JP6032724B2 - 脂質製剤組成物およびEg5遺伝子とVEGF遺伝子の発現を阻害する方法 - Google Patents
脂質製剤組成物およびEg5遺伝子とVEGF遺伝子の発現を阻害する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6032724B2 JP6032724B2 JP2011554247A JP2011554247A JP6032724B2 JP 6032724 B2 JP6032724 B2 JP 6032724B2 JP 2011554247 A JP2011554247 A JP 2011554247A JP 2011554247 A JP2011554247 A JP 2011554247A JP 6032724 B2 JP6032724 B2 JP 6032724B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dsrna
- composition
- lipid
- nucleotide
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/04—Uses of viruses as vector in vivo
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本出願は、それらのすべてが、参照により、それらの全体において、すべての目的で本明細書に組み込まれる、2009年3月12日に出願された、米国仮出願第61/159,788号;2009年8月5日に出願された、米国仮出願第61/231,579号;ならびに2009年12月11日に出願された、米国仮出願第61/285,947号の利益を主張するものである。
本出願は、2010年_月XX日に、XXX,XXXバイトのサイズで作成され、16564US_sequencelisting.txtと名付けられたテキストファイルとして電子データの形態で提出された配列表を包含する。該配列表は、参照により組み込まれる。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
細胞内におけるヒトキネシンファミリーメンバー11(Eg5/KSP)遺伝子の発現を阻害する第1の二本鎖リボ核酸(dsRNA)と、細胞内におけるヒトVEGFの発現を阻害する第2のdsRNAとを含む核酸脂質粒子を含む組成物であって、
前記核酸脂質粒子が、45〜65モル%の陽イオン性脂質、5モル%〜約10モル%の非陽イオン性脂質、25〜40モル%のステロール、および0.5〜5モル%のPEGまたはPEG改変脂質を含む脂質製剤を含み、
前記第1のdsRNAが、第1のセンス鎖と第1のアンチセンス鎖とからなり、前記第1のセンス鎖が、第1の配列を含み、前記第1のアンチセンス鎖が、
配列番号1311(5’−UCGAGAAUCUAAACUAACU−3’)
のうちの少なくとも15の連続ヌクレオチドと相補的な第2の配列を含み、
前記第1の配列が、前記第2の配列と相補的であり、前記第1のdsRNAが、15〜30塩基対の長さであり;
前記第2のdsRNAが、第2のセンス鎖と第2のアンチセンス鎖とからなり、前記第2のセンス鎖が、第3の配列を含み、前記第2のアンチセンス鎖が、
配列番号1538(5’−GCACAUAGGAGAGAUGAGCUU−3’)
のうちの少なくとも15の連続ヌクレオチドと相補的な第4の配列を含み、
前記第3の配列が、前記第4の配列と相補的であり、前記第2のdsRNAが、15〜30塩基対の長さである組成物。
(項目2)
前記陽イオン性脂質が、式Aを含み、
式Aが、
、または
[式中、R1およびR2が、独立してアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、各々が、必要に応じて置換されていてもよく、R3およびR4が、独立して低級アルキルであるか、またはR3およびR4が一緒になって、必要に応じて置換されるヘテロ環式環を形成し得る]である、項目1に記載の組成物。
(項目3)
前記陽イオン性脂質が、XTC(2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノエチル−[1,3]−ジオキソラン)を含む、項目2に記載の組成物。
(項目4)
前記陽イオン性脂質が、XTCを含み、前記非陽イオン性脂質が、DSPCを含み、前記ステロールが、コレステロールを含み、前記PEG脂質が、PEG−DMGを含む、項目2に記載の組成物。
(項目5)
前記陽イオン性脂質が、XTCを含み、前記製剤が、
からなる群から選択される、項目2に記載の組成物。
(項目6)
前記陽イオン性脂質が、ALNY−100((3aR,5s,6aS)−N,N−ジメチル−2,2−ジ((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエニル)テトラヒドロ−3aH−シクロペンタ[d][1,3]ジオキソール−5−アミン))を含む、項目1に記載の組成物。
(項目7)
前記陽イオン性脂質が、ALNY−100を含み、前記製剤が、
からなる、項目6に記載の組成物。
(項目8)
前記陽イオン性脂質が、MC3(((6Z,9Z,28Z,31Z)−ヘプタトリアコンタ−6,9,28,31−テトラエン−19−イル4−(ジメチルアミノ)ブタノエート)を含む、項目1に記載の組成物。
(項目9)
前記陽イオン性脂質が、MC3を含み、前記脂質製剤が、
からなる群から選択される、項目8に記載の組成物。
(項目10)
前記第1のdsRNAが、配列番号1534(5’−UCGAGAAUCUAAACUAACUTT−3’)からなるセンス鎖と、配列番号1535(5’−AGUUAGUUUAGAUUCCUGATT−3’)からなるアンチセンス鎖とからなり、前記第2のdsRNAが、配列番号1536(5’−GCACAUAGGAGAGAUGAGCUU−3’)からなるセンス鎖と、配列番号1537(5’−AAGCUCAUCUCUCCUAUGUGCUG−3’)からなるアンチセンス鎖とからなる、項目1に記載の組成物。
(項目11)
小文字の「c」または「u」により示される2’−O−メチルリボヌクレオチドと、小文字の「s」により示されるホスホロチオエートとを包含するように、各鎖が、以下:
前記第1のdsRNAが、
配列番号1240(5’−ucGAGAAucuAAAcuAAcuTsT−3’)
からなるセンス鎖と、
配列番号1241(5’−AGUuAGUUuAGAUUCUCGATsT)
からなるアンチセンス鎖とからなり;
前記第2のdsRNAが、
配列番号1242(5’−GcAcAuAGGAGAGAuGAGCUsU−3’)
からなるセンス鎖と、
配列番号1243(5’−AAGCUcAUCUCUCCuAuGuGCusG−3’)からなるアンチセンス鎖とからなる、
ように改変される、
項目10に記載の組成物。
(項目12)
前記第1および第2のdsRNAが、少なくとも1つの改変ヌクレオチドを含む、請求
項1に記載の組成物。
(項目13)
前記改変ヌクレオチドが、2’−O−メチル改変ヌクレオチド、5’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドからなる群から選択される、項目12に記載の組成物。
(項目14)
前記改変ヌクレオチドが、2’−デオキシ−2’−フルオロ改変ヌクレオチド、2’−デオキシ改変ヌクレオチド、ロックトヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2’−アミノ改変ヌクレオチド、2’−アルキル改変ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデートを含むヌクレオチド、および非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される、項目12に記載の組成物。
(項目15)
前記第1および第2のdsRNAの各々が、少なくとも1つの2’−O−メチル改変リボヌクレオチドと、5’−ホスホロチオエート基を含む少なくとも1つのヌクレオチドとを含む、項目1に記載の組成物。
(項目16)
各dsRNAの各鎖が、19〜23塩基の長さである、項目1に記載の組成物。
(項目17)
各dsRNAの各鎖が、21〜23塩基の長さである、項目1に記載の組成物。
(項目18)
前記第1のdsRNAの各鎖が、21塩基の長さであり、前記第2のdsRNAの前記センス鎖が21塩基の長さであり、前記第2のdsRNAの前記アンチセンス鎖が23塩基の長さである、項目1に記載の組成物。
(項目19)
前記第1および第2のdsRNAが、等モル比で存在する、項目1に記載の組成物。
(項目20)
ソラフェニブをさらに含む、項目1に記載の組成物。
(項目21)
リポタンパク質をさらに含む、項目1に記載の組成物。
(項目22)
アポリポタンパク質E(ApoE)をさらに含む、項目1に記載の組成物。
(項目23)
Eg5を発現する細胞と接触させると、Eg5の発現を少なくとも40%阻害する、項目1に記載の組成物。
(項目24)
VEGFを発現する細胞と接触させると、VEGFの発現を少なくとも40%阻害する、項目1に記載の組成物。
(項目25)
前記組成物を細胞に投与すると、前記細胞におけるEg5およびVEGFの発現が低下する、項目1に記載の組成物。
(項目26)
nM濃度で投与される、項目25に記載の組成物。
(項目27)
前記組成物を細胞に投与すると、前記細胞における単星の形成が増大する、項目1に記載の組成物。
(項目28)
前記組成物を哺乳動物に投与すると、前記哺乳動物における腫瘍増殖の防止、腫瘍増殖の低減、または生存の延長からなる群から選択される少なくとも1つの効果がもたらされる、項目1に記載の組成物。
(項目29)
前記効果が、体重の決定、器官重量の決定、視診、mRNA解析、血清AFP解析、および生存のモニタリングからなる群から選択される少なくとも1つのアッセイを用いて測定される、項目28に記載の組成物。
(項目30)
細胞内におけるEg5/KSPおよびVEGFの発現を阻害する方法であって、項目1に記載の組成物を前記細胞に投与する工程を含む方法。
(項目31)
癌の治療を必要とする哺乳動物において、腫瘍の増殖を防止するか、腫瘍の増殖を低減するか、または生存を延長させる方法であって、項目1に記載の組成物を前記哺乳動物に投与する工程を含む方法。
(項目32)
前記哺乳動物が、肝臓癌を有する、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記哺乳動物が、肝臓癌を有するヒトである、項目31に記載の方法。
(項目34)
0.25mg/kg〜4mg/kgのdsRNAを含有する用量が前記哺乳動物に投与される、項目31に記載の方法。
(項目35)
前記dsRNAが、約0.01、0.1、0.5、1.0、2.5、または5.0mg/kgでヒトに投与される、項目31に記載の方法。
(項目36)
癌の治療を必要とする哺乳動物において腫瘍の増殖を低減する方法であって、項目1に記載の組成物を前記哺乳動物に投与する工程を含み、腫瘍の増殖を少なくとも20%低減する方法。
(項目37)
KSPの発現を少なくとも60%低下させる、項目36に記載の方法。
I.定義
便宜のため、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で用いられる特定の用語および語句の意味を以下に示す。本明細書の他の部分における用語の用法と、本節において示されるその定義との間に見かけ上の齟齬が生じた場合は、本節における定義が優先されるものとする。
II.二本鎖リボ核酸(dsRNA)
本明細書でより詳細に記載される通り、本発明は、細胞または哺乳動物におけるEg5遺伝子および/またはVEGF遺伝子の発現を阻害する二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子であって、Eg5遺伝子および/またはVEGF遺伝子が発現するときに形成されるmRNAの少なくとも一部と相補的な相補性領域を含むアンチセンス鎖を含み、該相補性領域が、30ヌクレオチド未満の長さ、一般には19〜24ヌクレオチドの長さであり、前記Eg5遺伝子および/またはVEGF遺伝子を発現する細胞と接触すると、前記Eg5遺伝子および/またはVEGF遺伝子の発現を阻害するdsRNA分子を提供する。本発明のdsRNAは、1つ以上の一本鎖ヌクレオチド突出をさらに包含し得る。
改変
さらに別の実施形態では、dsRNAを化学修飾して安定性を増強する。本発明の核酸は、参照により本明細書に組み込まれる、「Current protocols in nucleic acid chemistry」、Beaucage, S.L.ら(編)、JohnWiley & Sons, Inc.、New York、NY、USAにおいて記載される方法など、当技術分野において十分に確立した方法により合成および/または改変することができる。本発明において有用な、好ましいdsRNA化合物の具体例には、改変骨格または非天然のヌクレオシド間結合を含有するdsRNAが含まれる。本明細書で定義される通り、改変骨格を有するdsRNAは、該骨格内にリン原子を保持するdsRNAと、該骨格内にリン原子を有さないdsRNAとを包含する。本明細書の目的において、また、当技術分野で場合によって言及される通り、それらのヌクレオシド間骨格においてリン原子を有さない改変dsRNAもまた、オリゴヌクレオシドと考えることができる。
コンジュゲート
本発明のdsRNAに対する別の改変は、dsRNAの活性、細胞における分布、または細胞への取込みを増強する1つ以上の部分またはコンジュゲートを、該dsRNAに化学結合させることを伴う。このような部分には、コレステロール部分(Letsingerら、Proc. Natl. Acid. Sci. USA、199巻、86号、6553〜6556頁)、コール酸(Manoharanら、Biorg.Med. Chem. Let.、1994年、4巻、1053〜1060頁)、チオエーテル、例えば、ベリル−S−トリチルチオール(Manoharanら、Ann.N.Y. Acad. Sci.、1992年、660巻、306〜309頁; Manoharanら、Biorg. Med. Chem. Let.、1993年、3巻、2765〜2770頁)、チオコレステロール(Oberhauserら、Nucl.Acids Res.、1992年、20巻、533〜538頁)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール残基もしくはウンデシル残基(Saison-Behmoarasら、EMBOJ、1991年、10巻、1111〜1118頁; Kabanovら、FEBS Lett.、1990年、259巻、327〜330頁; Svinarchukら、Biochimie、1993年、75巻、49〜54頁)、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−rac−グリセロールもしくはトリエチル−アンモニウム−1,2−ジ−O−ヘキサデシル−rac−グリセロ−3−H−ホスホネート(Manoharanら、TetrahedronLett.、1995年、36巻、3651〜3654頁; Sheaら、Nucl. Acids Res.、1990年、18巻、3777〜3783頁)、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖(Manoharanら、Nucleosides& Nucleotides、1995年、14巻、969〜973頁)、またはアダマンタン酢酸(Manoharanら、Tetrahedron Lett.、1995年、36巻、3651〜3654頁)、パルミチル部分(Mishraら、Biochim.Biophys. Acta、1995年、1264巻、229〜237頁)、またはオクタデシルアミン部分もしくはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分(Crookeら、J.Pharmacol. Exp. Ther.、1996年、277巻、923〜937頁)などの脂質部分が含まれるがこれらに限定されない。
ベクターによりコードされるsiRNA剤
本発明の別の態様では、転写単位から発現するEg5特異的dsRNA分子およびVEGF特異的dsRNA分子を、DNAベクターまたはRNAベクター内へと挿入することができる(例えば、Couture, Aら、TIG.(1996年)、12巻:5〜10頁; Skillern, A.ら、国際PCT公開第WO00/22113号;Conrad、国際PCT公開第WO00/22114号;およびConrad、米国特許第6,054,299号を参照されたい)。これらのトランス遺伝子を、宿主ゲノム内へと統合されるトランス遺伝子として組み込まれ、かつ、遺伝することが可能な、直鎖状構築物、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができる。トランス遺伝子はまた、それが、染色体外プラスミドとして遺伝することを可能とするように構築することもできる(Gassmannら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA(1995年)、92巻:1292頁)。
dsRNAを含有する薬学的組成物
一実施形態では、本明細書で記載されるdsRNAと、薬学的に許容されるキャリアとを含有する薬学的組成物、ならびにこれを投与する方法とを本発明が提供する。dsRNAを含有する薬学的組成物は、Eg5/KSPおよび/またはVEGFの発現を介する病理学的過程、例えば、肝臓癌など、Eg5/KSP遺伝子および/またはVEGF遺伝子の発現または活性化と関連する疾患または障害を治療するのに有用である。このような薬学的組成物は、送達方式に基づき製剤化される。
投与量
本明細書で特色とされる薬学的組成物は、EG5/KSP遺伝子および/またはVEGF遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与される。一般に、dsRNAの適切な用量は、1日当たり受容者体重1キログラム(kg)当たり0.01〜200.0ミリグラム(mg)の範囲内、一般に、1日当たり体重1キログラム当たり1〜50mgの範囲内にある。例えば、dsRNAは、1回の投与当たり0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、5.0mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、または50mg/kgで投与することができる。
投与
本発明の薬学的組成物は、局所治療または全身治療のいずれが望ましいかに応じ、かつ、治療される領域に応じるいくつかの方法により投与することができる。投与は、局所投与、肺投与、例えば、噴霧器による投与を含め、粉末またはエアゾールを吸入または吹送することによる投与、気管内投与、鼻腔内投与、表皮投与および経皮投与、ならびに皮下(subdermal)投与、経口投与、または非経口投与、例えば、皮下(subcutaneous)投与であり得る。
