DE3852823T2

DE3852823T2 - Transduktionsveränderte fibroblasten und ihre anwendung.

Info

Publication number: DE3852823T2
Application number: DE3852823T
Authority: DE
Inventors: Richard Mulligan; James Wilson
Original assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research; Howard Hughes Medical Institute
Current assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research; Howard Hughes Medical Institute
Priority date: 1987-09-11
Filing date: 1988-09-08
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2008-09-09
Also published as: JPH03500124A; US5460959A; EP0378576B1; HK1008049A1; DE3852823D1; WO1989002468A1; CA1341311C; EP0378576A1; ATE117375T1; JP3015383B2; EP0633318A1

Description

HINTERGRUND

Im Embryo befindet sich das Mesoderm in der Mitte der drei primären Keimblätter und liegt zwischen dem Ektoderm und dem Entoderm. Aus ihm entsteht während der Entwicklung das Bindegewebe, die gesamte Körpermuskulatur, Blut, kardiovaskuläres und lymphatisches System, der Großteil des urogenitalen Systems und die Auskleidung der Perikardial-, Pleural- und Peritoneal-Höhlen. Der Anteil des Mesoderms, der Bindegewebe, Blutgefäße und Blut, das lymphatische System und das Herz entstehen läßt, wird als Mesenchym bezeichnet. Ein Zelltyp, der von Mesenchymzellen produziert wird, sind Fibroblastenzellen, welche stern- oder spindelförmige Zellen sind, die zytoplasmatische Vorgänge aufweisen. Sie sind im Bindegewebe vorhanden und in der Lage, Kollagenfasern auszubilden.
Fibroblasten enthalten, wie alle anderen Zellen im Körper, eine vollständige Ausstattung des gesamten genetischen Materials. Jedoch wird nur ein kleiner Prozentsatz der in ihnen enthaltenen Gene in biologisch funktionellem Ausmaß exprimiert. Das bedeutet, daß die meisten Gene in den Fibroblasten überhaupt nicht exprimiert werden oder nur in solch geringem Ausmaß exprimiert werden, daß die Polypeptide, die sie kodieren, in nicht nachweisbaren Mengen produziert werden, oder in Konzentrationen, die biologisch nicht funktionell oder unsignifikant sind.
Es ist möglich, unter Anwendung von Verfahren, die in den letzten Jahren entwickelt wurden, eine zwischenartliche genetische Rekombination zu erhalten. In ausgewählten Mikroorganismen werden Gene aus verschiedenen biologischen Klassen repliziert und exprimiert. Von daher ist es möglich, Gene in einen Mikroorganismus einzuschleusen, die für andere Klassen von Mikroorganismen eine metabolische oder synthetische Funktion besitzen (z.B. Hormonsynthese, Proteinsynthese, Stickstoffixierung), die für andere Klassen von Mikroorganismen charakteristisch ist, indem die Gene mit einer bestimmten Virus- oder Plasmid-Replikation in Verbindung gebracht werden.
Seit den späten siebziger Jahren sind Fortschritte in der Entwicklung allgemeiner Methoden zur Einschleusung klonierter DNA Sequenzen in Säugerzellen gemacht worden. Gegenwärtig besteht jedoch Bedarf an einem effektiven Verfahren zur stabilen Einschleusung von genetischem Material in Fibroblasten und daran, diese in die Lage zu versetzen, genetisches Material zu exprimieren, das normalerweise nicht exprimiert oder normalerweise in biologisch nicht signifikantem Ausmaß exprimiert wird.

Zusammenfassung der Erfindung

Die hier beschriebene Erfindung bezieht sich auf Fibroblasten (z.B. menschliche Fibroblasten) in Verbindung mit (oder gebunden an) einer Trägermatrix, wobei die Fibroblasten transduziert wurden mit einem rekombinanten Helfer-freien Retrovirus und DNA oder RNA enthaltendes interessierendes genetisches Material inkorporieren, das (a) normalerweise nicht in Fibroblasten vorkommt, (b) normalerweise in Fibroblasten vorkommt, aber welches normalerweise nicht in biologisch signifikantem Ausmaß exprimiert wird, (c) normalerweise in Fibroblasten vorkommt, aber modifiziert wurde, so daß es in den transduzierten Fibroblasten exprimiert wird, oder (d) modifiziert werden kann, um in den transduzierten Fibroblasten exprimiert zu werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Fibroblasten, das die Schritte enthält:
(a) Kontaktieren der kultivierten Fibroblasten mit Medien, enthaltend das amphotrope Helfer-freie rekombinante Retrovirus, das ein rekombinantes Genom, bestehend aus dem interessierenden genetischen Material, aufweist, und
(b) Aufbewahren der kultivierten Fibroblasten und der Medien, enthaltend das infektiöse rekombinante Retrovirus unter Bedingungen, die für die Infektion der Fibroblasten durch das rekombinante Retrovirus geeignet sind.
Retrovirale Vektoren werden verwendet, um Fibroblasten stabil mit genetischem Material zu transduzieren, das genetisches Material umfaßt, welches ein interessierendes Polypeptid oder Protein kodiert und normalerweise nicht in einem biologisch signifikanten Ausmaß in Fibroblasten exprimiert wird. Das genetische Material, das auf diese Weise eingeschleust wird, beinhaltet ebenfalls genetisches Material, das einen dominanten selektierbaren Marker kodiert. Genetisches Material, einschließlich DNA, die ein interessierendes Polypeptid kodiert und DNA, die einen dominanten selektierbaren Marker kodiert, ist in kultivierte Fibroblasten eingeschleust worden. Eine Expression von diesen Genen durch Fibroblasten, in die sie inkorporiert wurden, (z.B. Fibroblasten, die durch Verwendung eines retroviralen Vektors transduziert wurden) ist ebenfalls nachgewiesen worden.
Die erfindungsgemäßen Fibroblasten können zur Therapie verwendet werden und können z.B. auch transplantiert werden. Sie können von daher zur konstitutiven Lieferung von Polypeptiden oder Proteinen verwendet werden, die zur Prävention und Therapie oder Behandlung nützlich sind, welche zur Zeit parenteral anwendbar sind. Sie können in glialen Zellen oder Fibroblasten-Implantaten verwendet werden, die DNA, welche ein interessierendes Polypeptid oder Protein kodiert, in das zentrale Nervensystem einschleusen.
Ein bedeutender Vorteil besteht darin, daß die genetisch veränderten Fibroblasten gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verabreichung therapeutischer Proteine (z.B. Hormone, Enzyme, Gerinnungsfaktoren), die zur Zeit intravenös, intramuskulär oder subkutan injiziert werden, verwendet werden können. Darüber hinaus müssen die Polypeptide nicht aufwendig (und oftmals kostspielig) gereinigt werden, bevor sie einem Patienten verabreicht werden, wie dies allgemein bei isolierten Polypeptiden (z.B. Insulin) notwendig ist. Fibroblasten, die gemäß der vorliegenden Erfindung modifiziert wurden, produzieren das Polypeptid-Hormon, wie es normalerweise produziert worden wäre. Z.B. im Falle von Insulin produzieren die genetisch veränderten Fibroblasten Insulin in derselben Form wie es im Pankreas entsteht.
Ein weiterer wichtiger Vorteil des Liefersystems gemäß der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die sehr kurzen Halbwertszeiten der Polypeptid-Hormone keine Rolle spielen, weil das Liefersystem kontinuierlich funktioniert. Z.B. beträgt die Halbwertszeit des menschlichen Wachstumshormons (HGH) ungefähr 19 Minuten, die des Parathyroidhormons ungefähr 2,5 bis 5 Minuten und die des nativen Insulins (reines Insulin) ungefähr 3 bis 4 Minuten.
Weil Gene mit Hilfe eines retroviralen Vektors in Fibroblasten eingeschleust werden können, können sie "on" der retroviralen Vektorkontrolle sein (dieser unterliegen); in solchem Fall wird das interessierende Gen von einem retroviralen Promotor transkribiert. Ein retroviraler Promotor ist eine spezifische Nukleotid-Sequenz, die von RNA-Polymerase- Molekülen erkannt wird und die RNA-Synthese startet. Andererseits besitzen retrovirale Vektoren zusätzliche Promotor- Elemente (zusätzlich zum Promotor, der sich in dem rekombinanten Retrovirus befindet), die für die Transkription des interessierenden genetischen Materials verantwortlich sind. Z.B. läßt sich ein Konstrukt verwenden, in dem sich ein zusätzlicher Promotor befindet, der durch einen externen Faktor oder Reiz reguliert werden kann, wodurch es möglich wird, durch Aktivierung des externen Faktors oder Reizes die Menge des durch die Fibroblasten gebildeten Polypeptids zu kontrollieren. Hitzeschock-Proteine sind z.B. Proteine, die durch Gene kodiert werden, in denen der Promotor durch die Temperatur reguliert ist. Der Promotor des Gens, welches das metallhaltige Protein Metallthionin kodiert, reagiert auf Cadmium-Ionen (Cd&spplus;&spplus;). Ein Einbau dieses Promotors oder anderer Promotoren, die durch externe Reize beeinflußt werden, macht es auch möglich, die Produktion des von den genetisch veränderten Fibroblasten produzierten Polypeptids zu regulieren.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

