JP6228010B2 - ビグリカンおよびユートロフィンに関する治療法および診断法 - Google Patents
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Description
この出願は、2010年12月27日に出願された米国仮出願第61/427,468号の利益を主張する。この参照された出願の全体の教示は、参考として本明細書に明確に援用される。
本発明は、National Institutes of Healthによって付与された助成金HD23924、AR57698、RR15578、NS064295、P20 RR018757、KO8 HL072332、AR 48871およびEY 013862の下、政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
本出願は、ASCIIフォーマットでEFS−Webを介して提出されており、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、配列表を含有する。2011年12月27日に作成された前記ASCIIコピーは、BURF013WO1.txtと名付けられ、59,240バイトのサイズである。
(項目1)
ビグリカン療法に対する患者の応答を予測する方法であって、前記患者のユートロフィンタンパク質のレベルまたは活性が基準レベルと比較して低いかどうかを決定するステップを含み、前記基準レベルと比べて低下していないユートロフィンタンパク質のレベルまたは活性は、前記患者がビグリカン療法に応答する可能性が高いことを示す、方法。
(項目2)
ビグリカン療法の効果をモニタリングする方法であって、ビグリカン療法を受容している患者における膜会合ユートロフィンの量を測定するステップを含み、膜会合ユートロフィンの増大したレベルは、前記ビグリカン療法が有効であることを示す、方法。
(項目3)
前記ビグリカン療法が、配列番号9と少なくとも90%同一なアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドの投与を含む、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記ビグリカン療法が、配列番号9のアミノ酸配列を含むポリペプチドの投与を含む、項目1または2に記載の方法。
(項目5)
前記ビグリカン療法が、配列番号10と少なくとも90%同一なアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドの投与を含む、項目1または2に記載の方法。
(項目6)
前記ビグリカン療法が、配列番号10のアミノ酸配列を含むポリペプチドの投与を含む、項目1または2に記載の方法。
(項目7)
前記ビグリカン療法が、配列番号11と少なくとも90%同一なアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドの投与を含む、項目1または2に記載の方法。
(項目8)
前記ビグリカン療法が、配列番号11のアミノ酸配列を含むポリペプチドの投与を含む、項目1または2に記載の方法。
(項目9)
ビグリカンポリペプチドの患者の用量を調整する方法であって、第1の用量のビグリカンポリペプチドを患者に投与するステップと、前記患者における膜会合ユートロフィンの量を測定するステップと、膜会合ユートロフィンの前記量を所定の標的レベルと比較するステップと、前記ビグリカンポリペプチドの前記用量を、前記測定されたレベルと前記標的レベルとの間の差違に応じて調整するステップとを含む、方法。
(項目10)
ビグリカンポリペプチドの活性を測定する方法であって、前記ビグリカンポリペプチドを、ユートロフィンを発現する被験細胞に投与するステップと、前記被験細胞における膜会合ユートロフィンの量を、ビグリカンポリペプチドを施されなかった対照細胞における膜会合ユートロフィンの量と比較するステップとを含み、前記被験細胞における膜会合ユートロフィンの増大した量は、ビグリカン活性の指標となる、方法。
(項目11)
前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号9と少なくとも90%同一なアミノ酸配列またはその断片を含む、項目9または10に記載の方法。
(項目12)
前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号9のアミノ酸配列を含む、項目9または10に記載の方法。
(項目13)
前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号10と少なくとも90%同一なアミノ酸配列またはその断片を含む、項目9または10に記載の方法。
(項目14)
前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号10のアミノ酸配列を含む、項目9または10に記載の方法。
(項目15)
前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号11と少なくとも90%同一なアミノ酸配列またはその断片を含む、項目9または10に記載の方法。
(項目16)
前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号11のアミノ酸配列を含む、項目9または10に記載の方法。
(項目17)
ビグリカン関連状態の治療剤を同定する方法であって、被験化合物を、ユートロフィンを発現する被験細胞に投与するステップと、前記被験細胞における膜会合ユートロフィンの量を、前記被験化合物を施されなかった対照細胞における膜会合ユートロフィンの量と比較するステップとを含み、前記被験細胞における膜会合ユートロフィンの量の増大により、前記化合物がビグリカン関連状態の治療剤であることが示される、方法。
(項目18)
前記ビグリカン関連状態が、筋ジストロフィー、神経筋疾患、神経疾患、または神経筋接合部またはシナプスの異常を特徴とする状態である、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または筋強直性(mytonic)ジストロフィーである、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記被験細胞が筋細胞である、項目17に記載の方法。
(項目21)
ビグリカンポリペプチドおよびユートロフィンポリペプチドを含む治療用組成物。
(項目22)
前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号9またはその断片と少なくとも90%同一である、項目21に記載の組成物。
(項目23)
前記ユートロフィンポリペプチドが、配列番号13またはその断片と少なくとも90%同一である、項目21に記載の組成物。
(項目24)