製剤
単位剤形で存在すると好都合であり得る本発明の医薬製剤は、製薬業界において周知である従来の技法により調製することができる。このような技法は、有効成分を、薬学的なキャリア(複数可)または賦形剤(複数可)と会合させる工程を包含する。一般に、製剤は、有効成分を、液体のキャリアもしくは微細化した固体のキャリアまたはそれらの両方と、一様かつ十分に会合させ、次いで、必要な場合は、生成物を成形することにより調製する。
経口製剤、非経口製剤、局所製剤、および生物学的製剤
経口投与のための組成物および製剤には、粉末または顆粒、マイクロ粒子、ナノ粒子、水または非水性媒体中における懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、トローチ、錠剤またはミニ錠剤が含まれる。増粘剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、または結合剤が所望される場合がある。一部の実施形態では、経口製剤が、それにより本発明で特色とされるdsRNAが1つ以上の浸透増強剤、界面活性剤、およびキレート化剤と共に投与される製剤である。適切な界面活性剤には、脂肪酸および/またはそれらのエステルもしくは塩、胆汁酸および/またはそれらの塩が含まれる。適切な胆汁酸/塩には、ケノデオキシコール酸(CDCA)およびウルソデオキシコール酸(ursodeoxychenodeoxycholic acid)(UDCA)、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸(glucholicacid)、グリコール酸(glycholic acid)、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−24,25−ジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが含まれる。適切な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリレート、トリカプリレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル1−モノカプレート、1−ドデシルアザシクロヘプタン−2−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、もしくは薬学的に許容されるその塩(例えば、ナトリウム塩)が含まれる。一部の実施形態では、浸透増強剤の組合せ、例えば、胆汁酸/塩と組み合わせた脂肪酸/塩が用いられる。1つの例示的な組合せは、ラウリン酸、カプリン酸、およびUDCAのナトリウム塩である。さらなる浸透増強剤には、ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−20−セチルエーテルが含まれる。本発明で特色とされるdsRNAは、噴霧用乾燥粒子、またはマイクロ粒子もしくはナノ粒子を形成するように複合体化された粒子を含め、顆粒形態で経口送達することができる。dsRNA複合体化剤には、ポリアミノ酸;ポリイミン;ポリアクリレート;ポリ(アクリル酸アルキル)、ポリオキシエタン、ポリ(シアノアクリル酸アルキル);陽イオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール(PEG)、およびデンプン;ポリ(シアノアクリル酸アルキル);DEAE誘導体化ポリイミン、ポルラン、セルロース、およびデンプンが含まれる。適切な複合体化剤には、キトサン、N−トリメチルキトサン、ポリ−L−リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレン P(TDAE)、ポリアミノスチレン(例えば、p−アミノスチレン)、ポリ(シアノアクリル酸メチル)、ポリ(シアノアクリル酸エチル)、ポリ(シアノアクリル酸ブチル)、ポリ(シアノアクリル酸イソブチル)、ポリ(シアノアクリル酸イソヘキシル)、DEAE−メタクリレート、DEAE−アクリル酸ヘキシル、DEAE−アクリルアミド、DEAE−アルブミンおよびDEAE−デキストラン、ポリ(アクリル酸メチル)、ポリ(アクリル酸ヘキシル)、ポリ(D,L−乳酸)、ポリ(D,L−乳酸−co−グリコール酸)(PLGA)、アルギネート、ならびにポリエチレングリコール(PEG)が含まれる。dsRNAの経口製剤およびそれらの調製については、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第6,887,906号;米国特許公開第20030027780号;および米国特許第6,747,014号において記載されている。
リポソーム製剤
マイクロエマルジョン以外に、多くの界面活性剤構造物の構成が研究され、薬物の製剤化に用いられている。これらには、単一層、ミセル、二重層、および小胞が含まれる。リポソームなどの小胞は、それらがもたらす特異性および作用時間のために、薬物送達の視点から多大の関心を惹起してきた。本発明で用いられる「リポソーム」という用語は、1つまたは複数の球形二重層内に配置された両親媒性脂質からなる小胞を意味する。
核酸脂質粒子
一実施形態では、本発明で特色とされるdsRNAが、脂質製剤中に完全に封入されて、例えば、核酸−脂質粒子を形成する。核酸−脂質粒子は、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、ステロール、ならびに粒子の凝集を防止する脂質(例えば、PEG−脂質コンジュゲート)を含有することが典型的である。核酸−脂質粒子は、静脈内(i.v.)注射後の循環中における寿命が延長され、遠位部位(例えば、投与部位から物理的に遠隔の部位)に蓄積されるので、全身適用に極めて有用である。加えて、核酸は、本発明の核酸−脂質粒子内に存在すると、水溶液中において、ヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性となる。核酸−脂質粒子、ならびにそれらを調製する方法は、例えば、米国特許第5,976,567号;同第5,981,501号;同第6,534,484号;同第6,586,410号;同第6,815,432号;ならびにPCT公開第WO96/40964号において開示されている。
陽イオン性脂質
本発明の核酸−脂質粒子は、陽イオン性脂質を包含することが典型的である。陽イオン性脂質は、例えば、N,N−ジオレイル−N,N−ジメチルアンモニウムクロリド(DODAC)、N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、N−(I−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロピル)−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTAP)、N−(I−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル)−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、N,N−ジメチル−2,3−ジオレイルオキシ)プロピルアミン(DODMA)、1,2−ジリノレイルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、1,2−ジリノレニルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)、1,2−ジリノレイルカルバモイルオキシ−3−ジメチルアミノプロパン(DLin−C−DAP)、1,2−ジリノレイオキシ−3−(ジメチルアミノ)アセトキシプロパン(DLin−DAC)、1,2−ジリノレイオキシ−3−モルホリノプロパン(DLin−MA)、1,2−ジリノレオイル−3−ジメチルアミノプロパン(DLinDAP)、1,2−ジリノレイルチオ−3−ジメチルアミノプロパン(DLin−S−DMA)、1−リノレオイル−2−リノレイルオキシ−3−ジメチルアミノプロパン(DLin−2−DMAP)、1,2−ジリノレイルオキシ−3−トリメチルアミノプロパンクロリド塩(DLin−TMA.Cl)、1,2−ジリノレオイル−3−トリメチルアミノプロパンクロリド塩(DLin−TAP.Cl)、1,2−ジリノレイルオキシ−3−(N−メチルピペラジノ)プロパン(DLin−MPZ)、または3−(N,N−ジリノレイルアミノ)−1,2−プロパンジオール(DLinAP)、3−(N,N−ジオレイルアミノ)−1,2−プロパンジオ(DOAP)、1,2−ジリノレイルオキソ−3−(2−N,N−ジメチルアミノ)エトキシプロパン(DLin−EG−DMA)、1,2−ジリノレニルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノメチル−[1,3]−ジオキソラン(DLin−K−DMA)またはそれらの類似体、(3aR,5s,6aS)−N,N−ジメチル−2,2−ジ((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエニル)テトラヒドロ−3aH−シクロペンタ[d][1,3]ジオキソール−5−アミン(ALNY−100)、(6Z,9Z,28Z,31Z)−ヘプタトリアコンタ−6,9,28,31−テトラエン−19−イル4−(ジメチルアミノ)ブタノエート(MC3)、またはこれらの混合物であり得る。
非陽イオン性脂質
本発明の核酸−脂質粒子は、非陽イオン性脂質を包含し得る。非陽イオン性脂質は、陰イオン性脂質の場合もあり、中性脂質の場合もある。例には、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(POPE)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシレート(DOPE−mal)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、16−O−モノメチルPE、16−O−ジメチルPE、18−1−trans PE、1−ステアロイル−2−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン(phosphatidyethanolamine)(SOPE)、コレステロール、またはこれらの混合物が含まれるがこれらに限定されない。
コンジュゲート脂質
核酸−脂質粒子において、ポリエチレングリコール(PEG)改変脂質、モノシアロガングリオシドGm1、ならびに米国特許第6,320,017号において記載されるものなどのポリアミドオリゴマー(「PAO」)を含めたコンジュゲート脂質を用いて、凝集を防止することができる。PEG、Gm1、またはATTAなど、製剤化の間に凝集を防止する、非荷電、親水性の立体障害部分を有する他の化合物もまた、脂質に連結して、本発明の方法および組成物において用いることができる。ATTA−脂質は、例えば、米国特許第6,320,017号において記載されており、PEG−脂質コンジュゲートは、例えば、米国特許第5,820,873号;同第5,534,499号;および同第5,885,613号において記載されている。凝集を低減するのに選択される脂質成分の濃度は、約1〜15%(脂質のモル百分率による)であることが典型的である。
リポタンパク質
一実施形態では、本発明の製剤が、アポリポタンパク質をさらに含む。本明細書で用いられる「アポリポタンパク質」または「リポタンパク質」という用語は、当業者に公知のアポリポタンパク質、ならびにこれらの変異体および断片と、アポリポタンパク質のアゴニスト、類似体、または以下で記載されるこれらの断片とを指す。
他の成分
多くの実施形態では、本発明の脂質粒子に両親媒性脂質が包含される。「両親媒性脂質」とは、脂質材料の疎水性部分が疎水性相にむけて配向するのに対し、親水性部分は水性相にむけて配向する、任意の適切な材料を指す。このような化合物には、リン脂質、アミノ脂質、およびスフィンゴ脂質が含まれるがこれらに限定されない。代表的なリン脂質には、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、またはジリノレイルホスファチジルコリンが含まれる。スフィンゴ脂質、グリコスフィンゴ脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ−アシルオキシ酸など、他のリンを欠く化合物もまた用いることができる。加えて、このような両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールなど、他の脂質とも容易に混合することができる。
核酸−脂質粒子の作製
一実施形態では、本発明の核酸−脂質粒子製剤は、押出し法またはインライン混合法により作製される。
核酸−脂質粒子の特徴付け
標準的な方法または押出しを伴わない方法により調製される製剤も、同様の方法で特徴付けることができる。例えば、目視検査により製剤を特徴付けることが典型的である。製剤は、凝集または沈殿を伴わない、白色がかった半透明の溶液であるものとする。脂質ナノ粒子の粒径および粒径分布は、例えば、Malvern Zetasizer Nano ZS(米国、Malvern社製)を用いる光散乱法により測定することができる。粒子は、40〜100nmなど、約20〜300nmのサイズであるものとする。粒径分布は、単峰性であるものとする。製剤中の他、封入画分中における全siRNA濃度も、色素排除アッセイを用いて推定する。製剤化されたsiRNA試料は、製剤を崩壊させる界面活性剤、例えば、0.5% Triton−X100の存在または不在下において、Ribogreen(Molecular Probes社製)などのRNA結合色素と共にインキュベートすることができる。製剤中における全siRNAは、界面活性剤を含有する試料からのシグナルを、標準曲線と比べることにより決定することができる。封入画分は、「遊離」siRNA含量(界面活性剤の不在下におけるシグナルにより測定される)を、全siRNA含量から減じることにより決定される。封入siRNAの百分率は、>85%であることが典型的である。一実施形態では、本発明の製剤が、少なくとも75%、少なくとも80%、または少なくとも90%封入される。
核酸−脂質粒子の製剤化
LNP01
核酸−脂質粒子合成の一例は、以下の通りである。リピドイドであるND98・4HCl(分子量1487)(式1)、コレステロール(Sigma−Aldrich社製)、およびPEG−セラミドC16(Avanti Polar Lipids社製)を用いて核酸−脂質粒子を合成する。この核酸−脂質粒子は、場合によって、LNP01粒子とも称する。エタノール中における各々の原液は、以下:ND98、133mg/ml;コレステロール、25mg/ml;PEG−セラミドC16、100mg/mlの通りに調製することができる。次いで、ND98、コレステロール、およびPEG−セラミドC16の原液を、例えば、42:48:10のモル比で混合することができる。最終エタノール濃度を約35〜45%とし、最終酢酸ナトリウム濃度を約100〜300mMとするように、混合脂質溶液を、siRNA水溶液(例えば、pH5の酢酸ナトリウム中)と混合することができる。混合すると、脂質−siRNAナノ粒子が自発的に形成されることが典型的である。所望の粒径分布に応じて、例えば、Lipex Extruder(Northern Lipids社製)などのサーモバレル型押出し器を用いて、結果として得られるナノ粒子混合物を、ポリカーボネート膜(例えば、100nmのカットオフ)を介して押し出すことができる。場合によっては、押出し工程を省くこともできる。エタノールの除去、ならびにこれと同時に行われる緩衝剤の置換は、例えば、透析またはタンジェンシャルフロー濾過により達成することができる。緩衝剤は、約pH7、例えば、約pH6.9、約pH7.0、約pH7.1、約pH7.2、約pH7.3、または約pH7.4の、例えば、リン酸緩衝食塩液(PBS)により置換することができる。
本発明の核酸−脂質粒子で用いられる任意の化合物、例えば、陽イオン性脂質などは、実施例においてより詳細に記載される方法を含めた、公知の有機合成法により調製することができる。別段に示さない限り、すべて置換基は、以下で定義される通りである。
式Aの合成
一実施形態では、本発明の核酸−脂質粒子が、式Aの陽イオン性脂質:
MC3の合成
DLin−M−C3−DMA(すなわち、(6Z,9Z,28Z,31Z)−ヘプタトリアコンタ−6,9,28,31−テトラエン−19−イル4−(ジメチルアミノ)ブタノエート)の調製は、以下の通りであった。ジクロロメタン(5mL)中における(6Z,9Z,28Z,31Z)−ヘプタトリアコンタ−6,9,28,31−テトラエン−19−オール(0.53g)、4−N,N−ジメチルアミノ酪酸ヒドロクロリド(0.51g)、4−N,N−ジメチルアミノピリジン(0.61g)、および1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド(0.53g)の溶液を、室温で一晩にわたり撹拌した。該溶液を希塩酸で洗浄の後、重炭酸ナトリウム希釈水溶液により洗浄した。有機画分を、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、回転式蒸発器(rotovap)で溶媒を除去した。残留物を、1〜5%のメタノール/ジクロロメタン溶出勾配を用いたシリカゲルカラム(20g)にかけて流過させた。精製された生成物を含有する画分を混合し、溶媒を除去することにより、無色の油(0.54g)が得られた。
ALNY−100の合成
ケタール519[ALNY−100]の合成は、以下のスキーム3:
スキーム3
515の合成:
2つ口丸底フラスコ(RBF)(1L)内の200ml 無水THF中におけるLiAlH4(3.74g、0.09852モル)の撹拌懸濁液に、70mLのTHF中における514(10g、0.04926モル)の溶液を、0℃の窒素雰囲気下でゆっくりと添加した。添加が完了した後に、反応混合物を室温まで温め、次いで、4時間にわたり加熱して還流させた。反応の進行は、薄層クロマトグラフィー(TLC)によりモニタリングした。反応が完了した後に(TLCによる)、混合物を0℃まで冷却し、飽和Na2SO4溶液を注意深く添加することによりクエンチした。反応混合物を室温で4時間にわたり撹拌し、濾過した。残留物を、THFにより十分に洗浄した。濾過物および洗浄物を混合し、400mLのジオキサンおよび26mLの濃HClにより希釈し、室温で20分間にわたり撹拌した。真空下で揮発物を除去して、白色固体としての515の塩酸塩を得た。収量:7.12g。1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 9.34 (広幅, 2H), 5.68 (s, 2H), 3.74 (m, 1H),2.66-2.60 (m, 2H), 2.50-2.45 (m, 5H).