In Fig. 1 ist eine schematische Wiedergabe eines (retroviralen) Wildtyp-Maus-Leukämie-Virus-Genoms.
Fig. 2. ist eine schematische Wiedergabe retroviraler Vektoren, von denen jeder ein rekombinantes Genom enthält, das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendbar ist. Fig. 2a ist pZIPNeo; Fig. 2b ist pLJ; Fig. 2c ist pWe; Fig. 2d ist pEm; und Fig. 2e ist pIp.
Fig. 3 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion eines rekombinanten retroviralen Vektors, wobei der pLJ-Vektor gemäß Fig. 2b und das menschliche Parathyroidhormon-Gen verwendet wurde.
Fig. 4 ist ein Diagramm, das in dem angegebenen Zeitintervall die Menge des von transduzierten Fibroblasten gebildeten menschlichen Parathyroidhormons darstellt. Die unterbrochene Linie zeigt die Produktion durch transduzierte NIH 3T3-Zellen auf Gewebekultur-Platten. Die durchgezogene Linie zeigt die Produktion durch transduzierte Fibroblasten, die aus einer Ratte stammen und auf Gewebekultur-Platten angezogen wurden.
Fig. 5 ist ein Diagramm, das in dem angegebenen Zeitintervall die Menge des produzierten menschlichen Parathyroidhormons zeigt, das in Ratten entweder mittels transduzierter Fibroblasten alleine (schwarze Kreise) eingebracht wurde oder mittels transduzierter Fibroblasten, die auf cyto-3-Kügelchen aufgebracht und dort bis zur Konfluenz gewachsen sind.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Interessierendes genetisches Material ist in Fibroblasten inkorporiert und in den entstandenen genetisch veränderten Fibroblasten exprimiert worden. Genetisches Material, das in Fibroblasten gemäß dem beschriebenen Verfahren inkorporiert wurde, kann DNA sein, die normalerweise nicht in Fibroblasten vorkommt; DNA, die normalerweise in Fibroblasten vorkommt, aber in ihnen nicht in biologisch signifikanten Ausmaßen exprimiert wird (Ausmaße, die ausreichend sind, um die normalen physiologischen Wirkungen der kodierten Polypeptide zu erreichen); DNA oder RNA, die in Fibroblasten vorkommt und modifiziert wurde, so daß sie in solchen Zellen exprimiert werden; und jede DNA oder RNA, die modifiziert werden kann, um in Fibroblasten exprimiert zu werden, allein oder in einer Kombination hiervon. Dieses interessierende genetische Material wird nachfolgend als inkorporiertes genetisches Material bezeichnet. Fibroblasten gemäß der vorliegenden Erfindung exprimieren das inkorporierte genetische Material. Das inkorporierte genetische Material (z.B. DNA oder RNA), das von Fibroblasten gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert wird, ist genetisches Material, das ein interessierendes Polypeptid oder Protein kodiert (interessierendes genetisches Material), allein oder in Kombination mit einem Gen, das einen selektierbaren Marker kodiert.
Beispielsweise wurde genetisches Material, das ein Hormon kodiert, in Fibroblasten eingeschleust, in dem diese einem Medium ausgesetzt wurden, das ein Virus mit einem rekombinanten Genom enthielt (z.B. durch Infektion derselben). Das verwendete Medium war erhältlich durch Abtrennen des Mediums, in dem die produzierenden Zellen gewachsen waren (z.B. ein Psi-am oder amphotroper Produzent). Das bedeutet, daß produzierende Zellen in einer Gewebekultur bis zu einer konfluenten Dichte in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DME) mit 10% Kalbsserum (CS) und Penicillin und Streptomycin gewachsen sind. Frisches Medium wird zugegeben, und anschließend (z.B. ungefähr 12 Stunden später) wird das Medium geerntet. Ungefähr 10 ml des Mediums werden von einer 10 cm- Platte mit konfluenten Produzentenzellen getrennt. Das verwendete Medium (oder Virus-Stammlösung) wird durch ein 0,45 m Millipore-Filter filtriert, um herausgelöste Zellen zu beseitigen und wird sofort zur Infektion der Zellen verwendet oder bei -70 ºC aufbewahrt. Von einer subkonfluenten Platte mit Fibroblasten (Empfänger-Fibroblasten) wird Medium entnommen und schnell durch Virus-Stammlösung (z.B. 5 ml pro 10 cm-Platte) ersetzt, das 8 mg/ml Polybrene (Aldrich) enthält. Danach (z.B. ungefähr 12 Stunden später) wird dies entfernt und durch neues Medium ersetzt. Von daher ist das verwendete Medium ein Virus-Überstand. Das rekombinante Genom des infektiösen Virus beinhaltet das interessierende genetische Material. Das rekombinante Genom kann ebenfalls genetisches Material enthalten, das einen dominanten selektierbaren Marker kodiert.
Demgemäß werden Fibroblasten hergestellt, die ein Polypeptid exprimieren, das normalerweise von solchen Zellen in einem biologisch signifikanten Ausmaß nicht exprimiert werden, sowie wahlweise einen dominanten selektierbaren Marker.
Insbesondere werden Fibroblasten einem Medium ausgesetzt, das ein in Psi-am-Zellen produziertes infektiöses Virus enthalten; das infektiöse Virus enthält ein rekombinantes Genom, welches das interessierende genetische Material aufweist. Das rekombinante Genom enthält in einem Fall genetisches Material, das menschliches Parathyroidhormon (hPTH) kodiert. Wahlweise kann es ebenfalls ein Gen enthalten, das einen dominanten selektierbaren Marker (z.B. das neo-Gen, das Neomycin-Resistenz kodiert) kodiert. Im Ergebnis werden die Fibroblasten transduziert -- das bedeutet, daß das interessierende genetische Material (in diesem Fall die DNA, die hPTH-kodiert und wahlweise das neo-Gen) stabil in die Fibroblasten eingeschleust wird. Die transduzierten Fibroblasten exprimieren das kodierte hPTH und, sofern das neo-Gen vorhanden ist, auch dieses, wodurch Zellen entstehen, die das selektierbare Merkmal besitzen.
Andererseits werden Fibroblasten dadurch transduziert, daß sie einem Medium ausgesetzt werden, welches ein infektiöses Virus enthält, in dem das rekombinante Genom solche DNA enthält, die das ein oder andere des folgenden kodiert:
Den Rezeptor für Lipoproteine niederer Dichte; Menschliches Wachstumshormon; Das Gen, das eine Resistenz gegenüber Histidonal bewirkt; Menschliche Adenosin-Desaminase; den Rezeptor für Interleukin 2; Menschliches Beta-Globin; Menschliches Alpha-Globin; Eine Mutationsform der Dihydrofolsäure-Reduktase; Multidrug-Resistenz; Glucosecerebrosidase aus Menschen; Das E1A-Gen aus dem Adenovirus; Viele verschiedene Gene aus HLA in Menschen; Menschliches Albumin; Menschliche Ornithin-Transcarbamoylase; Beta-Galactosidase aus E. coli; Resistenz gegenüber Neomycin in E. coli; Menschliches Insulin; und das Hüllprotein aus dem Moloney-Maus-Leukämie-Virus.
Fibroblasten, die das inkorporierte genetische Material exprimieren, werden bis zur Konfluenz in Gewebe-Kulturgefäßen kultiviert; aus den Kulturgefäßen, in denen sie kultiviert wurden, entfernt; und eingeführt oder am Körper angewandt. Sie wurden in die Intraperitoneal-Höhle eingeführt, entweder alleine oder aufgebracht auf Mikroträger-Kügelchen (ungefähr 100 Zellen/Kugel) die Kollagen-beschichtete Oberflächen besitzen. Andererseits können sie als Bestandteil eines Hauttransplantats angewendet werden, wobei nach einer Methode verfahren wird, wie sie von Bell in U.S. 4,485,096 beschrieben wurde und deren Lehren hiermit einbezogen sind.
Fibroblasten, die das inkorporierte genetische Material exprimieren, können auch in das zentrale Nervensystem eingeführt werden. Dies kann z.B. durch direkte Einführung der genetisch veränderten Fibroblasten gemäß der vorliegenden Erfindung (z.B. Fibroblasten, in die ein interessierendes Gen eingeschleust wurde) in die spezifischen Regionen des Gehirns durch stereotaktische Verabreichung erfolgen. Es kann auch in die cerebrospinale Flüssigkeit mittels Lumbalpunktion oder direkt in die Ventrikel eingeführt werden, was dazu führen würde, daß die Fibroblasten entlang der Meningen verteilt werden.
Einmal am Körper eingeführt oder angewandt, liefern die transduzierten Fibroblasten eine kontinuierliche Versorgung mit dem vom interessierenden genetischen Material kodierten Hormon, Enzym oder Wirkstoff. Im beschriebenen Beispiel ist das kodierte Produkt hPTH.
Die Menge des auf diese Weise gelieferten Hormons, Enzyms oder Wirkstoffs kann verändert oder reguliert werden, falls dies nötig ist. Dies wird z.B. unter Verwendung externer Reize oder Faktoren erreicht, die die Produktion beeinflussen; durch Größenkontrolle des eingesetzten Implantats oder der Menge der in den Körper eingeführten Fibroblasten; oder durch Entfernung des Transplantats.

Kultivierte Fibroblasten

Fibroblasten werden von einem Patienten durch Hautbiopsie (z.B. eine kleine Trokarbiopsie aus einer beliebigen Region des Körpers) entnommen. Das erhaltene Gewebe wird in Gewebe- Kulturmedium gelegt und in kleine Teile getrennt (z.B. durch Verwendung von Skalpellen, um das Gewebe auseinanderzuziehen). Kleine Stücke des Gewebes werden auf eine nasse Oberfläche eines Gewebe-Kulturkolbens gelegt; in jeden Kolben werden ungefähr 10 Stücke gelegt. Der Kolben wird umgedreht, dicht verschlossen und bei Raumtemperatur über Nacht belassen. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wird der Kolben gedreht; die Gewebestücke bleiben am Boden des Kolbens haften und es wird frisches Medium (z.B. Ham's F12-Medium mit 10% FBS und Penicillin und Streptomycin) zugegeben. Dies wird dann bei 37 ºC für ungefähr eine Woche inkubiert. Nach dieser Zeit wird frisches Medium zugeführt und nachfolgend jeweils nach einigen Tagen gewechselt. Nach einer weiteren Kulturdauer von zwei Wochen entsteht ein Monolayer aus Fibroblasten. Das Monolayer wird trypsinisiert und zum Scale- up in große Kolben übertragen. Die Fibroblasten halten sich in Kultur für ungefähr 50 Generationen; nach ungefähr dieser Zeit erreichen sie einen Zustand, der als Krise bezeichnet wird, und wachsen anschließend nicht mehr sehr gut. Bald danach werden die Fibroblasten in einem Scale-up auf größere Kolben übertragen (replattiert). Sie werden gemäß der unten stehenden Vorschrift infiziert.