ビグリカンポリペプチド、ならびに抗炎症薬、筋肉量を増大させる薬剤、ユートロフィンのmRNAレベルを増大させる薬剤、ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる薬剤、nNOS系の活性を増大させる薬剤、筋細胞膜の修復を促進する薬剤、筋再生を増大させる薬剤、線維化を低下させる薬剤、およびジストロフィンにおけるエクソンスキッピングを促進するアンチセンス剤のうちの1または複数を含む治療用組成物。
(項目25)
前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号9またはその断片と少なくとも90%同一である、項目24に記載の治療用組成物。
(項目26)
前記抗炎症薬が、ロフェコキシブまたはセレコキシブである、項目24に記載の治療用組成物。
(項目27)
筋肉量を増大させる前記薬剤が、ACE−031、AMG−745、またはMYO−029である、項目24に記載の治療用組成物。
(項目28)
ユートロフィンのmRNAレベルを増大させる前記薬剤が、BMN−195である、項目24に記載の治療用組成物。
(項目29)
ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる前記薬剤が、SMT C1100である、項目24に記載の治療用組成物。
(項目30)
nNOS系の活性を増大させる前記薬剤が、タダラフィル、バルデナフィル、またはシルデナフィルシトレートである、項目24に記載の治療用組成物。
(項目31)
筋細胞膜の修復を促進する前記薬剤が、ジスフェリン、MG53、またはCav3である、項目24に記載の治療用組成物。
(項目32)
筋再生を増大させる前記薬剤が、ACE−031またはAMG−745である、項目24に記載の治療用組成物。
(項目33)
線維化を低下させる前記薬剤が、線維化促進因子アンタゴニストまたは抗線維化薬である、項目24に記載の治療用組成物。
(項目34)
エクソンスキッピングを促進する前記薬剤が、AVI−4658、PRO51、またはPRO44である、項目24に記載の治療用組成物。
(項目35)
ビグリカン関連状態を処置する方法であって、ビグリカン関連状態の処置を必要とする患者にビグリカンポリペプチドを含む有効量の組成物およびユートロフィンポリペプチドを共時投与するステップを含む、方法。
(項目36)
前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号9またはその断片と少なくとも90%同一である、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記ユートロフィンポリペプチドが、配列番号13またはその断片と少なくとも90%同一である、項目35に記載の方法。
(項目38)
ビグリカン関連状態を処置する方法であって、ビグリカン関連状態の処置を必要とする患者に有効量の(i)ビグリカンポリペプチドを含む組成物、ならびに(ii)抗炎症薬、筋肉量を増大させる薬剤、ユートロフィンのmRNAレベルを増大させる薬剤、ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる薬剤、nNOS系の活性を増大させる薬剤、筋細胞膜の修復を促進する薬剤、筋再生を増大させる薬剤、線維化を低下させる薬剤、およびジストロフィンにおけるエクソンスキッピングを促進するアンチセンス剤のうちの1または複数を共時投与するステップを含む、方法。
(項目39)
前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号9またはその断片と少なくとも90%同一である、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記抗炎症薬が、ロフェコキシブまたはセレコキシブである、項目38に記載の方法。
(項目41)
筋肉量を増大させる前記薬剤が、ACE−031、AMG−745、またはMYO−029である、項目38に記載の方法。
(項目42)
ユートロフィンのmRNAレベルを増大させる前記薬剤が、BMN−195である、項目38に記載の方法。
(項目43)
ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる前記薬剤が、SMT C1100である、項目38に記載の方法。
(項目44)
nNOS系の活性を増大させる前記薬剤が、タダラフィル、バルデナフィル、またはシルデナフィルシトレートである、項目38に記載の方法。
(項目45)
筋細胞膜の修復を促進する前記薬剤が、ジスフェリン、MG53、またはCav3である、項目38に記載の方法。
(項目46)
筋再生を増大させる前記薬剤が、ACE−031またはAMG−745である、項目38に記載の方法。
(項目47)
線維化を低下させる前記薬剤が、線維化促進因子アンタゴニストまたは抗線維化薬である、項目38に記載の方法。
(項目48)
エクソンスキッピングを促進する前記薬剤が、AVI−4658、PRO51、またはPRO44である、項目38に記載の方法。
(項目49)
ビグリカン関連状態を処置する方法であって、0.1mg/kg〜100mg/kgのビグリカンポリペプチドを、ビグリカン関連状態の処置を必要とするヒト患者に1〜4週間ごとに投与するステップを含む、方法。
(項目50)
前記ビグリカン関連状態が、筋ジストロフィー、神経筋疾患、神経疾患、または神経筋接合部またはシナプスの異常を特徴とする状態である、項目49に記載の方法。
(項目51)
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または筋強直性ジストロフィーである、項目50に記載の方法。
(項目52)
ビグリカンポリペプチドの前記量が、0.1〜1.5mg/kgである、項目49に記載の方法。
本開示は、前出の態様および実施形態のうちのいずれかの全ての組合せのほか、「発明を実施するための形態」および「実施例」で示される実施形態のうちのいずれかによる組合せも想定する。
本開示は、機能不全性のDAPCと関連する疾患もしくは状態、細胞構造の不安定、神経筋接合部もしくはシナプスにおける欠陥、またはVI型コラーゲン欠損を処置および/または防止するための、ビグリカンを含有する組成物および方法を提供する。このような疾患には、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィー、他のミオパシー、神経筋障害、および神経障害が含まれるがこれらに限定されない。
便宜のため、明細書、実施例、および付属の特許請求の範囲において使用される特定の用語および語句の意味を以下に示す。
本明細書で開示される方法および組成物では、野生型のビグリカン治療剤を用いる場合もあり、変異体のビグリカン治療剤を用いる場合もある。このような治療剤は、例えば、形質細胞膜の完全性を維持するのに用いることができ、特に、ジストロフィン会合タンパク質複合体(DAPC)を安定化させるビグリカン治療剤は、これらの膜において用い、これにより膜の崩壊を防止することができる。ビグリカン治療剤はまた、シナプス後膜の分化を刺激することなどにより、神経筋接合部の形成も刺激し、より一般に、ビグリカン治療剤は、シナプス形成を刺激する。