516の合成:
250mLの2つ口RBF内の100mL乾燥DCM中における化合物515の撹拌溶液に、NEt3(37.2mL、0.2669モル)を添加し、窒素雰囲気下で0℃まで冷却した。50mlの乾燥DCM中にN−(ベンジルオキシ−カルボニルオキシ)−スクシンイミド(20g、0.08007モル)をゆっくりと添加した後に、反応混合物を室温まで温めた。反応が完了した後に(TLCにより2〜3時間)、混合物を1N HCl溶液(100mLで1回)および飽和NaHCO3溶液(50mLで1回)により逐次洗浄した。次いで、有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、溶媒を蒸発させて粗物質を得、これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、粘着性の塊としての516を得た。収量:11g(89%)。1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ = 7.36-7.27(m, 5H), 5.69 (s, 2H), 5.12 (s,2H), 4.96 (br., 1H) 2.74 (s, 3H), 2.60(m, 2H), 2.30-2.25(m, 2H).LC−MS[M+H]:232.3(96.94%)。
517Aおよび517Bの合成:
500mLの1つ口RBF内の220mLアセトンおよび水(10:1)の溶液中にシクロペンテンである516(5g、0.02164モル)を溶解させ、これに、室温で、N−メチルモルホリン−N−オキシド(N-methyl morpholine-N-oxide)(7.6g、0.06492モル)を添加した後、tert−ブタノール中のOsO4の7.6%溶液(0.275g、0.00108モル)4.2mLを添加した。反応(約3時間)が完了した後、固体のNa2SO3を添加することにより混合物をクエンチし、結果として得られる混合物を、室温で1.5時間にわたり撹拌した。反応混合物を、DCM(300mL)で希釈し、水(100mLで2回)で洗浄した後、飽和NaHCO3溶液(50mLで1回)、水(30mLで1回)、ならびに最後にブライン(50mLで1回)で洗浄した。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、真空中で溶媒を除去した。この粗物質を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、ジアステレオマーの混合物を得、これを、調製用HPLCにより分離した。収量:6gの粗517A:ピーク1(白色の固体)、5.13g(96%)。1H-NMR(DMSO, 400MHz): δ= 7.39-7.31(m, 5H), 5.04(s, 2H), 4.78-4.73 (m, 1H),4.48-4.47(d, 2H), 3.94-3.93(m, 2H), 2.71(s, 3H), 1.72- 1.67(m, 4H).LC−MS:[M+H]:266.3、[M+NH4+]:283.5が存在、HPLC:97.86%。X線により立体化学を確認した。
518の合成:
化合物505の合成について記載した手順と同様の手順を用いて、化合物518(1.2g、41%)を、無色の油として得た。1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ= 7.35-7.33(m, 4H), 7.30-7.27(m, 1H),5.37-5.27(m, 8H), 5.12(s, 2H), 4.75(m,1H), 4.58-4.57(m,2H), 2.78-2.74(m,7H),2.06-2.00(m,8H), 1.96-1.91(m, 2H), 1.62(m, 4H), 1.48(m, 2H), 1.37-1.25(br m,36H), 0.87(m, 6H).HPLC:98.65%。
化合物519を合成するための一般的な手順:
ヘキサン(15mL)中の化合物518溶液(1等量)を、THF中の氷冷LAH溶液(1M、2等量)へと滴下する形で添加した。添加が完了した後に、混合物を、40℃で0.5時間にわたり加熱し、次いで、氷浴上において再度冷却した。飽和Na2SO4水溶液により混合物を注意深く加水分解し、次いで、セライトを介して濾過し、油へと還元した。カラムクロマトグラフィーにより、無色の油として得られる純粋な519(1.3g、68%)がもたらされた。13C NMR δ = 130.2, 130.1 (x2), 127.9 (x3), 112.3, 79.3, 64.4, 44.7,38.3, 35.4, 31.5, 29.9 (x2), 29.7, 29.6 (x2), 29.5 (x3), 29.3 (x2), 27.2 (x3),25.6, 24.5, 23.3, 226, 14.1;エレクトロスプレーMS(+ve):C44H80NO2(M+H)+の分子量:計算値654.6、測定値654.6。
治療剤−脂質粒子組成物および製剤
本発明の脂質粒子と、該脂質粒子と会合させた活性作用物質とを含む組成物を、本発明は包含する。具体的な実施形態では、活性作用物質が、治療剤である。具体的な実施形態では、活性作用物質を、脂質粒子の水性の内部に封入する。他の実施形態では、活性作用物質を、脂質粒子の1つ以上の脂質層内に存在させる。他の実施形態では、活性作用物質を、脂質粒子の外部または内部の脂質表面に結合させる。
エマルジョン
本発明の組成物は、エマルジョンとして調製および製剤化することができる。典型的にはエマルジョンは、通常直径0.1μmを超える液滴の形態で別の液体中に分散した一液体の不均質系である(Idson、in Pharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Rieger andBanker(eds.)、1988年、Marcel Dekker、Inc., New York、N.Y.1巻、199頁、Rosoff、inPharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Rieger and Banker(eds.)、1988年、MarcelDekker、Inc., New York、N.Y.1巻、245頁、Block、in Pharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Riegerand Banker(eds.)、1988年、Marcel Dekker、Inc., New York、N.Y.2巻、335頁、Higuchiら、inRemington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.、Easton、Pa.、1985年、301頁)。エマルジョンは、完全に混合し互いに分散した2つの不溶性液相を含む二相系であることが多い。一般にエマルジョンは、油中水型(w/o)または水中油型(o/w)のいずれかであってよい。水相が細かく分かれ、バルク油相に微細液滴として分散するとき、生成する組成物は油中水型(w/o)エマルジョンと呼ばれる。あるいは、油相が細かく分かれ、バルク水相に微細液滴として分散するとき、生成する組成物は水中油型(o/w)エマルジョンと呼ばれる。エマルジョンは、分散相、および水相、油相のいずれか中に溶液として、またはそれ自体が分離相として存在し得る活性薬剤以外に、他の構成要素を含有することができる。乳化剤、安定剤、色素、および抗酸化剤などの薬学的賦形剤も、必要に応じてエマルジョン中に存在してよい。薬学的エマルジョンは、例えば油中水中油型(o/w/o)エマルジョンおよび水中油中水型(w/o/w)エマルジョンの場合など、2相より多くから構成される多層エマルジョンであってもよい。このような複合体製剤は、単純2層エマルジョンが与えない特定の利点を与えることが多い。o/wエマルジョンの個々の油滴が小さな水滴を封入する多層エマルジョンはw/o/wエマルジョンを構成する。同様に、油連続相中で安定化した水の小滴中に封入された油滴の系はo/w/oエマルジョンをもたらす。
一実施形態において本発明は、様々な浸透増強剤を利用して、動物の皮膚への、核酸、特にdsRNAの有効な送達を達成する。大部分の薬剤は、イオン形態と非イオン形態の両方で溶解して存在する。しかしながら通常、脂溶性または親油性薬剤のみが細胞膜を容易に横断する。横断すべき膜を浸透増強剤で処理する場合、非親油性薬剤でさえ細胞膜を横断することができることが発見されている。細胞膜を越える非親油性薬剤の拡散を助長する以外に、浸透増強剤は親油性薬剤の浸透性(permeability)も高める。
本発明のdsRNAは、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤で製剤化することができる。(本明細書では「賦形剤」とも呼ぶ)「薬学的に許容されるキャリア」は、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性な媒体(vehicle)である。薬学的に許容されるキャリアは液体または固体であってよく、望ましいバルク、コンシステンシー、および他の適切な輸送および化学的性質を与えるように、計画した投与形式を念頭に置いて選択することができる。典型的な薬学的に許容されるキャリアには、例えば、水、食塩水溶液、結合剤(例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)、増量剤(例えば、ラクトースおよび他の糖、ゼラチン、または硫酸カルシウム)、滑沢剤(例えば、デンプン、ポリエチレングリコール、または酢酸ナトリウム)、崩壊剤(例えば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム)、および湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)が挙げられるが、これらだけには限らない。
キャリア化合物と対照的に、「薬学的キャリア」または「賦形剤」は、1つ以上の核酸を動物に送達するための、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性な媒体である。賦形剤は、液体または固体であってよく、核酸および所与の薬学的組成物の他の構成要素と組み合わせると、望ましいバルク、コンシステンシーなどを与えるように、計画した投与形式を念頭に置いて選択することができる。典型的な薬学的キャリアには、結合剤(例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど)、増量剤(例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど)、滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属、硬化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど)、崩壊剤(例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど)、および湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど)が挙げられるが、これらだけには限らない。
本発明の組成物は、その当技術分野で確立した使用レベルで、薬学的組成物において従来見られる他の補助構成要素をさらに含有することができる。したがって、例えば、組成物は追加的な、適合性のある、薬学的に活性がある物質、例えばかゆみ止め薬、収斂薬、局所麻酔薬または抗炎症薬などを含有することができ、または色素、香味剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定剤などの、様々な剤形の本発明の組成物を物理的に製剤化する際に有用である追加的な物質を含有することができる。しかしながら、このような物質は添加のときに、本発明の組成物の構成要素の生物活性に過度に干渉してはならない。製剤は滅菌することができ、および望む場合、製剤の核酸(複数可)と有害に相互作用しない、補助剤、例えば滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、バッファー、着色物質、香味物質および/または芳香物質などと混合することができる。
一態様では、本発明の組成物を併用療法において使用することができる。用語「併用療法」は、他の生物活性成分(第二の異なる抗新生物剤などが挙げられるが、これに限らない)、および非薬剤療法(外科手術または放射線治療などが挙げられるが、これに限らない)とのさらなる併用で対象化合物の投与を含む。例えば、本発明の化合物は、他の薬学的に活性な化合物、好ましくは本発明の化合物の作用を高めることができる化合物と併用して使用することができる。本発明の化合物は、(単一の調製物または別の調製物として)同時に、または他の薬剤療法と連続して投与することができる。一般に、併用療法は、療法の単一サイクルまたは単一コース中の2個以上の薬剤投与を想定する。
本発明は特に、肝臓癌などの癌を治療するため、例えば腫瘍増殖および腫瘍転移を阻害するための、少なくとも2つのdsRNA、Eg5遺伝子を標的化するdsRNA、およびVEGF遺伝子を標的化するdsRNAを含有する組成物の使用に関する。例えば、薬学的組成物などの組成物を、例えば肝臓の癌において生じる可能性がある肝臓内腫瘍などの、固形腫瘍の治療に使用することができる。Eg5を標的化するdsRNAおよびVEGFを標的化するdsRNAを含有する組成物を使用して、他の腫瘍および癌、例えば乳癌、肺癌、頭頸部癌、脳癌、腹部癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃腸癌、グリオーマ、舌癌、神経芽腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫などを治療すること、メラノーマのような皮膚癌を治療すること、リンパ腫および血液癌を治療することも可能である。本発明はさらに、異なる型の癌、例えば肝臓癌、乳癌、肺癌、頭部癌、頸部癌、脳癌、腹部癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃腸癌、グリオーマ、舌癌、神経芽腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫、皮膚癌、メラノーマ、リンパ腫および血液癌において、腹水および胸水の蓄積を阻害するための、Eg5dsRNAおよびVEGFdsRNAを含有する組成物の使用に関する。Eg5およびVEGF発現に対する阻害効果のため、本発明による組成物またはそこから調製する薬学的組成物は生活の質を高めることができる。
さらに別の態様では、本発明は、哺乳動物中のEg5遺伝子およびVEGF遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。この方法は、標的Eg5遺伝子および標的VEGF遺伝子の発現が抑制されるように、本発明の特徴を有する組成物を哺乳動物に投与することを含む。
本発明の方法および組成物は特定のカチオン性脂質を利用し、その合成、調製および特徴付けは以下および添付の実施例中に記載する。さらに本発明は、治療剤、例えば核酸と結合する粒子を含めた、脂質粒子を調製する方法を提供する。本明細書に記載する方法において、脂質の混合物は核酸の緩衝水溶液と組み合わせて、脂質粒子中に封入された核酸を含有する中間体混合物を生成し、この場合封入核酸は約3重量%〜約25重量%、好ましくは5重量%〜15重量%の核酸/脂質比で存在する。中間体混合物は必要に応じてサイズ分けして、脂質部分が単層小胞であり、好ましくは30〜150nm、より好ましくは約40〜90nmの直径を有する脂質封入核酸粒子を得ることができる。次いでpHを上昇させ、脂質−核酸粒子の表面電荷の少なくとも一部分を中和し、したがって少なくとも部分的に表面が中和した脂質封入核酸組成物を与える。
本発明の脂質粒子を使用して、in vitroまたはin vivoで細胞に治療剤を送達することができる。特定の実施形態では、治療剤は核酸であり、本発明の核酸−脂質粒子を使用してそれを細胞に送達する。本発明の脂質粒子および関連の薬学的組成物を使用する様々な方法の以下の記載は、核酸−脂質粒子に関する記載によって例示されるが、これらの方法および組成物を、このような治療から恩恵を受ける任意の疾患または障害を治療するための任意の治療剤の送達に、容易に適合することができることは理解される。
dsRNA合成
試薬の供給元
試薬の供給元を本明細書で具体的に与えない場合、分子生物学における適用例の品質/純度標準で、分子生物学の任意の試薬供給業者から、このような試薬を入手することができる。
dsRNAのスクリーニング用に、Expedite8909合成装置(Applied Biosystems、Applera Deutschland GmbH、Darmstadt、ドイツ)および固体支持体として制御細孔ガラス(CPG、500Å、Proligo Biochemie GmbH、Hamburg、ドイツ)を使用して、1μmoleのスケールで固相合成によって一本鎖RNAを生成した。RNAおよび2’−O−メチルヌクレオチドを含有するRNAを、それぞれ対応するホスホラミダイトおよび2’−O−メチルホスホラミダイト(Proligo Biochemie GmbH、Hamburg、ドイツ)を利用して固相合成によって作製した。これらの構成単位(building block)を、Current protocols in nucleic acid chemistry、Beaucage、S.Lら、(Edrs.)、JohnWiley and Sons、Inc.、New York、NY、USAに記載された方法などの、標準的なヌクレオシドホスホラミダイト化学合成法を使用して、オリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択部位に組み込んだ。ホスホロチオエート結合を、アセトニトリル中のBeaucage試薬の溶液(1%)(Chruachem Ltd、Glasgow、UK)でヨウ素酸化剤溶液を置換することによって導入した。さらなる補助試薬はMallinckrodt Baker(Griesheim、ドイツ)から入手した。
初期スクリーニング設定
siRNA設計を実施して、(KIF11、HSKP、KNSL1およびTRIP5としても公知である)Eg5を標的化するsiRNAを同定した。Eg5に対するヒトmRNA配列、参照配列ID番号:NM_004523を使用した。
細胞増殖を介したEg5siRNAのin vitroスクリーニング
Eg5のサイレンシングは有糸分裂停止を引き起こすことが示されているので(Weil, Dら、[2002年]Biotechniques33巻:1244〜8頁)、細胞生存率アッセイをsiRNAの活性スクリーニングに使用した。HeLa細胞(ウエル当たり14000[スクリーニング1および3]またはウエル当たり10000[スクリーニング2])を96ウエルプレートに接種し、30nMのウエル中最終siRNA濃度、ならびに50nM(一次スクリーニング)および25nM(二次スクリーニング)の最終濃度で、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を用いて同時にトランスフェクトした。デュプレックスのサブセットは三次スクリーニングにおいて25nMで試験した(表5)。
mRNA阻害を介したEg5siRNAのin vitroスクリーニング
トランスフェクション直前に、HeLaS3(ATCC番号:CCL−2.2、LCG Promochem GmbH、Wesel、ドイツ)細胞を、75μlの増殖培地(ハムのF12、10%ウシ胎仔血清、100uペニシリン/100μg/mlストレプトマイシン、いずれもBookroom AG、ベルリン、ドイツ)が入った96ウエルプレート(Greiner Bio−One GmbH、Frickenhausen、ドイツ)に1.5×104個の細胞/ウエルで接種した。トランスフェクションは4連で実施した。それぞれのウエルに関して、0.5μlのリポフェクタミン2000(Invitrogen GmbH、Karlsruhe、ドイツ)を12μlのOpti−MEM(Invitrogen)と混合し、室温で15分間インキュベートした。100μlのトランスフェクション体積中に50nMであるsiRNA濃度に関して、1μlの5μMsiRNAをウエル当たり11.5μlのOpti−MEMと混合し、リポフェクタミン2000−Opti−MEM混合物と組み合わせ、室温で15分間再度インキュベートした。siRNA−リポフェクタミン2000−複合体を(ウエル当たりそれぞれ25μlで)細胞に完全に施し、細胞は加湿インキュベーター(Heroes GmbH、Hanau)において37℃および5%CO2で24時間インキュベートした。単回用量スクリーニングは、それぞれ50nMおよび25nMで一回行った。
LNP01製剤化siRNAの単回ボーラス投与後の幼若ラットにおける肝臓Eg5/KSPのサイレンシング
生まれてから約23日齢まで、成長中のラット肝臓においてEg5/KSP発現を検出することができる。製剤化Eg5/KSP siRNAを用いた標的のサイレンシングを、デュプレックスAD−6248を使用して幼若ラットにおいて評価した。
動物の投薬。オスの、幼若Sprague−Dawleyラット(19日齢)に、尾静脈注射によって単回用量のリピドイド(「LNP01」)製剤化siRNAを投与した。10匹の動物群に、体重1キログラム当たり10ミリグラム(mg/kg)の用量のAD6248または非特異的siRNAのいずれかを与えた。用量レベルは、製剤で投与するsiRNAデュプレックスの量を指す。第三群にはリン酸緩衝食塩水を与えた。動物はsiRNA投与後2日で屠殺した。肝臓を切開し、液体窒素中に急速凍結し、粉末状に粉砕した。
データの要約
Eg5/KSP mRNAに関する平均値(±標準偏差)を与える。PBS群に対する統計的有意性(p値)を示す(ns、有意性なし[p>0.05])。
LNP01製剤化VSPの静脈内注入後のラット肝臓VEGFのサイレンシング
2つのsiRNAの等モル混合物を含む「リピドイド」製剤をラットに投与した。本明細書で使用するVSPは、2つのsiRNA、Eg5/KSPを対象とするsiRNAおよびVEGFを対象とするsiRNAを有する組成物を指す。この実験用に、VEGFを対象とするデュプレックスAD3133およびEg5/KSPを対象とするAD12115を使用した。Eg5/KSPの発現は成体ラット肝臓においてほぼ検出不能なので、siRNA治療後にVEGFレベルのみを測定した。
動物の投薬。成体、メスのSprague−Dawleyラットに、大腿静脈への2時間の注入によってリピドイド(「LNP01」)製剤化siRNAを投与した。4匹の動物群に、体重1キログラム当たり5、10および15ミリグラム(mg/kg)の用量の製剤化siRNAを与えた。用量レベルは、製剤において投与するsiRNAデュプレックスの合計量を指す。第四群にはリン酸緩衝食塩水を与えた。動物はsiRNA注入終了後72時間で屠殺した。肝臓を切開し、液体窒素中に急速凍結し、粉末状に粉砕した。
リピドイドND98・4HCl(MW1487)(製剤1、上記)、コレステロール(Sigma−Aldrich)、およびPEG−セラミドC16(Avanti Polar Lipids)を使用して脂質−siRNAナノ粒子を調製した。
標準法または押出し遊離法のいずれかによって調製した製剤を同様の様式で特徴付けする。製剤は外観検査によって最初に特徴付けする。それらは凝集体または沈殿物を含まない白色半透明溶液であるべきである。脂質−ナノ粒子の粒径および粒径分布は、Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern、USA)を使用して動的光散乱によって測定する。粒子は20〜300nm、および理想的には40〜100nmの大きさでなければならない。粒径分布は単峰でなければならない。製剤、ならびに捕捉画分中の全体のsiRNA濃度は、色素排除アッセイを使用して評価する。製剤化siRNAのサンプルは、製剤化を妨害する界面活性剤、0.5%Triton−X100の有無の下でRNA結合色素Ribogreen(Molecular Probes)とインキュベートする。製剤中の全体のsiRNAは、標準曲線と比較して、界面活性剤を含有するサンプルからのシグナルによって決定する。捕捉画分は、全体のsiRNA含有量から(界面活性剤の不在下でのシグナルによって測定した)「遊離」siRNA含有量を差し引くことによって決定する。捕捉siRNAの割合は典型的には>85%である。SNALP製剤に関して、粒径は少なくとも30nm、少なくとも40nm、少なくとも50nm、少なくとも60nm、少なくとも70nm、少なくとも80nm、少なくとも90nm、少なくとも100nm、少なくとも110nm、および少なくとも120nmである。好ましい範囲は少なくとも約50nm〜少なくとも約110nm、好ましくは少なくとも約60nm〜少なくとも約100nm、最も好ましくは少なくとも約80nm〜少なくとも約90nmである。一例では、それぞれの粒径は少なくとも約1:1の比のEg5 dsRNAとVEGF dsRNAを含む。
データの要約
mRNA(VEGF/GAPDH)およびタンパク質(相対VEGF)に関する平均値(±標準偏差)をそれぞれの治療群に関して示す。それぞれの実験に関してPBS群に対する統計的有意性(p値)を示す。
ヒト肝臓腫瘍のマウスモデルにおけるVSP SNALPの評価
これらの試験は、KSP/Eg5を標的化するdsRNAおよびVEGFを標的化するdsRNAを含有するVSP siRNAカクテルを利用した。本明細書で使用するVSPは、2つのsiRNA、Eg5/KSPを対象とするsiRNAおよびVEGFを対象とするsiRNAを有する組成物を指す。この実験用に、(VEGFを対象とする)デュプレックスAD3133および(Eg5/KSPを対象とする)AD12115を使用した。siRNAカクテルは以下に記載するようにSNALPに製剤化した。