Retrovirale Vektoren

Retroviren sind RNA-Viren. D.h., daß das Virusgenom aus RNA besteht. Jedoch wird die genomische RNA revers transkribiert zu einem DNA-Zwischenglied, das sehr effizient in die chromosomale DNA der infizierten Zellen integriert werden kann. Dies integrierte DNA-Zwischenglied wird als Provirus bezeichnet. Wie in Fig. 1 dargestellt, besitzen das retrovirale Genom und die provirale DNA drei Gene: das gag, das pol und das env, die von zwei langen Wiederholungssequenzen (LTR) flankiert werden. Das gag-Gen kodiert die internen Strukturproteine (Nucleocapsid); das pol-Gen kodiert die RNA-abhängige DNA-Polymerase (reverse Transcriptase); und das env-Gen kodiert virale Hüllglycoproteine. Die 5'- und 3'-LTRs dienen zur Unterstützung der Transcription und Polyadenylierung der Virus RNAs.
Benachbart zur 5'-LTR befinden sich Sequenzen, die zur reversen Transkription des Genoms erforderlich sind (die tRNA- Primer-Bindungsstelle) und zur effizienten Einkapselung der viralen RNA in Partikeln (die Psi-Stelle).
Mulligan, R.C., IN: Experimental Manipulation of Gene Expression, M. Inouye (ed), 155-173 (1983); Mann, R., et al., Cell, 33:153-159 (183); Cone, R.D. and R.C. Mulligan, Proceedings of the National Academy of Sciences. U.S.A.,81:6349-6353 (1984).
Wenn die für die Einkapselung (oder Verpackung der retroviralen RNA in die infektiösen Viren) erforderlichen Sequenzen im viralen Genom fehlen, entsteht ein cis Defekt, der die Einkapselung der genomischen RNA verhindert. Jedoch bleibt die entstehende Mutante in der Lage, die Synthese aller Virusproteine zu regulieren. Mulligan und Mitarbeiter haben retrovirale Genome beschrieben, in denen diese Psi-Sequenzen zerstört wurden sowie Zellinien, in denen die Mutante stabil in das Chromosom integriert wurde. Mulligan, R.C., In: Experimental Manipulation of Gene Expression, M. Inouye (ed), 155-173 (1983); Mann, R., et al., Cell, 33:153-159 (1983); Cone, R.D. and R.C. Mulligan, Proceedings of the National Academy of Sciences. U.S.A., 81:6349-6353 (1984). Die Lehren dieser Veröffentlichungen sind hiermit einbezogen.
Die von Mulligan und Mitarbeitern beschriebene Psi-2-Zellinie wurde durch Transfektion von NIH-3T3-Fibroblasten mit pMOV-Psi erhalten, der ein ecotroper Maloney-Maus-Leukämie- Virus (mo-MuLV)-Klon ist. pMOV-Psi exprimiert alle viralen Genprodukte, besitzt jedoch nicht die Psi-Sequenz, die zur Einkapselung des viralen Genoms erforderlich ist. pMOV-Psi exprimiert ein ecotropes Virus-Hüllglycoprotein, das einen Rezeptor erkennt, der nur auf Maus- (und nahe verwandten Nager-)Zellen vorkommt.
Eine andere Zellinie ist die Psi-am-Linie, die eine Psi-2- ähnliche Verpackungszellinie darstellt. Diese Psi-am-Zellinien beinhalten ein modifiziertes pMOV-Psi-Genom, in dem das ecotrope Hüllglycoprotein ersetzt wurde durch Hüllsequenzen, die aus dem amphotropem Virus 4070A stammen. Hartley, J. W. and W. P. Rowe, Journal of Virology, 19:19-25 (1976). Hieraus ergibt sich, daß sie zur Produktion eines rekombinanten Virus mit amphotropem Wirtsspektrum verwendbar sind. Das zur Herstellung der Psi-am-Zellinie verwendete Retrovirus hat ein sehr breites Säuger-Wirtsspektrum (ein amphotropes Wirtsspektrum) und kann zur Infektion menschlicher Zellen verwendet werden. Zelltropismus hängt von den "Eigenschaften des Virus und der Zellen ab, in denen das Virus einen vollständigen Replikationszyklus durchmacht." Weiss, R. et al., RNA Tumor Viruses, Vol. 1 (2d ed.), Cold Spring Harbor, p. 73, 1984. Amphotrope Viren sind solche, die ein breites Wirtsspektrum haben und die sich sowohl in homologen als auch in heterologen Zellen replizieren. Wenn das rekombinante Genom die Psi-Verpackungs-Sequenz aufweist, ist die Psi-am-Zellinie in der Lage, rekombinante retrovirale Genome in infektiöse retrovirale Partikel zu verpacken. Cone, R. and Mulligan, R., Proceedings of the National Academy of Sciences. USA, 81:6349-6353 (1984).
Das retrovirale Genom ist von Cone und Mulligan modifiziert worden, um als Vektor verwendet zu werden, der zur Einschleusung neuer Gene in Zellen in der Lage ist. Wie in Fig. 2 dargestellt, wurden die gag-, pol- und env-Gene alle entfernt und an ihrer Stelle ein DNA-Segment eingeführt, das das neo-Gen enthält. Das neo-Gen dient als ein dominanter selektierbarer Marker. Die retrovirale Sequenz, die als Teil des rekombinanten Genoms verbleibt, enthält die LTRs, die tRNA-Bindungsstelle und die Psi-Verpackungsstelle. Cepko, C. et al., Cell, 37:1053-1062 (1984).
Weitere Vektorkonstruktionen wurden zur Herstellung transduzierter Fibroblasten gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet und sind in Fig. 2 dargestellt und nachfolgend beschrieben.
pZip. Die Konstruktion dieses Vektors wurde in Cepko, C.L. et al. Cell, 37:1053 (1984) beschrieben. Kurzum ist dieser Vektor in der Lage, zwei Gene zu expremieren: Das interessierende Gen und das neo-Gen als selektierbaren Marker.
Das interessierende Gen ist in die BamHI-Schnittstelle kloniert, unmittelbar benachbart zur 5'-LTR, flankiert von einer Splice-donor-site und einer Splice-acceptor-site. Die Transkription des Provirus führt zu zwei Transkripten: Das unprozessierte Transkript führt zur Expression des interessierenden Gens, während das "prozessierte" Transkript zur Expression des neo-Gens führt.
pLJ. Die Charakteristika dieses Vektors sind von Korman, A.J. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 84:2150 (1987) beschrieben worden. Dieser Vektor ist zur Expression zweier Gene in der Lage: Das interessierende Gen und ein dominanter selektierbarer Marker, wie das neo-Gen. Das interessierende Gen wird in direkter Orientierung in die BamHI/Sma1/Sal1-Klonierungsschnittstelle unmittelbar benachbart zur 5'-LTR kloniert, während das neo-Gen benachbart zum internen Promotor (aus SV40) plaziert wird und somit weiter in 3' im Vergleich zur Klonierungsschnittstelle (von der Klonierungsschnittstelle in 3' angeordnet).
Die Transkription von PLJ beginnt an zwei Orten: 1) An der 5'-LTR, welche für die Expression des interessierenden Gens verantwortlich ist und 2) am internen SV40-Promotor, der für die Expression des neo-Gens verantwortlich ist.
pWe. Die Konstruktion und ursprüngliche Charakterisierung dieses Vektors wurde beschrieben. Choudory, P.V. et al., CSH Symposia Quantitative Biology, L.I. 1047 (1986). Kurzum kann dieser Vektor zu einer Expression von zwei Genen führen. Einem dominanten selektierbaren Marker, wie neo, der unmittelbar downstream zur 5'-LTR liegt und einem interessierenden Gen, das in die BamHI-Schnittstelle kloniert werden kann, gerade downstream von einem internen Promotor, der zu einer konstitutiven High-Level-Expression in der Lage ist. Mehrere verschiedene interne Promotoren, wie der Beta-Actin- Promotor aus Hühnern (Choudory, P.V. et al., CSH Symposia Quantitative Biology, L.I. 1047 (1986)) und die menschlichen Histone H4 Promoter (Hanly, S.m. et al., Molecular and Cellular Biology 5:380 (1985)) sind verwendet worden. Die Expression des neo-Gens erfolgt von einem Transkript, das an der 5'-LTR initiiert wurde; die Expression des interessierenden Gens erfolgt von einem Transkript, das an dem internen Promotor initiiert wurde.
pEM. In diesem einfachen Vektor wird die vollständige Kodierungssequenz für gag, pol und env des Wiltyp-Virus durch das interessierende Gen ersetzt, das das einzig exprimierte Gen darstellt. Die Komponenten des pEm-Vektors sind unten beschrieben. Die 5'-flankierende Sequenz, 5'-LTR und 400 bp der benachbarten Sequenz (zur BamHI-Schnittstelle aufwärts) stammt aus pZIP. Die 3'-flankierende Sequenz und die LTR stammen ebenfalls aus pZIP; jedoch ist die cla-Schnittstelle 150 bp stromaufwärts von der 3'-LTR mit BAMH1 verbunden und bildet die andere Hälfte der BAMH1-Klonierungsschnittstelle, die im Vektor vorhanden ist. Das HindIII/EcoR1-Fragment aus pBR322 bildet das Plasmid-Gerüst. Dieser Vektor stammt aus Sequenzen, die aus einem Stamm des Moloney-Maus-Leukämie-Virus kloniert wurden. Ein analoger Vektor ist aus Sequenzen konstruiert worden, die aus dem Myeloproliferativen-Sarcom- Virus stammen.
pIp. Dieser Vektor ist zur Expression eines einzelnen Gens in der Lage, das von einem internen Promotor gesteuert ist. Die Konstruktion dieses Vektors ist unten zusammengefaßt. Die 5'-Region des Vektors, einschließlich der 5'-flankierenden Sequenzen, 5'-LTR und 1400 bp der benachbarten Sequenz (aufwärts in Richtung xho-Schnittstelle in der gag-Region) entstammt einer Wildtyp-Moloney-Maus-Leukämie-Virus-Sequenz. Shinnick et al., Nature, 293: 543 (1918). Der Unterschied zwischen diesen beiden ist, daß ein SacII-Linker in die HaeIII-Restriktionsschnittstelle kloniert wurde, unmittelbar benachbart zum ATG des gag-Gens. Die 3'-Sektion des Vektors einschließlich der 3'-flankierenden Sequenzen, 3'-LTR und benachbarter 3'-Sequenz (bis zur claI-Schnittstelle in der env-kodierenden Region) stammt aus pZIP. Jedoch gibt es zwei Modifikationen: 1) die claI-Schnittstelle wurde mit BamHI verknüpft und 2) eine kleine Sequenz in der 3'-LTR, die den Enhancer (von PvuII bis XbaI) spreizt, ist entnommen worden. Die Verbindung zwischen den 5'- und 3'-Sektionen des Vektors stellt einer von mehreren Promotoren dar; jeder ist in einem xhoI/BamHI-Fragment enthalten und jeder ist zur konstitutiven High-Level-Expression in den meisten Geweben in der Lage. Diese Promotoren umfassen Beta-Actin aus Hühnern (Choudory, P.V. et al., CSH Symposia Quantitative Biology, L.I. 1047 (1986) und Thymidin-Kinase aus dem Herpes-Simplex- Virus, Histon-H4 aus Menschen (Hanly, S.M. et al., Molekular and Cellular Biology 5:380 (1985)). Das Vektorgerüst ist das HIndIII/EcoRI-Fragment aus pBR322. Das interessierende Gen ist in die BamHI-Schnittstelle in direkter Orientierung kloniert, unmittelbar downstream zum internen Promotor.
RO-Vektoren. Diese Kategorie umfaßt eine heterogene Gruppe von Vektoren, in denen das interessierende Gen alle Sequenzen enthält, die zur Transkription notwendig sind (z.B. Promotor/Enhancer, Kodierungs-Sequenz mit und ohne Introns und Polyadenylierungssignal) und in einer Orientierung in den retroviralen Vektor eingefügt ist, in der die Transkription in einer Richtung verläuft, die entgegengesetzt zu der bei normaler retroviraler Transkription ist. Hierdurch wird es möglich, mehrere der cis-wirkenden Elemente einzusetzen, die an der Regulation der eingeschleusten Gene beteiligt sind. Im Grunde können alle der oben genannten Gene zu einem RO- Vektor führen. Ein Beispiel ist von Cone et al. beschrieben, in dem das vollständige Beta-Globin-Gen in umgekehrter Orientierung in die BamHI-Schnittstelle von pZIP kloniert wurde. Cone, R. and R.C. Mulligan Proceeding of the National Academy of Sciences, USA, 81:6349-6353 (1984). Es wurden RO- Vektoren konstruiert, in denen das interessierende Gen in die XhoI/BamHI-Schnittstelle von pIp kloniert wurde (im wesentlichen durch Ersatz des internen Promotors).
In Tabelle 1 sind Vektoren gezeigt, in die ein interessierendes Gen inseriert wurde sowie Ergebnisse, die erhalten wurden, als die Konstruktion auf Expression geprüft wurde. Tabelle 1 Vektoren die das interessierende Gen enthalten TABELLE 1 Vektor Funktionsprotein menschliches Wachstumshormon menschliches PTH menschlicher Rezeptor für LDL menschliches Albumin menschliche Ornitin-Transcarbamoylase menschliche Adenosin-Desaminase Rezeptor für Interleukin-2 menschliches Beta-Globin menschliches Alpha-Globin Mutations-Dihydrofolsäure-Reduktase Multidrug-Resistenz menschliche Glucosecerebrosidase Neomycin EIA-Gen aus Adenovirus Histidinol aus E. coli Galactosidase aus E. coli HLA-Antigene aus Menschen menschliches Insulin Hülle aus Moloney MLV ¹ konstruiert, nicht auf Expression getestet ² konstruiert, keine Expression im Test ³ konstruiert, Expression nachgewiesen
Vektoren, die einen selektierbaren Marker beinhalten, sind in Fig. 2a, 2b und 2c dargestellt. In Fig. 2a ist pZIP neo SVX dargestellt, das von Cepko beschrieben ist. Cepko, C. et al., Cell, 37: 1053-1062 (1984). Hier ist ein Splice-Donor und ein Splice-Akzeptor vorhanden, oder dargestellt als SD und SA, zwischen denen unter Anwendung bekannter Techniken das interessierende Gen inseriert ist. Die Expression des inserierten Gens basiert auf der LTR in der unprozessierten Information; die prozessierte Information ist verantwortlich für die Expression von Neomycin.
In Fig. 2b ist der Vektor pLJ dargestellt. Das interessierende genetische Material ist in pLJ hinter der 5'-LTR inseriert. Die Expression dieses genetischen Materials erfolgt über die LTR und die Expression des neo-Gens erfolgt über einen internen SV40-Promotor.
In Fig. 2c sind die pWe-Vektoren dargestellt. In pWe-Vektoren sind der LTR-Promotor und das Transkript für die Expression von Neomycin und ein interner Promotor für die Expression des interessierenden Gens verantwortlich. Promotoren, welche in dieser Art von Vektoren nützlich sind, beinhalten Promotoren vom Hühner-Beta-Aktin, menschlichem Histon, der Herpes-Simplex-Thymidin-Kinase, thy 1 (ein gewebespezifischer Promotor, der in T-Zellen verwendet wird) und Ratten- Albumin.
Vektoren ohne selektierbaren Marker können auch zur Transduktion von Fibroblasten mit interessierendem genetischen Material verwendet werden. Solche Vektoren sind grundsätzlich Vereinfachungen der zuvor beschriebenen Vektoren, in denen ein solcher Marker enthalten ist. In Fig. 2d ist der Vektor pEm dargestellt; wie dargestellt ist, sind die 5'- und 3'-LTR die Hauptkomponenten des Vektors, und das interessierende genetische Material ist zwischen diesen beiden LTRs inseriert. pIp repräsentiert eine Serie nützlicher Vektoren, in denen ein interner Promotor vorhanden ist. Wie in Fig. 2e dargestellt, befindet sich an jedem Ende eine LTR, die einen internen Promotor flankieren; Promotoren, die in diesen Vektoren nützlich sind, enthalten solche, die aus Hühner-Beta-Aktin, menschlichem Histon, Herpes-Simplex-Thymidin-Kinase und Ratten-thy-1 stammen.