ユートロフィンとは、発生しつつある筋肉において高レベルで発現するジストロフィンの相同体である。ユートロフィンは、成体筋の神経筋接合部近傍に局在化するが、ジストロフィンの非存在下において(すなわち、デュシェンヌ型筋ジストロフィーにおいて)、ユートロフィンはまた、筋鞘の細胞質面上にも配置される。トランスジェニック体でユートロフィンを過剰発現させると、ジストロフィン欠損mdxマウスにおけるジストロフィー性病態がレスキューされ、これにおける機能が回復される(5〜7)。成熟筋では、ユートロフィンの発現が、神経筋および筋腱間接合部に制約される。しかし、発生しつつある筋肉および再生しつつある筋肉では、ユートロフィンが、筋線維全体にわたり発現する(8〜10)。
本開示は、筋障害、神経筋障害、神経障害、およびVI型コラーゲン関連障害を含めた障害を処置するための治療法および予防法を提供する。治療法は、疾患または障害の少なくとも1つの症状を消失させるかまたは少なくとも軽減し、好ましくは疾患または障害を治癒させることを意図する。予防法には、疾患または障害の出現を防止することを意図する方法、すなわち、疾患または障害の出現に対して効力を及ぼすことを意図する方法が含まれる。
本明細書の組成物および方法は、多種多様なビグリカン関連障害に用いることができる。特に、本明細書の方法を用いて、ビグリカン療法に対する患者の応答を予測することができるが、この場合、患者は、ビグリカン療法で処置可能な任意の適切な疾患を有する。本明細書では、筋ジストロフィーおよび運動ニューロン病を含めた、このような疾患の多数の例が提示される。
対象に、薬学的有効量のビグリカンまたはビグリカン関連治療剤を、ユートロフィン治療剤などの第2の治療剤と共時投与することにより、対象おける上記の疾患または障害を処置または改善することができる。本明細書で用いられる「共時投与」とは、両方の薬剤が、処置される組織において同時に有効量で存在するように、2つの薬剤を患者に投与する治療レジメンを指す。2つの薬剤は、同時に投与する(例えば、同じ組成物による場合もあり、別個の組成物による場合もある)こともでき、別個の時点に投与する(いずれの順序による場合もある)こともでき、なおまた、異なる投与方式を介して投与することもできる。例えば、ビグリカン治療剤の投与は、第2の治療剤(例えば、ユートロフィン治療剤)の投与に、数分間〜数日間の範囲の間隔で先行する場合もあり、後続する場合もある。特定のこのような実施形態では、ビグリカン治療剤と第2の治療剤(ユートロフィン治療剤など)とを、互いから約1分間、約5分間、約10分間、約30分間、約60分間、約2時間、約4時間、約6時間、8時間、約10時間、約12時間、約18時間、約24時間、約36時間、もしくは約48時間、またはこれを超える時間以内に投与することができる。ビグリカンは、投与2週間後のマウス筋組織においても検出しうるため(実施例3を参照されたい)、一部の実施形態では、ビグリカンを、第2の治療剤の少なくとも2週間前に投与し、第2の治療剤を投与するときもなお有効レベルで存在させることができる。一部の実施形態では、ビグリカン治療剤の投与と第2の治療剤の投与とを、互いから約1分間、約5分間、約30分間、なおまたは約60分間以内に行う。
実施例8は、rhBRNがマウスに及ぼす毒性が低いことを示す。また、実施例8のアッセイを用いて、他のビグリカン治療剤の毒性を決定することもできる。ビグリカン治療剤の毒性および治療的有効性は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学手順、例えば、LD50(モデル生物集団のうちの50%に対して致死的な用量)およびED50(集団のうちの50%において治療的に有効な用量)を決定するための手順により判定することができる。毒性作用と治療効果との用量比が治療指数であり、これは、比LD50/ED50として表すことができる。大きな治療指数を呈示する化合物が好ましい。毒性の副作用を呈示する化合物も用いうるが、非感染細胞への潜在的な損傷を最小化し、これにより、副作用を軽減するためには、罹患組織部位をこのような化合物の標的とする送達系をデザインするように注意を払うべきである。
本開示に従い用いられる医薬組成物は、生理学的に許容される1または複数の担体または賦形剤を用いる従来の方式で調合することができる。したがって、治療剤およびそれらの生理学的に許容される塩および溶媒和物を、例えば、注射、吸入、もしくは送気を介する(口腔または鼻腔を介する)投与、または、経口投与、口腔内投与、非経口投与、もしくは直腸内投与のために調合することができる。
ビグリカン治療剤はまた、ユートロフィン(eutrophin)ポリペプチドなど、第2の治療剤と組み合わせた、細胞または組織培養物(例えば、成長しつつある器官系)に対する栄養補助物質としても用いることができる。任意の細胞型がこれらの栄養補助物質から利益を得る可能性がある。培養物へと添加される化合物の量は、小スケールの実験において、例えば、細胞または器官を、量を増大させる特定のビグリカンと共にインキュベートすることにより決定することができる。好ましい細胞には、真核細胞、例えば、筋細胞または神経細胞が含まれる。
特定の実施形態では、ビグリカンを第2の治療剤と組み合わせる。一部の実施形態では、第2の治療剤がユートロフィンポリペプチドである。一部の実施形態では、治療剤が、抗炎症薬、筋肉量を増大させる薬剤、ユートロフィンのmRNAレベルを増大させる薬剤、ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる薬剤、nNOS系の活性を増大させる薬剤、筋細胞膜の修復を促進する薬剤、筋再生を増大させる薬剤、線維化を低下させる薬剤、およびジストロフィンにおけるエクソンスキッピングを促進するアンチセンス剤である。
生後14日目(P14)、ユートロフィンは、シナプス周囲の筋鞘において高度に発現する(図1A)(9)。ビグリカンの存在下および非存在下におけるユートロフィンの発現レベルを比較するために、本発明者らは、bgn−/oマウスおよび年齢を適合させたコンジェニック対照に由来する筋切片を免疫染色した。全ての場合において、変異体の切片およびWT切片を、同じスライドガラスガラス上にマウントし、併せて染色し、同時に画像化した(「材料および方法」)。図1Aは、bgn−/o筋内のシナプス周囲の筋鞘では、ユートロフィンの発現が低下するのに対し、筋鞘におけるジストロフィンの発現は変化しなかったことを示す。各遺伝子型に由来する3匹ずつの動物の各々に由来する50の筋鞘節を定量化したところ、ユートロフィンレベルが約28%低下することが示された(図1B;bgn−/o:0.72±0.03、WT:1.0±0.04、対応のないスチューデントのt検定、P<0.0001)。これに対して、筋鞘におけるジストロフィンの発現には有意差が見られなかった(図1C;bgn−/o:1.01±0.03、WT:1.00±0.03、対応のないスチューデントのt検定、P=0.76)。とりわけ、ユートロフィン転写物の量は、P14におけるbgn−/o筋と比較したWTにおいて識別不能であった(以下の本文および図1D)。これらの結果は、筋鞘におけるユートロフィンタンパク質の発現が、ビグリカンの非存在下では選択的に低下することを示す。
次に、本発明者らは、ユートロフィンの筋鞘との会合の制御におけるビグリカンの役割についてより正確に詳述するために、細胞培養系に目を転じた。本発明者らは、1nMのrhBGNでbgn−/o筋管を刺激し、ウェスタンブロット法を介して膜画分中のユートロフィンレベルおよびγ−サルコグリカンレベルを評価した。図2Aに示される通り、rhBGNによる処置は、これらの膜画分中のユートロフィンタンパク質およびγ−サルコグリカンタンパク質を上方制御する。他方、rhBGNによる処置の後、ユートロフィン転写物のレベルは低減された(非処置:1±0.10;rhBGNによる処置:0.7±0.06;対応のないスチューデントのt検定、P=0.02;各々において3連ずつのフラスコによるn=6の別個の実験)。したがって、膜におけるユートロフィンタンパク質の発現の上方制御は、その転写物レベルの上昇とは関連しない。
ユートロフィンの膜への動員におけるビグリカンの役割は、内因性のビグリカンおよび筋内送達されたrhBGNのいずれも、in vivoにおいてDAPCタンパク質を制御しうる(15)ことを示す前出の結果と併せてまとめると、rhBGNがDMDの治療剤でありうることを示唆する。この実験は、rhBGNが全身送達されうることを示す。捕捉ELISAは、rhBGNが、腹腔内送達の30および60分後における循環中で容易に検出されることを示した(図7A)。内因性のビグリカンを発現する組織において組換えタンパク質を検出するために(13)、本発明者らは、動物にAlexa−555へとコンジュゲートしたrhBGNを腹腔内注射した。図7Bに示される通り、注射の48時間後、このrhBGNは、筋細胞外マトリックスにおいて容易に検出される。これらの観察は、循環する組換えタンパク質が筋へと分配され、そこで、ECMと安定的に会合することを示す。この結果は、bgn−/oマウスにおける単回筋内注射後少なくとも2週間にわたり、筋内送達されたrhBGNが筋内で安定であるという本発明者らのかつての知見(15)と合致する。この知見はまた、mdxマウスにおける単回注射の2週間後に観察されるrhBGNの有効性とも符合する(以下で論じる)。まとめると、これらの知見は、rhBGNは全身送達することが可能であり、長期間にわたり筋肉に局在化しうることを示す。
次に、本発明者らは、rhBGNがmdxマウスにおいてユートロフィンを上方制御しうるかどうかを問うた。rhBGNの単回腹腔内投与を約P18のmdxマウスへと送達し、2週間後に筋鞘におけるユートロフィンレベルを評価した。再生しつつある筋肉線維ではユートロフィンの発現が一過性に増大し(16)、シナプス領域およびシナプス周囲領域で濃縮されることが知られている(8、17)ため、本発明者らは、本発明者らの解析を、再生していない(末梢有核)筋線維のシナプス外域へと制約した。図3AおよびBに示される通り、rhBGNによる処置は、mdxマウスの大腿四頭筋の筋鞘におけるユートロフィンの発現を、>2.5倍に増大させた(媒体による処置:1.0±0.05、rhBGNによる処置:2.5±0.08、対応のないスチューデントのt検定、P<0.0001、各群から2匹ずつの動物に由来する筋鞘節のn=200)。
rhBGNがmdxマウスにおけるジストロフィー性病態に対抗するかどうかを決定するために、本発明者らはまず、約P18のmdxマウスにrhBGNまたは媒体単独の単回腹腔内投与を行い、2または3週間後に筋肉を組織学的に評価した。図5A(上パネル)は、媒体を注射したマウスに由来する横隔膜の切片が、高比率の中心核線維(CNF)ならびに壊死/再生巣および単核細胞浸潤領域を含めた特徴的なジストロフィー性病態を提示することを示す(18)。驚くべきことに、rhBGNによる処置の結果、rhBGNで処置したマウスに由来する筋肉において観察されるCNF比率が、約50%低減された(媒体を注射した動物およびrhBGNを注射した動物のそれぞれについて17.7%±2.8および9.6%±1.7;対応のないスチューデントのt検定、P=0.028、媒体を注射した動物のn=13およびrhBGNを注射した動物のn=11;図5B)。本発明者らはまた、1、2、または10mg/kgのrhBGNを施されたマウスにおいて、筋損傷のマーカーである血清クレアチンキナーゼ(CK)レベルも評価した。他の研究者らにより報告されている通り(18)、ベースラインのCKレベルには実験間でかなりのばらつきが認められた。本発明者らは、これらの動物において、CKレベルの低下への傾向を観察したが、データは統計学的有意性に到達しなかった(図9)。まとめると、これらの知見は、rhBGNによる処置が、mdxマウスにおけるジストロフィー性病態を軽減することを示す。
本発明者らは次に、rhBGNがmdxマウスにおけるジストロフィー性病態に対抗する能力が、ユートロフィンに依存するかどうかを問うた。ユートロフィンがmdxマウスにおけるrhBGNの作用に必要であるならば、ユートロフィンおよびジストロフィンの両方についてのマウス変異体の病態は、rhBGNの投与により影響されないであろう。図10は、rhBGNまたは媒体を単回注射した後のmdx:utrn−/−マウスにおいて再生した筋線維の組織学的特徴および数が、識別不能であったことを示す。したがって、少なくとも一部のユートロフィンは、rhBGNの高度な治療的有効性に必要である。
DMDの有効な処置は、筋機能を向上させる。DMDにおける筋線維病態、機能不全、および死亡の主要な原因のうちの1つは、収縮誘導性損傷に対する感受性の増大である。このような筋損傷は、ex vivoにおいて、複数回の逐次的な遠心性(伸展)収縮(ECC)の各回の後にもたらされる力を測定することにより評価することができる(19、20)。これらのex vivoのmdx筋では、損傷に対する感受性が、一連のECC後における力の低下の増大により証拠立てられる。本発明者らは、mdxマウスに、15週齢まで3週間間隔(P14に始まる)でrhBGNまたは媒体を注射し、既に記載される通りに筋肉生理を測定した(21、22)。各回の連続ECCの後における力の低下量の低減により示される通り、rhBGNによる処置により、筋機能の測定値についての成績が改善された(図6CおよびD)。この改善は頑健であり、2回目のECC以降統計学的に有意であった(図6C)。本発明者らは、発生した比力(specific force)の量を含め、筋機能の他のパラメータの変化は観察しなかった(表1)。このような生理学的改善のプロファイル(比力の変化を伴わない損傷に対する抵抗性の増大)は、AAVによるマイクロジストロフィン(R4〜R23)の送達(23)またはヘレグリンによる処置(24)で観察されるプロファイルと類似する。したがって、rhBGNによる処置は、mdxマウスにおける筋機能を向上させる。
本発明者らは、処置の3カ月後でもなお、mdxマウスにおけるrhBGN投与の有害な効果を観察していない。器官重量は、長年および広範にわたり受容されている薬理学的毒性の尺度である(25、26)。図11Aに示される通り、肝臓、腎臓、肺、または脾臓の重量に有意差は認められなかった。心臓の重量は8%減少した。動物の全体重は、媒体を投与した動物とrhBGNを投与した動物とで同等であった。また、筋重量も、rhBGNで処置した動物において17%大きいヒラメ筋を例外として変化しなかった。さらに、腎機能不全または肝機能不全の徴候も観察されなかった:1〜10mg/kgの範囲の単回投与時には、血清クレアチニン、血中尿素窒素(BUN)、アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)、またはビリルビンのレベルの有意な変化は認められなかった(図11B)。
ビグリカン
既に記載される通りに、非グリカン化組換えヒトビグリカン(rhBGN)を、哺乳動物細胞において生成させ、精製した(15)。この形態は、GAG側鎖を欠く。Alexa555タンパク質標識キット(Invitrogen Corporation)を用いて、この蛍光剤をrhBGNへとコンジュゲートした。
全てのプロトコールは、Brown Universityの Institutional Animal Care and Use Committeeによる同意および承認の下で実行した。単回注射では、P16〜19のマウスに20mMのトリス25μL、0.5MのNaCl、0.2%のCHAPS中に100μgのrhBGN、または媒体(20mMのトリス、0.5MのNaCl、0.2%のCHAPS)の腹腔内注射を施した。複数回注射されるマウスには、100μgのrhBGNまたは媒体のさらなる腹腔内注射を3週間間隔で施した。最終回の注射の13〜25日後にマウスを捕獲した。追跡研究のため、成体mdxマウスにAlexa555で標識したrhBGNの腹腔内注射を施し、48時間後に横隔膜を摘出した。
既に記載される通りに(15)凍結切片を調製および染色した。bgn−/o解析では、P14コンジェニックのbgn−/o切片およびWT切片を同じスライドガラスにマウントし、同時に免疫染色し、同じセッションで同一の曝露を用いて、冷却したCCDカメラにより画像化した。注射されたマウス(媒体およびrhBGN)に由来する比較のための全ての切片もまた、併せてマウントし、染色し、画像化した。切片は、Nikon(Melville、NY)Eclipse E800顕微鏡およびScanalytics IP LabスペクトルソフトウェアまたはNIS Elements(Nikon)により収集される画像を用いて観察した。ユートロフィンおよびジストロフィンの免疫反応の強度は、Metamorph画像解析ソフトウェア(Universal Imaging)またはImageJソフトウェア(National Institutes of Health)を用いて定量化した。本発明者らはまた、間質腔における構造であって、一部の実験においてユートロフィンの増大を示す血管でありうる構造も観察した(図3)。これらの構造は、本発明者らの測定値には組み入れなかった。筋鞘節の平均(average)ピクセル強度を測定し、これらから平均(mean)のバックグラウンド(各状態に由来する筋鞘以外の領域を測定することにより決定する)を減じた。平均(average)バックグラウンドレベルは、状態間で識別不能であった。mdxマウスにおける解析は、各状態2匹ずつのマウスに由来する大腿四頭筋および各状態3匹ずつのマウスに由来するTAにおいて実施した。CNFの百分率を記録するため、H&E染色した切片内の壊死/再生巣を別として、全ての断面化された筋線維を、20倍の対物レンズ下でカウントした(筋切片1個当たり270〜1,913本の線維)。
ユートロフィン転写物のレベルは、SYBR−Green(Invitrogen)を用いて測定した。培養法、溶解物の調製、および膜画分、ならびにウェスタンブロットによる解析は、以下で詳述される標準的な手順を介する。
前述の通り、mdxマウスに、rhBGN(動物1匹当たり25μgずつ)または媒体を、P14に始めて3週間ごとに腹腔内注射し、3.5カ月齢のとき、ex vivoにおいてEDL筋の生理学的特性を解析した(21、22)。筋長は、最大の単収縮応答を達成するように調整し、この長さ(Lo)を測定した。最大上刺激を700ミリ秒とし、総伸展を10回の平均Loとし、伸展速度を0.5Lo/秒とする標準的なECCプロトコールによる各強縮について、遠心性収縮力の減少を計算した。上記の通りにEDL切片を得、画像を収集した。断面積は、ImageJソフトウェア(National Institutes of Health)を用いて測定した。
細胞膜調製物のために、ビグリカンヌル筋管をPBS中で洗浄し、組織培養フラスコから掻爬し、解剖緩衝液(0.3Mのスクロース、pH7.4の35mMトリス、10mMのEDTA、10mMのEGTA、およびプロテアーゼ阻害剤混合物;Roche Applied Science)中でホモジナイズした。試料を、4℃、7,000×gで5分間にわたり遠心分離した。次いで、上清を、4℃、38,000×gで60分間にわたり遠心分離することにより、膜を回収した。タンパク質濃度は、ビシンコニン酸タンパク質濃度アッセイ(Pierce)により決定した。ビグリカンヌル筋管から全タンパク質を抽出するために、細胞をPBS中で洗浄し、RIPA溶解緩衝液(Santa Cruz Biotechnology)中で25分間にわたり可溶化し、溶解物を10,000×gで遠心分離し、上清を回収した。大腿四頭筋および大腿二頭筋に由来する膜画分は、既に記載される通りに(Mercado MLら(2006年)、「Biglycan regulates the expression and sarcolemmal localization of dystrobrevin, syntrophin, and nNOS」、FASEB J)調製した。
注射されたmdx動物に由来するビグリカンヌル筋不死化細胞系および大腿四頭筋からのRNAの抽出は、TRIzol法(Invitrogen)を用いて実施した。SuperScript III First−Strand Synthesis System Kit(Invitrogen)を用いて、精製されたRNAを、cDNAへと転換した。qPCR反応は、ABI PRISM 7300リアルタイムサーモサイクラーにおいてSYBR−Green法(Invitrogen)を用いて実施した。プライマーは、DS Geneプライマーデザインソフトウェア(Accelrys)を用いてデザインした。正規化のためにATPシンターゼを用いた。データ解析は、検量線法(Biggar WDら(2004年)、「Deflazacort in Duchenne muscular dystrophy: A comparison of two different protocols」、Neuromuscul Disord、14巻:476〜482頁)を用いて実施した。
C3Hバックグラウンドにおけるコンジェニックのビグリカンヌルマウスを、前述の通り(Mercadoら、2006年)に発生させ、Jackson Laboratory製のWT C3Hと比較した。C57BL/10ScSn−mdx/Jマウスは、Jackson Laboratoryから購入し、mdx:utrn−/−マウスは、記載されている(Mann CJら(2001年)、「Antisense−induced exon skipping and synthesis of dystrophin in the mdx mouse」、Proc Natl Acad Sci USA、98巻:42〜47頁)通りに飼育した。
以下の一次抗体を用いた:抗ユートロフィンモノクローナル抗体(Vector Labs)、ウサギ抗ユートロフィン抗体(S.Froehner、University of Washington、Seattle,WAにより恵与される)、Q:2ウサギ抗ジストロフィン抗体(Abcam)、抗γ−サルコグリカンモノクローナル抗体(Vector)、ウサギ抗ラミニン抗体(Sigma)、ウサギ抗β2−シントロフィン抗体(van Deutekom JCら(2007年)、「Local dystrophin restoration with antisense oligonucleotide PRO051」、N Engl J Med、357巻:2677〜2686頁)、およびウサギ抗nNOS抗体(Invitrogen)。抗ビグリカンモノクローナル抗体(2A5)(Mercadoら、2006年)、およびウサギ抗ビグリカン抗体(Bowe MA、Mendis DB、Fallon JR(2000年)、「The small leucine−rich repeat proteoglycan biglycan binds to alpha−dystroglycan and is upregulated in dystrophic muscle」、J Cell Biol、148巻:801〜810頁)の特異性は、ウェスタンブロット(Mercadoら、2006年、Boweら、2000年、Rafii MSら(2006年)、「Biglycan binds to alpha− and gamma−sarcoglycan and regulates their expression during development」、J Cell Physiol、209巻:439〜447頁)、およびELISA(実施例3)により確立し、これらの試薬をビグリカンヌル試料において調べたところ、反応性は観察されなかった。以下の二次抗体を用いた: Alexa488ヤギ抗マウスIgGおよびAlexa555ヤギ抗ウサギIgG(Invitrogen)、HRPヤギ抗マウスIgG、およびHRPヤギ抗ウサギIgG。
不死化ビグリカンヌル細胞は、既に記載されている通りに(Mercadoら、2006年)成長させた。細胞を4〜5日間にわたり分化させ、次いで、分化培地中に1nMのrhBGNで8時間にわたり処置した。
心穿刺によりrhBGNを注射したマウスおよび媒体を注射したマウスから血液を回収し、3,300RPMで10分間にわたりスピンして血清を分離した。血清クレアチンキナーゼ、BUN、クレアチニン、AST、および総ビリルビンの解析は、University of California−Davis Comparative Pathology Laboratoryにより実施された。
成体C57/B6マウスに、10mg/kgのrhBGNを腹腔内注射し、注射の30分間、1時間、および24時間後に心穿刺により血液を回収した(条件1つ当たりのマウスのn=3〜4)。対照実験は、同等なレベルのrhBGNが血漿中に存在する(注射の1時間後に0.12μg/mL;n=2)ことを示した。結合部位が2つのELISAでは、プレートをマウス抗ビグリカン抗体でコーティングし、ブロッキングし、血清試料または基準物質ビグリカン希釈液と共にインキュベートした後、ウサギ抗ビグリカン抗体およびヤギ抗ウサギHRP抗体と共にインキュベートした。アッセイの感度は、約5ng/mLであった。
ビグリカンは、プロテオグリカン(PG)形態および非グリカン化(NG)形態のいずれとしても発現する細胞外マトリックスタンパク質である。ビグリカン(biglyvan)のプロテオグリカン形態は、セリン5またはセリン10(番号付けは、成熟ポリペプチドの配列に基づく)において付加されうる1つまたは2つのグリコサミングリカン側鎖を含有する。
野生型VI型コラーゲンを伴うビグリカンヌルマウスでは、VI型コラーゲンレベルが低減される。組換えビグリカンがin vivoのこの系におけるVI型コラーゲンレベルを回復させる有効性を調べるため、レスキュー法を用いた。組換えビグリカンをビグリカンヌルマウスの筋内へと注射し、VI型コラーゲンの発現を評価した。精製された組換え非グリカン化ビグリカンまたはプロテオグリカンを、5週齢のビグリカンヌル動物(合計6匹の動物)の右側大腿四頭筋へと注射した。動物内比較を可能とするため、媒体単独を左側大腿四頭筋へと注射した。各例では、溶液中に1.0%の墨汁を包含させることにより、注射部位を画像化した。図22aは、注射された組換えビグリカンであるプロテオグリカンが、筋周膜および筋外膜の注射部位に適切に局在化することを示す。
タグ付けされていないS5A−S10A rhBGNを、以下のスキームにより精製した。第1に、変異体のビグリカンの凍結アリコートを、4℃で融解させた。完全に融解させたら、これらの試料を遠心分離して、任意の粒子状物質を除去した。次いで、0.45μmのシリンジフィルターを用いて上清を濾過した。次いで、濾過された試料を、脱イオン化水で1:3に希釈した。
タグ付けされていないT2ビグリカンのマウス形態およびヒト形態を生成させて調べた。図27に示される通り、T2ビグリカンによる処置は、全身注射された(合計2週間にわたり毎週1回)mdxマウスにおけるsCKレベルおよび中心核レベルの有意な低減を結果としてもたらした。2、5、および10mg/kgの用量で、sCKレベルの有意な低減(P<0.05;1群当たりの動物のn=5〜7;ダネットの事後多重比較検定による1元配置ANOVA解析)が認められた。10mg/kgで、sCKレベルは4.5分の1に低減された。処置された動物ではまた、中心核の百分率も低減された。10mg/kgの用量で、横隔膜CNの百分率は、54%低減された(p=0.04;スチューデントのt検定;1群当たりの動物のn=5〜7)。また、2および5mg/kgの用量で、有効性への傾向(p≒0.06)も観察された。
T2ビグリカンは、ECCにより判定される筋機能を向上させた。図29で示す通り、2mg/kgのT2−rMuBGNによりmdxマウスを処置した(12週間にわたり毎週1回)結果、遠心性収縮による損傷に対する抵抗性が、媒体を注射した対照と比較して63%向上した(p=0.007;1群当たりの動物のn=3〜4)。
タグ付けされていないT2ビグリカンの用量範囲を、細胞培養物によるバイオアッセイによりアッセイした。図30で示す通り、T2ビグリカンは、アグリンに誘導されるAChRのクラスター化活性を、濃度範囲:0.008〜0.256μg/ml(約0.2〜7nM)で30倍超強化する。0.512μg/ml(14nM)の高用量では、反応が、ほぼベースラインに戻る。本発明者らは、タグ付けされたrHuBGN、タグ付けされたT2 rHuBGNおよびタグ付けされていないT2 rHuBGN、ならびにT2 rMuBGNを含め、本発明者らが調べたGAG側鎖を欠く全ての組換えビグリカンによる類似する用量反応プロファイルを観察した。
当業者は、単に日常的な実験を用いて、本明細書で記載される本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識するか、または確認しうるであろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲に包摂されることを意図する。
Claims (50)
- 膜会合ユートロフィンのレベルを患者におけるビグリカン関連状態の処置におけるビグリカン療法の効果をモニタリングするための指標とする方法であって、ビグリカンポリペプチドを受容している患者から得られたサンプルにおける膜会合ユートロフィンの量を測定するステップを含み、前記ビグリカンポリペプチドは、配列番号9のアミノ酸38〜365に対応する配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、前記アミノ酸配列は、配列番号9の残基42および47に対応する位置のそれぞれにセリン以外のアミノ酸を含み、ここで、膜会合ユートロフィンの増大したレベルは、前記ビグリカン療法が有効であることを示し、そしてさらに、前記患者は、ユートロフィンを欠損していると決定されている、方法。
- 前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号9のアミノ酸38〜365に対応する配列と少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号9のアミノ酸38〜365に対応するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号10のアミノ酸38〜365に対応する配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号10のアミノ酸38〜365に対応するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号11のアミノ酸38〜365に対応する配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号11のアミノ酸38〜365に対応するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- ビグリカン関連状態を有する患者を処置するためのビグリカンポリペプチドを含む組成物であって、前記患者は、ユートロフィンを欠損していると決定されており、そして、前記ビグリカンポリペプチドは、配列番号9のアミノ酸38〜365に対応する配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、前記アミノ酸配列は、配列番号9の残基42および47に対応する位置のそれぞれにセリン以外のアミノ酸を含み、ここで、
(i)第1の用量の前記組成物が前記患者に投与され、その後、前記患者から得られたサンプルにおける膜会合ユートロフィンの量が測定され、そして、
(ii)第2の用量の前記組成物が前記患者に投与され、前記第2の用量における前記組成物の量は、前記サンプルにおける膜会合ユートロフィンの前記量に基づいて、前記第1の用量に対して不変であるか、増加されるか、または、減少される、
ことを特徴とする、組成物。 - 前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号9のアミノ酸38〜365に対応する配列と少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の組成物。
- 前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号11のアミノ酸38〜365に対応するアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の組成物。
- 前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号10のアミノ酸38〜365に対応する配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の組成物。
- 前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号10のアミノ酸38〜365に対応するアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の組成物。
- 前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号11のアミノ酸38〜365に対応する配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の組成物。
- ビグリカンポリペプチドおよびユートロフィンポリペプチドを含む治療用組成物であって、前記ビグリカンポリペプチドは、配列番号9のアミノ酸38〜365に対応する配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、前記アミノ酸配列は、配列番号9の残基42および47に対応する位置のそれぞれにセリン以外のアミノ酸を含む、組成物。
- 前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号11のアミノ酸38〜365に対応する配列と少なくとも95%同一である、請求項14に記載の組成物。
- 前記ユートロフィンポリペプチドが、配列番号13と少なくとも90%同一である、請求項14または15に記載の組成物。
- ビグリカンポリペプチド、ならびに抗炎症薬、筋肉量を増大させる薬剤、ユートロフィンのmRNAレベルを増大させる薬剤、ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる薬剤、nNOS系の活性を増大させる薬剤、筋細胞膜の修復を促進する薬剤、筋再生を増大させる薬剤、線維化を低下させる薬剤、およびジストロフィンにおけるエクソンスキッピングを促進するアンチセンス剤のうちの1または複数を含む治療用組成物であって、前記ビグリカンポリペプチドは、配列番号9のアミノ酸38〜365に対応する配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、前記アミノ酸配列は、配列番号9の残基42および47に対応する位置のそれぞれにセリン以外のアミノ酸を含む、組成物。
- 前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号11のアミノ酸38〜365に対応するアミノ酸配列を含む、請求項17に記載の組成物。