ヒトヘパトーマHep3B腫瘍を、肝臓内接種によってscid/beigeマウスにおいて樹立した。群A(n=6)の動物にはPBSを投与し、群B(n=6)の動物にはVSP SNALPを投与し、群C(n=5)の動物にはKSP/LucSNALPを投与し、群D(n=5)の動物にはVEGF/Luc SNALPを投与した。
第二のHep3B試験では、ヒトヘパトーマHep3B腫瘍を、肝臓内接種によってscid/beigeマウスにおいて樹立した。これらのマウスはリンパ球およびナチュラルキラー(NK)細胞に欠陥があったが、それは免疫媒介抗腫瘍効果について最小の余地がある。群A(n=6)のマウスは未治療であり、群B(n=6)のマウスにはルシフェラーゼ(luc)1955 SNALP(ロット番号AP10−02)を投与し、群C(n=7)のマウスにはVSP SNALP(ロット番号AP10−01)を投与した。SNALPは1:57 cDMA SNALP、および6:1 脂質:薬剤であった。
「++」=肝葉から突出した不連続な腫瘍小結節、「+++」=肝葉の両側で突出した
大きな腫瘍、「++++」=大きな腫瘍、肝葉全体の複数の小結節。
三次の試験では、ヒトHCC細胞(HepB3)をSCID/beigeマウスの肝臓に直接注射し、治療は20日後に開始した。群Aの動物にはPBSを投与し、群Bの動物には4mg/kgのLuc−1955 SNALPを投与し、群Cの動物には4mg/kgのSNALP−VSPを投与し、群Dの動物には2mg/kgのSNALP−VSPを投与し、群Eの動物には1mg/kgのSNALP−VSPを投与した。治療は単回静脈内(iv)投薬で行い、マウスは24時間後に屠殺した。
不連続な腫瘍小結節、「+++」=肝葉の両側で突出した大きな腫瘍
ヒト(腫瘍由来)KSPサイレンシングはTaqman分析によってアッセイし、その結果は図9に示す。hKSP発現はhGAPDHに対して標準化した。約80%の腫瘍KSPサイレンシングを4mg/kgのSNALP−VSPで観察し、有効性は1mg/kgで明らかであった。図9の白線は小(低GAPDH)腫瘍からの結果を表す。
第四の試験では、ヒトHCC細胞(HepB3)をSCID/beigeマウスの肝臓に直接注射し、治療は8日後に開始した。治療は静脈内(iv)ボーラス注射で、週に二回、合計6用量で行った。最終用量は第25日に投与し、終点エンドポイントは第27日であった。
ヒトヘパトーマHep3B腫瘍を、マウスにおける肝臓内接種によって樹立した。SNALP治療は腫瘍接種後20日に開始した。腫瘍担持マウス(群当たり3匹)を、2mg/kgの全siRNAで(i)VSP SNALPまたは(ii)対照(Luc)SNALPの単回静脈内(IV)用量によって治療した。
SNALP−VSP(KSP dsRNAとVEGF dsRNAのカクテル)治療によって、腫瘍量および腫瘍由来KSPおよびVEGFの発現が低減した。腫瘍量の指標であるGAPDHのmRNAレベルも、SNALP−VSP dsRNAの投与後に低下することを観察した(図12A、図12Bおよび図12C中に示す)。肉眼観察による腫瘍量の低下もSNALP−VSPの投与後に明らかであった。
SNALP−VSP動物対SNALP−Luc治療動物の生存
癌被験体の生存率に対するsiRNA SNALPの効果を試験するために、腫瘍をマウスにおける肝臓内接種によって樹立し、マウスはSNALP−siRNAで治療した。これらの試験は、KSP/Eg5およびVEGFを標的化するdsRNAを含有するVSP siRNAカクテルを利用した。対照はLucを標的化するdsRNAであった。siRNAカクテルはSNALPに製剤化した。
表15. 治療前および治療末期の時間における、それぞれの動物に関する血清アルファフェトプロテイン(AFP)濃度(濃度、μg/mlで)
樹立腫瘍中の単星の誘導
分裂細胞中のKSPの阻害は、組織切片において容易に観察可能である単星の形成をもたらす。単星の形成がSNALP−VSP治療腫瘍中で起こったかどうか決定するために、(Hep3B細胞移植後3週間の)腫瘍担持動物に、尾静脈注射によって2mg/kgのSNALP−VSPを投与した。対照動物には2mg/kgのSNALP−Lucを与えた。それぞれのカクテルは、元のクエン酸バッファーの条件を使用して、1:57cDMA SNALP(1.4%PEG−cDMA、57.1%DLinDMA、7.1%DPPC、および34.3%コレステロール)、6:1 脂質:薬剤に製剤化した。
ALN−VSP02(SNALP−VSP)の製造プロセスおよび製品仕様
ALN−VSP02製品は、注入を介したIV投与用に(SNALPと呼ばれる)滅菌脂質粒子製剤に製剤化された2mg/mLの薬剤物質ALN−VSPDS01を含有する。薬剤物質ALN−VSPDS01は、等モル比の2つのsiRNA(KSPを標的化するALN−12115およびVEGFを標的化するALN−3133)からなる。この薬剤製品は5mLの充填体積で10mLガラスバイアル中にパッケージされる。
薬剤物質ALN−VSPDS01、ALN−12115およびALN−3133の2つのsiRNA構成要素を、市販の合成装置および素材を使用して化学的に合成する。製造プロセスは、ホスホラミダイト化学合成法、ならびに5’Oジメトキシトリフェニルメチル(DMT)保護基、およびtertブチルジメチルシリル(TBDMS)で保護した2’ヒドロキシル、または2’メトキシ基(2’OMe)で置換した2’ヒドロキシルを使用した従来の固相オリゴヌクレオチド合成によって、それぞれのデュプレックスの2つの一本鎖オリゴヌクレオチド(ALN−12115のA19562センスとA19563アンチセンスおよびALN−3133のA3981センスおよびA3982アンチセンス)の合成からなる。制御細孔ガラスまたはポリスチレンなどの固相支持体上でのホスホラミダイト法によるオリゴヌクレオチド鎖の構築。サイクルは5’脱保護、カップリング、酸化、およびキャッピングからなる。それぞれのカップリング反応は、5(エチルチオ)1Hテトラゾール試薬、次に支持体固定保護ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの遊離5’ヒドロキシル基のカップリングを使用して、適切に保護されたリボ、2’OMe、またはデオキシリボヌクレオシドアミダイトの活性化によって実施する。適切なサイクル数の後、最終5’保護基を酸処理によって除去する。粗製オリゴヌクレオチドは、水性メチルアミン処理、ならびにシアノエチル保護基と核酸塩基保護基の同時除去によって固相支持体から切断される。2’OTBDMS基はフッ化水素含有試薬を使用して次いで切断し、粗製オリゴヌクレオチドを得て、これは強アニオン交換高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、次に限外濾過を使用した脱塩を使用して精製する。デュプレックスへのアニーリング前に、精製した一本鎖を分析して、正確な分子量、分子配列、不純物プロファイルおよびオリゴヌクレオチド含有量を確認する。アニーリングしたデュプレックス中間体ALN12115およびALN3133は凍結乾燥および20℃で保存し、または1:1のモル比で混合し、溶液を凍結乾燥して薬剤物質ALN VSPDS01を得る。デュプレックス中間体を乾燥粉末として保存する場合、それらは混合前に水中に再度溶かす。HPLC法により混合プロセスをモニタリングすることによって等モル比を得る。
ALN VSP02は、等張バッファー中の2つのsiRNA(1:1のモル比)と脂質賦形剤との滅菌製剤である。脂質賦形剤は2つのsiRNAと結合し、循環系中の分解からそれらを保護し、標的組織へのそれらの送達を促進する。(表17に示す)それぞれの具体的な脂質賦形剤および定量比は、多数の異なる製剤の物理化学的性質、安定性、薬力学、薬物動態、毒性および製品製造性を比較した一連の反復実験によって選択した。賦形剤DLinDMAは、哺乳動物細胞のエンドソームで見られるように低pHで正に帯電しているが、全血のより中性なpHでは比較的無電荷である滴定可能なアミノ脂質である。この特徴は、使用前に製剤バッファーをより中性な保存バッファーで置換することによって、低pHで負に帯電したsiRNAの効率よい封入を容易にし、空粒子の形成を妨げ、さらに粒子電荷の調節(低減)を可能にする。コレステロールおよび中性脂質DPPCを取り込ませて、粒子に物理化学的安定性を与える。ポリエチレングリコール脂質コンジュゲートPEG2000C DMAは薬剤製品の安定性を助け、目的とする用途に最適な循環時間を与える。ALN VSP02脂質粒子は、低多分散値で約80〜90nmの平均径を有する。中性pHでは、粒子は本質的に無電荷であり、6mV未満のゼータ電位値を有する。製造プロセスに基づく空(非充填)粒子の証拠はない。
ヒト癌細胞系におけるALN−VSP02のin vitro有効性
ヒト癌細胞系におけるALN−VSP02治療の有効性を、治療後のKSPmRNA、VEGFmRNA、および細胞生存率の測定によって決定した。IC50(nM)値はそれぞれの細胞系においてKSPおよびVEGFに関して決定した。
樹立Hep3B肝臓内腫瘍におけるソラフェニブに対するVSP SNALPの抗腫瘍有効性
樹立Hep3B肝臓内腫瘍を有するscid/beigeマウスにおけるソラフェニブに対する複数投薬VSP SNALPの抗腫瘍効果を試験した。ソラフェニブは、肝細胞癌(HCC)の治療用に承認されたプロテインキナーゼの低分子阻害剤である。
AD−12115およびAD−3133の変異体を使用したVSPのin vitro有効性
Eg5/KSPおよびVEGFを標的化する2組のデュプレックスを設計し合成した。それぞれの組は、AD−12115およびAD−3133の一方に対する標的部位の各方向に10ヌクレオチドをタイリングする(tiling)デュプレックスを含んでいた。
単一平滑末端を有するVEGFを標的化するdsRNA
VEGFを標的化する一組のdsRNAデュプレックスを設計し合成した。この組は、AD−3133に対する標的部位の各方向に10ヌクレオチドをタイリングするデュプレックスを含んでいた。それぞれのデュプレックスは、アンチセンス鎖の3’末端に相当する末端に2塩基の突出部分を含み、アンチセンス鎖の5’末端に相当する末端、例えば平滑末端には突出部分を含まない。
dsRNAオリゴヌクレオチド合成
合成
すべてのオリゴヌクレオチドはAKTAoligopilot合成装置で合成する。市販の制御細孔ガラス固体支持体(dT−CPG、500Å、Prime Synthesis)およびRNAホスホラミダイトおよび標準的保護基、5’−O−ジメトキシトリチルN6−ベンゾイル−2’−t−ブチルジメチルシリル−アデノシン−3’−O−N,N’−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホラミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2’−t−ブチルジメチルシリル−シチジン−3’−O−N,N’−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホラミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−N2−−イソブチリル−2’−t−ブチルジメチルシリル−グアノシン−3’−O−N,N’−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホラミダイト、および5’−O−ジメトキシトリチル−2’−t−ブチルジメチルシリル−ウリジン−3’−O−N,N’−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホラミダイト(Pierce Nucleic Acids Technologies)をオリゴヌクレオチド合成に使用した。2’−Fホスホラミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2’−フルオロ(fluro)−シチジン−3’−O−N,N’−ジイソプロピル−2−シアノエチル−ホスホラミダイトおよび5’−O−ジメトキシトリチル−2’−フルオロ−ウリジン−3’−O−N,N’−ジイソプロピル−2−シアノエチル−ホスホラミダイトは(Promega)から購入する。10%THF/ANC(v/v)中の0.2Mの濃度で使用するグアノシン以外、すべてのホスホラミダイトはアセトニトリル(CH3CN)中の0.2Mの濃度で使用する。16分のカップリング/リサイクル時間を使用する。アクチベーターは5−エチルチオテトラゾール(0.75M、American International Chemicals)であり、PO酸化用にヨウ素/水/ピリジンを使用し、PS酸化用には2,6−ルチジン/ACN(1:1v/v)中のPADS(2%)を使用する。
合成終了後、支持体を100mLガラス容器(VWR)に移す。オリゴヌクレオチドは、55℃で6.5時間のエタノールアンモニアの80mL混合物[アンモニア:エタノール(3:1)]を用いた塩基とホスフェート基の同時脱保護によって支持体から切断する。容器は氷上で軽く冷却し、次いでエタノールアンモニア混合物を新たな250mL容器に濾過する。CPGは2×40mL量のエタノール/水(1:1v/v)で洗浄する。次いでロータリーエバポレーター(roto−vap)によって混合物の体積を約30mLに減らす。次いで混合物はドライアイス上で凍結させ、speed vacで真空下において乾燥させる。
乾燥残渣を26mLのトリエチルアミン、トリエチルアミントリヒドロフルオリド(TEA・3HF)またはピリジン−HFおよびDMSO(3:4:6)中に再縣濁し、60℃で90分間加熱して、2’位置のtert−ブチルジメチルシリル(TBDMS)基を除去する。次いで反応を50mLの20mM酢酸ナトリウムを用いて停止させ、pHは6.5に調整する。オリゴヌクレオチドは精製までフリーザー中に保存する。
オリゴヌクレオチドは精製前に高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって分析し、バッファーおよびカラムの選択は配列およびまたは結合リガンドの性質に依存する。
リガンド結合オリゴヌクレオチドは逆相調製HPLCによって精製する。非結合オリゴヌクレオチドは、室内でパッケージしたTSKゲルカラム上でアニオン交換HPLCによって精製する。バッファーは、10%CH3CN中20mMリン酸ナトリウム(pH8.5)(バッファーA)、および10%CH3CN、1MNaBr中20mMリン酸ナトリウム(pH8.5)(バッファーB)である。完全長オリゴヌクレオチドを含有する画分をプールし、脱塩し、凍結乾燥する。約0.15ODの脱塩オリゴヌクレオチドを150μLまで水に希釈し、次いでCGEおよびLC/MS分析用に特殊バイアルに移す。次いで化合物はLC−ESMSおよびCGEによって分析する。
siRNAの調製用に、等モル量のセンス鎖とアンチセンス鎖を95℃において5分間1×PBS中で加熱して、室温までゆっくりと冷却する。デュプレックスの完全性はHPLC分析によって確認する。本明細書に記載するAD−3133およびAD−AD−12115を合成する。
結合脂質の合成
mPEG2000−1,2−ジ−O−アルキル−sn3−カルバモイルグリセリド(carbomoylglyceride)(PEG−DMG)などのPEG−脂質を以下の手順を使用して合成した:
化合物4aの調製:1,2−ジ−O−テトラデシル−sn−グリセリド1a(30g、61.80mmol)およびN,N’−スクシンイミジルカルボネート(succinimidylcarboante)(DSC、23.76g、1.5当量)をジクロロメタン(DCM、500mL)中におき、氷水混合物上で撹拌した。トリエチルアミン(25.30mL、3当量)を撹拌溶液に加え、その後反応混合物は周囲温度で一晩撹拌した。反応の進行はTLCによってモニタリングした。反応混合物はDCM(400mL)で希釈し、有機層は水(2×500mL)、NaHCO3水溶液(500mL)で洗浄し、次に標準的な後処理をした。得られた残渣は、一晩高真空下において周囲温度で乾燥させた。乾燥後、このようにして得た粗製カルボネート2aはジクロロメタン(500mL)中に溶かし、氷浴上で撹拌した。この撹拌溶液に、mPEG2000−NH2(3、103.00g、47.20mmol、NOF Corporation、日本から購入)および無水ピリジン(80mL、過剰)をアルゴン下で加えた。いくつかの実施形態では、メトキシ−(PEG)x−アミンは45〜49、好ましくは47〜49、およびより好ましくは49のxを有する。次いで反応混合物を、一晩周囲温度で撹拌した。溶媒および揮発性物質は真空下で除去し、残渣はDCM(200mL)中に溶かし、酢酸エチル中にパッケージしたシリカゲルのカラムにチャージした。カラムは最初に酢酸エチルで、次にジクロロメタン中5〜10%メタノールの勾配で溶出して、白い固体として所望のPEG−脂質4aを得た(105.30g、83%)。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ=5.20-5.12(m, 1H), 4.18-4.01(m, 2H), 3.80-3.70(m, 2H), 3.70-3.20(m, -O-CH2-CH2-O-,PEG-CH2), 2.10-2.01(m, 2H), 1.70-1.60 (m, 2H), 1.56-1.45(m, 4H),1.31-1.15(m, 48H), 0.84(t, J= 6.5Hz, 6H)。実測したMS範囲:2660〜2836。
押出し法に関する一般的なプロトコール
脂質(例えば、脂質A、DSPC、コレステロール、DMG−PEG)を溶かし、所望のモル比に従いエタノール中に混合する。エタノール注入法によってリポソームを形成し、この場合混合した脂質はpH5.2で酢酸ナトリウムバッファーに加える。これは35%エタノール中でリポソームの自発的形成をもたらす。リポソームは0.08μmのポリカーボネート膜を介して少なくとも2回押し出す。ストックsiRNA溶液を酢酸ナトリウムおよび35%エタノール中で調製し、リポソームに加えて充填する。siRNA−リポソーム溶液は30分間37℃でインキュベートし、およびその後希釈する。エタノールを除去し、透析またはタンジェンシャルフロー濾過によってPBSバッファーに交換する。
インラインミキシング法に関する一般的なプロトコール
個々および別々のストック溶液、脂質を含有する溶液、およびsiRNAを含有する他の溶液を調製する。例えば、脂質A、DSPC、コレステロールおよびPEG脂質を含有する脂質ストックは90%エタノール中に溶かすことによって調製する。残りの10%は低pHクエン酸バッファーである。脂質ストックの濃度は4mg/mLである。このクエン酸バッファーのpHは、利用される融合性脂質のタイプに応じて、pH3〜5の範囲であり得る。siRNAも4mg/mLの濃度でクエン酸バッファーに可溶化される。小規模用に、5mLの各ストック溶液を調製する。
マウスの肝臓内Hep3B腫瘍におけるLNP−08製剤化VSPによるsiRNAサイレンシング
VSPのサイレンシング(VEGFおよびKSP)を、核酸−脂質粒子を含有するXTCで製剤化したsiRNA、例えばLNP−08の静脈内投与後、同所性(肝臓内)Hep3B腫瘍において実施した。
マウスHep3b腫瘍モデルにおけるLNP−011およびLNP−012脂質製剤の評価
マウスの肝臓内Hep3B腫瘍におけるKSPおよびVEGFの発現に対する様々なVSP製剤の効果を比較した。35匹のメスFox Scid beigeマウスに、直接的肝臓内手術によって、0.025ccのPBSに縣濁した1×106個のHep3B−Luc細胞を注射した。XenogenによるLuc読み取り値によって腫瘍増殖をモニタリングした。
マウスHep3b腫瘍モデルにおけるLNP−08+/−C18脂質製剤の評価
以下のVSP製剤の効果をHEP3B腫瘍モデルにおいて試験した。腫瘍担持(肝臓内)マウスに、上に記載したプロトコールに従い、単回ボーラスIV用量として調製および投与した以下の製剤の1つを注射した:
HeLa細胞におけるリポソームの細胞取込みにおけるApoEの役割
LNP製剤化dsRNAを、組換えヒトApoEを加えることによって調製する。生成したLNP−ApoE製剤化dsRNAを、細胞によるdsRNAの取込みに対する効果に関してHeLa細胞において試験する。イオン化脂質と共にApoEを利用する組成物および方法は、その全容を参照により本明細書に組み込む国際特許出願第PCT/US10/22614号に記載される。
一晩、1ウエル当たり6000個のHeLa細胞を96ウエルプレート(Grenier)に接種する。Alexa−fluor647標識GFP siRNAの3つの異なるリポソーム製剤、1)LNP01、2)SNALP、3)LNP05を、50nMの最終濃度まで3つの培地条件の1つに希釈する。調べた培地条件は、OptiMem、10%FBSを含むDMEM、または10%FBSおよび10ug/mLのヒト組換えApoE(Fitzgerald Industries)を含むDMEMである。培地中または10分間ApoEと予め複合体形成した培地中の、示されたリポソームを、4、6、または24時間のいずれかの間、細胞に加える。それぞれの実験条件に関して3回の反復を実施した。示した時間地点の間に、プレート中のHeLa細胞に添加した後、細胞を15分間4%パラホルムアルデヒトで固定し、次いで核と細胞質をDAPIおよびSyto色素で染色した。Perkin ElmerからのOpera回転盤自動共焦点システムを使用して画像を得る。Alexa Fluor647 siRNAの取込みの定量化はAcapellaソフトウェアを使用して実施する。4つの異なるパラメーター、1)細胞数、2)視野当たりのsiRNA陽性スポットの数、3)細胞当たりのsiRNA陽性スポットの数、および4)統合したスポットシグナル、または細胞当たりのsiRNAスポットの平均数×平均スポット強度を定量化する。したがって平均スポットシグナルは、細胞当たりの全siRNA含量のおよその推定値である。
A375(メラノーマ)、B16F10(メラノーマ)、BT−474(乳房)、GTL−16(胃癌)、Hct116(結腸)、Hep3b(肝性)、HepG2(肝臓)、HeLa(子宮頸部)、HUH7(肝臓)、MCF7(乳房)、Mel−285(ぶどう膜メラノーマ)、NCI−H1975(肺)、OMM−1.3(ぶどう膜メラノーマ)、PC3(前立腺)、SKOV−3(卵巣)、U87(膠芽腫)。
ApoEの存在下でのKSP siRNAのKd
KSPを標的化するLNP−08製剤化siRNAのKd(親和性)に対するApoEの効果を複数の細胞系において評価した。LNP08とC18PEG製剤化siRNAを含むLNP08の両方を使用した。KSPを標的化するsiRNAデュプレックスはAL−DP−6248であった。
ApoEの存在下でのKSPsiRNAのIC50
KSPを標的化するLNP−08製剤化siRNAのIC50(有効性)に対するApoEの効果を多数の細胞系において評価した。LNP08とC18PEG製剤化siRNAを含むLNP08の両方を使用した。KSP標的化siRNAデュプレックスはAL−DP−6248であった。
ヒトにおけるEg5/KSPおよびVEGF発現の阻害
ヒト被験体を、薬学的組成物、例えばEg5/KSP遺伝子を標的化するdsRNAとVEGF遺伝子を標的化するdsRNAの両方を有する核酸−脂質粒子で治療して、核酸−脂質粒子においてEg5/KSPおよびVEGF遺伝子の発現を阻害する。核酸−脂質粒子は、例えばXTC、MC3、またはALNY−100を含む。
Claims (30)
- 細胞内におけるヒトキネシンファミリーメンバー11(Eg5/KSP)遺伝子の発現を阻害する第1の二本鎖リボ核酸(dsRNA)と、細胞内におけるヒトVEGFの発現を阻害する第2のdsRNAとを含む核酸脂質粒子を含む組成物であって、
前記核酸脂質粒子が、45〜65モル%の陽イオン性脂質、5〜15モル%の非陽イオン性脂質、25〜40モル%のステロール、および0.5〜5モル%のPEGまたはPEG改変脂質を含む脂質製剤を含み、
前記第1のdsRNAが、第1のセンス鎖と第1のアンチセンス鎖とからなり、前記第1のセンス鎖が、第1の配列を含み、前記第1のアンチセンス鎖が、
配列番号1311(5’−UCGAGAAUCUAAACUAACU−3’)
のうちの少なくとも15の連続ヌクレオチドと相補的な第2の配列を含み、
前記第1の配列が、前記第2の配列と相補的であり、前記第1のdsRNAが、15〜30塩基対の長さであり;
前記第2のdsRNAが、第2のセンス鎖と第2のアンチセンス鎖とからなり、前記第2のセンス鎖が、第3の配列を含み、前記第2のアンチセンス鎖が、
配列番号1538(5’−GCACAUAGGAGAGAUGAGCUU−3’)
のうちの少なくとも15の連続ヌクレオチドと相補的な第4の配列を含み、
前記第3の配列が、前記第4の配列と相補的であり、前記第2のdsRNAが、15〜30塩基対の長さであり、
前記陽イオン性脂質が、MC3((6Z,9Z,28Z,31Z)−ヘプタトリアコンタ−6,9,28,31−テトラエン−19−イル4−(ジメチルアミノ)ブタノエート)を含む、組成物。 - 前記第1のdsRNAが、配列番号1534(5’−UCGAGAAUCUAAACUAACUTT−3’)からなるセンス鎖と、配列番号1535(5’−AGUUAGUUUAGAUUCCUGATT−3’)からなるアンチセンス鎖とからなり、前記第2のdsRNAが、配列番号1536(5’−GCACAUAGGAGAGAUGAGCUU−3’)からなるセンス鎖と、配列番号1537(5’−AAGCUCAUCUCUCCUAUGUGCUG−3’)からなるアンチセンス鎖とからなる、請求項1に記載の組成物。
- 小文字の「c」または「u」により示される2’−O−メチルリボヌクレオチドと、小文字の「s」により示されるホスホロチオエートとを包含するように、各鎖が、以下:
前記第1のdsRNAが、
配列番号1240(5’−ucGAGAAucuAAAcuAAcuTsT−3’)