Einschleusung von genetischem Material in Fibroblasten und Bestimmung der Expression des genetischen Materials

Zur Infektion von Fibroblasten wird eine Zellinie benutzt, die das rekombinante amphotrope Retrovirus produziert, welches ein rekombinantes Genom enthält. Wie oben beschrieben, kann das rekombinante Genom verschiedene Komponenten beinhalten, doch enthält es im allgemeinen zwei LTRs und anstelle der gag-, pol- und env-Sequenzen eine zweite Promotor-Sequenz und, in einigen Fällen, ein Gen, welches einen selektierbaren Marker (z.B. neo) kodiert.
Virus-Stammlösungen, die zur Einschleusung des interessierenden genetischen Materials in Fibroblasten verwendet werden, werden geerntet, wie oben beschrieben mit 8 g/ml (mcg/ml) Polybrene (Aldrich) versetzt und zu einer Fibroblastenkultur gegeben. Wenn der Virustiter hoch ist (z.B. ungefähr 10&sup6; cfu per ml), werden nahezu alle Fibroblasten infiziert und es ist keine Selektion (z.B. nach Fibroblasten, in die der Vektor einschließlich des rekombinanten Genoms eingeschleust wurde) mehr erforderlich. Wenn der Titer sehr niedrig ist, dann ist es notwendig, einen retroviralen Vektor, der einen selektierbaren Marker, wie neo oder his aufweist, zu verwenden. Wenn ein selektierbarer Marker verwendet wird, setzt man die Zellen dem Virus aus, läßt sie bis zur Konfluenz wachsen und teilt dann auf selektive Medien auf (z.B. ein G418 enthaltendes Medium, falls der selektierbare Marker neo ist, Medien, die Histidinol und kein Histidin enthalten, wenn der selektierbare Marker his ist).
Das neo-Gen ist ein bakterielles Gen, das aus dem Transposon Tn5 stammt, welches Neomycin-Resistenz in Bakterien und Resistenz gegenüber dem Antibiotikum G418 in Säugerzellen kodiert. Das neo-Gen fungiert als dominanter selektierbarer Marker; seine Gegenwart in einer Säugerzelle ermöglicht der Zelle in Gegenwart von G418 zu wachsen (wenn es nicht vorhanden ist, stirbt die Zell in Gegenwart von G418). Demzufolge kann die Existenz dieses Gens in einer Säugerzelle durch Wachstum der Zellen auf einem G418 enthaltenden Medium nachgewiesen werden. Das dieses rekombinante Genom enthaltende rekombinante Retrovirus wird als neo-Virus bezeichnet.
Die rekombinanten retroviralen Vektoren, die das neo-Gen enthalten, besitzen eine Klonierungs-Schnittstelle. Demzufolge kann interessierendes genetisches Material in den Vektor eingeführt, in Fibroblasten inkorporiert und von Fibroblasten, die mit dem rekombinanten Retrovirus transduziert wurden, exprimiert werden (bezeichnet als Fibroblasten, die genetisches Material inkorporiert haben).
Es ist möglich, interessierendes genetisches Material an der BamHI-klonierungs-Schnittstelle zu inserieren. Das interessierende genetische Material kann DNA sein, das normalerweise nicht in Fibroblasten vorkommt; DNA, die normalerweise in Fibroblasten vorkommt, aber von diesen nicht in biologisch effizienten Ausmaßen exprimiert wird (z.B. in Ausmaßen, die ausreichend sind, um die normalen physiologischen Effekte des kodierten Polypeptids zu bewirken); DNA, die in Fibroblasten vorkommt und so modifiziert wurde, daß sie von solchen Zellen exprimiert wird; und jede DNA, die zur Expression in Fibroblasten modifiziert werden kann, alleine oder in jeder Kombination hiervon.
Eine Kopie des Gens, das menschliches Parathyroidhormon (hPTH) kodiert, ist in diese Schnittstelle folgendermaßen kloniert worden (z.B. in pLJ): das pLJ-Plasmid wurde mit BamHI geschnitten und anschließend mit dem Enzym Kalbsintesnial-Phosphatase behandelt. Im Anschluß hieran wurde der lineare Vektor auf einem Agarose-Gel fraktioniert und unter Verwendung von Glas-Kügelchen gereinigt. Darüber hinaus wurde das BamHI-Fragment, das das menschliche PTH enthielt, aus dem Plasmid wie von Hendy et al., präpariert, das eine vollständige cDNA des menschlichen PTH enthielt, welche in pBR322 kloniert wurde. Hendy, G.N. et al., Proceedings of the National Akademy of Sciences, USA, 78:7365-7369 (1981).
Ein Unterfragment der PTH-cDNA, das 17 bp der 5' unübersetzten, vollständig kodierenden und 31 bp der 3' unübersetzten Sequenz beinhaltet, wurde isoliert, indem das ursprüngliche Plasmid mit DdeI und HinfI geschnitten, und das 600bp-Fragment isoliert wurde. Die Enden dieses Fragments wurden mit DNA-Polymerase behandelt, um die fehlenden Enden aufzufüllen. Mit T4-DNA-Ligase wurden BamHI-Linker an die stumpfen Enden ligiert. Durch Schneiden der oben genannten Ligations- Mischung mit BamHI wurde ein richtiges BamHI-Restriktionsfragment hergestellt. Dies wurde dann in die BamHI-Schnittstelle des pBR322 subkloniert, welches das Plasmid in der Vektorkonstruktion ist, das als Quelle für hPTH verwendet wird.
Gleiche Mengen des linearen pLJ-Gerüsts und des BamHI-PTH- Fragments wurden in Gegenwart von T4-DNA-Ligase zusammengegeben. Die sich ergebende Mischung wurde unter Bedingungen gehalten, die zur Ligation von zwei Fragmenten geeignet sind. Die Ligationsmischung wurde zur Transformation des Bakteriums HB101 verwendet, das anschließend auf kanamycinhaltigem Agar plattiert wurde. Maniatis, T. et al., Molekular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p.p. 250-251, 504; Bolivar, F. and K. Backman, In: Methods in Enzymology, R. Wu (ed.), Vol. 68, Academic Press, N.Y. (1979). Die entstandenen Kolonien wurden auf das rekombinante Plasmid hin analysiert.
Parathyroidhormon ist ein Polypeptid, das bei der Calcium- Regulation im Körper eine Rolle spielt. Obgleich das hPTH- Gen in menschlichen Fibroblasten vorhanden ist, wird es in diesen Zellen nicht in biologisch signifikanten Ausmaßen exprimiert. Fibroblasten, die in der Lage sind, ein Polypeptid-Hormon wie hPTH oder eine andere Substanz, die normalerweise nicht von solchen Zellen in biologisch signifikanten Ausmaßen hergestellt wird, zu produzieren, können individuell verändert werden und als kontinuierliches Liefersystem für das Hormon oder einer anderen Substanz dienen.
Dieses Verfahren ist in bezug auf hPTH beschrieben, wobei es sich versteht, daß unter Anwendung der beschriebenen Methode auch jedes andere Gen in Fibroblasten eingeschleust werden, und daß eine Expression durch die Zellen in ähnlicher Weise stattfinden kann. Wie erläutert, wurde DNA, die die in Tabelle 1 aufgeführten Proteine oder Funktionen kodiert, in retrovirale Vektoren kloniert und in vielen Fällen in ähnlicher Weise in Fibroblasten eingeschleust und von den transduzierten Zellen exprimiert.
Wie oben beschrieben, wurden zur Herstellung einer Virus- Stammlösung die Psi-am-Zellen verwendet, die das rekombinante Viruskonstrukt produzieren, das die hPTH kodierende DNA enthielt und DNA, die einen selektierbaren Marker kodiert (wie das neo-Gen). Die Virus-Stammlösung wurde geerntet; mit der Stammlösung wurden Fibroblasten inkubiert, die transduziert werden sollen mit demjenigen Virus, das das hPTH-Gen enthält. In diesem Fall wird durch Kultivierung auf einem G418 enthaltenden Medium ein selektierbarer Marker zur Identifikation und Selektion auf transduzierte Fibroblasten verwendet. Wenn der Virustiter ausreichend hoch ist, so daß im wesentlichen alle Fibroblasten infiziert werden, ist eine Selektion unter Verwendung eines selektierbaren Markers und eines geeigneten Mediums nicht erforderlich.
Diploide Fibroblasten aus einer Wistar-Ratte, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung mit für hPTH kodierender DNA transduziert wurden, sind bei der American Type Culture Collection (Rockville, MD) unter der Hinterlegungsnummer CRL9514 hinterlegt worden. Die Fähigkeit der mit einem das hPTH-Gen enthaltenen rekombinanten Retrovirus transduzierten Fibroblasten, das hPH-Gen zu exprimieren, ist sowohl in vitro als auch in vivo bestimmt worden.
Die in vitro-Bestimmung wurde wie folgt durchgeführt:
Es wurde die in vitro-Produktion von hPTH durch NIH-3T3-Zellen, die mit einem das hPTH-Gen enthaltenen Virus infiziert und in Neomycin selektiert wurden, und durch Sekundärkulturen von Fibroblasten, die aus einer Wistar-Ratte (FWR) stammten, bestimmt. NIH-3T3-Zellen sind Zellen, die aus einem Hühnerembryo stammen und durch selektive Kultivierung in vitro am Leben erhalten wurden. Die FWR-Zellen stammten aus einem Explantat eines syngenischen Rattenstammes (Wistar). Die Zellen haben eine begrenzte Lebensdauer und werden als Sekundärkulturen bezeichnet.
Beide Arten von Zellen wurden zuvor infiziert mit einem Virus und in Neomycin selektiert, wie oben beschrieben. Nach der Selektion hat man jeden Zelltyp auf eine 10 cm-Gewebe- Kulturplatte geimpft und ließ ihn bis zur Konfluenz wachsen. Dann wurde frisches Kulturmedium (DME mit 10% CS und Penicillin und Streptomycin) zugegeben; dieser Zeitpunkt wird nachfolgend als Nullpunkt bezeichnet. Anschließend wurden Aliquots des Mediums abgenommen und eingefroren. Nach Ablauf von 24 Stunden wurde das gesamte Medium von den Zellen entfernt und zurück in den Brutschrank gestellt; 12 Stunden später wurde ein weiteres Aliquot zur Untersuchung der Beständigkeit des menschlichen PTH in der Gewebekultur entnommen.
Zur Bestimmung des Vorhandenseins von hPTH in den Aliquots wurde ein Radioimmunoassay (Nichols) verwendet, der das intakte hPTH mißt. Die Technik ist in Allegro Intact PTH/Immunoassay System for the Quantitative Determination of Human Intact Parathyroid Hormone in Serum, Nichols Institute Diagnostics, San Juan Capistrano, CA (36B-2170, Effective 7/86 Revised) beschrieben, wobei die Lehren hiermit einbezogen sind. Die Bestimmung hat eine Empfindlichkeit von ungefähr einem Nanogramm/Milliliter Serum (ng/ml) und ist dadurch für menschliches PTH spezifisch, daß es nicht zu einer Kreuzreaktion mit Ratten-PTH kommt. Die Ergebnisse des Experiments sind als Produktion des hPTH über die Zeit dargestellt, gemessen mittels RIA. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt.
Die gleiche Analyse wurde ebenfalls durchgeführt, nachdem die infizierten und selektierten Wistar-Ratten-Fibroblasten auf Cytodex-Kügelchen übertragen wurden. Im subkonfluenten Zustand der Zellen auf den Kügelchen wurde frisches Medium zugegeben; es wurden Aliquots abgenommen und die Produktionsrate des PTH gemessen. Unter diesen Bedingungen betrug die Produktionsrate das Zweifache dessen, was in der Gewebekultur auf Gewebekulturplastik gemessen wurde. In beiden Fällen wurden zum Ende der Bestimmungsdauer die Zellen mittels Trypsinisierung geerntet und gezählt.
Die in vivo-Bestimmung wurde wie folgt durchgeführt:
Ungefähr 2 x 10&sup7; veränderter Fibroblasten wurden entweder allein oder nach Kultivierung bis zur Konfluenz auf Cytodex 3-Mikroträger-Kügelchen in die Intraperitoneal-Höhle syngenischer Ratten injiziert. Als Kontrollen dienten Ratten, in die nur salinischer Phosphatpuffer (PBS) oder Kügelchen allein in entsprechender Menge intraperitoneal injiziert wurden. Eine Kontroll-Ratte erhielt eine intraperitoneal-Injektion (IP) aus PBS allein. Ein zweites Kontroll-Tier erhielt eine IP-Injektion aus 2 x 10&sup7; FWR-Zellen, die menschliches PTH exprimieren; diese wurden als Suspension in PBS appliziert. Eine weitere Kontroll-Ratte erhielt 300 mg Cytodex-3- Kügelchen allein (d.h. ohne weitere Zellen). Eine vierte Ratte erhielt ungefähr 150 mg mit FWR-PTH-Zellen beschichtete Cytodex-3-Kügelchen, was ungefähr 2 x 10&sup7; Zellen entspricht. Einer fünften Ratte wurden ungefähr 200 mg der mit FWR-Fibroblasten beschichteten Kügelchen verabreicht (ungefähr 2 - 3 x 10&sup7; Zellen). Der Zeitpunkt der Injektion wird mit T=0 bezeichnet.
Die Aufnahme der transduzierten Fibroblasten wurde durch Nachweis von hPTH im Empfängerblut bestätigt, indem ein für hPTH-spezifischer Radioimmunoassay verwendet wurde. hPTH wurde im Serum über einen Zeitraum von 3 Wochen nach der Transplantation nachgewiesen.
In allen Tieren wurde die erste Messung bei T=3 Stunden (3 Stunden nach der Injektion) durchgeführt. Dies erfolgte durch Entnahme von ungefähr 1/2 ml Blut aus der Schwanzvene eines jeden Tieres. Das Blut ließ man gerinnen und das Serum wurde analysiert auf hPTH unter Verwendung des Radioimmunoassays nach Nichols, wie oben beschrieben. Dies wurde wiederholt; zu verschiedenen Zeiten wurde ungefähr ein 1/2 ml Blut durch Schwanz-Phlebotomie entnommen und auf hPTH analysiert. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen sind in der Tabelle aufgeführt. In der Tabelle sind ebenfalls die Ergebnisse der Kalziumwerte im Serum dieser Tiere aufgeführt. TABELLE 2 Bestimmung der in vivo-Expression von menschlichem PTH RATTE ZEIT (TAGE) a freie PTH-Fibroblasten injiziert (IP) b Kügelchen injiziert c PTH-Fibro-beads (Cytotex-2 oder -3) injiziert T = 0 = Zeitpunkt der Injektion
Die Ergebnisse dieser Bestimmung sind in Fig. 5 dargestellt. 3 Stunden nach der Injektion transduzierter Fibroblasten allein wurden 60 Pikogramm (pg) hPTH pro Milliliter (ml) im Empfängerserum nachgewiesen. (Normale menschliche Serum-PTH- Werte reichen von 10 bis 50 pg/ml). Innerhalb von 3 Stunden nach der Injektion von konfluent auf Kügelchen aufgebrachter transduzierter Fibroblasten wurden hPTH-Werte von 120 pg/ml oder 175 pg/ml Serum ermittelt. Wie ebenfalls in der Tabelle dargestellt, wurden Ratten, denen die das hPTH-Gen enthaltene transduzierte Fibroblasten injiziert wurden, nicht hypercalcämisch. Dies war nicht zu erwarten, weil in vitro-Experimente vermuten ließen, daß hPTH im Rattengewebe aktiv ist. Eine mögliche Erklärung ist, daß ein gegenläufiger Regulations-Mechanismus aktiviert wurde (d.h. Calcitonin).
Als Ergebnis konnte gezeigt werden, daß transduzierte Fibroblasten ein Polypeptid-Hormon ausscheiden, das normalerweise nicht in biologisch signifikantem Ausmaß von Fibroblasten ausgeschieden wird und daß sie zusätzlich dieses Hormon in physiologischen (oder höheren) Konzentrationen ausscheiden können. Die Transplantation der das menschliche Parathyroidhormon ausscheidenden Fibroblasten (hier in der Intraperitoneal-Höhle) hat gezeigt, daß die durch das Retrovirus hervorgerufene phenotypische Änderung der Fibroblasten (d.h. die Sekretion des hPTH) systematisch im Empfänger nachgewiesen werden kann. Eine Anwendung transduzierter Fibroblasten in vergleichbarer Weise auf parathyroidektomierte Ratten kann ferner die Effektivität des produzierten hPTH zeigen.
Von daher werden gemäß einer Ausgestaltung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung Fibroblasten transduziert, indem ein retroviraler Vektor verwendet wird, in dem das rekombinante Genom die interessierende DNA und gegebenenfalls DNA enthält, die einen dominanten selektierbaren Marker kodiert. Transduzierte Zellen werden isoliert, und man läßt sie bis zur erforderlichen Zahl wachsen. Sie werden in den Empfänger mittels Transplantation eingeführt (z.B. in die Intraperitoneal-Höhle, in das zentrale Nervensystem). Andererseits werden Fibroblasten entsprechend transduziert, isoliert, kultiviert und dann in Verbindung mit oder gebunden an eine Matrix transplantiert. Dieser Ansatz ist insbesondere dann nützlich, wenn Langzeit-Anwendungen (mehrere Wochen oder länger) erforderlich sind. Wie beschrieben, kann die verwendete Matrix ein Träger sein, beispielsweise Mikroträger-Kügelchen, insbesondere mit Kollagen beschichtete Mikroträger- Kügelchen. Die Matrix kann im Grunde jede feste Matrix sein, die eine geeignete Größe besitzt. Es kann ein Hauttransplantat angewendet werden, das transduzierte Fibroblasten enthält.

Einschleusung von genetischem Material, das andere Polypeptide als hPTH kodiert

Gene, die andere Polypeptide als hPTH kodieren, können ebenfalls in Fibroblasten mittels retroviraler Vektoren eingeschleust werden. Z.B. kann ein menschliches Wachstumshormon (HGH) kodierendes Gen oder ein Insulin kodierendes Gen in Fibroblasten eingeschleust werden. Solche Gene können in Fibroblasten allein oder in Kombination mit solchen Genen eingeschleust werden, die einen selektierbaren Marker wie das neo-Gen kodieren. HGH ist ein 29.000 Dalton Polypeptid, das normalerweise nur vom Hypothalamus abgesondert wird. Insulin ist ein Polypeptid, das die Glucosekonzentration im Blutstrom reguliert.
Diese und andere Gene (z.B. einige der oben aufgeführten) wurden in Fibroblasten in der gleichen Weise wie oben für das hPTH-Gen beschrieben eingeschleust, und die sich ergebenden transduzierten Fibroblasten können auf einen geeigneten Ort im Körper übertragen werden.

Verwendung anderer dominanter selektierbarer Marker bei der Einschleusung von genetischem Material, das Polypeptide kodiert

Es ist ebenfalls möglich, andere dominante selektierbare Marker als das neo-Gen zu verwenden, um genetisches Material in Fibroblasten einzuschleusen. Z.B. kann in solchem Fall das His D-Gen verwendet werden. Das His D-Gen ist ein bakterielles Gen aus Salmonella und codiert Histidinoldehydrogenase, ein Polypeptid, das Histidinol in Histidin umwandelt. Histidin ist eine essentielle Aminosäure; Histidinol ist ein Alkohol, analog zu Histidin, der unter geeigneten metabolischen Bedingungen zu Histidin umgewandelt werden kann. Wenn Zellen in einem Medium kultiviert werden, das Histidinol enthält, aber kein Histidin, können solche Zellen Histidinol in Histidin umwandeln, die das His D-Gen besitzen. Weil Histidin essentiell für die Zellfunktion ist, werden solche Zellen überleben, die das His D-Gen besitzen (und von daher Histidin produzieren), dagegen nicht solche, denen das Gen fehlt.
Zur Infektion von Keratinocyten wurde ein Retrovirus-Vektor verwendet, der das His D-Gen besitzt. Die das His D-Gen enthaltenden Keratinocyten wurden dadurch selektiert, daß diese Zellen in einem Histidin freien aber Histidinol enthaltenden Medium gewachsen sind. Wie erwartet, bildeten Keratinocyten, die das His D-Gen besaßen, Kolonien und wuchsen bis zur Konfluenz; solche, die das Gen nicht hatten, taten das nicht. In der Tat traten diese Zellen viel häufiger auf als solche, in denen das neo-Gen enthalten war. Die gleichen Techniken sind zur Selektion von Fibroblasten nützlich, die interessierende DNA enthalten.
Als ein Ergebnis dieser Arbeit ist es auch möglich, unabhängige dominante selektierbare Marker (z.B. das neo-Gen und das His D-Gen) bei der Einschleusung neuen genetischen Materials in Fibroblasten zu verwenden. Z.B. im Falle von Polypeptiden, die zwei verschiedene Untereinheiten besitzen, lassen sich separate dominante selektierbare Marker bei der Einschleusung der die beiden Untereinheiten kodierenden genetischen Information verwenden. Darüber hinaus können zwei oder mehr dominante selektierbare Marker im Falle von Polypeptiden verwendet werden, die spezifisch geschnitten oder prozessiert werden müssen, um aktiv zu werden (z.B. Insulin und Parathyroidhormon). Ein Gen, das das notwendige Prozessierungsenzym kodiert, kann zusammen mit dem Gen eingeschleust werden, das das die Prozessierung erfordernde Polypeptid-Hormon kodiert. Dies würde Fibroblasten dazu befähigen, das Polypeptid-Hormon zu prozessieren.

Andere Mittel zur Einschleusung von interessierendem genetischen Material in Fibroblasten

Es ist ferner möglich, andere Mittel als die Retroviren zu verwenden, um Fibroblasten genetisch zu manipulieren oder zu verändern. Interessierende genetische Information kann in Fibroblasten mittels eines beliebigen Virus eingeschleust werden, der das neue genetische Material in solchen Zellen exprimieren kann. Z.B. können zu diesem Zweck SV40, Herpes Virus, Adenovirus und menschliches Papilloma-Virus verwendet werden.

Einschleusung von interessierendem genetischen Material in andere Zelltypen

Unter Verwendung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist es ferner möglich, interessierendes genetisches Material in andere Zelltypen zu inkorporieren. Das Verfahren kann verwendet werden, um interessierendes genetisches Material in ein beliebiges System einzuschleusen, in dem Zellen von einem Gewebe gewonnen werden können, in Gewebekultur auf eine festen Matrix wachsen und infiziert werden können mit einem Retrovirus. Interessierendes genetisches Material kann ebenfalls in das zentrale Nervensystem inkorporiert werden. Z.B. kann es eingeschleust werden in Fibroblasten oder in gliale Zellen oder neurogliale Zellen, die nicht-neuronale zelluläre Elemente des zentralen und des peripheren Nervensystems darstellen. Die transduzierten Zellen können in das Wirtstier eingeschleust werden. Dies kann durch stereotaktische Verabreichung erfolgen, direkt in die spezifischen Regionen des Gehirn oder durch Einschleusung in die Cerebrospinal-Flüssigkeit. Im zentralen Nervensystem umfassen gliale Zellen oligodendrogliale Zellen, Astrozyten, ependymale Zellen und mikrogliale Zellen. Im peripheren Nervensystem umfassen sie die Satelliten-Zellen der Ganglien und die neurolemmalen (oder Schwann-) Zellen im Umkreis der peripheren Nervenfasern.
Interessierendes genetisches Material wie das Purin-Salvage- Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (HPRT) kann in gliale Zellen eingeschleust werden, damit der erbliche Deffekt der HPRT, der sich in dem Lesch-Nyhan-Syndrom darstellt, korrigiert werden kann; eine gewebszerstörende genetische Krankheit mit mehreren CNS-Abnormalitäten. Zur Behandlung oder Prävention kann es auch in das zentrale Nervensystem eingeschleust werden, z.B. bei degenerativen Krankheiten (z.B. durch Einschleusung genetischen Materials, das den Nervenwachstumsfaktor kodiert), der Parkinsonschen Krankheit (z.B. durch Einschleusung genetischen Materials, das DOPA synthetisierende Enzyme kodiert) und bei genetischen Erkrankungen, die durch ein "abnormales" Gen hervorgerufen werden (z.B. Huntingtonsche Krankheit, manische Depression, Alzheimer Krankheit), in denen das abnormale Gen ersetzt werden kann, seine Funktion korrigiert oder dieser entgegengesteuert werden kann, oder durch Produktion eines kodierten veränderten Produkts.
Interessierendes genetisches Material kann auch in Endothel- Zellen eingeschleust werden, die die serösen Membranen umgeben und das Herz, Blutgefäße, Lymphgefäße und die vordere Augenkammer auskleiden. Interessierendes genetisches Material, wie hPTH, kann in solche Zellen eingeschleust werden, um deren Ausscheidung in den Blutstrom zu fördern.

Verwendung von Fibroblasten und anderer Zellen, die genetisches Material inkorporiert haben

Die vorliegende Erfindung macht es möglich, Fibroblasten in der Weise genetisch zu verändern, daß sie Polypeptide und Proteine, die normalerweise in Fibroblasten nicht in biologisch signifikanten Mengen produziert werden, zu produzieren und sie in den Blutstrom oder anderer Bereiche des Körpers abzusondern, wie z.B. das zentrale Nervensystem. Die auf diese Weise hergestellten Fibroblasten können als kontinuierliches Wirtstoff-Liefersystem fungieren, um bestehende Maßnahmen, die eine periodische Anwendung benötigter Substanzen erfordern (durch Einnahme, Injektion, usw.) zu ersetzen.
Z.B. können sie verwendet werden, um eine kontinuierliche Lieferung von Insulin zu ermöglichen, das gegenwärtig aus dem Pankreas isoliert umfassend gereinigt und von denjenigen, deren Insulinproduktion oder -verwertung beeinträchtigt ist, in den Körper injiziert werden muß. Auf diese Weise kann Insulin in den Körper über ein kontinuierliches Wirkstoff-Liefersystem eingeschleust werden, so daß folglich kein Bedarf mehr für tägliche Insulin-Injektionen besteht.
Genetisch veränderte Fibroblasten können auch zur Herstellung von Gerinnungsfaktoren verwendet werden. Bei Blutern fehlt ein Protein, das mit Faktor VIII bezeichnet wird, welches an der Blutgerinnung beteiligt ist. Faktor VIII wird gegenwärtig mittels Injektion verabreicht. Fibroblasten, die den Faktor VIII kodierende Gene besitzen, lassen sich verwenden, um eine Hauttransplantation durchzuführen, bei der sie den Faktor VIII produzieren; bei einer Hauttransplantation gibt das Gewebe den Faktor in den Blutstrom ab.
Die Einschleusung interessierenden genetischen Materials in Fibroblasten oder andere Zelltypen ist insbesondere bei der Behandlung einer Erbkrankheit oder der Behandlung einer erworbenen Krankheit von Bedeutung. Im Falle von Erbkrankheiten wird dieser Ansatz verwendet, um genetisch modifizierte Fibroblasten und andere Zellen zu schaffen, die als metabolischer Auffang verwendet werden können. Das bedeutet, daß solche Fibroblasten dazu dienen, potentiell toxische Verbindungen abzubauen. Dies könnte z.B. bei der Behandlung von Harnstoffzyklus-Erkrankungen erfolgen. Fibroblasten gemäß der vorliegenden Erfindung können auch zur Behandlung von genetischen Erkrankungen verwendet werden, in denen ein Produkt (z.B. ein Enzym oder Hormon), das normalerweise vom Körper produziert wird, nicht oder nur in ungenügenden Mengen produziert wird. Hier können Fibroblasten, die mit einem die fehlende oder die unzureichend produzierte Substanz kodierenden Gen transduziert sind, eingesetzt werden, um diese in ausreichenden Mengen zu produzieren. Dies kann z.B. bei der Produktion von Alpha-1-Antitrypsin erfolgen. Es kann ebenfalls bei der Produktion des Faktor VIII und des Faktors IX verwendet werden, so daß es bei der Behandlung von Hämophilie hilfreich ist.
Es gibt viele erworbene Krankheiten, für die sich eine Behandlung mittels genetisch veränderter Fibroblasten anbietet (d.h. Fibroblasten, die mit interessierendem genetischen Material transduziert wurden). Z.B. können solche Zellen zur Behandlung der Anämie verwendet werden, die gewöhnlich bei chronischer Erkrankung auftritt und oft begleitet ist von chronischer Niereninsuffizienz ( z.B. bei Hämodialyse-Patienten). In diesem Fall würden Fibroblasten, in die ein Erythropoietin kodierendes Gen eingebaut ist, die Anämie ausgleichen, indem das Knochenmark stimuliert wird, die Erythropoese zu steigern (d.h. die Produktion der roten Blutkörperchen). Fibroblasten gemäß der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um eine geringe Dosis des Gewebeplasminogen-Aktivators als ein Aktivator zur Verhinderung der Thrombenbildung zu verabreichen. In diesem Fall würden Fibroblasten, die genetisches Material inkorporiert haben, welches TPA kodiert, in einen Patienten transplantiert, bei dem eine Thrombenprävention erforderlich ist. Dies wäre z.B. hilfreich, als Prophylaxe gegen allgemeine Leiden wie Coronararterienerkrankung, Cerebrovascularerkrankung, periphere Gefäßerkrankung, Venenthrombose (z.B. oberflächliche) wie sie bei einer Lungenembolie feststellbar ist oder Tiefervenenthrombose. Fibroblasten, die Calcitonin kodierende DNA beinhalten, können zur Behandlung des Eisenbahnrückens verwendet werden, einer fortschreitenden chronischen Beeinträchtigung des Knochenmetabolismus, in der Calcitonin gegenwärtig subkutan zugeführt wird.
Fibroblasten, die zur Produktion und Sekretion von Interleukinen (z.B. IL-1, IL-2, IL-3) verändert wurden, können in verschiedenen Fällen verwendet werden. Z.B. ist die Folge einiger zur Zeit angewandter Therapien (z.B. Chemotherapie) die Induktion der Neuropenie (das Auftreten von ungewöhnlich niedriger Zahl neurophiler Leukozyten im Blut), was häufig durch direkte Suppression des Knochenmarks hervorgerufen wird. Z.B. führt die Verwendung von grundsätzlich allen chemotherapeutischen Stoffen, wie auch AZT, das zur Behandlung der erworbenen Immunschwächekrankheit (AIDS) verwendet wird, zur Neutropenie. Dieser Zustand führt zu vielen lebensbedrohenden Infektionen. In diesen Fällen kann eine Verabreichung von z.B. IL-3 durch Transplantation von Fibroblasten, die IL-3 kodierendes genetisches Material enthalten, dazu verwendet werden, die Zahl der Leukozyten zu erhöhen. Darüber hinaus kann die Verabreichung von Thrombopoietin, das die Produktion von Thrombozyten stimuliert, zur Behandlung vieler Zustände verwendet werden, in denen die Thrombozytenzahl gering ist. In diesem Fall können die Fibroblasten, die mit einem Gen für Thrombopoietin transduziert wurden, bei einem Patienten angewendet werden; Produktion und Ausscheidung des kodierten Produkts führt zur Stimulation der Thrombozytenproduktion.
Eine andere hiermit verbundene Anwendung von Fibroblasten, die genetisches Material inkorporiert haben, ist die Behandlung von AIDS. Interleukin-2 und Interleukin-3, die das Immunsystem stimulieren, sind bei der Behandlung von AIDS potentiell von Bedeutung. Sie könnten von einem Hauttransplantat geliefert werden, das genetisch veränderte Fibroblasten aufweist, um diese zwei Polypeptide zu produzieren (die nicht durch periodische Injektion verabreicht werden).
Eine andere Anwendung der vorliegenden Erfindung besteht in der Behandlung von Enzymdefekterkrankungen. In diesem Fall wird das Produkt (Polypeptid), das von dem in die Fibroblasten eingeschleusten Gen kodiert wird, nicht abgesondert (wie dies bei Hormonen der Fall ist); vielmehr handelt es sich hierbei um ein Enzym, das in der Zelle verbleibt. Es gibt viele Fälle von genetischen Erkrankungen, in denen es einem Patienten an einem besonderen Enzym fehlt und der nicht in der Lage ist, verschiedene Aminosäuren oder andere Metaboliten zu metabolisieren. Für diese Enzyme können die richtigen Gene in ein Hauttransplantat eingeschleust werden; das Transplantat würde dann die metabolische Funktion ausführen. Z.B. gibt es eine genetische Krankheit, bei denen den Betroffenen das Enzym Adenosindesaminase fehlt. Dieses Enzym ist an dem Abbau von Purinen zu Harnsäure beteiligt. Unter Anwendung der vorliegenden Erfindung könnte es möglich sein, ein Hauttransplantat zu produzieren, das in der Lage ist, das fehlende Enzym in ausreichend großen Mengen zu produzieren, um Blut zu entgiften, soweit das Blut über die Region geführt wird, bei der das Transplantat angewendet ist.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch veterinärmedizinische Anwendungen. Z.B. kann sie bei Tieren zur Lieferung von Stoffen wie Arzneimitteln (z.B. Antibiotika) und Hormonen angewendet werden, die sonst dem Futter zugemischt, dem Wasser zugegeben oder periodisch (z.B. täglich oder weniger häufig) injiziert würden. Die Anwendung der modifizierten Fibroblasten gemäß der vorliegenden Erfindung hat den Vorteil, daß das von den modifizierten Zellen gebildete Gewebe bei dem Tier angewendet werden kann und Mengen des kodierten Proteins auf einer bleibenden Basis geliefert werden, so daß die Notwendigkeit zur täglichen/periodischen Verabreichung der Substanz entfällt.

Industrielle Verwendung

Die Erfindung hat eine industrielle Verwendungsmöglichkeit, indem Hormone, Enzyme und Arzneimittel für Säuger einschließlich Menschen zur Verfügung gestellt werden kann, sofern für solche Substanzen Bedarf ist. Z.B. kann sie verwendet werden, um eine kontinuierliche Versorgung mit einem Hormon, das sonst intravenös, intramuskulär oder subkutan verabreicht würde, zu ermöglichen. Sie ist insbesondere bei der Bereitstellung solcher Substanzen wie Hormone (z.B. Parathyroidhormon, Insulin) von Bedeutung, die für längere Zeiträume erforderlich sind.

Äquivalente

Der Fachmann wird viele Äquivalente zu den speziellen Ausführungsformen der Erfindung, die im einzelnen hier beschrieben sind, erkennen oder durch routinemäßige Versuche auffinden. Derartige Äquivalente sollen von dem Umfang der folgenden Ansprüche umfaßt sein.

Claims

1. Fibroblasten (z.B. menschliche Fibroblasten) in Verbindung mit (oder gebunden mit) einer Trägermatrix, wobei die Fibroblasten transduziert wurden mit einem rekombinanten Helfer-freien Retrovirus und Inkorporieren von interessierendem genetischem Material enthaltend DNA oder RNA, das (a) normalerweise nicht in Fibroblasten vorkommt, (b) normalerweise in Fibroblasten vorkommt, aber welches normalerweise nicht in biologisch signifikantem Ausmaß exprimiert wird, (c) normalerweise in Fibroblasten vorkommt, aber modifiziert wurde, so daß es in den transduzierten Fibroblasten exprimiert wird, oder (d) modifiziert werden kann, um in den transduzierten Fibroblasten exprimiert zu werden.

2. Fibroblasten gemäß Anspruch 1, wobei die Trägermatrix aus Mikroträger-Kügelchen z.B. mit Kollagen überzogenen Mikroträger-Kügelchen besteht.

3. Fibroblasten gemäß Anspruch 1 oder 2 , wobei das inkorporierte genetische Material weiterhin Material enthält, das wenigstens einen selektierbaren Marker codiert, z.B. einen dominanten selektierbaren Marker, z.B. ein Gen für eine Antibiotika-Resistenz-Determinante.

4. Fibroblasten gemäß Anspruch 3, worin der Marker eine Neomycin-Resitenz-Determinante ist.

5. Fibroblasten gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das inkorporierte genetische Material ein therapeutisches Protein codiert, z.B. (a) ein Hormon, z.B. menschliches Parathyroidhormon oder ein die Fruchtbarkeit regulierendes Hormon, (b) ein Enzym oder (c) ein Wirkstoff; wobei das Hormon, das Enzym oder der Wirkstoff normalerweise in den Fibroblasten nicht in biologisch signifikantem Ausmaß hergestellt wird.

6. Fibroblasten gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Retrovirus ein rekombinantes amphotropes Retrovirus ist mit einem Genom, das die langen terminalen Wiederholungssequenzen, tRNA Bindungsstelle und psi Verpackungsstelle, abgeleitet von dem amphotropen Moloney-Maus-Leukämie-Virus, und das interessierende genetische Material enthält.

7. Fibroblasten gemäß Anspruch 6, worin das retrovirale Genom weiterhin einen eurokaryontischen Promotor enthält, der durch einen externen Reiz reguliert werden kann.

8. Fibroblasten gemäß Anspruch 6, wobei das Retrovirus ausgewählt ist aus pRO (pRO sind Vektoren, in denen die interessierenden Gene alle Sequenzen beinhalten, die zur Transkription nötig sind (z.B. Promotor/Enhancer, codierende Sequenz, mit oder ohne Introns und Polyadenylierungs-Signal) in einer Orientierung, in der die Transkription des Gens in einer Richtung erfolgt, die entgegengesetzt zu der bei normaler retroviraler Transkription ist), pEM (pEM ist ein Vektor, bei dem die vollständige Codierungssequenz für gag, pol und env des Wildtyp-Virus ersetzt ist durch die interessierenden Gene und die 5'- flankierende-Sequenz, 5'-LTR, 400 bp der benachbarten Sequenz (zur BAMHI-Schnittstelle aufwärts) die 3'-flankierende-Sequenz und LTR vom pZIP stammen, während die cla-Schnittstelle 150 bp stromaufwärts von der 3'-LTR mit BAMHI verbunden ist, so daß sich daraus die andere Hälfte der BamHI-Klonierungsschnittstelle im Vektor ergibt; das HindIII/EcoR1-Fragment aus pBR322 bildet das Plasmid-Gerüst) und pIP (pIP ist ein Vektor, der zur Expression eines einzelnen Gens in der Lage ist, das von einem internen Promotor gesteuert ist, wobei die 5'-Region des Vektors, einschließlich der 5'-flankierenden-Sequenz, der 5'-LTR und der benachbarten 1400-bp-Sequenz (aufwärts in Richtung xho-Schnittstelle in der gag Region) aus einem Wildtyp-Moloney-Leukämie-Virus stammt, mit einem SacII- Linker, welcher in die HaeIII-Restriktionsschnittstelle unmittelbar benachbart zu ATG des gag Gens kloniert wurde, der 3'-Sektion des Vektors, einschließlich der 3'- flankierenden-Sequenzen, der 3'-LTR und benachbarter 3'- Sequenz (bis zur claI-Schnittstelle in der env codierenden Region), welche zu pZIP dadurch modifiziert ist, daß 1) die claI Schnittstelle mit BamHI verknüpft ist und 2) eine kleine Sequenz in der 3'-LTR entnommen ist, die den Enhancer (von PvuII nach XbaI) spreizt).

9. Ein Verfahren zur Herstellung der Fibroblasten gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 enthaltend die Schritte des

(a) Kontaktierens der kultivierten Fibroblasten mit Medium enthaltend das amphotrope Helfer-freie rekombinante Retrovirus, das ein rekombinantes Genom bestehend aus dem interessierenden genetischen Material aufweist, und

(b) Aufbewahren der kultivierten Fibroblasten und des Mediums enthaltend das infektiöse rekombinante Retrovirus unter Bedingungen, die für die Infektion der Fibroblasten durch das rekombinante Retrovirus geeignet sind.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, weiterhin enthaltend den Schritt der Kultivierung der Fibroblasten des Schrittes (b) unter Bedingungen, die für ihr Wachstum geeignet sind.

11. Fibroblasten gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 zur therapeutischen Verwendung, z.B. als ein kontiniuierlich Wirkstoff lieferndes System.

12. Fibroblasten gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen Verwendung, z.B. als ein kontiniuierlich Wirkstoff lieferndes System.