- 前記抗炎症薬が、ロフェコキシブまたはセレコキシブである、請求項17に記載の治療用組成物。
- 筋肉量を増大させる前記薬剤が、ACE−031、AMG−745、またはMYO−029である、請求項17に記載の治療用組成物。
- ユートロフィンのmRNAレベルを増大させる前記薬剤が、BMN−195である、請求項17に記載の治療用組成物。
- ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる前記薬剤が、SMT C1100である、請求項17に記載の治療用組成物。
- nNOS系の活性を増大させる前記薬剤が、タダラフィル、バルデナフィル、またはシルデナフィルシトレートである、請求項17に記載の治療用組成物。
- 筋細胞膜の修復を促進する前記薬剤が、ジスフェリン、MG53、またはCav3である、請求項17に記載の治療用組成物。
- 筋再生を増大させる前記薬剤が、ACE−031またはAMG−745である、請求項17に記載の治療用組成物。
- 線維化を低下させる前記薬剤が、線維化促進因子アンタゴニストまたは抗線維化薬である、請求項17に記載の治療用組成物。
- エクソンスキッピングを促進する前記薬剤が、AVI−4658、PRO51、またはPRO44である、請求項17に記載の治療用組成物。
- ユートロフィンを欠損している患者においてビグリカン関連状態を処置するための、ビグリカンポリペプチドおよびユートロフィンポリペプチドの組み合わせ物であって、前記ビグリカンポリペプチドは、配列番号9のアミノ酸38〜365に対応する配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、前記アミノ酸配列は、配列番号9の残基42および47に対応する位置のそれぞれにセリン以外のアミノ酸を含む、組み合わせ物。
- 前記ビグリカンポリペプチドおよび前記ユートロフィンポリペプチドが、異なる投与様式で投与される、請求項28に記載の組み合わせ物。
- 前記ビグリカンポリペプチドおよび前記ユートロフィンポリペプチドが、別々の時間に投与される、請求項28に記載の組み合わせ物。
- 前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号11のアミノ酸38〜365に対応するアミノ酸配列を含む、請求項28に記載の組み合わせ物。
- 前記ユートロフィンポリペプチドが、配列番号13と少なくとも90%同一である、請求項28に記載の組み合わせ物。
- ユートロフィンを欠損している患者においてビグリカン関連状態を処置するための組み合わせ物であって、
(i)ビグリカンポリペプチドであって、配列番号9のアミノ酸38〜365に対応する配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、前記アミノ酸配列は、配列番号9の残基42および47に対応する位置のそれぞれにセリン以外のアミノ酸を含むビグリカンポリペプチド、ならびに
(ii)抗炎症薬、筋肉量を増大させる薬剤、ユートロフィンのmRNAレベルを増大させる薬剤、ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる薬剤、nNOS系の活性を増大させる薬剤、筋細胞膜の修復を促進する薬剤、筋再生を増大させる薬剤、線維化を低下させる薬剤、およびジストロフィンにおけるエクソンスキッピングを促進するアンチセンス剤のうちの1または複数
を含む、組み合わせ物。 - 前記抗炎症薬が、ロフェコキシブまたはセレコキシブである、請求項33に記載の組み合わせ物。
- 筋肉量を増大させる前記薬剤が、ACE−031、AMG−745、またはMYO−029である、請求項33に記載の組み合わせ物。
- ユートロフィンのmRNAレベルを増大させる前記薬剤が、BMN−195である、請求項33に記載の組み合わせ物。
- ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる前記薬剤が、SMT C1100である、請求項33に記載の組み合わせ物。
- nNOS系の活性を増大させる前記薬剤が、タダラフィル、バルデナフィル、またはシルデナフィルシトレートである、請求項33に記載の組み合わせ物。
- 筋細胞膜の修復を促進する前記薬剤が、ジスフェリン、MG53、またはCav3である、請求項33に記載の組み合わせ物。
- 筋再生を増大させる前記薬剤が、ACE−031またはAMG−745である、請求項33に記載の組み合わせ物。
- 線維化を低下させる前記薬剤が、線維化促進因子アンタゴニストまたは抗線維化薬である、請求項33に記載の組み合わせ物。
- エクソンスキッピングを促進する前記薬剤が、AVI−4658、PRO51、またはPRO44である、請求項33に記載の組み合わせ物。
- ビグリカン関連状態を有する患者を処置するための、ビグリカンポリペプチドを含む組成物であって、前記患者は、ユートロフィンを欠損していると決定されており、前記ビグリカンポリペプチドは、配列番号9のアミノ酸38〜365に対応する配列と少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、前記アミノ酸配列は、配列番号9の残基42および47に対応する位置のそれぞれにセリン以外のアミノ酸を含み、ここで、0.1mg/kg〜100mg/kgの前記ビグリカンポリペプチドが、ビグリカン関連状態の処置を必要とする患者に1〜4週間ごとに投与されることを特徴とする、組成物。
- 前記ビグリカン関連状態が、筋ジストロフィー、神経筋疾患、神経疾患、または神経筋接合部またはシナプスの異常を特徴とする状態である、請求項1に記載の方法。
- 前記ビグリカン関連状態が、筋ジストロフィー、神経筋疾患、神経疾患、または神経筋接合部またはシナプスの異常を特徴とする状態である、請求項8または43に記載の組成物。
- 前記ビグリカン関連状態が、筋ジストロフィー、神経筋疾患、神経疾患、または神経筋接合部またはシナプスの異常を特徴とする状態である、請求項28または33に記載の組み合わせ物。
- 前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または筋強直性ジストロフィーである、請求項44に記載の方法。
- 前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または筋強直性ジストロフィーである、請求項45に記載の組成物。
- 前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または筋強直性ジストロフィーである、請求項46に記載の組み合わせ物。
- 0.1〜1.5mg/kgの前記ビグリカンポリペプチドが、ビグリカン関連状態の処置を必要とする患者に1〜4週間ごとに投与される、請求項43に記載の組成物。
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