からなるセンス鎖と、
配列番号1241(5’−AGUuAGUUuAGAUUCUCGATsT)
からなるアンチセンス鎖とからなり;
前記第2のdsRNAが、
配列番号1242(5’−GcAcAuAGGAGAGAuGAGCUsU−3’)
からなるセンス鎖と、
配列番号1243(5’−AAGCUcAUCUCUCCuAuGuGCusG−3’)からなるアンチセンス鎖とからなる、
ように改変される、
請求項3に記載の組成物。 - 前記第1および第2のdsRNAが、少なくとも1つの改変ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記改変ヌクレオチドが、2’−O−メチル改変ヌクレオチド、5’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項5に記載の組成物。
- 前記改変ヌクレオチドが、2’−デオキシ−2’−フルオロ改変ヌクレオチド、2’−デオキシ改変ヌクレオチド、ロックトヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2’−アミノ改変ヌクレオチド、2’−アルキル改変ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデートを含むヌクレオチド、および非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される、請求項5に記載の組成物。
- 前記第1および第2のdsRNAの各々が、少なくとも1つの2’−O−メチル改変リボヌクレオチドと、5’−ホスホロチオエート基を含む少なくとも1つのヌクレオチドとを含む、請求項1に記載の組成物。
- 各dsRNAの各鎖が、19〜23塩基の長さである、請求項1に記載の組成物。
- 各dsRNAの各鎖が、21〜23塩基の長さである、請求項1に記載の組成物。
- 前記第1のdsRNAの各鎖が、21塩基の長さであり、前記第2のdsRNAの前記センス鎖が21塩基の長さであり、前記第2のdsRNAの前記アンチセンス鎖が23塩基の長さである、請求項1に記載の組成物。
- 前記第1および第2のdsRNAが、等モル比で存在する、請求項1に記載の組成物。
- ソラフェニブをさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- リポタンパク質をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- アポリポタンパク質E(ApoE)をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- Eg5を発現する細胞と接触させると、Eg5の発現を少なくとも40%阻害する、請求項1に記載の組成物。
- VEGFを発現する細胞と接触させると、VEGFの発現を少なくとも40%阻害する、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物を細胞に投与すると、前記細胞におけるEg5およびVEGFの発現が低下する、請求項1に記載の組成物。
- nM濃度で投与される、請求項18に記載の組成物。
- 前記組成物を細胞に投与すると、前記細胞における単星の形成が増大する、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物を哺乳動物に投与すると、前記哺乳動物における腫瘍増殖の防止、腫瘍増殖の低減、または生存の延長からなる群から選択される少なくとも1つの効果がもたらされる、請求項1に記載の組成物。
- 前記効果が、体重の決定、器官重量の決定、視診、mRNA解析、血清AFP解析、および生存のモニタリングからなる群から選択される少なくとも1つのアッセイを用いて測定される、請求項21に記載の組成物。
- 細胞内におけるEg5/KSPおよびVEGFの発現を阻害するための、請求項1に記載の組成物。
- 癌の治療を必要とする哺乳動物において、腫瘍の増殖を防止するか、腫瘍の増殖を低減するか、または生存を延長させるための、請求項1に記載の組成物。
- 前記哺乳動物が、肝臓癌を有する、請求項24に記載の組成物。
- 前記哺乳動物が、肝臓癌を有するヒトである、請求項24に記載の組成物。
- 前記組成物が、0.25mg/kg〜4mg/kgのdsRNAを含有する用量で前記哺乳動物に投与されることを特徴とする、請求項24に記載の組成物。
- 前記組成物が、0.01、0.1、0.5、1.0、2.5、または5.0mg/kgの前記dsRNAの用量でヒトに投与されることを特徴とする、請求項24に記載の組成物。
- 癌の治療を必要とする哺乳動物において腫瘍の増殖を低減するための、請求項1に記載の組成物であって、前記組成物の投与によって腫瘍の増殖が少なくとも20%低減される、組成物。
- 前記組成物の投与によってKSPの発現が少なくとも60%低下される、請求項29に記載の組成物。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US15978809P | 2009-03-12 | 2009-03-12 | |
US61/159,788 | 2009-03-12 | ||
US23157909P | 2009-08-05 | 2009-08-05 | |
US61/231,579 | 2009-08-05 | ||
US28594709P | 2009-12-11 | 2009-12-11 | |
US61/285,947 | 2009-12-11 | ||
PCT/US2010/027210 WO2010105209A1 (en) | 2009-03-12 | 2010-03-12 | LIPID FORMULATED COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING EXPRESSION OF Eg5 AND VEGF GENES |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016121412A Division JP2016168053A (ja) | 2009-03-12 | 2016-06-20 | 脂質製剤組成物およびEg5遺伝子とVEGF遺伝子の発現を阻害する方法 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2012520082A JP2012520082A (ja) | 2012-09-06 |
JP2012520082A5 JP2012520082A5 (ja) | 2013-05-02 |
JP6032724B2 true JP6032724B2 (ja) | 2016-11-30 |
Family
ID=42199883
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011554247A Expired - Fee Related JP6032724B2 (ja) | 2009-03-12 | 2010-03-12 | 脂質製剤組成物およびEg5遺伝子とVEGF遺伝子の発現を阻害する方法 |
JP2016121412A Pending JP2016168053A (ja) | 2009-03-12 | 2016-06-20 | 脂質製剤組成物およびEg5遺伝子とVEGF遺伝子の発現を阻害する方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016121412A Pending JP2016168053A (ja) | 2009-03-12 | 2016-06-20 | 脂質製剤組成物およびEg5遺伝子とVEGF遺伝子の発現を阻害する方法 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20100267806A1 (ja) |
EP (1) | EP2406376A1 (ja) |
JP (2) | JP6032724B2 (ja) |
CN (2) | CN102421900B (ja) |
AU (1) | AU2010223967B2 (ja) |
CA (1) | CA2754043A1 (ja) |
HK (2) | HK1169676A1 (ja) |
NZ (1) | NZ594995A (ja) |
WO (1) | WO2010105209A1 (ja) |
Families Citing this family (71)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2832154B1 (fr) | 2001-11-09 | 2007-03-16 | Centre Nat Rech Scient | Oligonucleotides inhibiteurs et leur utilisation pour reprimer specifiquement un gene |
EP2636739B1 (en) | 2004-03-12 | 2014-12-10 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | iRNA agents targeting VEGF |
EA014886B1 (ru) | 2006-03-31 | 2011-02-28 | Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. | КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА Eg5 |
US8598333B2 (en) * | 2006-05-26 | 2013-12-03 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | SiRNA silencing of genes expressed in cancer |
SG188121A1 (en) * | 2008-03-05 | 2013-03-28 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Compositions and methods for inhibiting expression of eg5 and vegf genes |
JP5475753B2 (ja) | 2008-04-15 | 2014-04-16 | プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド | 核酸送達用の脂質製剤 |
CA3039251C (en) * | 2008-11-10 | 2024-01-09 | Arbutus Biopharma Corporation | Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics |
US20100233270A1 (en) | 2009-01-08 | 2010-09-16 | Northwestern University | Delivery of Oligonucleotide-Functionalized Nanoparticles |
CA3036963A1 (en) * | 2009-01-29 | 2010-08-05 | Arbutus Biopharma Corporation | Lipid formulations comprising cationic lipid and a targeting lipid comprising n-acetyl galactosamine for delivery of nucleic acid |
AU2010245933B2 (en) * | 2009-05-05 | 2016-06-16 | Arbutus Biopharma Corporation | Methods of delivering oligonucleotides to immune cells |
JP5766188B2 (ja) | 2009-07-01 | 2015-08-19 | プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド | 固形腫瘍に治療剤を送達するための脂質製剤 |
WO2011034798A1 (en) | 2009-09-15 | 2011-03-24 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of eg5 and vegf genes |
EP3403647A1 (en) | 2009-12-01 | 2018-11-21 | Translate Bio, Inc. | Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases |
EP2558074B1 (en) | 2010-04-08 | 2018-06-06 | The Trustees of Princeton University | Preparation of lipid nanoparticles |
WO2012000104A1 (en) | 2010-06-30 | 2012-01-05 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Non-liposomal systems for nucleic acid delivery |
CA2813024A1 (en) | 2010-10-21 | 2012-04-26 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Novel low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery |
US9067882B2 (en) | 2010-11-05 | 2015-06-30 | Sirna Therapeutics, Inc. | Low molecular weight cyclic amine containing cationic lipids for oligonucleotide delivery |
WO2012064824A1 (en) | 2010-11-09 | 2012-05-18 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of eg5 and vegf genes |
US8853377B2 (en) | 2010-11-30 | 2014-10-07 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | mRNA for use in treatment of human genetic diseases |
EP2649182A4 (en) | 2010-12-10 | 2015-05-06 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | COMPOSITIONS AND METHOD FOR INCREASING AN ERYTHROPOIETIN (EPO) PREPARATION |
EP2717893B1 (en) | 2011-06-08 | 2019-05-08 | Translate Bio, Inc. | Lipid nanoparticle compositions and methods for mrna delivery |
US20150267192A1 (en) | 2012-06-08 | 2015-09-24 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof |
EP3628335B1 (en) | 2012-12-07 | 2023-11-08 | Translate Bio, Inc. | Lipidic nanoparticles for mrna delivery in the lungs |
US9687448B2 (en) * | 2012-12-07 | 2017-06-27 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid lipid particle formulations |
AU2014236396A1 (en) | 2013-03-14 | 2015-08-13 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Methods for purification of messenger RNA |
US20160184458A1 (en) | 2013-03-14 | 2016-06-30 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Mrna therapeutic compositions and use to treat diseases and disorders |
CN105142676B (zh) | 2013-03-14 | 2022-06-28 | 夏尔人类遗传性治疗公司 | Cftr mrna组合物以及相关方法和用途 |
EP2994167B1 (en) | 2013-05-06 | 2020-05-06 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Dosages and methods for delivering lipid formulated nucleic acid molecules |
US10894963B2 (en) | 2013-07-25 | 2021-01-19 | Exicure, Inc. | Spherical nucleic acid-based constructs as immunostimulatory agents for prophylactic and therapeutic use |
US10568898B2 (en) | 2013-08-13 | 2020-02-25 | Northwestern University | Lipophilic nanoparticles for drug delivery |
MX2016005237A (es) | 2013-10-22 | 2016-08-12 | Shire Human Genetic Therapies | Terapia de acido ribonucleico mensajero para la deficiencia de argininosuccinato sintetasa. |
JP6506749B2 (ja) | 2013-10-22 | 2019-04-24 | シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド | フェニルケトン尿症のためのmRNA療法 |
MX2016007287A (es) | 2013-12-03 | 2017-05-03 | Univ Northwestern | Particulas liposomales, metodos para elaborarlas y sus usos. |
US10751283B2 (en) | 2014-01-14 | 2020-08-25 | Capability Building, Inc. | Liposomal rehydration salt formulation and associated methods of use |
AR094658A1 (es) * | 2014-01-14 | 2015-08-19 | Fast Rehydration Llc | Formulación de sales de rehidratación liposomal |
EP3556353A3 (en) | 2014-02-25 | 2020-03-18 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Lipid nanoparticle vaccine adjuvants and antigen delivery systems |
PT3134506T (pt) | 2014-04-25 | 2019-10-31 | Translate Bio Inc | Métodos de purificação de rna mensageiro |
CN106535876B (zh) | 2014-06-04 | 2020-09-11 | 埃克西奎雷股份有限公司 | 免疫调节剂通过脂质体球形核酸的多价递送以用于预防或治疗应用 |
CA2955254A1 (en) * | 2014-08-29 | 2016-03-03 | Immunomedics, Inc. | Identification of cancer genes by in-vivo fusion of human cancer cells and animal cells |
WO2016045732A1 (en) * | 2014-09-25 | 2016-03-31 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Stable formulations of lipids and liposomes |
EP3247796A4 (en) | 2015-01-14 | 2018-07-11 | Exicure, Inc. | Nucleic acid nanostructures with core motifs |
CA2984512A1 (en) | 2015-05-06 | 2016-11-10 | Benitec Biopharma Limited | Reagents for treatment of hepatitis b virus (hbv) infection and use thereof |
US11564893B2 (en) * | 2015-08-17 | 2023-01-31 | Modernatx, Inc. | Methods for preparing particles and related compositions |
WO2017079442A1 (en) | 2015-11-04 | 2017-05-11 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Methods of treating tumors and cancer, and identifying candidate subjects for such treatment |
US11234994B2 (en) | 2016-04-14 | 2022-02-01 | Benitec Biopharma Limited | Reagents for treatment of oculopharyngeal muscular dystrophy (OPMD) and use thereof |
EP3448881B1 (en) | 2016-04-26 | 2023-06-07 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | Treatment of hippo pathway mutant tumors and methods of identifying subjects as candidates for treatment |
US10967072B2 (en) | 2016-04-27 | 2021-04-06 | Northwestern University | Short interfering RNA templated lipoprotein particles (siRNA-TLP) |
WO2018039629A2 (en) | 2016-08-25 | 2018-03-01 | Northwestern University | Micellar spherical nucleic acids from thermoresponsive, traceless templates |
EP3528827A4 (en) | 2016-10-21 | 2020-11-04 | Merck Sharp & Dohme Corp. | INFLUENZA HEMAGGLUTININ PROTEIN Vaccines |
US11253605B2 (en) | 2017-02-27 | 2022-02-22 | Translate Bio, Inc. | Codon-optimized CFTR MRNA |
US11173190B2 (en) | 2017-05-16 | 2021-11-16 | Translate Bio, Inc. | Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mRNA encoding CFTR |
EP3638215A4 (en) | 2017-06-15 | 2021-03-24 | Modernatx, Inc. | RNA FORMULATIONS |
AU2018314159A1 (en) | 2017-07-13 | 2020-01-30 | Northwestern University | General and direct method for preparing oligonucleotide-functionalized metal-organic framework nanoparticles |
CN111315359A (zh) | 2017-08-31 | 2020-06-19 | 摩登纳特斯有限公司 | 制备脂质纳米颗粒的方法 |
WO2019126766A1 (en) * | 2017-12-21 | 2019-06-27 | Taiwan Liposome Co., Ltd. | Sustained-release triptan compositions and method of use the same through subdermal route or the like |
