JPH07500820A - ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの細胞への標的を定めた送達 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの細胞への標的を定めた送達 免豆立１１ アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内における望ましくない遺伝子の発現 を特異的に阻止する手段として大いに有望である。オリゴヌクレオチドの細胞へ の送達の改良は効率を増大するであろう、裸のアンチセンスオリゴヌクレオチド は、非特異的に且つ低効率で細胞に取り込まれ得る。幾つかの方法が取り込みを 増大するために探究された。Ｌｅｍａｉｔｒｅ等は、オリゴヌクレオチドをポリ リジンに共有結合させて、ポリリジンとアンチセンスＤＮＡとの混合物に比較し て、ＤＮＡ４度よりより数倍低（ウィルス遺伝子の発現を阻止することを示した （　Ｌｅｍａｉｔｒｅ、　Ｍ、等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅ ｔ、υＳ＾８４：６４８−６５２　）　、特異的な抗ウイルス効果は示されたが 、特異的送達は示されなかった。

免豆立ｌ尤 この発明は、可溶性の、遺伝子の発現を阻止するために特定の細胞を標的として ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを送達するための、標的を定めること の出来る分子複合体に関する。この分子複合体は、遺伝子のＲＮＡ転写物にハイ ブリダイズする一本鎖のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを、細胞特異 的結合剤とポリ又はオリゴヌクレオチド結合剤との結合体であるキャリアーと複 合体化して含む。この複合体は、製薬上許容し得る溶液にて、ハイブリダイズし てＲＮＡ転写物の機能を阻止するのに十分な量で投与される。

このポリ又はオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。アンチセ ンス応用のために、ハイブリダイズしてＲＮＡの機能を阻止するアンチセンスオ リゴデオキシヌクレオチドを用いることが出来る。標的ＲＮＡは、典型的には、 メツセンジャーＲＮＡである。このオリゴヌクレオチドは又、触媒活性を有する ＲＮＡ　（リボザイム）であってもよい。アンチセンス又はリボザイム媒介によ る阻止の標的は、細胞起源の遺伝子（例えば、細胞性癌遺伝子）又は非細胞性起 源の遺伝子（例えば、ウィルス性癌遺伝子又はウィルス等の感染性病原体の遺伝 子）であってよい。

細胞特異的結合剤は、細胞表面Ｉ＃１ｍ、典型的には、エンドサイト−シスによ る結合したリガンドの内在化を媒介するレセプター（例えば、肝細胞のアシアロ 糖蛋白質レセプター）に特異的である。細胞特異的結合剤は、天然の又は合成の リガンドであり（例えば、蛋白質、ポリペプチド、糖蛋白質、炭水化物等）又は 、それは、細胞表面構造に特異的に結合する（該構造は、次いで、結合した複合 体の内在化を媒介するン抗体若しくはそのアナログであってよい。この結合体の ポリ又はオリゴヌクレオチド結合成分は、細胞外条件下において一本鎖のポリ又 はオリゴヌクレオチドと安定に複合体を形成し及び細胞内で機能し得るように細 胞内条件下でそれを放出するポリカチオン等の化合物である。

この遺伝子及びキャリアーの複合体を、イン・ビトロ又はイン・ビボで用いて、 ポリ又はオリゴヌクレオチドを標的細胞に選択的に送達することが出来る。この 複合体は、生理的液体中において安定且つ可溶性である。それは、表面構造媒介 エンドサイト−シス経路により標的細胞に選択的に取り込まれる場合に、イン・ ビボ投与することが出来る。取り込まれたポリ又はオリゴヌクレオチドは、その 相補性ＲＮＡとハイブリダイズし、それにより、ＲＮＡの機能及び標的遺伝子の 発現を阻止する。

・・　の　な古註 図１は、複合体化アンチセンスＤＮＡのＨｅｐＧ２及び５ＫＨｅｐｌ細胞による 取り込みを示す。

図２は、複合体化アンチセンスＤＮＡの、培地中のＢ型肝炎ウィルス表面抗原濃 度に対する効果を示す。

図３は、アンチセンスＤＮＡに２４時間さらした後の培地及び細胞から抽出した ＤＮＡのサザーンプロットを示す・ ８の　な目８ 可溶性の、標的を定め得る分子複合体を用いて、−水鑵のポリ及びオリゴヌクレ オチドを標的細胞又は組織に選択的に送達してイン・ビボで遺伝子発現を特異的 に阻止することが出来る。この分子複合体は、送達すべきオリゴヌクレオチドを 、標的細胞に特異的な結合剤とＤＮＡ結合剤とで構成されるキャリアーに複合体 化して含む、この複合体は標的細胞に特異的に取り込まれ、そのオリゴヌクレオ チドはＲＮＡ転写物にハイブリダイズし、それが標的遺伝子の発現を阻止する。

このポリ又はオリゴヌクレオチドは、細胞内条件下で特異的ＲＮＡにハイブリダ イズする一本鎖分子である。

細胞内条件下での標的ＲＮＡ配列への適当な相補的ハイブリダイゼーションのた めに必要な相補性の程度は、経験的に決定することが出来る。

好適具体例において、このオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴデオキシ ヌクレオチドである。このアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、正常な オリゴデオキシヌクレオチド又は、有効濃度で標的に到達するだけ十分に安定な オリゴデオキシヌクレオチドのアナログ（例えば、リン酸の１つの酸素を硫黄原 子で置換したホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）であってよい。例えば、 ５ｔｅｉｎ、　Ｃ，Ａ、及びＣｏｈｅｎ、　Ｊ、Ｓ、（１９８８１Ｃａｎｃｅｒ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４８：２６５９−２６６８を参照されたい。アンチセンス オリゴデオキシヌクレオチドは、！目的合成手順によって製造することが出来る 。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、種々の遺伝子阻止の機構により作用するよ うにデザインすることが出来る。一般に、これらの機構は、オリゴヌクレオチド の特定のＲＮＡ配列（典型的には、メツセンジャーＲＮＡ）へのハイブリダイゼ ーションを含む。標的配列は、ＲＮＡのコード領域内に位置することが出来、又 は、それはＲＮＡのプロセッシング又は翻訳に必要なシグナル配列であってよい 。標的配列は、生物体内に普通に見出される配列であってよく、又は、病原性生 物体内に見出されるがその宿主中には見出されない配列であってよい。或は、オ リゴヌクレオチドは、三重らせんＤＮＡ構造を形成してｍＲＮＡ配列の転写を阻 止していてもよい。

他の具体例において、オリゴヌクレオチドは、触媒活性を有するＲＮＡ分子（即 ち、リボザイム）であってよい。リボザイムは、標的ＲＮＡ配列を特異的に開裂 させそれ故破壊するので、都合がよい、リボザイムは、米国特許第４，９８７， ０７１号に記載されている。

この複合体のキャリアー成分は、細胞特異的結合剤とオリゴヌクレオチド結合剤 との結合体である。細胞特異的結合剤は細胞表面構造に特異的に結合し、該構造 は、例えば、エンドサイト−シス過程により核剤の内在化を媒介する。表面構造 は、蛋白質、ポリペプチド、炭水化物、脂質又はそれらの組合せであってよい。

それは、典型的には、リガンドのエンドサイト−シスを媒介する表面レセプター である。従って、この結合剤は、レセプターに結合する天然又は合成のリガンド であってよい。リガンドは、細胞表面構造によって認識されるのに十分なだけ露 出している官能基を有する蛋白質、ポリペプチド、炭水化物、脂質又はそれらの 組合せであってよい。

それは又は、ウィルス、細胞（例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、原生動物細胞 ）等の生物学的有機体の成分又はリポソーム等の人工キャリアーであってもよい 。

この結合剤は又、細胞表面構造に結合する抗体又は抗体のアナログ（−水鑵抗体 等）であってもよい。

キャリアーを形成するのに有用なリガンドは、標的とされる特定の細胞によって 変わる。肝細胞を標的とするためには、ポリペプチドホルモン等の他のリガンド を用いることも出来るが、露出した末端カルボキシル基を有するアシアロ糖蛋白 質（ガラクトース−末端）等の糖蛋白質を用いることが出来る。アシアロ糖蛋白 質の例は、アシアロオロソムコイド、アシアロフェチュイン及び脱シアル化した 木簡性口内炎ウィルスを含む。かかるリガンドは、末端シアル酸及び末端から２ 番目のガラクトース残基を有する糖蛋白質の化学的又は酵素的脱シアル化によっ て形成することが出来る。或は、アシアロ糖蛋白質リガンドは、ガラクトース末 端を有する炭水化物、例えばラクトース又はアラビノガラククンを非ガラクトー ス含有蛋白質にラクトサミン化（ｌａｃｔｏｓａｍｉｎａｔｉｏｎ　）により結 合することによって形成することが出来る。

この分子複合体に他の細胞表面レセプターを標的とさせるためには、マクロファ ージに対するマンノース（リンパ腫）、繊維芽細胞に対するマンノース−６−リ ン酸糖蛋白質（繊維肉腫）、腸細胞に対する内性因子−ビタミンＢ１２及び脂肪 細胞に対するインシュリン等の他の型のリガンドを用いることが出来る。或は、 細胞特異的結合剤は、細胞表面のリガンド（例えば、抗原）に結合する抗体等の レセプター又はレセプター様分子であってよい。かかる抗体は、榎率的手順によ って製造することが出来る。

ポリ又はオリゴヌクレオチド結合剤は、送達されるべきオリゴヌクレオチドに複 合体化する。このオリゴヌクレオチドとの複合体形成は、標的細胞による内在化 の前に細胞外でオリゴヌクレオチドが有意に分離するのをＩｌｌ止するだけ十分 にイン・ビボで安定でなければならない。しかしながら、この複合体は、細胞内 で適当な条件下で開裂してオリゴヌクレオチドを機能的なハイブリダイズ可能な 形態で放出することが出来る。例えば、この複合体は、リソソームの酸性及び酵 素に富む環境において不安定であってよい。結合剤とオリゴヌクレオチドとの間 の静電引力に基づ（非共有結合は、細胞外安定性を与久且つ細胞内条件下で遊離 することが出来る。

好適ポリ又はオリゴヌクレオチド結合剤は、負に帯電した核酸鎖と結合するポリ カチオンである。これらの正に帯電した物質はポリ又はオリゴヌクレオチドに非 共有結合で結合して、可溶性の、細胞外で安定であるが細胞内ではポリ又はオリ ゴヌクレオチドを機能性（例えば、ハイブリダイズ可能な）分子として放出する 標的を定め得る分子複合体を形成することが出来る。適当なポリカチオンは、ポ リリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、塩基性蛋白質、例えばヒストン、 アビジン、プロタミン等である。好適ポリカチオンは、ポリリジン（例えば、３ ，８００〜６０，０００ダルトンの範囲）である、ポリ又はオリゴヌクレオチド と遊離可能に結合するために用いることの出来る他の非共有結合は、水素結合、 疎水結合、静電結合（単独で用いるか或はポリ又はオリゴヌクレオチドに結合し た抗ポリ又はオリゴヌクレオチド抗体等と組合せて用いる）、及びビオチン化ヌ クレオチドを含むポリ又はオリゴヌクレオチドに結合するストレプトアビジン又 はアビジンを含む。

キャリアーは、細胞特異的結合剤とオリゴヌクレオチド結合剤とを化学的に結合 することにより形成することが出来る。この結合は、典型的には、共有結合であ る。

好適結合はペプチド結合である。これは、Ｊｕｎｇ、　Ｇ、等。

ｆ１９８１）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ 、山：　５９９−６０６により記載されたように水溶性カルボジイミドにより形 成することが出来る。別の結合はジスルフィド結合である。

この結合反応は、キャリアーを形成するために用いる特定の細胞特異的結合剤及 びオリゴヌクレオチド結合剤に対して最適化することが出来る。反応条件は、結 合形成が最大になるが、キャリアー成分の凝集が最小になるようにデザインする ことが出来る。細胞特異的結合剤のポリ又はオリゴヌクレオチド結合剤に対する 最適比は、経験的に決定することが出来る。ポリカチオンを用いたときは、これ らの成分のモル比は、ポリカチオンの寸法及びポリ又はオリゴヌクレオチドの寸 法によって変化する。例えば、２１量体オリゴヌクレオチドと複合体化したポリ リジンに結合したアシアロオロソムコイド結合体について、その比は、２：１〜 １：２（アシアロオロソムコイド；オリゴヌクレオチドの重量比）にわたってよ い。未結合成分及び凝集物は、分子ふるい又はイオン交換クロマトグラフィーに よってキャリアーから分離することが出来る。好適具体例において、この結合体 は、高圧液体カチオン交換カラム（Ｒａｉｎｉｎ製、Ａｑｕａｐｏｒｅ　（登録 商樟）カチオン交換カラム）上で、Ｏ，１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０，２， ５，２，２５及び２．０）による段階的溶出によって精製する。

複合体を形成するために、ポリ又はオリゴヌクレオチドとキャリアーとを混合し て複合体化の助けと成る条件下でインキュベートする。例えば、ポリ又はオリゴ ヌクレオチドとキャリアーとを適当な比で２Ｍ　ＮａＣ１中で混合し、その溶液 を０．１５Ｍに希釈し及び濾過して投与可能な組成物を与えることが出来る。

この分子複合体は、ｌコピーより多い核酸鎖を含むことが出来る。ポリ又はオリ ゴヌクレオチドの量は、勿論、生成する複合体の可溶性を維持するのに必要な量 を超えてはならない。用いる構成物について、キャリアーのポリ又はオリゴヌク レオチドに対する好適重量比又はモル比は、常例的実験方法によって決定するこ とが出来る。

この発明の分子複合体は、非経口投与することが出来る。好ましくは、それを静 脈注射する。この複合体は、生理的に許容し得るビヒクル中で、溶液にて投与す る。

この発明の分子複合体は、普通は標的ＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーション の故に、広範囲のポリ及びオリゴヌクレオチドの標的を定めた送達に用いること が出来る。この標的は、三重用形成により、ＤＮＡでもよい。Ｄｕｖａｌｌ−Ｖ ａｌｅｎｔｉｎｅ等、（１９９２１ＰＮＡＳ　８９：５０４−５０８゜前者の場 合には、治療目的によって、オリゴヌクレオチドは、細胞起源の遺伝子（例えば 、細胞性癌遺伝子）の畦訳に対するものであってもよいし又は非細胞性起源の遺 伝子（例えば、ウィルス性癌遺伝子或はウィルス等の感染性病原体又はマラリア 、トリパノゾーマ、リステリア若しくはマイコプラズマ等の寄生生物の遺伝子） に対するものであってもよい。後者の場合には、アンチセンスは、標的遺伝子の 転写に対するものであってよい。

１つの具体例において、この発明の方法を用いて肝炎感染を治療することが出来 る。複合体を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを肝細胞に特異的に送達し て肝炎ウィルスの生成をブロックすることが出来る。１つの戦略は、ヒトＢ型肝 炎ウィルスは、そのコンパクトな性質の故に１つのポリアデニル化シグナル（ヌ クレオチド１９０３〜１９２３）Ｌ、か有しないという事実を利用することであ る。このシグナルは、すべてのＢ型肝炎ウィルス由来のｍＲＮＡに共通しており 、哨乳動物のシグナルとは異なっている。その結果、この領域に相補的なアンチ センスオリゴヌクレオチドは、ウィルス性蛋白質の合成をブロックすることが出 来る。好適具体例において、アンチセンス鎮は、肝細胞アシアロ糖蛋白質レセプ ターに対するリガンド及びポリリジン等のポリカチオン性蛋白質を含むキャリア ーと複合体化して、肝臓を標的とすることの出来る可溶性の分子複合体を与λる 。

起源の遺伝子の発現を変えることが出来る。この方法は、異常な生合成、特に正 常又は異常な細胞性蛋白質の過剰発現を特徴とする病気の治療に有用である。

この発明を、下記の実施例によって、更に説明する。

叉」Ｌ遡」。

材料と方法 細　び　１立 Ｇｅｏｒｇｅ　Ａｃｓ博士にニーヨーク州、Ｍｔ、　５ｉｎａｉ医学校）の好意 により提供を受けたヒト肝細胞、ＨｅｐＧ２２．２．１５及びＳＫ　Ｈｅｐｌ細 胞を、ＤＭＥＭ及び１０％ウシ胎児血清中で、前に記載されたようにして生育さ せた（Ｎｕ、　Ｇ、Ｙ、及びＷｕ、　Ｃ，Ｈ，（１９８７１Ｊ、　ＢｉｏｌＣｈ ｅｍ、２６２：４４２９−４４３２）　。

を　め′るアンチセンスＤＮＡの・ 櫟的を定め得る。可溶性ＤＮＡキャリアーを、アシアロオロソムコイドを、１− エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド）　（Ｐｉｅｒ ｃｅ社！＃）を用いて、前に記載された（　Ｎｕ、　Ｇ、Ｙ、及びＷｕ、　Ｃ， Ｈ。

（１９８７）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６罎４４２９−４４３２）よ うにして、ポリＬ−リジン（Ｓｉｇｍａ社￥Ｊ）（Ｍｒ＝５９．０００）に結合 させることにより調製した（但し、結合体を、高圧液体クロマトグラフィーシス テム（Ｒａｉｎｉｎ社製）を用いて、Ａｑｕａｐｏｒｅ　Ｃ−３００カラム（Ｒ ａｌｎｉｎ社製）及び０．　１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０，２，５，２，２ ５及び２．０）での段階的溶出を用いるカチオン交換クロマ１−グラフィーによ って精製した）。カラムから溶出した第２のピーク（２３０ｎｍでのＵＶ吸収に より検出）を最適結合体形態として測定し、以下のすべての実験に用いた。ウィ ルスゲノムのヌクレオチド１９０３〜１９２３（Ｓ　Ｅ　Ｑ　Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ｏ、 ｌ　−ＴＴＴＡＴＡＡＧＧＧＴＣＧＡＴＧＴＣＣＡＴ参照）に対応するポリアデ ニル化シグナルを含むヒｌ−Ｂ型肝炎ウィルス（ａｙｗサブタイプ）　（Ｈｉｒ ｓｃｈｍａｎ、　Ｓ、Ｚ等　Ｎ９８０）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ　７７＋５５０７−５５１１１の一部に相補的な２１１体のオリゴヌ クレオチドを、自動ヌクレオチド合成装Ｗ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓ社製）にて、ホスホロチオエート結合を用いて合成した（　Ｍａｔｓｕｋ ｕｒａ、　Ｍ、等、（１９８７１Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８４ニア７０５−７７１０）、コントロールとして、ランダムな２１量 体配列を同じ方法で調製した。オリゴヌクレオチドの純度を、１５％ポリアクリ ルアミドゲル中で電気泳動してエチジウムプロミドで染色することによって測定 した。アンチセンスＤＮＡを、前に記載したアガロースゲル遅延システム（Ｗｕ 、　Ｇ、Ｙ、及びＷｕ、　Ｃ，Ｈ，（１９８７）　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２：４４２９−４４３２）を用いて、結合体で滴 定して可溶性複合体を形成し、結合体対ＤＮＡの重量比１．６：ｌ（アシアロオ ロソムコイド：　ＤＮＡ）を選択した。

レセプター　による　Ａ　アンチセンスＤＮＡのルーム立二二圭ユ オリゴヌクレオチドの取り込みを評価するために、アンチセンスＤＮＡを１２ｐ で末端標識した（　Ｓａｍｂｒｏｏｋ。

Ｊｌ等、（１９８９）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　−Ａ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒＭａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ、第２版、第２巻、１１．３１頁）。ＤＮＡを単独で又は複合体の形 態でＨｅｐＧ２及びＳＫ　Ｈｅｐｌ細胞の培地に加えて、添加したアンチセンス ＤＮＡに関して５０μＭの溶液を作成した。取り込みを、アシアロ糖蛋白質につ いて前に記載した（　Ｓｃｈｗａｒｔｚ、　Ａ、　Ｌ等、（１９８１１、Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

±：８８７８−８８８１　）ようにして測定した。簡単に言えば、細胞をリガン ドと共に３７℃でインキュベートし且つ規則的な時間間隔を置いて、皿を４℃に 冷却し、冷ＩＱｍＭ　ＥＤＴＡ−リン酸緩衝塩溶液で洗浄し、そして細胞層を取 り出してシンチレーション計数を行なった。細胞表面に結合したカウントを測定 するために、同じ細胞のセットを４℃でリガンドとインキュベートして、上記の ように洗浄した後に、細胞層を取り出して付着放射能をシンチレーション計数に より測定した。取り込みを、各時点における、３７℃での全細胞結合カウントと ４℃での細胞に結合したカウントとの差として計算した。すべての点を三重に測 定し、結果を、平均値±ＳＥＭとして示したく２モルＤＮＡ／１０’細胞で表す ）。

アンチセンスＤＮＡとウィルス゛　− ウィルス遺伝子発現におけるアンチセンスＤＮＡの効果を測定するために、ｌ− １ｅｐＧ２　２．２．１５細胞をコンフルエンスの６日前に、アンチセンスＤＮ Ａ単独、複合体化アンチセンスＤＮＡ、？！合体化ランダムＤＮＡを含む又は含 まない培地に播種して３７℃でインキュベートシた。添加ＤＮＡを含むすべての 培地は、ＤＮＡに関して初ＦｉＡ濃度５０μＭであった。日々の間隔において、 ５０μｍの培地を採取してＢ型肝炎表面抗原をＥ　ＬＩＳ　Ａ　（Ａｂｂｏｔｔ 、社）法によって製造者により記載されているようにしてアッセイし、定量につ いては、試事４中に見出される抗原レベルの範囲内で直線的応答を生じる連続希 釈した標準表面抗原（ｃａｔｓｔｏｃｈｅｍ社）を用いる変法とした。細胞数を 、トリバンブルーで染色した細Ｉ包を顕微鏡下で計数することにより測定した。

すべての占、を三重に測定し、４実験の結果を平均値±ＳＥＸとして示す（μｇ 　／　ｍ　１　／　１０　’細胞で表す）。

Ｗ゛・におしるアンチセンエ、ＬＤ＋虹へｌ口伽ヌＨｅｐＧ２　２．２．１５細 胞を、図２に示すように、５０ＬＬＭの複合体化ＤＮＡと共にインキュベートし た（但し、１０ｕＣｉの［”Ｓ］−メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）（比活性 １０００　Ｃｉ　／　ｍモル）を添加して新たに合成した蛋白質を標識した）。

２４時間後、培地を移動して、細胞をリン酸緩衝塩溶液で洗い、１％ドデシル硫 酸ナトリウムで溶解させ、次いで、ドデシル硫酸ナトリウムをトリトンＸ−１０ ０で除去した。培地及び細胞溶解物の両者を、特異的ウサギ抗表面抗原抗体（Ｄ ＡＫＯ社）で処理し、プロティンＡセファロースｆＳｉｇｍａ社）で沈殿させた 。沈殿物をシンチレーション計数し、各点を三重にアッセイした。全細胞蛋白質 を比色アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）により測定した。３実験の結果を、平均値 ±ＳＥＭとして示す（ｃｐｍ／ｍｇ細胞蛋白質で表す）。

全蛋白質合成における複合体化アンチセンスＤＮＡの効果を評価するために、上 記のように複合体化ＤＮＡで処理し［３ｓＳＦ　−メチオニンで標識した細胞を 培地から分離した。全蛋白質を１０％トリクロロ酢酸で沈殿させて計数した。３ 実験の三重アッセイの結果を平均値±ＳＥＭとして示す（ｃｐｍ／ｍｇ細胞蛋白 質）６ウイルス゛ＤＮＡの−におけるアンチセンスＤＮＡの肱呈 細胞を５０１ＬＭの単独の又は複合体形態のアンチセンスＤＮＡと共にインキュ ベートした。２４時間後、培地を移動し、ＨＢＶ　ＤＮＡを、５ｅｌｌｓ等の方 法（ＳｅｌｌｓＭ、Ａ、等、（１９８７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：１００５−１００９）によって培地から抽出し、 Ｈｉｒｔの方法（ＨｉｒｔＢ、Ｊ、　＊、（１９６７１Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、廷 ：３６５−３７１）によって細胞層から抽出した。全細胞蛋白質を比色アッセイ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）によって測定した。等容量の培地（４０ｍｌ）及びほぼ同 数の細胞（１０’）から抽出したＤＮＡを、アガロースゲル上に載せた。ＨＢＶ 　ＤＮＡを、３２ｐで標識したＨＢＶゲノムのＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ断１ ′１（ヌクレオチド０〜１９８２）をプローブとして用いるサザーンプロットに より同定し、前に記載したようにしてＸ線フィルムに露出した（　Ｓａｍｂｒｏ ｏｋ　Ｊ、等、（＋９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　−Ａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ、第２版、第２巻、１０．１４−１０、１５頁）。相対的定置を 濃度測定により行ない、対応するバンドのシンチレーション計数により確認した 。

第１の目的は、１本ＩＩ　Ｄ　Ｎ　Ａオリゴヌクレオチドがアシアロ糖蛋白質ベ ースのキャリアーによって結合され得るか否か及び、それがアシアロ糖蛋白質を 有する細胞を特異的に標的とすることが出来るか否かを測定することである。

図１は、ＨｅｐＧ２及びＳＫ　Ｈｅｐｌ細胞による複合体化アンチセンスＤＮＡ の取り込みを示している。標的を定め得る、可溶性のＤＮＡキャリアーを、前述 （Ｗｕ、　Ｇ、Ｙ、及びＷｕ、　Ｃ，）１．　（１９８７１Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｗ、　２６２：　４４２９−４４３２）のように水溶性カルボジイミドを 用いてアシアロオロソムコイドをポリＬ−リジンに結合することにより調製し、 材料と方法に記載したようにして精製した。結合体を、ポリアデニル化シグナル を含み且つｉｉｐで標識されたヒトＢ型肝炎ウィルスの一部に相補的な２１量体 オリゴデオキシヌクレオチドに複合体化した。

単独の又は複合体形態のＤＮＡを培地に加えて、添加アンチセンスＤＮＡについ て５０ｕＭとした。取り込みを、アシアロ糖蛋白質について、前述したようにし て測定した（　Ｓｃｈｗａｒｔｚ、＾、Ｌ１等、（１９８１）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｍ。

当＋８８７８−８８８１　）。細胞を３７℃でインキュベートシ。

規則的時間間隔で皿を冷却し、ｌｏｍＭ　ＥＤＴＡ−リン酸緩衝塩溶液で洗った 。細胞表面に結合したカウントを測定するために、同じ細胞のセットも又リガン ドと共に４℃でインキュベートし、上記のように洗浄した後に細胞層を取り出し て放射能をシンチレーション計数によって測定した。取り込みを、各時点におけ る、３７℃において細胞に結合したカランｉ・と４℃において細胞表面に結合し たカウントとの差として計算した。すべての点を三重に測定し、結果を平均値± ＳＥＭとして示した（９モルＤＮＡ／１０’細胞で表し、ＯはアンチセンスＤＮ Ａ単独、◆は複合体化アンチセンスＤＮＡ、△は複合体化アンチセンスＤＮＡ＋ 　１００倍モル過剰のアシアロオロソムコイドを表す）。図１は、５ＫＨｅｐｌ ［アシアロ糖蛋白質レセプター（−）細胞］において、アンチセンスＤＮＡ！！ Ｊの平均取り込みが、４時間の露出において、０．０５ｐモル／　ｈ　ｒ　／百 方細胞より少ないことを示している。複合体形態のＤＮＡとのインキュベーショ ンは、これらの細胞における取り込みを改善しなかった。同様に、ＨｅｐＧ２　 ［アシアロ糖蛋白質レセプター（＋）］細胞によるアンチセンスＤＮＡＩ！ｌｉ の取り込みは、４時間の過程において、レセプター（−）細胞において観られた のと同じ程度に低かった。しかしながら、レセプター（＋）細胞においては、複 合体化アンチセンスＤＮＡは、４時間のインキュベーション中、アンチセンスＤ ＮＡ単独より−１２ユ侶速い平均速度でほぼ直線的に取り込まれた。複合体化ア ンチセンスの蓄積も又、４時間の露出の後に、アンチセンスＤＮＡ単独より１２ 倍多かった。複合体化ＤＮＡの取り込みは、遊離のキャリアー蛋白質、アシアロ オロソムコイドのモル大過剰の投与によるレセプター結合への競合よって、事実 上完全にブロックされた。これは、アンチセンスＤＮＡの特異的送達におけるア シアロ糖蛋白質レセプターの関与を確実にした。

標的を定めたアンチセンスＤＮＡが機能的であるか否かを測定するために、Ｂ型 肝炎ウィルスの遺伝子発現における効果を評価した。図２は、培養培地中のＢ型 肝炎ウィルス表面抗原濃度に対する複合体化アンチセンスＤＮＡの効果を示して いる。ＨｅｐＧ２　２．２．１５細胞を、単独のアンチセンスＤＮＡ、？１合体 化アンチセンスＤＮＡ、　複合体化ランダムＤＮＡを含む又は含まない培地中で ３７℃で培養した。添加ＤＮＡを含むすべての培地は、最初、ＤＮＡについて５ ０ｕＭであった。１日ごとに、培地を採取して、Ｂ型肝炎表面抗原の存在につい てＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ　（Ａｂｂｏｔｔ社）法により、製造者よって記載された ようにして及び材料と方法に記載したように改変してアッセイした。細胞数を、 トリパンブルーで染色した細胞を顕微鏡下で計数することにより測定した。すべ ての点を三重に測定し、４実験の結果を平均値±ＳＥＭとして示す（μｇ／ｍｌ ／１０６細胞で表す）。

図２は、未処理のコントロール細胞において、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原が、培 地中の濃度を、１μｇ　／　ｍ　１／１０６細胞（１日目）から５．５ｕｇ／ｍ ｌ／１０’細胞（７日目）へと、着実に増加させたことを示してしする。細胞を 単独のアンチセンスＤＮＡにさらすことは、表面抗原濃度が未処理のコントロー ルより３０％低くなる３日目までに何の有意の効果もなかった。それにもかかわ らず、アンチセンスＤＮＡが単独で存在する場合の表面抗原濃度は、さらした７ 日間の間中着実に増加し続けた。しかしながら、複合体化アンチセンスＤＮＡで の処理は、未処理コントロールに比較して、１日経過の後に８０％の阻止を生じ 、７日経過後には９５％の阻止を生じた。最初の２４時間の後に、表面抗原濃度 の有意の増加はなかった。同じ寸法の複合体化ランダムＤＮＡは、同一条件下に おける任意の時点において、抗原濃度に何の効果も有しなかった。

複合体化アンチセンスＤＮＡで処理した細胞の培地中にＢ型肝炎表面抗原の蓄積 が欠如したことは、蛋白質の分泌のブロックによるものであろう。この可能性を 試験するために、新規な表面抗原の合成を培地及び細胞層において測定した。表 ＩＡは、培地と細胞の両者において、放射性標識した免疫沈降可能な表面抗原が 、複合体化アンチセンスＤＮＡでの２４時間の処理の後に、未処理の細胞に比較 して同程度（８０％）に減少していたことを示している。蛋白質の分泌のブロッ クが起きた場合に予想される新規に合成された抗原の有意の細胞内蓄積はなかっ た。

表ＩＢは、複合体化アンチセンスＤＮＡもランダムＤＮＡも細胞層中の新規に合 成された全蛋白質に有意の効果を有しなかったことを示している。複合体化アン チセンスＤＮＡにさらした細胞における新規に合成されＩｆ艶並犬蛋白質におい て、僅か（２％）の減少が検出された。これは、恐らく、表ＩＡに示したウィル ス表面抗原の合成の阻止の影響を反映しているのであろう。このデータは、全体 として、Ｂ型肝炎表面抗原の合成の複合体化アンチセンスＤＮＡによる観られた 阻止が特異的であり、全蛋白質合成の全体的阻止によるものではなかったことを 示している。

表ＩＡ 免疫沈降可能なり型肝炎表面抗原。

未処理コントロール　５６，１００　上２゜３２１　１１４．５００±２，４４ ２複合体化　ｔｏ、　２００±１．００９　１５，３００±８９０アンチヤンス ＯＮ＾ 全ＴＣＡ沈殿可能な放射能。

未処理コントロール　１８４，４９８±　２．２５８　７１２．４９８±５．４ ３５０２４時間のインキュベーション後 ＋ｃｐｍ／ｍｇ細胞蛋白質 ＴＣＡ　−トリクロロ酢酸 最後に、ウィルスの複製が影響を受けるか否かを測定するために、ＤＮＡを、オ リゴヌクレオチドに２４時間さらした培地及び細胞層から抽出してサザーンプロ ットにより分析した。図３は、アンチセンスＤＮＡに２４時間さらした後の培地 及び細胞から抽出したＤＮＡのサザーンプロットを示している。細胞を、図２に ついて記載したようにして、５０％Ｍの単独のＤＮＡ又は複合体形態のＤＮＡと 共にインキュベートした。２４時間後に、培地を取り出し、ＤＮＡを培地（Ｓｅ ｌｌｓ、　Ｍ、Ａ　等（１９８７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ　８４：１００５−１００９）及び細胞層（Ｈｉｒｔ、　Ｂ、Ｊ 、　（１９６７１Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　２６：３６５−３７１）から抽出した 。全細胞蛋白質を比色アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒｓｄ社）により測定した。等容積の 培地及びほぼ同数の細胞から抽出したＤＮＡをアガロースゲルに載せ、ＨＢＶ　 ＤＮＡを、３２ｐで標識したＨＢＶゲノムのＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ断片を プローブとして用いてＸ線フィルムに露出させるサザーンプロットにより同定し た（　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、等、（＋９８９）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ ｏｎｉｎ　−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

第２版、第２巻、１０．１４−１ｏ、　１５頁）。相対的定量を濃度測定により 行ない且つ対応するバンドのシンチレーション計数により確認し、培地及び細胞 層それぞれについて等容積又は同細胞数に欅準化した。重複プロットを行なった （その代表を上に示しである）。レーン１〜４は細胞ン容解物であり、レーン５ 〜８は培地であり、レーン１及び５は未処理コントロールであり、レーン２及び ６は複合体化アンチセンスＤＮＡで処理したものであり、レーン３及び７は複合 体化ランダムＤＮＡで処理したものであり、レーン４及び８は単独のアンチセン スＤＮＡで処理したものである。弛緩した環（ＲＣ）及び１本鎖（ＳＳ）形態に ついて予想される位置を右側に示しである。

図３のレーン１及び５は、未処理細胞が、弛緩した環及び１本鎖の直鎖状ウィル ス性復製型ＤＮＡ形態について予想される位置にバンドを生じることを示してい る。

その他の弱いバンド（例えば、２．３ｋｂのバンド）が、この細胞系統について 前に記載したように、存在する（Ｓｅｌｌｓ、　Ｍ、Ａ　等、（１９８７）　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８４：１００５−１００９）。レーン２及び６は、複合体化アンチセン スＤＮＡでの細胞の処理が、培地中のすべてのウィルス性ＤＮＡ形態の量を、未 処理の細胞（レーン１及び５）に比較して約８０％減少させたことを示している 。複合体化ランダムＤＮＡ　（レーン３及び７）は、同一　条件下で、ＨＢＶ　 ＤＮＡのレベルについて検出可能な効果を有しなかった。単独のアンチセンスＤ ＮＡ　（レーン４及び８）は、ＨＢＶ　ＤＮＡを未処理コントロールに比較して 約３０％減じた。生存力を有する細胞の数は、トリパンブルー排除により測定し た場合、何れの形態のＤＮＡで処理しても影響を受けなかった（データは示して ない）。

多くのタイプの細胞が遊離のオリゴヌクレオチドを取り込むことが出来るという ことは以前に示された（　Ｌａｋｅ、　Ｓ、　Ｌ、等　（１９８９１Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌＪｓ、Ａヌクレオチドの寸法に反比例 するということを示した（　Ｌｏｋｅ、　Ｓ、　Ｌ、等、（１９８９）　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ廷：　３４７４−３４７８） 。しかしながら、一般に、長いＤＮＡ配列はど、標的ｍＲＮＡ分子に対する特異 性が大きい。これらの相反する特性は、現在のアンチセンスオリゴヌクレオチド の利用に伴う２つの共通の問題である効率の悪い取り込みと細胞特異性の欠如と を説明する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの取り込みを改善するために、Ｌ ｅｍａｉｔｒｅ等は、オリゴヌクレオチドをポリリジンに共何結合させて（Ｌｅ ｍａｉｔｒｅ、　Ｍ、等、（１９８７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：６４８−６５２）遊離のＤＮＡで得られ るより数倍低い濃度で抗ウイルス効果を得た。しかしながら、この送達は、細胞 特異的ではなかった。我々の取り込みデータは、オリゴヌクレオチドの細胞内へ の輸送を大いに増大させ得るだけでな（、その取り込みを、アシアロ糖蛋白質を ベースとするＤＮＡキャリアーシステムによって、特定の細胞に向けることも可 能であることを示している。

翻訳のアンチセンス媒介による阻止に関係するハイブリッドを形成するｍＲＮＡ とのＤＮＡハイブリダイゼーションの特異性の故に、アンチセンスオリゴヌクレ オチドを上首尾で用いて正常遺伝子発現をイン・ビトロで研究した（　Ｂｅｖｉ ｌａｑｕａ、　Ａ、等、　（＋９８８）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ− 恒ロエＵＳＡ　８５＋８３１−８３５）　、同様の理由により、アンチセンスオ リゴヌクレオチドも又、前に、抗ウイルス効果について試験された（　Ｇｏｏｄ ｃｈｊ　ｌｄ、　Ｊ、等、ｆ１９８８１　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５：５５０７−５５１１及び　Ａｇｒａｗａｌ、　Ｓ等、 （１９８９）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６ ：７７９０−７７９４）　、例えば、Ａｇｒａｗａｌ等は、感染性ウィルス（Ｈ ｌ■）をアンチセンスオリゴヌクレオチドと共に標的を定めない方法で細胞培地 に投与した（　Ａｇｒａｗａｌ、　Ｓ、等。

（１９８９）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ　８６： ７７９０−７７９４）　。

ウィルス復製の特異的阻止を示した。同様に、Ｌｅｓ＋ａｉｔｒｅ等は、実質的 に特定の抗ウイルス性効果を有するアンチセンスを細胞に予備投与した急性ウィ ルス感染のモデルを研究した（　Ｌｅｍａｉｔｒｅ、　Ｍ等、（１９８７１Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：６４ｇ−６５２） 　、我々の実験は、これらの以前の研究とは、我々の細胞がインチグレートした ウィルスゲノムにより維持されるウィルス性生成物を伴う予め存在させた安定な ウィルス感染を有していたという点で異なっている。我々のデータは、たとえ安 定な感染が存在しても、アンチセンスオリゴヌクレオチドの送達は、特異的様式 でウィルス遺伝子の発現を劇的に阻止することが出来るということを示している 。しかしながら、イン・ビボにおいて、Ｂ型肝炎ウィルスの永続的生成は、通常 、インチグレートしていないウィルスＤＮＡの存在による（　５ｈａｆｒｉｔｚ 、　Ｄ、等、（１９８１）　Ｎ、　Ｅｎ　、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３０５：１０６ ７−１０７３１　。

ウィルスゲノムの宿主ゲノムへのインテグレーションは、通常、完全なウィルス 粒子の生成の中止を伴う（Ｇａｎｅｍ、Ｄ、（１９８２）　Ｒｅｖ、Ｉｎｆｅｃ ｔ、Ｄｉｓ、４：１０２６　）　ｅ　ｅＪ的を定めたアンチセンス送達が、イン チグレートしていないウィルスＤＮＡにより生じた感染の存在下において有効で あり得るか否かは未確認のままである。しかしながら、肝炎ウィルスに感染した ＨｅｐＧ２細胞におけるアシアロ糖蛋白質の取り込みは、非感染ＨｅｐＧ２細胞 と実質的に異ならないことが見出され（データは示してない）、このウィルスに よる感染がこれらの細胞においてレセプターの活性を変えなかったことを示して いる。

これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的を定めた送達が、一般に、自然 に感染し他の点では正常な肝細胞に、アシアロ糖蛋白質レセプターを介して適用 可能であることを示唆している。

この現在の仕事に用いるオリゴヌクレオチドはホスホロチオエート結合により一 緒に結合されたということを注意すべきである。これらの結合は１通常のホスホ ジエステル結合よりヌクレアーゼ分解を受けにくい。しかしながら、ホスホジエ ステル結合で合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドも又有効であった。更に 、アンチセンスオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を与えるために多様な他 の合成戦略が開発された（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｐ、Ｓ等、（１９８５）　Ｎｕｃｌ ｅｏｓｉｄｅｓ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　６：７６９−７７６１　。ポリアニ オン特性を保持する形態も又、レセプター媒介のキャリアーシステムによって、 増大し且つ延長した効果を与えるために、信的を定めた様式で送達することが出 来るであろう。

Ａｓ０Ｒ−ポリＬ−リジンーオリゴＤＮＡ　ム　のイン・ビボでの　゛み Ａｓ０Ｒ−ポリーＬ−リジンーオリゴＤＮＡ複合体がイン・ビボで肝細胞のアシ アロ糖蛋白質レセプターにより認識される能力を保持しているか否かを測定する ために、２００〜２５０ｇのラットに、Ａｓ０Ｒ−ポリーＬ−リジン−［３２Ｐ ｌ　−オリゴＤＮＡを単独で又は１０００倍モル過剰のアシアロオロソムコイド と共に（０，１５Ｍ　無菌塩（′ａ液液中１尾の静脈へ静脈注射した。１０分後 に動物を殺して、血液、肝臓、牌臓、肺及び腎臓の試料を得た。組織試料を重量 測定し、ホモジエナイズして水性の計数用シンチラントと混合し、ベータカウン ターにてｓａｐの放射能をカウントした。各器官による放射能の取り込みを、注 射した総カウントに対するパーセントによって表した。これらのデータは、複合 体化した１重鎮（アンチセンス）オリゴＤＮＡ配列が、筆なる静脈注射によって 、特異的に肝臓を標的とすることが出来ることを示している。

Ａｓ０Ｒ−ＰＬ？１合体としての ３ｉｐ　（オリゴヌクレオチド）ＤＮＡの器官分布・　だ　に・　る％ 血液　６．０ 心［２，１ 肺　４．５ 腎Ｈ２，７ 牌臓　３，７ 肝＠８１ １０００倍モル過剰の冷ＡｓＯＲとの競合した　に・　る％ 腎ｌ１ｉＩ４川 牌臓　３ 肝臓　１４．ｌ 夾１０１１ 材料と方法 Ａｓ０Ｒ−ＰＬ−αＩ　Ｉ　プロコラーゲンアンチセンスＤＮＡのプロコラーゲ ン　Ａ　に・　るるためのアッセイ を立　び Ｍｉｃｈａｅｌ　５ｈｉａ博±（マサチューセッツ州、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、マ サチューセッツ工科大学）から好意的に提供されたコラーゲンを産生し且つアシ アロｖ！蛋白質（ＡｓＧ）レセプター遺伝子をトランスフェクトされたマウス繊 維芽細胞系統（３Ｔ３−ＡｓＧＲｌをＤＭＥＭ及びｌＯ％ＦＢＳ中で生育させた 。３５ｍｍ皿でフンフルエンドになった３Ｔ３−ＡｓＧＲをａｔ　（Ｉ）アンチ センスＤＮＡ単独（１，３μＭ又は２．７ｕ）で又はアンチセンスＤＮＡ複合体 濃度を変えて（１，３，１，７又は２．７μＭのアンチセンス）１２〜１６時間 （−晩）３７℃でＤＭＥＭ及び１０％ＦＢＳ中で処理した。培地を取り出し、５ 　ｕＣｉ　／　ｍ　１の［３Ｈ］　−プロリン、５０　ｕ　ｇ／ｍ　＋Ｌ−アス コルビン酸塩及び種々の１度のアンチセンスＤＮＡ若しくは複合体を含む襟識用 培地と交換した。細胞を、橿識用培地中で４時間３７℃でインキュベートした。

新規に合成されたプロコラーゲン及び他の蛋白質を細菌コラゲナーゼ消化によっ て測定した（　Ｐｅｔｅｒｋｏｆｓｋｙ。

Ｂ、及びＤｉｅｇｅｌｍａｎｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　１０：９８８−９９ ４（１９７１））。

ユｊ二二ヱ」」１化 榎識用培地を取り出してとっておいた。プロテアーゼインヒビターを含む緩衝液 （０，５Ｍトリス（ｐＨ７，４）、０．４ｍＭ　ＮＥＭ、０．２ｍＭ　Ｐ　Ｍ　 ＳＦ、２．５ｍＭ　ＥＤＴＡ）を細胞層に加え、その細胞層を取り出して上清と 共にプールした。全混合物をダウンスホモジエナイザーを用いてホモジェナイズ し、水冷ＴＣＡを加えて終濃度１５％とした。ＴＣＡ沈殿可能な蛋白質を細菌コ ラゲナーゼ（Ｉ　Ｉ　Ｉ型、ニューヨーク州、Ｌｙｎｂｒｏｏｋ在、Ａｄｖａｎ ｃｅｄ　Ｂｉｏｆａｃｔｕｒｅｓ社）を用いて３７℃で２時間消化し、その後、 ＴＣＡ−タンニン酸で沈殿させた。上清中のコラゲナーゼ感受性の放射能を遠心 分離によって分離して新規に合成されたプロコラーゲン産生を測定した。コラゲ ナーゼ耐性の沈殿した放射能を用いて非コラーゲン性蛋白質産生を計算した。す べてのアッセイを同数の細胞に欅準化した。

・を　め′るＤＮＡの・　！ 標的を定め得る、可溶性のＤＮＡキャリアーを、前述（Ｗｕ、Ｇ、　Ｙ、及びＷ ｕ、　Ｃ，Ｈ，（１９８７１Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２・４４２９ −４４３２）のようにして、１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル ）カルボジイミド）　ｆ　Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて、アジアロオロソムコイド をポリＬ−リジン（Ｓｉｇｍａ社）（Ｍｒ＝４１．０００）に結合させることに よって調製した（但し、結合体を、Ａｑｕａｐｏｒｅ　Ｃ−３００カラム（Ｒａ １ｎｉｎ社）を用いる高圧液体クロマトグラフィーシステム（Ｒａ１ｎｉｎ社） 及びＯ，１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０，２，５，２，２５及び２．０）での 段階的溶出を用いるカチオン交換クロマトグラフィーによって精製した）。カラ ムから溶出した第２のピーク（２３０ｎｍでのＬＩＶ吸収により検出）を最適結 合体形態として測定し、次のすべての実験に用いた。プロα１プロコラーゲンｍ ＲＮＡの５′領域に相補的な２４量体オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ 、　２　−ＣＣＧＧ＾ＧＧＴＣＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＴ参照）を、ホス ホジエステル結合を用いて自動ヌクレオチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ社）にて合成した（　Ｍａｔｓｕｋｕｒａ、　Ｍ、等、（１９８ ７）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４ニア７０５−７７１０）　、 特に、この配列は、プロα１プロコラーゲンの第１の２４ヌクレオチド（α１（ ■）翻訳開始部位から始まり、第１のイントロンの一部を含む）に対してアンチ センスである。オリゴヌクレオチドの純度を、エチジウムプロミドで染色した１ ５％ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動により測定した。アンチセンスＤＮ Ａを、前に記載したアガロースゲル遅延システム（Ｗｕ、　Ｇ、　Ｙ、及びＷｕ 、　Ｃ，Ｈｌ（１９８７１Ｊ　、　８ｉｏ１．　Ｃｈｅｍ、　２６２：４４２９ −４４３２）を用いて、結合体で滴定して可溶性複合体を形成し、結合体対ＤＮ Ａの重量比２・Ｉ　（アシアロオロソムコイドーポリリジン（ＡｓＯＲ−Ｐ　Ｌ 　）　・ＤＮＡ）を選択した。

Ａ　アンチセンスＤＮＡのレセス　−　の　入みのアッセイ ３Ｔ３−ＡｓＧＲ細胞におけるアシアロ糖蛋白質レセプターの取り込み能力を特 性決定するために、３５ｍｍ皿でＤＭＥＭ及び１０％ＦＢＳ中でコンフルエント になった３７３−ＡｓＧＲ細胞をリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）−１０ｍＭ　ＥＤ ＴＡ　（ｐＨ５，０）を用いてはがし、２ｕｇ／ｍｌ　［”’Ｉ］　−ＡｓＯＲ （比活性ｌＸ１０＠ｃｐｍ／μｇ）と共にインキュベートした。取り込みを、ア シアロ糖蛋白質について前述したようにして測定した（　Ｓｃｈｗａｒｔｚ、　 Ａ、　Ｌ、等、　＋　１９８１　）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ］１ｅｍ±：８８７ｇ− ８８８１）。簡単に言えば、細胞を［目６エ］−ＡｓＯＲと３７℃でインキュベ ートし、規則的時間間隔（０，５，１，２又は４時間）で皿を４℃に冷却し、冷 １０ｍＭ　ＥＤＴＡ−リン酸緩衝塩溶液で３回洗い、細胞層を０．１　ＮａＯＨ で可溶化してガンマ−線をカウントする。この方法を、３Ｔ３−ＡｓＧＲ細胞を ［”Ｐ］　−ＤＮＡ−ＡｓＯＲ−ＰＬ　（１，３ｕＭ　アンチセンス）又は１． ３ｕ、Ｍ　ＤＮＡ−［”％Ｉ］　−ＡｓＯＲ−ＰＬ　Ｃ比活性＝０．５ｘ　１０ ’　ｃｐｍ／ｕｇ）と共にインキュベートすることによって反復してアンチセン ス複合体の取り込み速度を測定した（但し、３２ｐ標識した複合体とインキュベ ートした細胞層をシンチレーション計数した）。比較用の皿を、放射性標識した リガンド及び重量で３００倍過剰の冷ＡｓＯＲと共にインキュベートして非特異 的な取り込みを測定した。細胞表面に結合したカウントを確かめるために、同じ 細胞のセットをリガンドと共に４℃でインキュベートし、上記のように洗浄した 後に細胞層を取り出して付着放射能をシンチレーション計数により測定した。取 り込みを、３７℃において細胞に結合した全カウントと４℃において細胞に結合 したカウントとの各時点における差として計算した。

ＲＮＡ　びＲＮＡドツトプロット １０ｃｍ皿でＤＭＥＭ及びｌＯ％ＦＢＳ中でコンフルエントになった３Ｔ３−Ａ ｓＧＲ細胞を、単独で又は下記の組合せで、３７℃で一晩インキュベートした： （１）α１　（Ｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチド（１，３ｕＭ又は２．７ｕ Ｍ）、（２）ＡｓＯＲ−ＰＩ、と複合体化した同１度のアンチセンス。（Ｃｈｏ ｍｃｚｙｎｓｋｉ。

Ｐ、及び５ａｃｃｈｉ、　Ｎ、、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６２：１ ５６−１５９（１９８７１）。抽出したＲＮＡの量及び性質をＡｔ＠Ｏ／Ａ　２ 　ＩＱ吸光度及びエチジウムプロミド染色したホルムアルデヒドゲルにより測定 した。

２０μｍの全ＲＮＡで始めたドツトプロット研究は。

２０　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（ｐ　Ｈ７、０）において連続的に２倍希釈した。試料を 、５０％ホルムアミド、７％ホルムアルデヒド及びｌＸ５ｓｃ　（ｐＨ７゜Ｏ） 中で熱変性させた（　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ： １ｏｎｉｎ　７．５４．１９８９）。

試料を、スロットプロット袋層を用いてニトロセルロースフィルターに載せ、紫 外線にさらしてフィルターに架橋させ、そして４２℃で３時間予備パイプリダイ ズさせた。ランダムプライム法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、等、Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ」頗」ｌ　３　、４４、（１９８９））　ヲ用いてｓ２Ｐテ標識したＣＤＮ Ａプローブは、ラットのプロα１（Ｉ）及びβ−アクチン（両者とも、ＥｃｏＲ Ｔで直鎮状にしたもの）及びラットのプロα２（１）の９００ｂｐ断片であった 。これらのニトロセルロースフィルターをプローブ（０５〜１．０ｘｌＯ’　ｃ ｐｍ／フィルター）と−晩４２℃でハイブリダイズさせ、洗浄し、そしてフィル ムに露出した。これらのフィルターをシンチレーション計数することによって定 量を行なった。

ノーザンプロット 全ＲＮＡ試料（６０ｕ　ｇ）を、５０％ホルムアミド、２×ホルムアルデヒド泳 動用緩衝液、７％ホルムアルテヒド中で、５５℃で１５分間熱変性させた（　Ｓ ｍｂｒｏｏｋ。

Ｊ３等、証匡止■二）二」７．４３．　（１！１１８９１１゜試１１を、ホルム アルデヒドゲル（１％アガロース、２．２Ｍ　ホルムアルデヒド）上で、４時間 、１００ボルトで、水上で泳動した。分子量及びコントロール用ＲＮＡを０１酢 酸アンモニウム及び０．５μｇ　／　ｍ　ｌエチジウムプロミドで染色して蛍光 ルーラ−で写真を撮った。残りのゲルを水で数回洗い、ＲＮＡを０．５Ｎ　Ｎａ ＯＨで２０分間加水分解し及び２０ＸＳＳＣに４５分間浸した。ＲＮＡを、１時 間にわたって真空下でニトロセルロースフィルター上にトランスファ　−Ｌ／　 、　５ｔｒａｔａｌａｉｎｋｅｒを用いて、紫外線照射にさらすことによりフィ ルターに架橋した。予備ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの 条件は、スロットプロット研究におけるのと同じであった。

結果 ３Ｔ３−ＡｓＧＲの　へ ３Ｔ３−ＡｓＧＲ細胞は普通アシアロ糖蛋白質レセプターを有しないので、それ らにアシアロ糖蛋白質レセプター遺伝子をトランスフェクトし、それらは、１． ５×１０−’ＭのＫ　ａ　、１　、８　ｕ　ｇ　／　ｍ　Ｉの［”’Ｉ］−Ａｓ ＯＲの結合飽和及び１．８ｐモル／百万細胞／時間の［”Ｊ］　−ＡｓＯＲの取 り込み速度を有することが見出された。細胞当りのアシアロ糖蛋白質レセプター の数は、２５０，０００であった。

３Ｔ３−ＡｓＧＲ細胞は、４時間まで、１８２ｕモルＤＮＡ／百万細胞／時間の 速度でα１　（■）アンチセンスＤ　Ｎ　Ａ　−Ａ　ｓ　ＯＲ−Ｐ　Ｌ複合体の 直線的取り込みを示した。対照的に、標識ａｌ　（Ｉ）アンチセンスＤＮＡ単独 の取り込み速度は、Ｏ，Ｉ５ｐ５ｕＤＮＡ／百万細胞／時間であった。ＡｓＯＲ の取り込みは、３００倍過剰（重量）で、α１　（１）アンチセンスＤＮＡ複合 体の取り込みと競合した。

コラーゲン４　に・するα１　■　アンチセンスＤＮＡ復」」１９３１里 α１　（Ｉ）アンチセンスＤＮＡ複合体は、３Ｔ３−ＡｓＧＲ細胞によるコラー ゲン産生を阻止した。この阻止は、コラーゲン産生に特異的であり、複合体中の ｕｌ（Ｉ）アンチセンスＤＮＡの濃度に依存した。この結果を下記の表に示す。

α　１（Ｈゴラーグン蛋白質　非コラーゲン　蛋白質　コラーゲン産生Ｍ　Ｃｍ 　コントロールに　・　る％ ０　４．３３０　４５．０００　１００１．３　３，１９０　４４．５００　７ ４１．７　２，７７０　４５．６６０　６４２．７　２．２１０　４０．５００ 　５６プロコラーゲンＩのｍＲＮＡレベルに・　るａｌ　エアンチセンスＤＮＡ 　Ａ　の α１　（Ｉ）アンチセンスＤＮＡ複合体は、α１　（■）鎗のｍＲＮＡを特異的 に阻止した。しかし、アンチセンスＤＮＡ複合体が一層高濃度（２，７μＭ）の 場合は。

両α１　（Ｉ）及びα２（１）鎖のｍＲＮＡが共に阻止された。下記の表は、幾 つかのドツトプロット分析の定量の結果である。

ｕＭ　ｐａｌ　（１）　ｐｃ２　（１）　β−アクチンコントロールに文　る％ 同ｊＬ物 当業者は、ここに記載した特定の手順の多くの同等物を認識し、又は常例的実験 を用いて確認すること力Ｓ出来る。かかる同等物は、この発明の範囲内にあると 考えられ及び下記の請求の範囲によって保護される。

配ＪＬ大 （１）一般的情報・ （ｉｌ出願人：ウー、ジョージ　Ｙ。

ウー、キャスリン　Ｈｏ （Ａ）出願番号：　ＵＳ　０７／８６４，００３（Ｂｌ出願日：１９９２年４月 ３日 （Ｃ）出願番号：　ＵＳ　０７／７８８，１１９２）配列番号２の情報： （ｉ）配列の特性。

（＾）長さ：２４ヌクレオチド ＋Ｂｌ型：核酸 （Ｃ１鎖の数＝１本鎖 （Ｄ）　トポロン−二　直鎖状 （ｉｆ）分子の種類・ＤＮＡ （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｉｘ）配列の特徴：Ｃ１（Ｉ）翻訳開始部位から始まり第１のイントロンの一 部を含む プロαｌプロコラーゲンの最初の ２４ヌクレオチドに相補性 （ｘｉ）配列（配列番号２）： ＣＣＧＧＡＧＧＴＣＣＡ（：ＡＡＡＧＣＴＧＡ　ＡＣＡＴ　２４オリゴＤＮＡの 取り込み（ｐモル／百方細胞）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを特定の細胞へ、その細胞中のＲ ＮＡとのハイブリダイゼーションのために、標的を定めて送達するための可溶性 分子複合体であって、ＲＮＡにハイブリダイズする１本鎖のポリ又はオリゴヌク レオチドを、細胞特異的結合剤とポリ又はオリゴヌクレオチド結合剤とからなる キャリアーと複合体化して含む、上記の可溶性分子複合体。 ２．オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである、請 求の範囲第１項に記載の可溶性分子複合体。 ３．アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが細胞性又はウイルス性のＲＮＡ 又はＤＮＡとハイブリダイズする、請求の範囲第２項に記載の可溶性分子複合体 。 ４．アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが肝炎ウイルスＲＮＡにハイブリ ダイズする、請求の範囲第３項に記載の可溶性分子複合体。 ５．アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが肝炎ＲＮＡのポリアデニル化部 位にハイブリダイズする、請求の範囲第４項に記載の可溶性分子複合体。 ６．アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが癌遺伝子ＲＮＡにハイブリダイ ズする、請求の範囲第２項に記載の可溶性分子複合体。 ７．オリゴヌクレオチドがリボザイムである、請求の範囲第１項に記載の可溶性 分子複合体。 ８．オリゴヌクレオチド結合剤がポリカチオンである、請求の範囲第１項に記載 の可溶性分子複合体。 ９．ポリカチオンがポリリジンである、請求の範囲第８項に記載の可溶性分子複 合体。 １０．細胞特異的結合剤が、複合体の細胞によるエンドサイトーシスを媒介する 細胞表面レセプターに結合する、請求の範囲第１項に記載の可溶性分子複合体。 １１．細胞特異的結合剤がアシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドであり 且つ標的とされる細胞が肝細胞である、請求の範囲第１０項に記載の可溶性分子 複合体。 １２．リガンドがアシアロ糖蛋白質である、請求の範囲第１１項に記載の可溶性 分子複合体。 １３．請求の範囲第１項の分子復合体の溶液と生理的に許容し得るビヒクルとを 含む製薬組成物。 １４．アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを肝細胞に標的を定めて送達す るための可溶性分子複合体であって、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド を、アシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドとオリゴデオキシヌクレオチ ド結合性ポリカチオンとからなるキャリアーと複合体化して含む、上記の可溶性 分子複合体。 １５．アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドがウイルスのＲＮＡ転写物にハ イブリダイズする、請求の範囲第１４項に記載の可溶性分子複合体。 １６．アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが肝炎ＲＮＡ転写物にハイブリ ダイズする、請求の範囲第１５項に記載の可溶性分子複合体。 １７．アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが肝炎ウイルスＲＮＡのポリア デニル化部位にハイブリダイズする、請求の範囲第１６項に記載の可溶性分子複 合体。 １８．ポリカチオンがポリリジンである、請求の範囲第１４項に記載の可溶性分 子複合体。 １９．肝炎ＲＮＡのポリアデニル化部位に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオ チドを、アシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドとオリゴヌクレオチド結 合性ポリカチオンとからなるキャリアーと複合体化して含む可溶性分子複合体。 ２０．ポリカチオンがポリリジンである、請求の範囲第１９項に記載の可溶性分 子複合体。 ２１．オリゴヌクレオチドを生物体の特定の細胞に送達してその細胞中の遺伝子 の発現をブロックする方法であって、遺伝子のＲＮＡ転写物にハイブリダイズす る１本鎖オリゴヌクレオチドを細胞特異的結合剤とオリゴヌクレオチド結合剤と からなるキャリアーと複合体化して含む可溶性分子複合体を生物体に投与するこ とを含む、上記の方法。 ２２．オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである、 請求の範囲第２１項に記載の方法。 ２３．オリゴデオキシヌクレオチドがウイルスのＲＮＡ転写物にハイブリダイズ する、請求の範囲第２２項に記載の方法。 ２４．オリゴデオキシヌクレオチドが肝炎ウイルスのＲＮＡ転写物にハイブリダ イズする、請求の範囲第２３項に記載の方法。 ２５．オリゴデオキシヌクレオチドが肝炎ウイルスのＲＮＡのポリアデニル化部 位にハイブリダイズする、請求の範囲第２４項に記載の方法。 ２６．オリゴヌクレオチドが転写物の開裂を触媒するリボザイムである、請求の 範囲第２１項に記載の方法。 ２７．オリゴヌクレオチド結合剤がポリカチオンである、請求の範囲第２１項に 記載の方法。 ２８，ポリカチオンがポリリジンである、請求の範囲第２７項に記載の方法。 ２９．細胞特異的結合剤が複合体のエンドサイトーシスを媒介する細胞表面レセ プターに結合する、請求の範囲第２２項に記載の方法。 ３０．細胞特異的結合剤がアシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガンドであり 且つ標的細胞が肝細胞である、請求の範囲第２９項に記載の方法。 ３１．リガンドがアシアロ糖蛋白質である、請求の範囲第３０項に記載の方法。 ３２．分子複合体を静脈経路で投与する、請求の範囲第２１項に記載の方法。 ３３．肝炎ウイルスの感染した肝細胞内での複製を阻止する方法であって、有効 量の、ウイルス複製に必要な肝炎ＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物にハイブリダイズす るアンチセンスオリゴヌクレオチドをアシアロ糖蛋白質レセプターに対するリガ ンドとオリゴデオキシヌクレオチド結合性ポリカチオンとからなるキャリアーと 複合体化して含む分子複合体の製薬上許容し得る溶液を注射することを含む、上 記の方法。 ３４．オリゴデオキシヌクレオチドが肝炎ウイルスＲＮＡのポリアデニル化部位 に相補的である、請求の範囲第３３項に記載の方法。 ３５．ポリカチオンがポリリジンである、請求の範囲第３３項に記載の方法。 ３６．分子複合体を静脈経路で投与する、請求の範囲第３３項に記載の方法。 ３７．肝炎ウイルスのポリアデニル化部位にハイブリダイズするアンチセンスオ リゴヌクレオチド。 ３８．配列番号１として与えられたヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリ ゴデオキシヌクレオチド。