也称为“辅助抗 肿瘤方式”)一起使用。因此，本发明的方法可以与这种常规疗法一起应用 而具有降低副作用和增强疗效的效果。

当要治疗的生物体为哺乳动物(如人)时，组合物可以通过本领域已知 的任意方式施用，包括但不限于经口或肠胃外途径，包括静脉内、肌肉内、 皮下、透皮、空气(气溶胶)、鼻、直肠和局部(包括口含和舌下)施用。在 优选的实施方案中，组合物通过静脉内输注或注射施用。

除了抑制VEGF和/或Eg5(KSP)的表达外，本发明的组合物和方法可 用于实现多种功能终点(functional endpoint)。这些功能终点包括但不限于， 例如与对照相比时，延长生存、防止肿瘤形成、减少肿瘤形成、降低肿瘤 生长速度、增加肿瘤细胞单星体的形成、增加肿瘤细胞异常有丝分裂象的 形成、减少肿瘤内出血和降低肿瘤微血管密度。

除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语与本发明所属的技 术领域中的普通技术人员通常所理解的意思相同。虽然在本发明的实施或 检验中可以使用与本文所描述的方法和物质类似或相同的方法和物质，但 是以下描述了合适的方法和物质。本文提及的所有出版物、专利申请、专 利和其他参考文献通过引用整体并入本文。在发生冲突的情况下，以本说 明书(包括定义)为准。另外，物质、方法和实施例仅为说明性的，并不意图限制本发明的范围。

实施例

实施例1.dsRNA合成

试剂来源

在本文没有特别给出试剂来源时，这种试剂可以以分子生物学应用的 质量/纯度标准从任何分子生物学试剂供应商处获取。

siRNA合成

为筛选dsRNA，利用Expedite 8909合成仪(Applied Biosystems， AppleraDeutschland GmbH，Darmstadt，Germany)和作为固相载体的可控 微孔玻璃(CPG，Proligo Biochemie GmbH，Hamburg，Germany)以1 微摩尔的规模通过固相合成产生单链RNA。通过分别利用相应的亚磷酰 胺和2′-O-甲基亚磷酰胺(Proligo Biochemie GmbH，Hamburg，Germany) 的固相合成产生RNA和包含2′-O-甲基核苷酸的RNA。利用标准的核苷亚磷酰胺化学反应(如在核酸化学的当前方法(current protocols in nucleic acidchemistry)(Beaucage，S.L.等人(编辑)，John Wiley&Sons，Inc.， New York，NY，USA)中所描述的化学反应)，在寡核苷酸链序列内的选 定位点处引入这些构建块(buildingblock)。通过用Beaucage试剂 (Chruachem Ltd，Glasgow，UK)的乙腈(1％)溶液替换碘氧化剂溶液引入硫 代磷酸酯键。进一步的辅助试剂从Mallinckrodt Baker(Griesheim，Germany) 获得。

根据已知的方法进行通过阴离子交换HPLC对粗制的寡核糖核苷酸 的脱保护和纯化。利用分光光度计(DU 640B，Beckman Coulter GmbH， Unterschleiβheim，Germany)通过各个RNA溶液在260nm波长的UV吸收 确定产量和浓度。通过在退火缓冲液(20mM磷酸钠，pH6.8；100mM氯 化钠)中混合等摩尔的互补链产生双链RNA，在85-90℃的水浴中加热3 分钟并在3-4小时的时间内冷却至室温。退火的RNA溶液储存在-20℃直 至使用。

带有5′-12-十二烷酸双癸酰胺基团(5′-12-dodecanoic acid bisdecylamidegroup)(本文称为″5′-C32-″)或5’-胆固醇基衍生基团(本文称 为″5′-Chol-″)的siRNA的合成根据WO 2004/065601中所述进行，除了对 于胆固醇基衍生物，氧化步骤利用Beaucage试剂进行以在核酸低聚物的 5’末端引入硫代磷酸酯键。

靶向Eg5基因的dsRNA

初始筛选组

完成siRNA的设计以鉴别靶向Eg5(也被称为KSP、KIF11、HSKP、 KNSL1和TRIP5)的siRNA。使用了对于人类Eg5基因的mRNA序列， NCBI登录号NM_004523。

靶向Eg5/KSP的siRNA序列(包括AD-12115)描述于2007年3月30 日提交的美国专利申请号11/694,215(现美国专利号7,718,629)和2010年4 月5日提交的美国分案专利申请号12/754,110(美国专利申请公布号 2011/0015250)中。为了所有的目的，这些申请的内容通过引用并入。特别 是，为了所有的目的，在这些申请中公开的siRNA序列例如表1和表2通过引用并入。如所描述的合成siRNA并进行活性分析。

靶向VEGF基因的dsRNA

在VEGF-A121的mRNA序列的外显子1-5中识别出四百个靶序列。 该mRNA参考序列是NM_003376。

靶向VEGF的siRNA序列(包括AD-3133)如2005年3月11日提交的 美国专利申请号11/078,073(美国专利公布号2006-0094032)和2006年1 月25日提交的美国部分继续专利申请号12/754,110(美国专利申请公布号 2006-0223770)中所描述的。为了所有的目的，这些申请的内容通过引用 并入。特别是，为了所有的目的，引用在这些申请中公开的siRNA序列， 例如表1和表2，通过引用并入。如所描述的合成siRNA和进行活性分析。

实施例2.通过细胞增殖对Eg5siRNA进行体外筛选

因为Eg5的沉默已被证明引起有丝分裂阻滞(Weil，D等人， [2002]Biotechniques33：1244-8)，所以细胞存活力测定用于siRNA活性筛 选。测试靶向Eg5的siRNA双链体对HeLa细胞生长抑制作用的影响。 在2007年3月30日提交的11/694,215号(现美国专利号为7,718,629)中提 供了结果。双链体AL-DP-6249表现出对细胞增殖抑制的最低IC50值。

实施例3.通过mRNA的抑制作用对Eg5 siRNA进行体外筛选

测试了靶向Eg5的siRNA双链体对HeLA S3细胞中KSP的mRNA 水平的影响。在2007年3月30日提交的11/694,215号专利申请(现美国 专利号7,718,629)中提供了结果。双链体AD-12115表现出强的KSP mRNA 反应的降低，具有0.60和0.41pM的IC20值、3.79和3.39pM的IC50值 和23.45和23.45pM的IC80值。

实施例4.单次推注施用LNP01配制siRNA后幼年大鼠中肝Eg5/KSP的沉默

从出生开始一直到约23天大，可以在生长的大鼠肝中检测到 Eg5/KSP表达。使用双链体AD-6248，在幼鼠中评估配制的Eg5/KSPsiRNA 的靶沉默。2007年3月30日提交的美国专利申请号11/694,215(现美国专 利号7,718,629)提供了AD-6248的序列和结果。

在用10mg/kg剂量的配制AD6248处理之后，获得肝Eg5/KSP mRNA 的统计显著性降低。

实施例5.静脉内输注LNP01配制VSP后大鼠肝VEGF的沉默

向大鼠施用包含两种siRNA的等摩尔混合物的“类脂质”制剂。如本 文所用，VSP指具有两种siRNA的组合物，一种针对Eg5/KSP，一种针 对VEGF。对于这个实验，使用针对VEGF的双链体AD3133和针对 Eg5/KSP的AD12115。由于在成年大鼠肝中几乎检测不到Eg5/KSP的表 达，因此只测量siRNA处理后的VEGF水平。

施用的siRNA双链体(VSP)

注：A、G、C、U-核糖核苷酸；c、u-2'-O-Me核糖核苷酸；s-硫逐磷 酸酯。

各个链的未修饰形式和各个siRNA的靶如下

方法

动物的给药。通过向股静脉中的两小时输注向成年雄性 Sprague-Dawley大鼠施用类脂质(“LNP01”)配制的siRNA。4只动物的组 接受5、10和15毫克/千克(mg/kg)体重剂量的配制siRNA。剂量水平指在 制剂中施用的siRNA双链体的总量。第四组接受磷酸盐缓冲盐水。在 siRNA输注结束后72小时处死动物。切除肝，在液氮中快速冷冻并粉碎 成粉末。

配制过程

类脂质ND98·4HCl(分子量1487)(上述式1)、胆固醇(Sigma-Aldrich) 和PEG-神经酰胺C16(Avanti Polar Lipids)用于制备脂质-siRNA纳米微粒。 制备在乙醇中的各储备液：ND98，133mg/mL；胆固醇，25mg/mL；PEG- 神经酰胺C16，100mg/mL。然后将ND98、胆固醇和PEG-神经酰胺C16 的储备液以42：48：10的摩尔比混合。合并后的脂质溶液与水性siRNA(在 pH值5的醋酸钠中)快速混合，以使得最终的乙醇浓度为约35-45％，且 最终的醋酸钠浓度为100-300mM。脂质-siRNA纳米微粒通常在混合时自 发形成。根据所需粒度分布，在某些情况下，产生的纳米微粒混合物使用 热桶挤出机(Lipex挤出机，Northern Lipids，Inc)通过聚碳酸酯膜(100nm 的截止值)挤出。在其它情况下，挤出步骤省略。通过透析或切向流过滤 实现乙醇去除和同时的缓冲液交换。缓冲液与pH值7.2的磷酸盐缓冲盐 水(PBS)交换。

制剂的鉴定

通过标准方法或无挤出法制备的制剂可以以类似的方式表征。制剂首 先通过目视检查来表征。它们应该是不含聚集体或沉积物的发白的半透明 溶液。使用MalvernZetasizer Nano ZS(Malvern，USA)通过动态光散射测 量脂质-纳米微粒的微粒大小和粒度分布。微粒大小应该是约20-300nm， 理想地为40-100nm。粒度分布应该是单峰的。使用染料排除法评估制剂 中的总siRNA浓度以及捕获分数。在制剂破坏表面活性剂(0.5％的Triton-X100)存在或不存在的情况下，配制的siRNA的样品与RNA结合 染料Ribogreen(Molecular Probe)一起孵育。通过来自含表面活性剂的样品 的信号相对于标准曲线确定制剂中的总siRNA。通过从总siRNA含量减 去“游离的”siRNA含量(如通过不存在表面活性剂的情况下的信号所测量 的)确定捕获分数。捕获siRNA的百分比通常＞85％。对于SNALP制剂， 微粒大小为至少30nm，至少40nm，至少50nm，至少60nm，至少70nm， 至少80nm，至少90nm，至少100nm，至少110nm和至少120nm。优选 的范围为约至少50nm至约至少110nm，优选约至少60nm至约至少 100nm，最优选约至少80nm至约至少90nm。在一个实例中，各微粒大小包含至少约1：1比例的Eg5dsRNA与VEGF dsRNA。

mRNA的测量。在含有蛋白酶K的组织裂解缓冲液中对各肝粉末样品 (约10毫克)进行匀浆化。对于各个样品，使用Quantigene分支DNA测定 (GenoSpectra)一式三份地测量VEGF和GAPDH mRNA的水平。对于各个 样品，VEGF的平均值相对于GAPDH平均值标准化。确定组平均值，并 对于各个实验相对于PBS组标准化。

蛋白质测量。在1毫升RIPA缓冲液中，对各个肝粉末样品(约60毫 克)进行匀浆。使用Micro BCA蛋白质检测试剂盒(Pierce)确定总蛋白浓度。 使用VEGF ELISA测定(R&D系统)，来自各动物的总蛋白样品用于确定 VEGF蛋白水平。确定组平均值，并相对于各实验的PBS组标准化。

统计分析。通过按照Tukey post-hoc检验的ANOVA确定显著性。

结果

数据总结

对于各处理组给出mRNA(VEGF/GAPDH)和蛋白质(rel.VEGF)的平 均值(±标准差)。对于各实验，显示相对于PBS组的统计显著性(p值)。

表1.

	VEGF/GAPDH	p值	rel VEGF	p值
					PBS	1.0±0.17		1.0±0.17
5mg/kg	0.74±0.12	<0.05	0.23±0.03	<0.001
					10mg/kg	0.65±0.12	<0.005	0.22±0.03	<0.001
15mg/kg	0.49±0.17	<0.001	0.20±0.04	<0.001

在所有3个siRNA剂量水平上，测得肝VEGF mRNA和蛋白质的统 计显著性减少。

实施例6.人类肝脏肿瘤的小鼠模型中VSP SNALP的评估。

这些研究利用含有靶向KSP/Eg5的dsRNA和靶向VEGF的dsRNA 的VSP siRNA混合物(cocktail)。如本文所用，VSP指具有两种siRNA的 组合物，一种针对Eg5/KSP，一种针对VEGF。对于这个实验，使用双链 体AD3133(指向VEGF)和AD12115(指向Eg5/KSP)。在SNALP中配制 siRNA混合物。

最大的研究规模使用20-25只小鼠。为了测试siRNA SNALP混合物 治疗肝癌的疗效，将1x10^6个肿瘤细胞直接注射到试验小鼠的左侧叶中。 通过缝合封闭切口，并使得小鼠恢复2-5小时。小鼠在48-72小时内完全 恢复。在接种肿瘤后8-11天开始SNALP siRNA的处理。

采用的SNALP制剂是：(i)VSP(KSP+VEGF siRNA混合物(1：1摩尔 比))；(ii)KSP(KSP+Luc siRNA的混合物)和(iii)VEGF(VEGF+Luc siRNA 的混合物)。所有制剂包含等量(毫克)的各种活性siRNA。所有小鼠接受总 的siRNA/脂质剂量，且使用初始的柠檬酸缓冲液条件，将各混合物配制 成1：57的cDMA SNALP(1.4％的PEG-cDMA；57.1％的DLinDMA，7.1％ 的DPPC；和34.3％的胆固醇)，6：1的脂质：药物。

人Hep3B研究A：VSP-SNALP的抗肿瘤活性

通过肝内接种在scid/beige小鼠中建立人肝癌细胞Hep3B肿瘤。向组 A(n＝6)动物施用PBS；向组B(n＝6)动物施用VSP SNALP；向组C(n＝ 5)动物施用KSP/Luc SNALP；和向组D(n＝5)动物施用VEGF/Luc SNALP。

在肿瘤接种后8天开始SNALP处理。每周两次(星期一及星期四)以 3mg/kg的总siRNA给予SNALP，总计6个剂量(累计18mg/kg的siRNA)。 在第25天施用最终剂量，且终点是第27天。

通过(a)体重；(b)肝重量；(c)在第27天的目测+摄影；(d)人特异性的 mRNA分析；和(e)在第27天测量的血液甲胎蛋白水平检测肿瘤负荷。

下面的表2说明在接种的(左侧)肝叶中测量的肿瘤负荷的视觉评分结 果。评分：“-”＝没有可见的肿瘤；“+”＝注射部位具有肿瘤组织的迹象； “++”＝从肝叶突出的离散的肿瘤结节；″+++″＝从肝叶两侧突出的大肿 瘤；″++++″＝大的肿瘤，在整个肝叶上的多个结节。

表2.

作为体重的百分比的肝脏重量如图1所示。

体重如图2A-2D所示。

从该研究得出以下结论。(1)VSP SNALP在Hep3B 1H模型中表现出 强的抗肿瘤效果；(2)VSP混合物的抗肿瘤活性似乎在很大程度上与KSP 成分有关；(3)通过单剂量组织学分析证实了抗KSP的活性；和 (4)VEGF siRNA在此模型中没有显示出对于肿瘤生长抑制的可测量的效 应。

人类Hep3B的研究B：用VSP治疗延长存活时间

在第二项Hep3B研究中，通过向scid/beige小鼠肝内接种建立人类肝 癌Hep3B肿瘤。这些小鼠缺乏淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞，这是免疫 介导的抗肿瘤作用的最小范围。组A(n＝6)小鼠未处理；向组B(n＝6)小 鼠施用荧光素酶(Luc)1955SNALP(批号AP10-02)；和向组C(n＝7)小鼠施 用VSP SNALP(批号AP10-01)。SNALP为1:57的cDMA SNALP和6:1的脂质:药物。

在肿瘤接种后8天开始SNALP处理。每周两次(星期一及星期四)以 3mg/kg的siRNA给予SNALP，总计6个剂量(累计18mg/kg的siRNA)。 在第25天施用最终剂量，和研究终点是第27天。

通过(1)体重；(2)在第27天的目视检查+摄影；(3)人特异性mRNA分 析；和(4)在第27天测量的血液甲胎蛋白测量肿瘤负荷。

在给药的各天(第8、11、14、18、21和25天)和处死的那天测量体 重(图3)。

表3.

评分：“-”＝没有可见的肿瘤；“+”＝注射部位具有肿瘤组织的迹象； “++”＝从肝叶突出的离散的肿瘤结节；”+++″＝从肝叶两侧突出的大肿 瘤；″++++”＝大的肿瘤，在整个肝叶中的多个结节。

体重和肿瘤负荷之间的相关性如图4、5和6所示。

给予Hep3B小鼠单剂量的VSP SNALP(2mg/kg)也导致在通过组织学 染色检验的肝组织样品中形成有丝分裂纺锤体。

通过定量RT-PCR(pRT-PCR)(Taqman)量化肿瘤负荷。通过物种特异 性Taqman测定将人GAPDH相对于小鼠GAPDH标准化。上表中通过肉 眼观察表明的肿瘤评分与GADPH水平相关(图7A)。

进行血清ELISA以测量肿瘤分泌的甲胎蛋白(AFP)。如下所述，如果 AFP水平在治疗后下降，则肿瘤没有增长。与对照的处理相比，一些动物 中VSP处理降低AFP水平(图7B)。

人HepB3研究C：

在第三项研究中，将人HCC细胞(HepB3)直接注入SCID/beige小鼠 的肝中，并在20天后开始处理。向组A动物施用PBS；向组B动物施用 4mg/kg Luc-1955SNALP；向组C动物施用4mg/kg SNALP-VSP；向组D 动物施用2mg/kg SNALP-VSP；和向组E动物施用1mg/kgSNALP-VSP。 处理是使用单次静脉内(iv)给药，并在24小时后处死小鼠。

通过qRT-PCR(Taqman)测定肿瘤负荷和靶沉默。也如上所述，目视 地测量肿瘤评分，结果如下表所示。如图8所示，hGAPDH水平与如下 表所示的肉眼观察的肿瘤评分相关。

表4.

评分：“+”＝可变的肿瘤获取量/一些小的肿瘤，“++”＝从肝叶突出的 离散的肿瘤结节；″+++″＝从肝叶两侧突出的大肿瘤。

通过TaqMan分析测定人(肿瘤来源的)KSP沉默，且结果如图10所 示。hKSP的表达相对于hGAPDH标准化。在4mg/kg的SNALP-VSP下 观察到约80％的肿瘤KSP沉默，且在1mg/kg下疗效是明显的。图9中的 透明条代表小(低GAPDH)肿瘤的结果。

通过TaqMan分析检测人(肿瘤来源的)VEGF沉默，且结果如图10所 示。hVEGF的表达相对于hGAPDH标准化。在4mg/kg的SNALP-VSP 下观察到约60％的肿瘤VEGF沉默，且在1mg/kg下疗效是明显的。图10 中的透明条代表小(低GAPDH)肿瘤的结果。

通过TaqMan分析检测小鼠(肝源的)VEGF沉默，且结果如图11A所 示。mVEGF的表达相对于hGAPDH标准化。在4mg/kg的SNALP-VSP 下观察到约50％的肝VEGF沉默，且在1mg/kg下疗效是明显的。

人HepB3研究D：各dsRNA对肿瘤生长的影响

在第四项研究中，将人HCC细胞(HepB3)直接注射入SCID/beige小 鼠的肝中，并在8天后开始处理。每周两次用静脉内(iv)推注治疗，总计 6个剂量。在第25天施用最终剂量，且终点是第27天。

通过总的组织学(gross histology)、人特异性的mRNA分析 (hGAPDH qPCR)和血液甲胎蛋白水平(通过ELISA的血清AFP)检测肿瘤 负荷。

在研究1中，用PBS处理组A，用SNALP-KSP+Luc(3mg/kg)处理组 B，用SNALP-VEGF+Luc(3mg/kg)处理组C，和用ALN-VSP02(3mg/kg) 处理组D。

在研究2中，用PBS处理组A，用SNALP-KSP+Luc(1mg/kg)处理组 B，用ALN-VSP02(1mg/kg)处理组C。

在用ALN-VSP02处理后，GAPDH mRNA水平和血清AFP水平都显 示下降(图11B)。

组织学研究：

通过在小鼠中肝内接种建立人肝癌Hep3B肿瘤。在肿瘤接种后20天 开始SNALP处理。以2mg/kg的总siRNA通过单次静脉内(IV)给予 (i)VSP SNALP或(ii)对照(Luc)SNALP处理荷瘤小鼠(每组三只)。

单次SNALP施用后24小时收集肝/肿瘤样品用于常规H&E组织学研 究。

尸检时，大的肉眼观察的肿瘤结节(5-10毫米)是明显的。

ALN-VSP在Hep3B小鼠中的效应：

ALN-VSP(KSP dsRNA和VEGF dsRNA的混合物)的处理减小肿瘤负 荷和肿瘤源性KSP和VEGF的表达。也观察到GAPDH mRNA水平(作为 肿瘤负荷的量度)在施用ALN-VSPdsRNA后下降(见图12A-12C)。通过视 觉肉眼观察的肿瘤负荷的减少在施用ALN-VSP之后也是明显的。

单次静脉内推注ALN-VSP也导致有丝分裂纺锤体的形成，其在 Hep3B小鼠肝组织标本可明显地检测到。这个现象表明细胞周期阻滞。

实施例7a.SNALP-VSP动物相对于SNALP-Luc处理动物的存活

为了测试siRNA SNALP对于癌症受试者的生存率的影响，通过在小 鼠中肝内接种建立肿瘤，并用SNALP-siRNA处理小鼠。这些研究利用了 含有靶向KSP/Eg5和VEGF的dsRNA的VSP siRNA混合物。对照是靶 向Luc的dsRNA。在SNALP中配制siRNA混合物。

将肿瘤细胞(人肝癌Hep3B，1x10^6个)直接注射到scid/beige小鼠的 左侧叶中。这些小鼠缺乏淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞，这是免疫介导 的抗肿瘤作用的最小范围。通过缝合封闭切口，并允许小鼠恢复2-5小时。 小鼠在48-72小时内完全恢复。

所有小鼠接受总的siRNA/脂质静脉内注射(iv)剂量，且各混合物使用 原始的柠檬酸缓冲条件配制成1:57的cDMA SNALP(1.4％的 PEG-cDMA；57.1％的DLinDMA，7.1％的DPPC；和34.3％的胆固醇)， 6:1的脂质:药物。

肿瘤接种后，在下面指明的天数(18或26天)开始siRNA-SNALP处 理。在4mg/kg剂量施用18或26天之后，每周两次施用siRNA-SNALP， 进行3周。监测存活率，并基于人道替代终点(humane surrogate endpoint) (如动物的体重、腹胀/变色以及整体健康)对动物实施安乐死。

观察到肿瘤后18天开始治疗的生存数据总结于表5、表6和图13A 中。

表5.Kaplan-Meier(生存)数据(存活％)

表6.各个动物的存活天数.

动物	处理组	存活
				1	SNALP-Luc	28	天
2	SNALP-Luc	33	天
				3	SNALP-Luc	33	天
4	SNALP-Luc	33	天
				5	SNALP-Luc	36	天
6	SNALP-Luc	38	天
				7	SNALP-Luc	57	天
8	SNALP-VSP	38	天
				9	SNALP-VSP	51	天
10	SNALP-VSP	51	天
				11	SNALP-VSP	51	天
12	SNALP-VSP	53	天
				13	SNALP-VSP	53	天
14	SNALP-VSP	57	天
				15	SNALP-VSP	57	天

图13A显示SNALP-VSP动物和SNALP-Luc处理的动物相对于肿瘤 接种后的天数的平均存活率。SNALP-VSP动物的平均存活时间相对于 SNALP-Luc处理的动物延长约15天。

表7.对于各动物在处理前和处理结束时的血清甲胎蛋白(AFP)的浓 度(浓度以μg/ml计)

在实验过程中，使用血清AFP水平监测肿瘤负荷。甲胎蛋白(AFP) 是胎儿期过程中由卵黄囊和肝产生的主要血浆蛋白。这种蛋白质被认为是 血清白蛋白的胎儿对应物，且人AFP和白蛋白基因按相同的转录方向成 串地存在于第4染色体上。AFP被发现以单体以及二聚体和三聚形式存 在，并结合铜、镍、脂肪酸和胆红素。AFP水平在出生后逐渐降低，到 8-12个月达到成人水平。正常成人的AFP水平较低，但可检测到。AFP 在正常成人中没有已知的功能，且在成人中的AFP表达通常与肿瘤的子 集(如肝癌和畸胎瘤)相关。AFP是用于监测睾丸癌、卵巢癌和恶性畸胎瘤 的肿瘤标志物。分泌AFP的原发肿瘤包括内胚窦瘤(卵黄囊癌)、神经母细 胞瘤、肝母细胞瘤和肝细胞癌。在患有AFP分泌肿瘤的患者中，AFP的 血清水平往往与肿瘤大小关联。血清水平可用于评估对于治疗的反应。通 常情况下，如果AFP水平在治疗后下降，则肿瘤没有增长。化疗后立即 出现的AFP的暂时增加可能表明肿瘤并不是在增长而是在缩小(并随着肿 瘤细胞死亡而释放AFP)。切除通常与血清水平下降相关。如图14所示， SNALP-VSP处理的动物中的肿瘤负荷明显降低。

实施例7b.ALN-VSP延长存活

本文中所用的，ALN-VSP是指脂质配制的靶向VEGF和KSP(Eg5) 的siRNA。该siRNA是靶向KSP的ALN-12115和靶向VEGF的ALN-3133。 脂质制剂是SNALP制剂(本文所述)且包括DLinDMA、DSPC、 mPEG2000-C-DMA和胆固醇。

如本文所述的将Hep3B细胞肝内植入以建立肿瘤。在肿瘤植入后26 天开始每周两次施用4mg/kg的ALN-VSP或SNALP-Luc，持续三周。根 据人道替代终点对动物进行安乐死。如图13B中所示，与SNALP-Luc处 理的动物相比，ALN-VSP动物的平均存活时间延长了约50％。

实施例8a.原位HCC模型中单星体的诱导

在分裂的细胞中KSP的抑制导致可在组织切片中容易观察到的单星 体形成。如本文所述的使用原位小鼠肝脏肿瘤模型。简单地说，将人肝细 胞瘤细胞(Hep3B)或人结肠直肠癌细胞(HCT116)肝内注射到scid/beige小 鼠的左侧叶中。

为了确定在SNALP-VSP处理的肿瘤中是否出现单星体形成，向荷瘤 动物(在Hep3B细胞植入后3周)经尾静脉注射施用2mg/kg的 SNALP-VSP。对照动物接受2mg/kg的SNALP-Luc。24小时后，处死动 物，并处理荷瘤肝叶以进行组织学分析。H&E染色组织切片的典型图像 如图15中所示。广泛的单星体形成在ALN VSP02处理的肿瘤(图15A) 中是明显的，但不是在SNALP-Luc处理的肿瘤(图15B)中。在后者中， 正常的有丝分裂象是明显的。单星体的产生是KSP抑制的特有特征，并 提供表明SNALP-VSP在建立的肝脏肿瘤中具有显著活性的进一步证据。

实施例8b.腹膜内HCC模型中单星体的诱导

建立了小鼠HEP3B转移模型并用于测定ALN-VSP处理对腹膜内 HEP3B肿瘤中单星体形成的影响。HEP3B细胞从ATCC获得并经工程化 以稳定表达萤火虫荧光素酶。Fox scidbeige小鼠(8-9周龄)从Charles River 实验室获得。悬浮在100cc无菌PBS中的1毫升细胞注射到腹膜腔中。 使用非侵入性荧光成像监测肿瘤生长。

动物接受了单剂量的8mg/kg ALN-VSP或SNALP-Luc。给药48h后 对肿瘤进行分析。肿瘤的石蜡包埋切片用H&E染色。整个肿瘤切片采用 浮点ROI(目的区域)成像分析，并计数简单有丝分裂数或异常有丝分裂像 (单星体)。总计数除以每肿瘤的ROI数。如图20所示，ALN-VSP处理导 致腹膜内HCC模型的肿瘤组织中异常有丝分裂像(单星体)的累积。

实施例8c.在肝脏和肝外位点的结肠直肠癌肿瘤中mRNA水平的降低和单星体的诱 导

测定ALN-VSP处理在结肠直肠癌肿瘤中的效力。通过直接向免疫功 能低下的小鼠肝脏中(如scid/beige小鼠左叶中)肝内植入HCT116细胞建 立肿瘤。在一些动物中，扩散的肿瘤在肝外位点发育，包括淋巴结、肺和 皮下(s.c.)。荷瘤动物接受了一剂或多剂。

荷瘤动物在肿瘤植入后14天接受了单剂的ALN-VSP(4、2或1mg/kg) 或SNALP-Luc(4mg/kg)。源于肿瘤(人类)的KSP的mRNA水平(相对于 GAPDH标准化)在药物施用后24小时用物种特异性的TaqMan探针进行 测量。如图21所示，相对于4mg/kg的SNALP-Luc对照，ALN-VSP表 现出hKSP的35％降低。

在肿瘤植入后14天荷瘤动物接受了多剂的ALN-VSP和SNALP-Luc。 ALN-VSP以4.0和1.0mg/kg施用而对照SNALP-Luc以4mg/kg施用，每 周两次，持续三周。给药后48小时，分析荷瘤的肝脏、淋巴结、肺和皮 下转移。石蜡包埋的肿瘤切片用H&E染色。整个肿瘤切片采用浮点ROI(目 的区域)分析进行成像，并计算简单有丝分裂数或异常有丝分裂像(单星体)。总计数除以每个肿瘤的ROI数。

如图25A、25B和25C所示，ALN-VSP处理导致在肝脏肿瘤、肺、 淋巴结和皮下转移中异常有丝分裂像(单星体)的累积。图22A和25A(肝 脏)，P＜0.05(具有Tukey’s多重比较检验的单因素方差分析)；图25B(肺)， P＝0.0182，与SNALP-1955处理动物中的单星体比较，用非配对t检验方 法；图22B和25C(淋巴结)；图25C(皮下)。

结果表明，各siRNA对疗效产生明显不同的贡献。ALN-VSP处理在 原位肝脏肿瘤以及不同来源的肝外肿瘤这两种类型中都导致异常有丝分 裂像(单星体)的累积(KSP抑制的标志)。微血管密度明显降低和原位肿瘤 的肿瘤内出血显示了治疗性VEGF抑制的证据。

实施例8d：ALN-VSP减少肿瘤内出血和微血管密度

ALN-VSP处理与SNALP-Luc相比对肿瘤内出血和微血管密度的影 响使用本文描述的Hep3B原位HCC小鼠模型来分析。

进行了两项研究。研究1比较了Hep3B原位肿瘤植入后26天开始的 4mg/kg ALN-VSP与SNALP-Luc施用，每周两次，持续三周。基于人道 替代终点，对动物实行安乐死。研究2比较了肿瘤植入后14天开始的 6mg/kg的仅SNALP-VEGF与SNALP-Luc施用，每周两次，持续三周。 IP施用的5mg/kg的贝伐单抗用作阳性对照。最后一次给药后72小时， 对动物进行安乐死。

用H&E染色石蜡包埋的肿瘤切片来显示肿瘤出血的区域，或用CD34 抗体染色以检测肿瘤脉管系统。两个完整的肿瘤切片采用浮点ROI(目的 区域)分析成像，对肿瘤内出血的区域在H&E染色的切片中进行描绘和在 各个肿瘤中对出血总面积进行定量。为了定量微血管密度，CD34染色区 域量化为肿瘤总面积的百分比。

如图23所示，ALN-VSP处理减少了肿瘤内出血和微血管密度。如图 24所示，ALN-VSP的血管效应是可归因于VEGF siRNA，因为 SNALP-VEGF减少肿瘤内出血和微血管密度达到与ALN-VSP相同的程 度。

实施例9.ALN-VSP02的制造过程和产品说明(SNALP-VSP)

ALN-VSP02产品包含用于通过输注用于IV施用的配制成无菌脂质 微粒制剂的2mg/mL药物物质ALN-VSPDS01(称为SNALP)。药物物质 ALN-VSPDS01由等摩尔比的两种siRNA(靶向KSP的ALN-12115和靶向 VEGF的ALN-3133)组成。药品包装于具有5毫升填充容积的10毫升的 玻璃小瓶中。

在本文使用下列术语：

*备用名＝AD-12115、AD12115；**备用名＝AD-3133、AD3133

9.1药物物质ALN-VSPDS01的制备

使用市售的合成器和原材料化学合成药物物质ALN-VSPDS01、 ALN-12115和ALN-3133的两种siRNA成分。制造方法包括通过常规的 固相寡核苷酸合成，使用亚磷酰胺(phosphoramidite)化学和具有用叔丁基 二甲基硅烷基(TBDMS)保护的2’羟基或用2’甲氧基(2’OMe)取代的2′羟基 的5’-O-二甲氧基三苯基甲基(DMT)保护基合成各双链体的两个单链寡核 苷酸(ALN 12115的A19562正义链和A19563反义链及ALN 3133的 A3981正义链和A3982反义链)。通过亚磷酰胺方法将寡核苷酸链组装在 固体载体(如可控的微孔玻璃或聚苯乙烯)上。循环由5′脱保护、偶合、氧 化和加帽(capping)组成。通过以下步骤进行各偶合反应：使用5(乙硫基)1H 四唑试剂使得适当保护的核糖、2’OMe或脱氧核糖核苷亚酰胺(amidite) 活化，接着偶合载体固定的保护核苷或寡核苷酸的游离5’羟基。经过适当 次数的循环后，通过酸处理去除最后的5’保护基。通过甲胺水溶液处理从 固体载体切除粗的寡核苷酸，同时除去氰乙基保护基以及核碱基保护基。 然后使用含氟化氢的试剂切割2’OTBDMS基团，以产生粗的寡核糖核苷 酸，其使用强阴离子交换高效液相色谱(HPLC)接着使用超滤脱盐而纯化。 对纯化的单链进行分析以在退火成双链体之前确认正确的分子量、分子序 列，杂质特征和寡核苷酸含量。退火的双链中间体ALN 12115和ALN 3133 进行冻干并在20℃下存储或以1:1的摩尔比混合，且溶液经冻干以产生 药物物质ALNVSPDS01。如果双链中间体作为干粉储存，它们在混合前 在水中重新溶解。通过HPLC法监测混合过程来获得等摩尔比率。

制造方法流程图如图16所示。

测定药物物质的储存稳定性(数据未提供)。选择测定方法以评估物理 性质(外观、pH值、水分)、纯度(通过SEC和变性阴离子交换色谱法)和 效力(通过变性阴离子交换色谱法[AX-HPLC])。ALN-VSPDS01表现出在 20摄氏度下最多12个月的稳定储存。

9.2药物产品ALN-VSP02(SNALP-VSP)的制备

ALN VSP02是两种siRNA(以1:1的摩尔比)与脂质赋形剂一起溶于等 渗缓冲液中的无菌制剂。脂质赋形剂与两种siRNA结合，保护它们免于 在循环系统中降解，并帮助它们递送到靶组织。通过重复的系列实验比较 各种不同制剂的理化性质、稳定性、药效学、药代动力学、毒性和产品可 制造性选择具体的脂质赋形剂和各脂质赋形剂的数量比例(如表9所示)。 赋形剂DLinDMA是可滴定的氨基脂质，其在低pH值下(如在哺乳动物细 胞的核内体中存在的pH值)带正电，但在全血的更中性的pH下相对不带 电。这一特征有助于在低pH值下高效封装带负电的siRNA，从而防止空 微粒的形成，但仍允许通过在使用前用更中性的存储缓冲液代替制剂缓冲 液来调整(减少)微粒的电荷。为了向微粒提供理化稳定性，掺入胆固醇和 中性脂质DPPC。聚乙二醇脂质偶联物PEG2000C DMA有助于药物产品 的稳定性，并为预期的应用提供最佳的循环时间。ALN VSP02脂质微粒 具有低多分散性特征的约80-90nm的平均直径。代表性的低温透射电子 显微镜(cryo TEM)图像如图17中显示。在中性pH值下，微粒基本上不带 电，且Zeta电位值低于6mV。基于该制造工艺，没有空(非负载的)微粒 的证据。

表9：ALN-VSP02的定量组成

*在药品微粒的整个粒径分布上维持药品中两种siRNA的1：1摩尔 比。

脂质的溶液(乙醇中)和ALN VSPDS01药物物质的溶液(在水性缓冲 液中)混合，并稀释以形成具有约80-90nm的平均微粒大小的siRNA脂质 微粒的胶状分散体。这种分散体然后通过0.45/0.2微米过滤器过滤，浓缩， 并通过切向流过滤进行渗滤(diafilter)。经过在线测试和浓度调整至 2.0mg/mL后，产品经无菌过滤，无菌填充到玻璃小瓶中，塞住，加盖， 并在5±3℃下放置。乙醇和所有水性缓冲液成分是USP级的；所有使用 的水是USP无菌注射级无菌水。代表性的ALN-VSP02过程如图18中的 流程图所示。

9.4容器/密封系统

在具有5毫升填充体积的10毫升玻璃小瓶中包装ALN VSP02药品。 容器密封系统包括USP/EP I型硼硅玻璃小瓶、聚四氟乙烯贴面的丁基橡 胶瓶塞和铝翻转盖(flip offcap)。药品储存在5±3℃下。

9.5药品ALN-VSP02的稳定性

药品的稳定性在储存条件(2-8℃)和25℃/60％相对湿度下进行测定。 药品在4℃的储存温度下保持18个月时是稳定的(数据未提供)。

实施例10.ALN-VSP02在人癌细胞系中的体外效力

通过处理后的KSP mRNA、VEGF mRNA和细胞活力的测量确定 ALN-VSP02处理在人类癌细胞系中的效力。在各个细胞系中测定KSP和 VEGF的IC50(nM)值。

表11：细胞系

测试的细胞系	ATCC分类号
		HELA	ATCC Cat N:CCL-2
KB	ATCC Cat N:CCL-17
		HEP3B	ATCC Cat N:HB-8064
SKOV-3	ATCC Cat N:HTB-77
		HCT-116	ATCC Cat N:CCL-247
HT-29	ATCC Cat N:HTB-38
		PC-3	ATCC Cat N:CRL-1435
A549	ATCC Cat N:CCL-185
		MDA-MB-231	ATCC Cat N:HTB-26

第1天，细胞在完全培养基中接种在96孔板中，以在第2天达到70％ 的密度。第2天，用Opti-MEM减血清培养基(Invitrogen Cat N：11058-021) 替换培养基，并用开始为1.8μM降低至10pM的浓度范围的ALN-VSP02 或对照SNALP-Luc转染细胞。6个小时后，培养基改为完全培养基。对 于各实验，各细胞系进行3个重复培养。

转染后24小时收获细胞。使用bDNA测量KSP的水平；使用人 TaqMan测定测量VEGFmRNA水平。

按照生产商的说明在48和/或72小时使用细胞滴度蓝试剂 (Cell Titer Bluereagent)(Promega Cat N：G8080)测量存活力。

如表12所示，VSP02的nM浓度在多种人类细胞系中有效降低KSP 和VEGF的表达。经过处理的细胞存活率不是

表12：结果

细胞系	IC50(nM)KSP	IC50(nM)VEGF
			HeLa	8.79	672
SKOV-3	142	1347
			HCT116	31.6	27.5
Hep3B	1.3	14.5
			HT-29	262	ND
PC3	127	ND
			KB	50.6	ND
A549	201	ND
			MB231	187	ND

实施例11.在建立的Hep3B肝内肿瘤中VSP SNALP相对于索拉非尼的抗肿瘤效力

负载建立的Hep3B肝内肿瘤的scid/beige小鼠中研究多剂量 VSP SNALP相对于索拉非尼的抗肿瘤效应。索拉非尼是经核准用于治疗 肝细胞癌(HCC)的蛋白激酶小分子抑制剂。

如本文所述，在scid/beige小鼠中通过肝内接种建立肿瘤。在接种后 11天开始处理。用以下对小鼠进行处理：索拉非尼和对照siRNA-SNALP， 索拉非尼和VSP siRNA-SNALP，或仅VSP siRNA-SNALP。只用缓冲液(对 于索拉非尼为DMSO，和对于siRNA-SNALP为PBS)处理对照小鼠。从 周一至周五腹腔内施用索拉非尼，持续3星期，以15mg/kg体重总计15 次注射。在注射SNALP之后最短1小时施用索拉非尼。根据最近记录的 体重，在第1、4、7、10、14和17天以3mg/kg的剂量(10ml/kg)通过侧尾 静脉静脉内施用siRNA-SNALPS，3周时间(总计6个剂量)。

根据包括进行性体重减轻的肿瘤负荷评估及包括状态、腹胀/变色和 活动性的临床症状的评估对小鼠实施安乐死。

存活百分比的数据如图21中所示。相比单独施用索拉非尼或VSP siRNA-SNALP，共施用VSP siRNA-SNALP与索拉非尼提高存活比例。 相比于索拉非尼，VSP siRNA-SNALP提高存活比例。

实施例12.采用AD-12115和AD-3133变异体的VSP体外效力

设计并合成靶向Eg5/KSP和VEGF的两组双链体。各组包括在 AD-12115和AD-3133的靶位点的各个方向迭铺(tiling)10个核苷酸的双链 体。

各个双链体的靶、正义链和反义链的序列列于下表中。

使用本文所述的分析方法测试各个双链体的表达抑制。双链体单独和 /或组合施用，例如，Eg5/KSP dsRNA组合VEGF dsRNA。在一些实施方 案中，以如本文所述的SNALP制剂施用dsRNA。

表13：靶向VEGF和Eg5/KSP的dsRNA的序列(迭铺)

实施例13.带有单个平端的靶向VEGF的dsRNA

设计并合成靶向VEGF的一组双链体。该组包括在AD-3133的靶位 点的各个方向迭铺10个核苷酸的双链体。各个双链体在对应于反义链的 3’末端的末端包括2个碱基的突出端，而在对应于反义链的5’末端的末端 没有突出端，例如平端。

这些双链体的各个链的序列如下表所示。

使用本文所述的测定方法测定各个双链体的表达抑制。单独和/或与 Eg5/KSPdsRNA(例如，AD-12115)组合施用VEGF双链体。在一些实施方 案中，以如本文所述的SNALP制剂施用dsRNA。

表14：靶向VEGF的平端dsRNA的靶序列

表15：靶向VEGF的平端dsRNA的链序列

实施例14.人体中Eg5/KSP和VEGF表达的抑制

人类受试者用具有靶向Eg5/KSP基因的SNALP配制的dsRNA和靶 向VEGF基因的SNALP配制的dsRNA的药物组合物(如ALN-VSP02)治 疗以抑制Eg5/KSP和VEGF基因的表达。

选择或确定有相应需要的受试者。受试者可以需要治疗癌症，如肝癌。

在时间的零点，向受试者皮下施用该组合物的合适的第一剂量。该组 合物如本文所述配制。一段时间之后，评估受试者的状态，例如，通过测 量肿瘤生长、测量血清AFP水平等。测量可以伴随所述受试者中Eg5/KSP 和/或VEGF表达的测量，和/或成功的Eg5/KSP和/或VEGF mRNA的靶 向siRNA的产生。也可以测量其他相关指标。按照受试者的需要调整剂量的数量和强度。

治疗后，受试者的状态与治疗前存在的状态相比，或者相对于具有类 似病症但未经治疗的受试者的状态进行比较。

实施例15.ALN-VSP02在人类中的临床试验

进行临床研究以评估ALN-VSP02在患有肝脏累及的晚期实体瘤的患 者中的安全性和耐受性，以表征ALN-VSP02的PK(药代动力学)和评估 ALN-VSP02的抗肿瘤/抗血管生成活性的初步证据。该项研究是开放标签 的、多中心的、剂量递增的，利用最多约55名患有原发性或继发性肝癌 的患者。

ALN-VSP02通过每2周一次的15分钟静脉内输注给药，剂量水平为： 0.1、0.2、0.3、0.4、0.7、1.0、1.25、1.5、1.7、2.0、3.0和6.0mg/kg。

每4个剂量后对肿瘤进行测量。患者继续治疗直到疾病取得进展(用 RECIST标准来定义)或达到了不可接受的毒性。

实施例16. 1期临床研究的ALN-12115的PK数据的比较：ALN-VSP02在人体中

用实施例15中所述的参数开始临床研究。每个时间点对单个肿瘤获 取三个芯针组织活检样品：治疗前及第一次给药后2和7天。各活检样品 用2种方法处理：1：福尔马林固定、石蜡包埋和2：在液氮中急冻。肿 瘤中ALN-12115的PK用qRT-PCR定量。

ALN-12115(ALN-VSP02中的KSP双链体)的异速生长类比和预测的 AUC(曲线下面积)如下所述。预测的C_max和AUC_n-∞具有预测值的1.5到 3.4倍范围的实际反应，也就是说，预测剂量的误差不会大于±)3-4倍 (Mordenti等人)。

	单位	异速生长方程	85kg人体中的预测
				CL	mL/min	LogCL＝1.04·LogBW+0.01	103(1.21 mL/min/kg)
Vd	mL	LogVd＝0.98·LogBW+1.98	7394(86.99 mL/kg)

·预测的AUC＝(D x F)/CL人体中(对于IV给药F＝1)

从1期临床研究中获得的ALN-12115的PK数据的比较显示如下。 对于同龄组1，预测的AUC为41202 ng·min/mL，而实际的平均值范围为 30784至37280 ng·min/mL。对于同龄组2，预测的AUC为82404 ng·min/mL，而实际的平均值范围从115469到130736 ng·min/mL。AUC 在不超过(±)3至4倍的预测值的范围内。

缩写：

CL-清除率-每单位时间药物从中完全清除的血浆量。消除的量与血液 中的药物浓度成比例。

Vd-分布容积-体内药物的量除以血液中的浓度。

AUC-曲线下总面积-对于计算不同药品的相对效力是非常有用的。

C_max-最高浓度

t1/2-半衰期-给定药物浓度降低50％所需的时间。T1/2通过清除和分 布容积来确定。

C1W1-周期1，第一周。

C2W2-周期2，第二周。

实施例17.使用ALN-VSP02治疗患有累及到肝的晚期癌症患者

进行临床研究以评估ALN-VSP02在患有具有肝脏累及的晚期实体瘤 患者中的安全性和耐受性，以表征ALN-VSP02的PK(药代动力学)和评估 不同剂量水平下ALN-VSP02的抗肿瘤/抗血管生成活性的初步证据。该研 究集中于患有原发性或继发性肝癌的患者。

对于患有具有肝脏累及的晚期癌症的患者，ALN-VSP02通过每2周 一次的15分钟IV输注给药，剂量水平如下：0.1、0.2、0.4和0.7mg/kg。 治疗以2个剂量的周期(一个月)进行，每2个周期后测量肿瘤。在各个剂 量的施用后，以确定的时间间隔采集血浆样品，并测定ALN-VSP02浓度 的水平以获得药代动力学信息和观察任何药物蓄积的证据。

对于第一次剂量和第三次剂量，患者血浆中KSP siRNA的C_max、t_max和AUC分别如表16a和16b中所示。对于第一次剂量和第三次剂量，患 者血浆中VEGF siRNA的C_max、t_max和AUC分别如表17a和17b中所示。 这些表显示了各个剂量水平入组的前3名患者(即N＝3)对于ALN-VSP02 的第一次和第三次剂量的药代动力学数据。ALN-VSP02治疗导致人血浆 中产生与剂量成比例的ALN-VSP02的C_max和AUC，且第1次剂量和第3 次剂量之间没有药物蓄积的证据。

表16a：通过剂量水平估计的KSP siRNA平均血浆浓度参数

表16b：通过剂量水平估计的KSP siRNA平均血浆浓度参数及药物蓄积证据

表17a：通过剂量水平估计的VEGF siRNA平均血浆浓度参数

表17b：通过剂量水平估计的VEGF siRNA平均血浆浓度参数及药物蓄积证据

以各个剂量水平在患者中进行一个或多个可评价的肝脏肿瘤的 DCE-MRI评估。治疗前进行一次测量(基线)，给药后3-5天测量一次而给 药后8-10天再测量一次。K_trans与基线相比的平均变化从2次治疗后扫描 后各个可评价肿瘤的K_trans峰变化导出。结果提示在大多数治疗患者中的 抗VEGF作用。有些患者也有VEGF水平的相关降低。

在大多数患者中，在0.1至0.7mg/kg剂量下只观察到轻微的与药物相 关的副作用，表明ALN-VSP02在提供的剂量下通常有很好的耐受性。

ALN-VSP02组合物对治疗诊断患有累及肝的癌症的患者是有效的且 在达到最高0.7mg/kg剂量时患者具有良好的耐受性。ALN-VSP-2人血浆 药代动力学参数显示与与剂量成比例的C_max和AUC，且无药物蓄累的证 据。

实施例18.患有晚期实体肿瘤的患者中15分钟IV输注后ALN-VSP02的药代动力学 特征

进行临床研究以表征ALN-VSP02在患有具有肝脏累及的晚期实体肿 瘤的患者中的PK(药代动力学)。

对于41位患有具有肝脏累及的晚期实体癌症的患者，ALN-VSP02 通过15分钟IV输注给药，剂量水平如下：0.1、0.2、0.4、0.7、1.0、1.25 和1.50mg/kg。患者的中值年龄为57岁(范围为34-78岁，17位男性和24 位女性)且所有患者已接受多个现有癌症疗法(对于转移性疾病平均为4.3 个现有方案，范围1-13)。单一剂量水平定义同龄组；每个同龄组n＝3患者。每2周一次提供治疗，1个周期包含2个剂量。在第一个剂量(C1W1D1) 后和在第三个剂量(C2W1D1)后进行药代动力学评价。单一患者在给药1 年后保持研究治疗。

在确定的时间间隔采集血浆样品并且测定ALN-VSP02浓度水平以获 得药代动力学信息和以观察任何药物累积的证据。在给药前、输注结束时、 以及在输注结束后5、10和30分钟以及2、4、6、8和24小时。测量总 siRNA和游离siRNA两者(包封的siRNA和未包封的siRNA)。

输注结束后0-8和8-24小时获得尿样品，使用以下定量下限(LLOQ) 通过杂化分析：对于AD-3133(靶向VEGF的siRNA)LLOQ为3ng/mL且 对于AD-12115(靶向KSP/Eg5的siRNA)LLOQ为1ng/mL。所有给药前 siRNA浓度为<LLOQ。

生成每种siRNA的血浆浓度-时间曲线。利用用于PK/PD建模的 V5.2.1软件(St.Louis,MO)，采用所获得的浓度- 时间曲线计算药代动力学(PK)参数。

结果

所有7个剂量水平/同龄组的血浆浓度时间曲线具有类似性质：所有 均为多相性的，在C1(第一次剂量)和C2(第三次剂量)时具有快速分布相 和类似曲线(数据未显示)。对于

所有同龄组，PK参数显示Cmax在C1和C2时大约类似而t_1/2α较短 且在C1和C2时大约类似。在一些患者中，在一些剂量时，AUC在C1 和C2时大约类似。对于同龄组1、4和5，由于测定灵敏性而未完全捕获 消除期。

表18和19中提供了平均血浆PK参数。

表18：AD-12115的平均血浆PK参数

NA：不适用

括弧内为标准偏差

表19：AD-3133的平均血浆PK参数

NA：不适用

括弧内为标准偏差

一般而言，对于两个同龄组中的两种siRNA，尿siRNA的浓度在0-8 小时时可检测到，而水平在8-24小时时降低。

AD-12115和AD-3133血浆浓度-时间曲线为多相性的，在大约在输 注结束时形成尖峰。在单次或多次施用0.1、0.2、0.4、0.7,1.0、1.25和1.5 mg/kg的ALN-VSP02后，C_max和AUC_0-最后随剂量增加而大约成比例增加。

在1.5mg/kg时产生对ALN-VSP02的最大暴露。与C2W2(第3次剂 量)相比，在C1W1(第1次剂量)时观察到AD-12115和AD-3133的类似 暴露。

在1.0mg/kg的剂量时，在第一次剂量(C1W1)后AD-12115的平均C_max为15314.98±5347.86ng/mL，而AD-3133的平均C_max为15843.73± 7014.77ng/mL。在第二次剂量(C2W1)后AD-12115的平均C_max为12440.80 ±9615.15ng/mL，而AD-3133的平均C_max为12681.94±8811.54ng/mL。 在第一次剂量(C1W1)后AD-3133的平均AUC_0-最后为16404.33±7280.14 ng*小时/mL，而AD-12115的平均AUC_0-最后为15393.10±6002.12ng*小时 /mL。在第二次剂量(C2W1)后AD-3133的平均AUC_0-最后为9563.98± 2173.22ng*小时/mL，而AD-12115的平均AUC_0-最后为9984.02±2517.30 ng*小时/mL。

对于C1W1，ALN-12115和ALN-3133的平均分布半衰期(T_1/2α)分别 从21.41至74.93分钟和从12.87至34.83分钟变化。

对于C2W2，ALN-12115和ALN-3133的平均分布半衰期(T_1/2α)分别 从13.70至43.46分钟和从17.14至44.28分钟变化。

表20显示肿瘤患者对肿瘤的应答的汇总。

*包括第一次剂量为0.7mg/kg的1位患者

**包括第一次剂量为1.25mg/kg的2位患者

***包括具有～70％肿瘤减灭的应答的1位患者

在施用至少0.7mg/kg的剂量的50％患者(12/24)中，该疾病是稳定的 或有所好转。

各个剂量水平的患者中进行一个或多个可评价的肝脏肿瘤的 DCE-MRI评价。治疗前进行一次测量(基线)，给药后第3-5天测量一次， 和给药后第8-10天再测量一次。K_trans与基线相比的平均变化从2次治疗 后扫描后各个可评价肿瘤的K_trans峰值变化导出。46％患者(13/28)显示肝 脏肿瘤中的K_trans平均降低≥40％。

从15位患者获得29个肿瘤活检。在下面表21中提供这些活检的结 果。通过5’RACE针对VEGF测试这些活检。15位患者中的3位对VEGF 5’RACE是阳性的。

表21

本领域的技术人员熟悉除了那些在本公开中明确阐述的方法和组合 物之外使得他们在所附的权利要求的全部范围内实施本发明的方法和组 合物。

Claims (40)

1.一种治疗有相应需要的受试者的子宫内膜癌的方法，包括向所述受试者施用至少约0.7mg/kg(基于以mg/kg体重计的siRNA总重量)的组合物，所述组合物包含

(i)DLinDMA；

(ii)DPPC；

(iii)PEG2000-C-DMA；

(iv)胆固醇；

(v)靶向Eg5/KSP的siRNA；和

(vi)靶向VEGF的siRNA。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者之前未能对癌症治疗作出反应。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述靶向Eg5/KSP的siRNA为AD12115。

4.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述靶向VEGF的siRNA为AD3133。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中约1.0mg/kg的组合物被施用。

6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中至少约1.0mg/kg的组合物被施用。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述受试者患有具有肝脏累及的晚期癌症。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中通过静脉内(IV)输注施用所述组合物。

9.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中每2周一次地通过静脉内(IV)输注来施用所述组合物。

10.如权利要求8和9中任一项所述的方法，其中每次IV输注的持续时间为约15分钟、约30分钟或约60分钟。

11.如权利要求8和9中任一项所述的方法，其中每次IV输注的持续时间为约15分钟至约3小时的范围。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中每2周一次地向所述受试者施用所述组合物，持续4周。

13.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中每2周一次地向所述受试者施用所述组合物，持续8周。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中DLinDMA:DPPC:胆固醇:PEG2000-C-DMA的摩尔比为约57.1:7.1:34.4:1.4。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中靶向Eg5/KSP的siRNA与靶向VEGF的siRNA的摩尔比为约1:1。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，进一步包括向所述受试者施用皮质类固醇。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述皮质类固醇选自安西缩松、倍他米松、倍他米松二丙酸酯、倍他米松戊酸酯、布地奈德、氯倍他索、氯倍他索醋酸酯、氯倍他索丁酸酯、氯倍他索17-丙酸酯、可的松、地夫可特、去羟米松、二氟米松戊酸酯、地塞米松、地塞米松磷酸钠、地索奈德、糠酸酯、氟轻松、醋酸氟轻松、哈西缩松、氢化可的松、氢化可的松丁酸酯、氢化可的松琥珀酸钠、氢化可的松戊酸酯、甲基强的松龙、莫米松、泼尼卡酯、泼尼松龙、曲安西龙、丙炎松和卤贝他索丙酸酯。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述组合物为ALN-VSP02且提供了约10至约1100μg*min/mL的平均KSP siRNA AUC_0-最后，约0.4至约10.0μg/mL的平均KSP siRNAC_max，约10至约1200μg*min/mL的平均VEGF siRNA AUC_0-最后和约0.4至约18μg/mL的平均VEGFsiRNA C_max。

19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中在以1mg/kg的第一剂量施用所述组合物后，KSP siRNA的AUC_0-最后在15393.10±6002.12ng*小时/mL的约80％至约125％内，和/或在以1mg/kg的第二剂量施用所述组合物后，KSP siRNA的AUC_0-最后在9984.02±2517.30ng*小时/mL的约80％至约125％内。

20.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中在以1mg/kg的第一剂量施用所述组合物后，KSP siRNA的C_max在15314.98±5347.86ng/mL的约80％至约125％内，和/或在以1mg/kg的第二剂量施用所述组合物后，KSP siRNA的C_max在12440.80±9615.15ng/mL的约80％至约125％内。

21.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中在以1mg/kg的第一剂量施用所述组合物后，VEGF siRNA的AUC_0-最后在16404.33±7280.14ng*小时/mL的约80％至约125％内，和/或在以1mg/kg的第二剂量施用所述组合物后，VEGF siRNA的AUC_0-最后在9563.98±2173.22ng*小时/mL的约80％至约125％内。

22.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中在以1mg/kg的第一剂量施用所述组合物后，VEGF siRNA的C_max在15843.73±7014.77ng/mL的约80％至约125％内，和/或在以1mg/kg的第二剂量施用所述组合物后，VEGF siRNA的C_max在12681.94±8811.54ng/mL的约80％至约125％内。

23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中如可在所述受试者血浆中测量的，所述组合物具有与剂量成比例的最大浓度(C_max)和曲线下面积(AUC)。

24.如权利要求23所述的方法，其中如可在所述受试者血浆中测量的，KSP siRNA的与剂量成比例的AUC为700至1100μg*min/mL。

25.如权利要求23所述的方法，其中如可在所述受试者血浆中测量的，KSP siRNA的与剂量成比例的C_max为4.0至10.0μg/mL。

26.如权利要求23所述的方法，其中如可在所述受试者血浆中测量的，VEGF siRNA的与剂量成比例的AUC为580至1200μg*min/mL。

27.如权利要求23所述的方法，其中如可在所述受试者血浆中测量的，VEGF siRNA的与剂量成比例的C_max为10至18μg/mL。

28.如权利要求23所述的方法，其中KSP siRNA的AUC值在预测的KSP siRNA AUC值的±3至4倍的误差内。

29.如权利要求23所述的方法，其中VEGF siRNA的AUC值在预测的VEGF siRNA AUC值±3至4倍的误差内。

30.一种治疗有相应需要的受试者的方法，包括每2周一次地通过静脉内(IV)输注向所述受试者施用1.0mg/kg剂量的组合物，所述组合物包含

(i)DLinDMA；

(ii)DPPC；

(iii)PEG2000-C-DMA；

(iv)胆固醇；

(v)靶向Eg5/KSP的siRNA；和

(vi)靶向VEGF的siRNA；

其中

所述组合物具有与剂量成比例的最大浓度(C_max)和曲线下面积(AUC)，如可在所述受试者血浆中测量的；

KSP siRNA的AUC_0-最后在15393.10±6002.12或9984.02±2517.30ng*小时/mL的约80％至约125％内；

KSP siRNA的C_max在15314.98±5347.86或12440.80±9615.15ng/mL的约80％至约125％内；

VEGF siRNA的AUC_0-最后在16404.33±7280.14或9563.98±2173.22ng*小时/mL的约80％至约125％内；和

VEGF siRNA的C_max在15843.73±7014.77或12681.94±8811.54ng/mL的约80％至约125％内。

31.一种治疗有相应需要的受试者的方法，包括每2周一次地通过静脉内(IV)输注向所述受试者施用1.25mg/kg剂量的组合物，所述组合物包含

(vii)DLinDMA；

(viii)DPPC；

(ix)PEG2000-C-DMA；

(x)胆固醇；

(xi)靶向Eg5/KSP的siRNA；和

(xii)靶向VEGF的siRNA；

其中

所述组合物具有与剂量成比例的最大浓度(C_max)和曲线下面积(AUC)，如可在受试者血浆中测量的；

KSP siRNA的AUC_0-最后在(i)33929.01±18334.75ng*小时/mL或(ii)28833.57ng*小时/mL的约80％至约125％内；

KSP siRNA的C_max在(i)21937.49±7642.00ng/mL或(ii)17897.05ng/mL的约80％至约125％内；

VEGF siRNA的AUC_0-最后在(i)33442.95±18558.98ng*小时/mL或(ii)31072.98ng*小时/mL的约80％至约125％内；和

VEGF siRNA的C_max为(i)21578.94±6798.07ng/mL或(ii)18230.74ng/mL的约80％至约125％的范围内。

32.如权利要求30或权利要求31所述的方法，其中所述受试者患有癌症。

33.如权利要求30-32中任一项所述的方法，其中受试者患有具有肝脏累及的晚期癌症。

34.如权利要求30-32中任一项所述的方法，其中所述受试者患有子宫内膜癌症。

35.如权利要求30-34中任一项所述的方法，其中每次IV输注的持续时间为15分钟。

36.如权利要求30-34中任一项所述的方法，其中每次IV输注的持续时间为15分钟至3小时。

37.如权利要求30-36中任一项所述的方法，其中每2周一次地向所述受试者施用所述组合物，持续4周。

38.如权利要求30-36中任一项所述的方法，其中每2周一次地向所述受试者施用所述组合物，持续8周。

39.如权利要求30-38中任一项所述的方法，进一步包括向所述受试者施用皮质类固醇。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述皮质类固醇选自安西缩松、倍他米松、倍他米松二丙酸酯、倍他米松戊酸酯、布地奈德、氯倍他索、氯倍他索醋酸酯、氯倍他索丁酸酯、氯倍他索17-丙酸酯、可的松、地夫可特、去羟米松、二氟米松戊酸酯、地塞米松、地塞米松磷酸钠、地索奈德、糠酸酯、氟轻松、醋酸氟轻松、哈西缩松、氢化可的松、氢化可的松丁酸酯、氢化可的松琥珀酸钠、氢化可的松戊酸酯、甲基强的松龙、莫米松、泼尼卡酯、泼尼松龙、曲安西龙、丙炎松和卤贝他索丙酸酯。