CA3088546A1 (en) | 2018-01-29 | 2019-08-01 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Stabilized rsv f proteins and uses thereof |
KR20210054502A (ko) | 2018-06-21 | 2021-05-13 | 유니버시티 오브 로체스터 | 헌팅턴병을 치료하거나 이의 발병을 저해하는 방법 |
WO2020041793A1 (en) | 2018-08-24 | 2020-02-27 | Translate Bio, Inc. | Methods for purification of messenger rna |
US20230057355A1 (en) | 2019-02-13 | 2023-02-23 | University Of Rochester | Gene networks that mediate remyelination of the human brain |
CN112111488A (zh) * | 2019-06-21 | 2020-12-22 | 苏州吉玛基因股份有限公司 | siRNA修饰物及其在抑制血管新生中的应用 |
CA3166256A1 (en) | 2020-02-14 | 2021-08-19 | Marian E. Gindy | Human papillomavirus (hpv) virus-like particles (vlps) vaccine |
MX2023006056A (es) | 2020-11-25 | 2023-06-06 | Akagera Medicines Inc | Nanoparticulas lipidicas para suministro de acidos nucleicos y metodos de uso de las mismas. |
TW202245835A (zh) | 2021-02-04 | 2022-12-01 | 美商默沙東有限責任公司 | 用於肺炎球菌結合物疫苗之奈米乳化液佐劑組合物 |
US20240122883A1 (en) * | 2021-02-16 | 2024-04-18 | National Jewish Health | Methods of treating a subject exposed to a toxic inhaled chemical with mesna |
US20240200077A1 (en) * | 2021-03-18 | 2024-06-20 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Stearoyl-coa desaturase 5 (scd5) irna agent compositions and methods of use thereof |
WO2022260480A1 (ko) | 2021-06-11 | 2022-12-15 | 주식회사 나이벡 | 타겟 세포 내로 올리고뉴클레오티드를 전달하기 위한 펩타이드-지질의 결합체를 포함하는 나노입자 및 이를 포함하는 약학적 조성물 |
TW202315602A (zh) | 2021-08-19 | 2023-04-16 | 美商默沙東有限責任公司 | 新穎熱穩定脂質奈米粒子及其使用方法 |
CN115894281A (zh) * | 2021-09-22 | 2023-04-04 | 广州谷森制药有限公司 | 新型阳离子脂质化合物、其制备方法、组合物及应用 |
WO2023133275A1 (en) * | 2022-01-07 | 2023-07-13 | Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute | Inhibition of glutaryl-coa dehydrogenase for the treatment of melanoma |
US12064479B2 (en) | 2022-05-25 | 2024-08-20 | Akagera Medicines, Inc. | Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids and methods of use thereof |
CN115869286B (zh) * | 2022-11-10 | 2023-08-18 | 海南卓泰制药有限公司 | 一种含安吖啶的包封组合物及其制备方法 |
Family Cites Families (237)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US513030A (en) | 1894-01-16 | Machine for waxing or coating paper | ||
US564562A (en) | 1896-07-21 | Joseph p | ||
US3687808A (en) | 1969-08-14 | 1972-08-29 | Univ Leland Stanford Junior | Synthetic polynucleotides |
US3993754A (en) | 1974-10-09 | 1976-11-23 | The United States Of America As Represented By The United States Energy Research And Development Administration | Liposome-encapsulated actinomycin for cancer chemotherapy |
US4086257A (en) | 1976-10-12 | 1978-04-25 | Sears Barry D | Phosphatidyl quaternary ammonium compounds |
CH624011A5 (ja) | 1977-08-05 | 1981-07-15 | Battelle Memorial Institute | |
US4235871A (en) | 1978-02-24 | 1980-11-25 | Papahadjopoulos Demetrios P | Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles |
US4469863A (en) | 1980-11-12 | 1984-09-04 | Ts O Paul O P | Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof |
US4534899A (en) | 1981-07-20 | 1985-08-13 | Lipid Specialties, Inc. | Synthetic phospholipid compounds |
US4426330A (en) | 1981-07-20 | 1984-01-17 | Lipid Specialties, Inc. | Synthetic phospholipid compounds |
US5023243A (en) | 1981-10-23 | 1991-06-11 | Molecular Biosystems, Inc. | Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same |
US4522803A (en) | 1983-02-04 | 1985-06-11 | The Liposome Company, Inc. | Stable plurilamellar vesicles, their preparation and use |
US4476301A (en) | 1982-04-29 | 1984-10-09 | Centre National De La Recherche Scientifique | Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon |
JPS5927900A (ja) | 1982-08-09 | 1984-02-14 | Wakunaga Seiyaku Kk | 固定化オリゴヌクレオチド |
US4603044A (en) | 1983-01-06 | 1986-07-29 | Technology Unlimited, Inc. | Hepatocyte Directed Vesicle delivery system |
FR2540122B1 (fr) | 1983-01-27 | 1985-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application |
US4605735A (en) | 1983-02-14 | 1986-08-12 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Oligonucleotide derivatives |
US4948882A (en) | 1983-02-22 | 1990-08-14 | Syngene, Inc. | Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis |
US4824941A (en) | 1983-03-10 | 1989-04-25 | Julian Gordon | Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems |
US4588578A (en) | 1983-08-08 | 1986-05-13 | The Liposome Company, Inc. | Lipid vesicles prepared in a monophase |
US4587044A (en) | 1983-09-01 | 1986-05-06 | The Johns Hopkins University | Linkage of proteins to nucleic acids |
US5118802A (en) | 1983-12-20 | 1992-06-02 | California Institute Of Technology | DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside |
US5118800A (en) | 1983-12-20 | 1992-06-02 | California Institute Of Technology | Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide |
US4828991A (en) | 1984-01-31 | 1989-05-09 | Akzo N.V. | Tumor specific monoclonal antibodies |
US5008050A (en) | 1984-06-20 | 1991-04-16 | The Liposome Company, Inc. | Extrusion technique for producing unilamellar vesicles |
US5550111A (en) | 1984-07-11 | 1996-08-27 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof |
FR2567892B1 (fr) | 1984-07-19 | 1989-02-17 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons |
US5430136A (en) | 1984-10-16 | 1995-07-04 | Chiron Corporation | Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites |
AU587989B2 (en) | 1984-10-16 | 1989-09-07 | Mitsubishi Chemical Corporation | DMA fragments, expression vectors, proteins, hosts, and process for production of the proteins |
US5367066A (en) | 1984-10-16 | 1994-11-22 | Chiron Corporation | Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites |
US5258506A (en) | 1984-10-16 | 1993-11-02 | Chiron Corporation | Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains |
US4828979A (en) | 1984-11-08 | 1989-05-09 | Life Technologies, Inc. | Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection |
FR2575751B1 (fr) | 1985-01-08 | 1987-04-03 | Pasteur Institut | Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques |
WO1986004920A1 (en) | 1985-02-13 | 1986-08-28 | Biotechnology Research Partners, Limited | Human metallothionein-ii promoter in mammalian expression system |
US5166315A (en) | 1989-12-20 | 1992-11-24 | Anti-Gene Development Group | Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids |
US5235033A (en) | 1985-03-15 | 1993-08-10 | Anti-Gene Development Group | Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof |
US5185444A (en) | 1985-03-15 | 1993-02-09 | Anti-Gene Deveopment Group | Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages |
US5034506A (en) | 1985-03-15 | 1991-07-23 | Anti-Gene Development Group | Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages |
US5405938A (en) | 1989-12-20 | 1995-04-11 | Anti-Gene Development Group | Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids |
US4762779A (en) | 1985-06-13 | 1988-08-09 | Amgen Inc. | Compositions and methods for functionalizing nucleic acids |
US4980286A (en) | 1985-07-05 | 1990-12-25 | Whitehead Institute For Biomedical Research | In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells |
ATE68013T1 (de) | 1985-07-05 | 1991-10-15 | Whitehead Biomedical Inst | Expression von fremdem genetischem material in epithelzellen. |
EP0239631A4 (en) | 1985-10-04 | 1989-01-12 | Biotech Res Partners Ltd | RECOMBINANT APOLIPOPROTEINS AND METHODS. |
US5139941A (en) | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
US4737323A (en) | 1986-02-13 | 1988-04-12 | Liposome Technology, Inc. | Liposome extrusion method |
US5317098A (en) | 1986-03-17 | 1994-05-31 | Hiroaki Shizuya | Non-radioisotope tagging of fragments |
JPS638396A (ja) | 1986-06-30 | 1988-01-14 | Wakunaga Pharmaceut Co Ltd | ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体 |
US4920016A (en) | 1986-12-24 | 1990-04-24 | Linear Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
US4837028A (en) | 1986-12-24 | 1989-06-06 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
US5276019A (en) | 1987-03-25 | 1994-01-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
US5264423A (en) | 1987-03-25 | 1993-11-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
GB8712540D0 (en) | 1987-05-28 | 1987-07-01 | Ucb Sa | Expression of human proapolipoprotein a-i |
US4904582A (en) | 1987-06-11 | 1990-02-27 | Synthetic Genetics | Novel amphiphilic nucleic acid conjugates |
DE3851889T2 (de) | 1987-06-24 | 1995-04-13 | Florey Howard Inst | Nukleosid-derivate. |
ATE117375T1 (de) | 1987-09-11 | 1995-02-15 | Whitehead Biomedical Inst | Transduktionsveränderte fibroblasten und ihre anwendung. |
US5585481A (en) | 1987-09-21 | 1996-12-17 | Gen-Probe Incorporated | Linking reagents for nucleotide probes |
US5188897A (en) | 1987-10-22 | 1993-02-23 | Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education | Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates |
US4924624A (en) | 1987-10-22 | 1990-05-15 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof |
US5525465A (en) | 1987-10-28 | 1996-06-11 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same |
DE3738460A1 (de) | 1987-11-12 | 1989-05-24 | Max Planck Gesellschaft | Modifizierte oligonukleotide |
JP2914692B2 (ja) | 1987-12-11 | 1999-07-05 | ホワイトヘツド・インスチチユート・フオー・バイオメデイカル・リサーチ | 内皮細胞の遺伝子修飾 |
EP0400047B1 (en) | 1988-02-05 | 1997-04-23 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Modified hepatocytes and uses therefor |
US5082830A (en) | 1988-02-26 | 1992-01-21 | Enzo Biochem, Inc. | End labeled nucleotide probe |
WO1989009221A1 (en) | 1988-03-25 | 1989-10-05 | University Of Virginia Alumni Patents Foundation | Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates |
US5278302A (en) | 1988-05-26 | 1994-01-11 | University Patents, Inc. | Polynucleotide phosphorodithioates |
US5109124A (en) | 1988-06-01 | 1992-04-28 | Biogen, Inc. | Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine |
US5216141A (en) | 1988-06-06 | 1993-06-01 | Benner Steven A | Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages |
US5175273A (en) | 1988-07-01 | 1992-12-29 | Genentech, Inc. | Nucleic acid intercalating agents |
US5262536A (en) | 1988-09-15 | 1993-11-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides |
GB8824593D0 (en) | 1988-10-20 | 1988-11-23 | Royal Free Hosp School Med | Liposomes |
US5512439A (en) | 1988-11-21 | 1996-04-30 | Dynal As | Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof |
US4927637A (en) | 1989-01-17 | 1990-05-22 | Liposome Technology, Inc. | Liposome extrusion method |
US4957773A (en) | 1989-02-13 | 1990-09-18 | Syracuse University | Deposition of boron-containing films from decaborane |
US5599923A (en) | 1989-03-06 | 1997-02-04 | Board Of Regents, University Of Tx | Texaphyrin metal complexes having improved functionalization |
US5457183A (en) | 1989-03-06 | 1995-10-10 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Hydroxylated texaphyrins |
US5328470A (en) | 1989-03-31 | 1994-07-12 | The Regents Of The University Of Michigan | Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor |
US5391723A (en) | 1989-05-31 | 1995-02-21 | Neorx Corporation | Oligonucleotide conjugates |
US4958013A (en) | 1989-06-06 | 1990-09-18 | Northwestern University | Cholesteryl modified oligonucleotides |
US5182364A (en) | 1990-02-26 | 1993-01-26 | The Scripps Research Institute | Polypeptide analogs of apolipoprotein E |
US5473039A (en) | 1989-08-18 | 1995-12-05 | The Scripps Research Institute | Polypeptide analogs of apolipoprotein E, diagnostic systems and methods using the analogs |
US5168045A (en) | 1989-08-18 | 1992-12-01 | The Scripps Research Institute | Diagnostic systems and methods using polypeptide analogs of apolipoprotein e |
US5177189A (en) | 1989-08-18 | 1993-01-05 | The Scripps Research Institute | Polypeptide analogs of Apolipoprotein E |
US5451463A (en) | 1989-08-28 | 1995-09-19 | Clontech Laboratories, Inc. | Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides |
US5134066A (en) | 1989-08-29 | 1992-07-28 | Monsanto Company | Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs |
US5254469A (en) | 1989-09-12 | 1993-10-19 | Eastman Kodak Company | Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures |
US5591722A (en) | 1989-09-15 | 1997-01-07 | Southern Research Institute | 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity |
US5286634A (en) | 1989-09-28 | 1994-02-15 | Stadler Joan K | Synergistic method for host cell transformation |
US5356633A (en) | 1989-10-20 | 1994-10-18 | Liposome Technology, Inc. | Method of treatment of inflamed tissues |
US5013556A (en) | 1989-10-20 | 1991-05-07 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
US5225212A (en) | 1989-10-20 | 1993-07-06 | Liposome Technology, Inc. | Microreservoir liposome composition and method |
US5399676A (en) | 1989-10-23 | 1995-03-21 | Gilead Sciences | Oligonucleotides with inverted polarity |
US5264564A (en) | 1989-10-24 | 1993-11-23 | Gilead Sciences | Oligonucleotide analogs with novel linkages |
EP0497875B1 (en) | 1989-10-24 | 2000-03-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2' modified oligonucleotides |
US5292873A (en) | 1989-11-29 | 1994-03-08 | The Research Foundation Of State University Of New York | Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe |
US5177198A (en) | 1989-11-30 | 1993-01-05 | University Of N.C. At Chapel Hill | Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates |
US5486603A (en) | 1990-01-08 | 1996-01-23 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide having enhanced binding affinity |
US5587470A (en) | 1990-01-11 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 3-deazapurines |
US5681941A (en) | 1990-01-11 | 1997-10-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Substituted purines and oligonucleotide cross-linking |
US5587361A (en) | 1991-10-15 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
US5459255A (en) | 1990-01-11 | 1995-10-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | N-2 substituted purines |
US5578718A (en) | 1990-01-11 | 1996-11-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Thiol-derivatized nucleosides |
US5646265A (en) | 1990-01-11 | 1997-07-08 | Isis Pharmceuticals, Inc. | Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites |
US5670633A (en) | 1990-01-11 | 1997-09-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression |
US5214136A (en) | 1990-02-20 | 1993-05-25 | Gilead Sciences, Inc. | Anthraquinone-derivatives oligonucleotides |
WO1991013080A1 (en) | 1990-02-20 | 1991-09-05 | Gilead Sciences, Inc. | Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers |
US5321131A (en) | 1990-03-08 | 1994-06-14 | Hybridon, Inc. | Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling |
US5470967A (en) | 1990-04-10 | 1995-11-28 | The Dupont Merck Pharmaceutical Company | Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages |
US5665710A (en) | 1990-04-30 | 1997-09-09 | Georgetown University | Method of making liposomal oligodeoxynucleotide compositions |
GB9009980D0 (en) | 1990-05-03 | 1990-06-27 | Amersham Int Plc | Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides |
ATE167523T1 (de) | 1990-05-11 | 1998-07-15 | Microprobe Corp | Teststreifen zum eintauchen für nukleinsäure- hybridisierungsassays und verfahren zur kovalenten immobilisierung von oligonucleotiden |
US5602240A (en) | 1990-07-27 | 1997-02-11 | Ciba Geigy Ag. | Backbone modified oligonucleotide analogs |
US5618704A (en) | 1990-07-27 | 1997-04-08 | Isis Pharmacueticals, Inc. | Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling |
US5608046A (en) | 1990-07-27 | 1997-03-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds |
US5138045A (en) | 1990-07-27 | 1992-08-11 | Isis Pharmaceuticals | Polyamine conjugated oligonucleotides |
US5541307A (en) | 1990-07-27 | 1996-07-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof |
US5677437A (en) | 1990-07-27 | 1997-10-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Heteroatomic oligonucleoside linkages |
EP0544824B1 (en) | 1990-07-27 | 1997-06-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression |
US5489677A (en) | 1990-07-27 | 1996-02-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms |
US5610289A (en) | 1990-07-27 | 1997-03-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogues |
US5623070A (en) | 1990-07-27 | 1997-04-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Heteroatomic oligonucleoside linkages |
US5218105A (en) | 1990-07-27 | 1993-06-08 | Isis Pharmaceuticals | Polyamine conjugated oligonucleotides |
US5688941A (en) | 1990-07-27 | 1997-11-18 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds |
US5245022A (en) | 1990-08-03 | 1993-09-14 | Sterling Drug, Inc. | Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides |
DK0541722T3 (da) | 1990-08-03 | 1996-04-22 | Sterling Winthrop Inc | Forbindelser og fremgangsmåder til inhibering af genekspression |
US5512667A (en) | 1990-08-28 | 1996-04-30 | Reed; Michael W. | Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides |
US5214134A (en) | 1990-09-12 | 1993-05-25 | Sterling Winthrop Inc. | Process of linking nucleosides with a siloxane bridge |
US5561225A (en) | 1990-09-19 | 1996-10-01 | Southern Research Institute | Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages |
CA2092002A1 (en) | 1990-09-20 | 1992-03-21 | Mark Matteucci | Modified internucleoside linkages |
US5432272A (en) | 1990-10-09 | 1995-07-11 | Benner; Steven A. | Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases |
DE69123981T3 (de) | 1990-10-31 | 2006-06-14 | Cell Genesys Inc | Nützliche retrovirale vektoren für die gentherapie |
EP0556301B1 (en) | 1990-11-08 | 2001-01-10 | Hybridon, Inc. | Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides |
GB9100304D0 (en) | 1991-01-08 | 1991-02-20 | Ici Plc | Compound |
JP3220180B2 (ja) | 1991-05-23 | 2001-10-22 | 三菱化学株式会社 | 薬剤含有タンパク質結合リポソーム |
US5719262A (en) | 1993-11-22 | 1998-02-17 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having amino acid side chains |
US5714331A (en) | 1991-05-24 | 1998-02-03 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility |
US5539082A (en) | 1993-04-26 | 1996-07-23 | Nielsen; Peter E. | Peptide nucleic acids |
WO1993000443A1 (en) | 1991-06-26 | 1993-01-07 | Bio-Technology General Corp. | Purification of recombinant apolipoprotein e from bacteria |
US5371241A (en) | 1991-07-19 | 1994-12-06 | Pharmacia P-L Biochemicals Inc. | Fluorescein labelled phosphoramidites |
US5571799A (en) | 1991-08-12 | 1996-11-05 | Basco, Ltd. | (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response |
DE59208572D1 (de) | 1991-10-17 | 1997-07-10 | Ciba Geigy Ag | Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte |
US5594121A (en) | 1991-11-07 | 1997-01-14 | Gilead Sciences, Inc. | Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines |
US5252479A (en) | 1991-11-08 | 1993-10-12 | Research Corporation Technologies, Inc. | Safe vector for gene therapy |
US5484908A (en) | 1991-11-26 | 1996-01-16 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines |
SE9103701D0 (sv) | 1991-12-13 | 1991-12-13 | Kabi Pharmacia Ab | Apolipoprotein |
US5359044A (en) | 1991-12-13 | 1994-10-25 | Isis Pharmaceuticals | Cyclobutyl oligonucleotide surrogates |
US5565552A (en) | 1992-01-21 | 1996-10-15 | Pharmacyclics, Inc. | Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis |
US5595726A (en) | 1992-01-21 | 1997-01-21 | Pharmacyclics, Inc. | Chromophore probe for detection of nucleic acid |
FR2687679B1 (fr) | 1992-02-05 | 1994-10-28 | Centre Nat Rech Scient | Oligothionucleotides. |
DE4203923A1 (de) | 1992-02-11 | 1993-08-12 | Henkel Kgaa | Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis |
US5633360A (en) | 1992-04-14 | 1997-05-27 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation |
US5434257A (en) | 1992-06-01 | 1995-07-18 | Gilead Sciences, Inc. | Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages |
US5587308A (en) | 1992-06-02 | 1996-12-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services | Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter |
US6372886B1 (en) | 1992-06-23 | 2002-04-16 | Arch Development Corp. | Expression and purification of kringle domains of human apolipoprotein (a) in E. coli |
EP0577558A2 (de) | 1992-07-01 | 1994-01-05 | Ciba-Geigy Ag | Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte |
US5272250A (en) | 1992-07-10 | 1993-12-21 | Spielvogel Bernard F | Boronated phosphoramidate compounds |
US5478745A (en) | 1992-12-04 | 1995-12-26 | University Of Pittsburgh | Recombinant viral vector system |
SE9203753D0 (sv) | 1992-12-11 | 1992-12-11 | Kabi Pharmacia Ab | Expression system for producing apolipoprotein ai-m |
US5574142A (en) | 1992-12-15 | 1996-11-12 | Microprobe Corporation | Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery |
JP3351476B2 (ja) | 1993-01-22 | 2002-11-25 | 三菱化学株式会社 | リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム |
US5476925A (en) | 1993-02-01 | 1995-12-19 | Northwestern University | Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups |
US6020317A (en) | 1993-02-19 | 2000-02-01 | Nippon Shinyaku Co. Ltd. | Glycerol derivative, device and pharmaceutical composition |
US5395619A (en) | 1993-03-03 | 1995-03-07 | Liposome Technology, Inc. | Lipid-polymer conjugates and liposomes |
GB9304618D0 (en) | 1993-03-06 | 1993-04-21 | Ciba Geigy Ag | Chemical compounds |
ATE155467T1 (de) | 1993-03-30 | 1997-08-15 | Sanofi Sa | Acyclische nucleosid analoge und sie enthaltende oligonucleotidsequenzen |
AU6412794A (en) | 1993-03-31 | 1994-10-24 | Sterling Winthrop Inc. | Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages |
DE4311944A1 (de) | 1993-04-10 | 1994-10-13 | Degussa | Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen |
US5502177A (en) | 1993-09-17 | 1996-03-26 | Gilead Sciences, Inc. | Pyrimidine derivatives for labeled binding partners |
US5540935A (en) | 1993-12-06 | 1996-07-30 | Nof Corporation | Reactive vesicle and functional substance-fixed vesicle |
US5457187A (en) | 1993-12-08 | 1995-10-10 | Board Of Regents University Of Nebraska | Oligonucleotides containing 5-fluorouracil |
US5446137B1 (en) | 1993-12-09 | 1998-10-06 | Behringwerke Ag | Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides |
US5519134A (en) | 1994-01-11 | 1996-05-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Pyrrolidine-containing monomers and oligomers |
US5596091A (en) | 1994-03-18 | 1997-01-21 | The Regents Of The University Of California | Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides |
WO1995025749A2 (en) | 1994-03-22 | 1995-09-28 | Research Corporation Technologies, Inc. | Eating suppressant peptides |
US5627053A (en) | 1994-03-29 | 1997-05-06 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid |
US5625050A (en) | 1994-03-31 | 1997-04-29 | Amgen Inc. | Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics |
US6054299A (en) | 1994-04-29 | 2000-04-25 | Conrad; Charles A. | Stem-loop cloning vector and method |
US5525711A (en) | 1994-05-18 | 1996-06-11 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes |
US5534499A (en) | 1994-05-19 | 1996-07-09 | The University Of British Columbia | Lipophilic drug derivatives for use in liposomes |
US5543152A (en) | 1994-06-20 | 1996-08-06 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Sphingosomes for enhanced drug delivery |
US5597696A (en) | 1994-07-18 | 1997-01-28 | Becton Dickinson And Company | Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates |
US5580731A (en) | 1994-08-25 | 1996-12-03 | Chiron Corporation | N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith |
US5597909A (en) | 1994-08-25 | 1997-01-28 | Chiron Corporation | Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use |
US5885613A (en) | 1994-09-30 | 1999-03-23 | The University Of British Columbia | Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes |
WO1996010585A1 (en) | 1994-09-30 | 1996-04-11 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Glycosylated protein-liposome conjugates and methods for their preparation |
US5820873A (en) | 1994-09-30 | 1998-10-13 | The University Of British Columbia | Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof |
SE9500778D0 (sv) | 1995-03-03 | 1995-03-03 | Pharmacia Ab | Process for producing a protein |
AU723163B2 (en) | 1995-06-07 | 2000-08-17 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer |
US7422902B1 (en) | 1995-06-07 | 2008-09-09 | The University Of British Columbia | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer |
US5756122A (en) | 1995-06-07 | 1998-05-26 | Georgetown University | Liposomally encapsulated nucleic acids having high entrapment efficiencies, method of manufacturer and use thereof for transfection of targeted cells |
US5981501A (en) | 1995-06-07 | 1999-11-09 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers |
WO1997004787A1 (en) | 1995-08-01 | 1997-02-13 | Novartis Ag | Liposomal oligonucleotide compositions |
US5672685A (en) | 1995-10-04 | 1997-09-30 | Duke University | Source of apolipoprotein E and method of isolating apolipoprotein E |
US5858397A (en) | 1995-10-11 | 1999-01-12 | University Of British Columbia | Liposomal formulations of mitoxantrone |
US5994316A (en) | 1996-02-21 | 1999-11-30 | The Immune Response Corporation | Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells |
JP4656675B2 (ja) | 1997-05-14 | 2011-03-23 | ユニバーシティー オブ ブリティッシュ コロンビア | 脂質小胞への荷電した治療剤の高率封入 |
WO1999001579A1 (en) | 1997-07-01 | 1999-01-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the delivery of oligonucleotides via the alimentary canal |
US6037323A (en) | 1997-09-29 | 2000-03-14 | Jean-Louis Dasseux | Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders |
US6004925A (en) | 1997-09-29 | 1999-12-21 | J. L. Dasseux | Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders |
US6046166A (en) | 1997-09-29 | 2000-04-04 | Jean-Louis Dasseux | Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders |
US6320017B1 (en) | 1997-12-23 | 2001-11-20 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Polyamide oligomers |
US6506559B1 (en) | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
JP5015373B2 (ja) | 1998-04-08 | 2012-08-29 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション | 改良表現型を得るための方法及び手段 |
AR020078A1 (es) | 1998-05-26 | 2002-04-10 | Syngenta Participations Ag | Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta |
WO2000003683A2 (en) | 1998-07-20 | 2000-01-27 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes |
BR9914773A (pt) | 1998-10-09 | 2002-02-05 | Ingene Inc | Conjunto de elementos genéricos, método para a produção de dna de cordão único, transcrição de mrna, construção de ácido nucléico, transcrição de ssdna, vetor, sistema vetor, célula hospedeira, conjunto para a produção de uma sequência de ácido nucléico de cordão único, método para a produção in vivo ou in vitro de uma sequência de ácido nucléico de cordão único, transcrição de cdna de cordão único, ácido nucléico inibidor, molécula heteroduplex, e composição farmacêutica |
KR20010099682A (ko) | 1998-10-09 | 2001-11-09 | 추후보충 | 단일가닥 dna의 효소 합성 |
JP2002529240A (ja) | 1998-11-13 | 2002-09-10 | オプタイム セラピュウティクス, インコーポレイテッド | リポソーム生成のための方法および装置 |
DE19956568A1 (de) | 1999-01-30 | 2000-08-17 | Roland Kreutzer | Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens |
WO2000050050A1 (en) | 1999-02-23 | 2000-08-31 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Multiparticulate formulation |
US6271359B1 (en) | 1999-04-14 | 2001-08-07 | Musc Foundation For Research Development | Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes |
US20050112141A1 (en) * | 2000-08-30 | 2005-05-26 | Terman David S. | Compositions and methods for treatment of neoplastic disease |
DE10100586C1 (de) | 2001-01-09 | 2002-04-11 | Ribopharma Ag | Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens |
AU2001247951A1 (en) * | 2000-02-07 | 2001-08-14 | Roche Diagnostics Corporation | Novel cationic amphiphiles |
US20030170891A1 (en) * | 2001-06-06 | 2003-09-11 | Mcswiggen James A. | RNA interference mediated inhibition of epidermal growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
US20040009216A1 (en) * | 2002-04-05 | 2004-01-15 | Rodrigueza Wendi V. | Compositions and methods for dosing liposomes of certain sizes to treat or prevent disease |
US20040115201A1 (en) * | 2002-09-25 | 2004-06-17 | Paz Einat | Mitotic kinesin-like protein-1, MKLP1, and uses thereof |
JP2006507841A (ja) * | 2002-11-14 | 2006-03-09 | ダーマコン, インコーポレイテッド | 機能的siRNAおよび超機能的siRNA |
AR050920A1 (es) * | 2003-03-07 | 2006-12-06 | Astrazeneca Ab | Enantiomeros de heterociclos fusionados seleccionados y usos de los mismos |
KR20060130057A (ko) * | 2003-11-21 | 2006-12-18 | 알자 코포레이션 | 절단가능한 peg 표면 변형을 갖는 리포좀-dna복합체에 의해 매개되는 유전자 송달 |
ATE537263T1 (de) * | 2004-06-07 | 2011-12-15 | Protiva Biotherapeutics Inc | Kationische lipide und verwendungsverfahren |
EP1766035B1 (en) * | 2004-06-07 | 2011-12-07 | Protiva Biotherapeutics Inc. | Lipid encapsulated interfering rna |
TWI335352B (en) * | 2005-03-31 | 2011-01-01 | Calando Pharmaceuticals Inc | Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof |
WO2007012191A1 (en) | 2005-07-27 | 2007-02-01 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Systems and methods for manufacturing liposomes |
CN101346393B (zh) * | 2005-11-02 | 2015-07-22 | 普洛体维生物治疗公司 | 修饰的siRNA分子及其应用 |
EA014886B1 (ru) * | 2006-03-31 | 2011-02-28 | Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. | КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА Eg5 |
US8598333B2 (en) * | 2006-05-26 | 2013-12-03 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | SiRNA silencing of genes expressed in cancer |
EP2695608B1 (en) * | 2006-10-03 | 2016-11-23 | Arbutus Biopharma Corporation | Lipid containing formulations |
MX2009005527A (es) * | 2006-11-27 | 2009-06-08 | Isis Pharmaceuticals Inc | Metodos para el tratamiento de hipercolesterolemia. |
US20080213350A1 (en) * | 2007-02-20 | 2008-09-04 | Texas Tech University System | Encapsulation of nucleic acids in liposomes |
US7858592B2 (en) * | 2007-02-26 | 2010-12-28 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Interfering RNAs against the promoter region of P53 |
CA3044134A1 (en) * | 2008-01-02 | 2009-07-09 | Arbutus Biopharma Corporation | Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids |
BRPI0907008A2 (pt) * | 2008-01-31 | 2015-07-07 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Métodos otimizados para liberação de dsrna alvejando o gene pcsk9 |
SG188121A1 (en) * | 2008-03-05 | 2013-03-28 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Compositions and methods for inhibiting expression of eg5 and vegf genes |
JP5475753B2 (ja) * | 2008-04-15 | 2014-04-16 | プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド | 核酸送達用の脂質製剤 |
PL2350043T3 (pl) * | 2008-10-09 | 2014-09-30 | Tekmira Pharmaceuticals Corp | Ulepszone aminolipidy i sposoby dostarczania kwasów nukleinowych |
SG10201403054SA (en) * | 2009-06-10 | 2014-10-30 | Tekmira Pharmaceuticals Corp | Improved lipid formulation |
US10799808B2 (en) | 2018-09-13 | 2020-10-13 | Nina Davis | Interactive storytelling kit |
-
2010
- 2010-03-12 CA CA2754043A patent/CA2754043A1/en active Pending
- 2010-03-12 CN CN201080020483.1A patent/CN102421900B/zh active Active
- 2010-03-12 US US12/723,471 patent/US20100267806A1/en not_active Abandoned
- 2010-03-12 EP EP10708686A patent/EP2406376A1/en not_active Withdrawn
- 2010-03-12 JP JP2011554247A patent/JP6032724B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-03-12 CN CN201510338694.4A patent/CN104922699B/zh active Active
- 2010-03-12 NZ NZ594995A patent/NZ594995A/xx not_active IP Right Cessation
- 2010-03-12 WO PCT/US2010/027210 patent/WO2010105209A1/en active Application Filing
- 2010-03-12 AU AU2010223967A patent/AU2010223967B2/en not_active Ceased
-
2012
- 2012-10-17 HK HK12110313.5A patent/HK1169676A1/xx unknown
-
2014
- 2014-06-09 US US14/300,167 patent/US20140288154A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-03-18 HK HK16103207.5A patent/HK1215180A1/zh unknown
- 2016-06-20 JP JP2016121412A patent/JP2016168053A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102421900B (zh) | 2015-07-22 |
CN102421900A (zh) | 2012-04-18 |
HK1169676A1 (en) | 2013-02-01 |
WO2010105209A1 (en) | 2010-09-16 |
US20100267806A1 (en) | 2010-10-21 |
CN104922699B (zh) | 2020-07-24 |
AU2010223967A1 (en) | 2011-09-29 |
NZ594995A (en) | 2013-06-28 |
HK1215180A1 (zh) | 2016-08-19 |
JP2016168053A (ja) | 2016-09-23 |
CA2754043A1 (en) | 2010-09-16 |
JP2012520082A (ja) | 2012-09-06 |
AU2010223967B2 (en) | 2015-07-30 |
US20140288154A1 (en) | 2014-09-25 |
EP2406376A1 (en) | 2012-01-18 |
CN104922699A (zh) | 2015-09-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6032724B2 (ja) | 脂質製剤組成物およびEg5遺伝子とVEGF遺伝子の発現を阻害する方法 | |
US20190153443A1 (en) | METHODS FOR INCREASING EFFICACY OF LIPID FORMULATED siRNA | |
JP5894913B2 (ja) | Pcsk9遺伝子を標的とする、脂質で製剤化されたdsrna | |
KR101397407B1 (ko) | Eg5 및 VEGF 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법 | |
US8859516B2 (en) | Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of Eg5 and VEGF genes | |
US9339513B2 (en) | Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of Eg5 and VEGF genes | |
WO2011017548A1 (en) | Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of eg5 and vegf genes |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130311 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130311 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140807 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20141106 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20141113 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20141205 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20141212 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20150106 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150206 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150610 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20150828 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20160219 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160620 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20160804 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160920 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160927 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20161019 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20161020 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6032724 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |