JP2017530948A - 抗腫瘍組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
腫瘍に送達されると、腫瘍内の細胞において自然免疫を生じさせるオリゴヌクレオチド配列が本明細書に開示される。ある特定の実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドは、腫瘍細胞表面上の受容体へのナノ粒子の特異的結合をもたらし、腫瘍細胞中へのナノ粒子の取込みを可能にする標的化ペプチドを提示するナノ粒子を介して、腫瘍中に特異的に送達される。一態様では、腫瘍細胞増殖を標的化および阻害するための組成物が、本明細書に開示される。
Description
本発明は、一般に、医学および分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、腫瘍に標的化された場合に、ヒトまたは動物において抗腫瘍自然免疫応答を活性化するオリゴヌクレオチド、およびその使用のための方法に関する。
一部の低分子干渉RNA(siRNA)は、インターフェロンおよびサイトカイン産生の刺激、タンパク質合成の全体的シャットダウン、mRNAの非特異的分解、ならびに遺伝子の発現の非特異的低減を生じるオフターゲット効果を含む、種々の非特異的副作用を引き起こし得る(Robbinsら、2009年)。多くのsiRNA適用について、特異的遺伝子サイレンシングが好ましく、siRNAの投与後の対象における自然免疫の活性化は、望ましくない副作用とみなされる。
しかし、がん治療では、これらの免疫賦活性siRNAまたは「isRNA」は、がん細胞において望ましい増殖の阻止、分化およびアポトーシスを含む有益な効果を活性化するために、強力な免疫調節剤として使用され得る。したがって、自然免疫系は、腫瘍サプレッサーとして機能し得(Shankaranら、2001年;BuiおよびSchreiber、2007年;Koebelら、2007年)、免疫賦活剤は、抗腫瘍治療において使用され得る。
しかし、ヒトまたは動物において腫瘍細胞に対する自然免疫応答のisRNA活性化を制限することが可能であるが、非腫瘍細胞において一般に可能ではない有効な技術が、未だ必要とされている。
本出願人らは、ヒトまたは動物中の腫瘍細胞にisRNA複合体を特異的に送達するための組成物および方法を、本明細書に開示する。これらの複合体が腫瘍細胞に送達されると、isRNA複合体は、腫瘍細胞における対象の自然免疫応答を特異的に活性化でき、そうすることで、これらに限定されないが、とりわけ増殖の阻止、分化およびアポトーシスなどの有益な効果を誘導する。
一態様では、腫瘍細胞増殖を標的化および阻害するための組成物が、本明細書に開示される。ある特定の実施形態では、組成物は、腫瘍内で自然免疫応答を活性化することが可能な単離されたオリゴヌクレオチド;腫瘍細胞標的化部分(moiety);およびその薬学的に許容される塩を含む。
一態様では、腫瘍内の自然免疫応答を活性化することが可能な単離されたオリゴヌクレオチドを含む、腫瘍細胞増殖を標的化および阻害するための組成物が、本明細書に開示される。一実施形態では、組成物のオリゴヌクレオチドは、配列番号1の核酸配列を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号2の核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、二本鎖である。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、二本鎖であり、一方の鎖は、配列番号1の核酸配列を含み、一方の鎖は、配列番号2の核酸配列を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、二本鎖であり、一方の鎖は、配列番号3の核酸配列を含み、一方の鎖は、配列番号4の核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、二本鎖であり、一方の鎖は、配列番号5の核酸配列を含み、一方の鎖は、配列番号6の核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、組成物のオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数のUGモチーフを含む。一部の実施形態では、組成物のオリゴヌクレオチドの核酸配列は、1つもしくは複数のUGモチーフを含むかまたはUGリッチである。
他の実施形態では、腫瘍細胞増殖を標的化および阻害するための開示される組成物のオリゴヌクレオチドは、細胞において自然免疫系の活性化を促進する少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドを含む。一実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、修飾されたリボースを含む。別の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、O−メチルまたはフルオロ修飾を含む。ある特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、開示される組成物のオリゴヌクレオチドの5’末端から2番目の位置に配置されている。
別の態様では、腫瘍細胞標的化部分を含む、腫瘍細胞増殖を標的化および阻害するための組成物が、本明細書に開示される。ある特定の実施形態では、腫瘍細胞標的化部分は、タンパク質、ペプチドまたはアプタマーである。ある特定の実施形態では、腫瘍細胞標的化部分は、任意の目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第8,680,045号に開示されるような、細胞標的化部分またはドメインのいずれかを含む。
別の態様では、腫瘍細胞増殖を標的化および阻害するための本明細書に開示される組成物は、ナノ粒子をさらに含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、脂質、シクロデキストリン、キトサン、炭水化物ポリマー、エラスチン様ポリマー(ELP)、リン酸カルシウムポリマーまたはそれらの組合せを含む。一実施形態では、ナノ粒子はPEG化されている。具体的な一実施形態では、ナノ粒子はELP−Lである。
別の実施形態では、腫瘍細胞増殖を標的化および阻害するための本明細書に開示される組成物は、リポソームにカプセル化されている。一実施形態では、リポソームはPEG化されている。
別の態様では、腫瘍細胞増殖を標的化および阻害するための開示される組成物を含む医薬組成物が、本明細書に開示される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示される組成物、および薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントを含む。他の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示される組成物、および化学療法薬または化学療法剤を含む。さらに他の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示される組成物および免疫チェックポイント阻害剤を含む。
別の態様では、腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法が、本明細書に開示される。ある特定の実施形態では、方法は、腫瘍細胞において自然免疫応答を活性化することが可能なオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供するステップ、および腫瘍細胞を、腫瘍細胞増殖を阻害するのに十分な量の組成物と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、組成物は、腫瘍細胞増殖を標的化および阻害するための本明細書に開示される組成物である。
別の態様では、対象の自然免疫応答を対象の腫瘍細胞において特異的に活性化するための方法が、本明細書に開示される。一部の実施形態では、方法は、腫瘍細胞において自然免疫応答を活性化することが可能なオリゴヌクレオチドを取得するステップ;オリゴヌクレオチドを腫瘍細胞標的化部分と接触させて、対象中の腫瘍細胞にオリゴヌクレオチドを特異的に送達するような組成物を形成するステップ;および薬学的有効量の組成物を対象に投与するステップを含む。
ある特定の実施形態では、開示される方法のいずれかの腫瘍細胞は、ヒト膀胱細胞、ヒト乳房細胞、ヒト結腸細胞、ヒト肝臓細胞、ヒト肺細胞、ヒト神経芽腫細胞、ヒト卵巣細胞、ヒト膵細胞、ヒト前立腺細胞またはヒト皮膚細胞である。
一態様では、腫瘍細胞において自然免疫応答を活性化することが可能なオリゴヌクレオチドが、本明細書に開示される。本明細書で使用する場合、用語「自然免疫応答」とは、ヒトまたは動物中の細胞および組織における、好ましくは、腫瘍細胞において示差的にまたは優先的に誘導される、非抗原特異的応答を指す。これは、細胞が抗原提示細胞として作用する能力および/または抗原特異的適応免疫応答をモジュレートする能力に影響を与える細胞性変化もまた指す。一実施形態では、自然免疫応答は、ナチュラルキラー(NK)細胞活性の活性化を含む。NK細胞は、病原体に対する第一線の防御に関与する。別の実施形態では、自然免疫応答は、1つまたは複数のサイトカインまたは増殖因子、例えば、非限定的な例では、IFN−α、IFN−γ、IL−1、IL−6、IL−10、IL−12およびTNF−αの産生および/または分泌を含む。自然免疫は、マクロファージ、樹状細胞および単球の関与をさらに含み得る。
免疫系は、腫瘍特異的抗原または細胞性ストレスによって誘導される分子の発現に基づいて腫瘍細胞を同定および排除することが可能である。しかし、腫瘍細胞は、腫瘍免疫監視から逃れることができ、抗腫瘍免疫を増強することを標的化する治療が、現在開発されている(SwannおよびSmyth、2007年)。
本明細書に記載されるisRNAオリゴヌクレオチドは、ある特定の実施形態では、化学的に合成されたオリゴリボヌクレオチドの二重鎖である。これらのisRNA二重鎖は、免疫系に対する有益な効果を有する。いずれかの特定の理論または機構によって束縛されることは意図しないが、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、腫瘍細胞上および腫瘍細胞内のToll様受容体(TLR)を活性化することによって、自然免疫応答を活性化すると考えられる。一旦活性化されると、サイトカインおよび他の細胞傷害性酵素が、樹状細胞、単球/マクロファージおよびナチュラルキラー細胞から放出される。通常、この効果は、とりわけ治療剤としての従来のsiRNA分子の投与が特に関与する臨床実務においては、有害事象とみなされる。
哺乳動物自然免疫系は、潜在的病原体のシグネチャーとして、いくつかの核酸種を認識する。ヒトおよびマウスの両方において、二本鎖RNAを認識する特異的TLR(TLR3)(Alexopoulou、Holtら、2001年)および一本鎖RNA(ssRNA)を認識する特異的TLR(TLR7およびTLR8)(Diebold、Kaishoら、2004年;Heil、Hemmiら、2004年;Lund、Alexopoulouら、2004年)が、同定されている。これらの核酸感知性TLRは、細胞内に局在し、活性化の際に、I型インターフェロン、例えばIFN−α、および炎症性サイトカインを誘導する。TLR7は、典型的には、形質細胞様樹状細胞およびB細胞によって発現され、ssRNAウイルス、ならびにグアノシンおよびウリジンがリッチな合成ssRNAによって活性化される。TLR7およびTLR8は、典型的には、別個の免疫細胞型上で発現されるが、これらのTLRは、類似の核酸を認識する。マウスTLR8は、従来のTLR7/8リガンドに対しては応答せず、最近まで、マウスにおいて非機能的であると考えられていた(Diebold、Kaishoら、2004年)。RNAは、細胞質RNA受容体RIG−1およびMda−5を含むTLRおよびdsRNA依存的タンパク質キナーゼ(PKR)非依存的機構を介して、インターフェロン応答を生じることもできる(Yoneyama、Kikuchiら、2004年)。
リガンドがTLRに結合する場合、シグナルが核に伝達され、細胞内調節分子の合成をコードする遺伝子が発現される(Ulevitch、2004年)。TLRを介した免疫系の活性化は、感染に対する自然免疫応答および適応免疫応答の発達を組織化する炎症促進性サイトカインおよびインターフェロンの迅速な産生を引き起こす。これらの経路の異常なまたは過剰な刺激が、多くの炎症性障害および自己免疫障害の根底にあると考えられている。例えば、全身性エリテマトーデスにおけるRNA関連およびDNA関連自己抗原は、TLR7およびTLR9の活性化を介して、病的自己抗体およびインターフェロンの産生を駆動することが示されている(Lau、Broughtonら、2005年;Vollmer、Tlukら、2005年;Christensen、Shupeら、2006年;Pisitkun、Deaneら、2006年;Subramanian、Tusら、2006年)。
TLR3は、二本鎖RNAに対する公知の受容体である。TLR3は、樹状細胞、線維芽細胞、マクロファージおよび上皮細胞上で発現される(Matsumoto、Funamiら、2004年)。TLR3に対するアダプター分子は、TICAM−Iであり、ここで、TLR3のTICAM−Iへの結合は、I型インターフェロン(IFN−αβ)の産生を最終的にもたらす複数のシグナル伝達カスケードを誘導する(Matsumoto、Funamiら、2004年)。これらのインターフェロンは、RNAを分解することが可能な、したがって、ウイルス複製を防止することが可能な酵素を産生するように非感染細胞を誘導するサイトカインである。インターフェロンはまた、細胞傷害性Tリンパ球、マクロファージおよびNK細胞を含む、防御にとって重要な種々の細胞を活性化する。
一本鎖RNA認識は、マウスではToll様受容体7によって媒介され、ヒトではTLR−8によって媒介される。マウスでは、TLR7は、アダプターMyD88に結合し、IFN−αの活性化をもたらす。Dieboldら(Diebold、Kaishoら、2004年)は、インフルエンザウイルスRNA、ポリウリジル酸およびインビトロで合成されたmRNAが全て、形質細胞様樹状細胞においてIFN−α産生を誘導したことを示した。Heilら(Heil、Hemmiら、2004年)は、ホスホロチオエート末端を有する20残基のグアニンおよびウリジンリッチなRNAオリゴヌクレオチドが、INF−αならびに炎症促進性および調節性サイトカインを分泌するように、樹状細胞およびマクロファージを刺激することを示した。TLR欠損マウスを使用して、これらの著者は、マウスTLR−7およびヒトTLR−8が、一本鎖RNAへの結合を担ったこともまた示した。ヒトTLR−7は、グアニンヌクレオチドアナログによっても活性化される(Lee、Chuangら、2003年)。
二本鎖RNAもまた、PKRと呼ばれる遍在的に発現されるセリン/スレオニンタンパク質キナーゼとの相互作用を介して、自然免疫系を活性化できる。PKRは、細菌LPSのTLR4結合によって活性化されるTLR4カスケードの一部である。PKRは、インターフェロンによって誘導され、dsRNA、サイトカイン、増殖因子およびストレスシグナルによって活性化される。PKRは、dsRNAへの結合の際に自己リン酸化され、活性化される。活性化は、eIF2aリン酸化を介したタンパク質合成の阻害を生じ、また、異なる転写因子の活性化のPKR依存的シグナル伝達によって、炎症性遺伝子の転写を誘導する(Williams、1999年)。PKRは、NF−κB発現をその阻害因子IkBのリン酸化を介して上方調節する(Kumar、Haqueら、1994年)。11塩基対ほどの小さなdsRNAはPKRに結合し、活性を誘導できるが、最大の活性化は、少なくとも30塩基対を必要とする(Manche、Greenら、1992年)。
本明細書に記載されるisRNA剤は、核酸またはヌクレオチドアナログに結合することが公知の受容体のうち1つを介して、自然免疫系を活性化し得る。siRNA二重鎖は、ある特定の条件下でヒト細胞において免疫応答を誘発できることが報告されている。Sledzら(SledzおよびWilliams、2003年)は、試験した6つの異なるsiRNA二重鎖の各々によるインターフェロン系の誘導を報告した。Bridgeら(Bridge、Pebernardら、2003年)は、ウイルスベクターを使用して送達されたいくつかのshRNAが、インターフェロン刺激された遺伝子の発現を誘導することを報告した。これら2つの報告は、siRNA二重鎖がPKRを活性化することを示した。対照的に、Karikoらからのデータは、TLR3経路およびTLR3活性化が、濃度依存的であったことを暗示した(Kariko、Bhuyanら、2004年)。
自然免疫応答の活性化は、ウイルス感染からがんまでの範囲の疾患において有利である(Whitmore、DeVeerら、2004年)。isRNA剤は、自然免疫を活性化すると予想され、それに続いて適応免疫応答を形成すると予想される。いくつかのisRNA配列および修飾は、他のものよりも自然免疫応答をより良好に活性化することができる。この活性化は、核酸に結合することが公知の任意のToll様受容体経路:二本鎖RNAに対する受容体であるTLR3;一本鎖RNAに対する受容体であるTLR8;またはdsRNAによって活性化されるタンパク質キナーゼであるPKRを介して起こる可能性がある。これらのタンパク質の各々は、記載されるisRNA剤に類似した分子に結合することが公知である。
修飾されていないか、または対象の免疫系に対して影響を有するように、もしくは対象の免疫系に対して影響を有することを特異的に回避するように修飾されたかのいずれかであるisRNAオリゴヌクレオチド剤が、本明細書にさらに開示される。理論に束縛されることは望まないが、免疫系活性のモジュレーションは、isRNA剤と免疫系の構成要素との相互作用から生じ得ると考えられ、この相互作用は、この構成要素の活性を邪魔または刺激する。これらの効果は、RNAi適用のためのsiRNA分子の伝統的な使用におけるようなRISC媒介性の遺伝子サイレンシングとは独立している。対照的に、本明細書に開示されるisRNA分子は、一本鎖または二本鎖RNAと免疫系のタンパク質構成要素との相互作用を介して作用すると考えられる。
本開示の別の態様では、腫瘍内の自然免疫応答を活性化することが可能なオリゴヌクレオチドは、特異的ヌクレオチド配列を含む。isRNA二重鎖の腫瘍細胞への特異的送達の効果を実証するために使用したオリゴヌクレオチド配列が、以下の表1に示され、ここで、表1の配列中に出現する「m」は、示されたヌクレオシド塩基の2’リボース位置の修飾を示し、dTはデオキシリボチミジンを示す。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、isRNAの二本鎖二重鎖を形成するようにアニーリングされる。一実施形態では、本明細書に開示される二本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号1の核酸配列を含む鎖および配列番号2の核酸配列を含む鎖を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される二本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号3の核酸配列を含む鎖および配列番号4の核酸配列を含む鎖を含む。さらに別の実施形態では、本明細書に開示される二本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号5の核酸配列を含む鎖および配列番号6の核酸配列を含む鎖を含む。
本明細書に開示される単離されたオリゴヌクレオチドおよびisRNA二重鎖は、従来の分子生物学技術によって産生され得る。例えば、対象のdsRNA(例えば、siRNA)の産生は、化学的合成方法または組換え核酸技術によって実施され得る。用語「dsRNA」とは、本明細書で使用する場合、siRNAを含む、RNA干渉(RNAi)が可能な二本鎖RNA分子を指す。二本鎖RNA二重鎖を形成する方法および他のisRNA調製技術は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるJudge、2006年に開示されている。処理された細胞の内因性RNAポリメラーゼが、インビボで転写を媒介してもよいし、またはクローニングされたRNAポリメラーゼをインビトロで転写に使用してもよい。
本明細書で使用する場合、本出願のdsRNAまたはsiRNA分子は、RNAのみを含有する分子に限定される必要はなく、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含し得る。例えば、本明細書に開示されるdsRNAは、例えば、細胞性ヌクレアーゼに対する感受性を低減させるため、バイオアベイラビリティを改善するため、製剤特徴を改善するため、および/または他の薬物動態学的特性を変化させるために、リン酸−糖骨格またはヌクレオシドのいずれかに対する修飾を含み得る。例示であるが、天然RNAのホスホジエステル連結は、少なくとも1つの窒素または硫黄ヘテロ原子を含むように修飾され得る。RNA構造における修飾は、dsRNAに対する全般的な応答を回避しつつ、特異的な遺伝子阻害を可能にするために行われ得る。同様に、塩基は、とりわけアデノシンデアミナーゼ活性を遮断するように、修飾され得る。dsRNAは、酵素的に、または部分的もしくは全体的な有機合成によって産生され得、ここで、任意の修飾されたリボヌクレオチドは、インビトロの酵素的合成または有機合成によって導入され得る。RNA分子を化学的に修飾する方法が、dsRNAを修飾するために適応され得る。単なる例示であるが、dsRNAまたはsiRNAの骨格は、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート(phosphoramidate)、ホスホジチオエート(phosphodithioate)、キメラメチルホスホネート−ホスホジエステル、ペプチド核酸、5−プロピニル−ピリミジン含有オリゴマーまたは糖修飾(例えば、2’−置換リボヌクレオシド、a−立体配置)で修飾され得る。ある特定の場合、本出願のdsRNAは、2’−ヒドロキシ(2’−OH)含有ヌクレオチドを欠く。ある特定の実施形態では、siRNA分子は、ホスホロチオエートセンス鎖を含む。ある特定の実施形態では、siRNA分子は、ホスホジエステルアンチセンス鎖を含む。修飾されたRNA分子を生成するための1つの例示的な方法は、その全体が参照により組み込まれるRobbins、2008年に開示されている。
特記しない限り、本明細書に示される配列は、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端が5’末端であり;二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向が5’方向と称される慣習に従う。新生RNA転写物の、5’から3’の付加の方向は、転写方向と称される;RNAと同じ配列を有し、RNA転写物の5’末端に対して5’側にあるDNA鎖上の配列領域は、「上流配列」と称される;RNAと同じ配列を有し、RNA転写物の3’末端に対して3’側にあるDNA鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。
用語「ポリヌクレオチド」とは、本明細書で使用する場合、少なくとも10塩基長であるヌクレオチドのポリマー形態を意味する。ある特定の実施形態では、これらの塩基は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはヌクレオチドのいずれかの型の修飾形態であり得る。この用語は、DNAまたはRNAの一本鎖形態および二本鎖形態を含む。
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、天然に存在するおよび/または天然に存在しないオリゴヌクレオチド連結によって一緒に連結された、天然に存在するヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に200ヌクレオチド以下を含むポリヌクレオチドサブセットである。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、10〜60ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または30〜40塩基長である。
オリゴヌクレオチドは、例えばアンチセンスRNAとしての使用のための一本鎖、または低分子干渉RNA(siRNA)もしくは低分子(もしくはショート)ヘアピンRNA(shRNA)としての二本鎖であり得る。
オリゴヌクレオチドは、検出可能な標識、例えば、放射能標識、蛍光標識、抗原性標識またはハプテンを含み得る。
用語「取得する」とは、生理学的検体を物理的に所有することを意味する。材料が獲得される様式は、いずれかの具体的なプロセスに限定されない。
用語「天然に存在するヌクレオチド」には、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドが含まれる。用語「修飾されたヌクレオチド」には、修飾または置換された糖基などを有するヌクレオチドが含まれる。用語「オリゴヌクレオチド連結」には、例えば、ホスフェート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート(phoshoraniladate)、ホスホロアミデートなどのオリゴヌクレオチド連結が含まれる。例えば、任意の目的のためにそれらの各々の開示が参照により本明細書に組み込まれる、LaPlancheら、1986年、Nucl. Acids Res. 14巻:9081頁;Stecら、1984年、J. Am. Chem. Soc. 106巻:6077頁;Steinら、1988年、Nucl. Acids Res. 16巻:3209頁;Zonら、1991年、Anti−Cancer Drug Design 6巻:539頁;Zonら、1991年、Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach(F. Eckstein編)、Oxford University Press、Oxford England、87〜108頁;Stecら、米国特許第5,151,510号;UhlmannおよびPeyman、1990年、Chemical Reviews 90巻:543頁を参照のこと。
本明細書で使用する場合、用語「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたオリゴヌクレオチド」とは、ゲノム、cDNAもしくは合成起源またはそれらの組合せのポリヌクレオチドを意味し、その供給源によって、「単離されたポリヌクレオチド」は、(1)ポリヌクレオチドであって、その中に「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見出されるポリヌクレオチドの全てもしくは部分を伴わないか、(2)天然では連結されていないポリヌクレオチドに連結されているか、または(3)より大きい配列の一部として天然に存在しない。
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来または外因性ヌクレオチドの取込みを指すために使用され、細胞は、外因性ヌクレオチドが細胞の内側に導入された場合、「トランスフェクト」される。いくつかのトランスフェクション技術が、当該分野で周知であり、本明細書に開示される。例えば、Grahamら、1973年、Virology 52巻:456頁;Sambrookら、2001年、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.;Davisら、1986年、Basic Methods in Molecular Biology(Elsevier);ならびにChuら、1981年、Gene 13巻:197頁を参照のこと。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、対象への投与のための、リポソームおよびナノ粒子を含む送達ビヒクル;担体および希釈剤ならびにそれらの塩を含み得;医薬組成物中に存在し得る。特定の実施形態では、isRNAは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第8,680,045号に開示されるように、ELP−Lナノ粒子と会合して送達される。核酸分子の送達のための方法は、例えば、Akhtarら、1992年、Trends Cell Bio. 2巻:139頁;Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics、Akhtar編、1995年、Maurerら、1999年、Mol. Membr. Biol. 16巻:129〜140頁;HoflandおよびHuang、1999年、Handb. Exp. Pharmacol.、137巻:165〜192頁;ならびにLeeら、2000年、ACS Symp. Ser. 752巻:184〜192頁に記載されており、これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる。Beigelmanら、米国特許第6,395,713号およびSullivanら、PCT WO94/02595は、細胞および組織中への核酸分子の送達のための一般的な方法をさらに記載している。これらのプロトコルは、細胞中への事実上任意の核酸分子の送達のために利用され得る。核酸分子は、これに限定されないがリポソームにおけるカプセル化など当業者に公知の種々の方法によって、イオン導入によって、または他の送達ビヒクル、例えば、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセルおよび生体接着性(bioadhesive)ミクロスフェア中への取込みによって、またはタンパク質性ベクターによって、細胞に投与され得る(例えば、O’HareおよびNormand、国際PCT公開番号WO00/53722を参照のこと)。
本明細書に開示されるナノ粒子は、典型的には、ヌクレオチドまたは薬物剤を束ね、血液中で分子を安定化する、化学的ベースのシェル構造である。ナノ粒子は、糖、デキストラン、リン酸カルシウム、キトサン、ペプチドおよび/またはプラスチックポリマーを含む場合が多い。がん薬物送達のための薬物剤がロードされたナノ粒子は、好ましくは、以下の特性を有する:1)高い純度および収量で、数ステップで合成することが容易である;2)100nm未満のサイズを有する、単分散の、薬物がロードされたナノ粒子へとアセンブルする;3)多様な薬物のカプセル化を可能にする;4)好都合な薬物動態および腫瘍蓄積を示す;5)制御された調節可能な速度論で薬物を放出する;6)治療応答をもたらす;ならびに7)有害な毒性なしに身体からのクリアランスを可能にするように、非毒性構成要素へと分解する。いくつかの異なるナノスケールの送達系が、がん治療のために提案されてきたが、ほとんどは、系を臨床実施へと移すために重要なこれらの基準を満たしていない。
ELP薬物送達ナノ粒子は、腫瘍血管およびリンパ脈管構造の異常から生じる血管透過性・滞留性亢進(enhanced permeability and retention)(EPR)効果に起因して、腫瘍に特異的に進入すると考えられる。本明細書に開示されるELPナノ粒子を使用することによって、自然免疫系は、腫瘍内でのみ活性化され、自然免疫系の全身性の活性化が防止される。しかし、本発明は、ELPナノ粒子に限定されない。本発明の他の実施形態は、(1)ヌクレオチド分子を運搬できる、(2)従来の化学療法剤を運搬できるまたは運搬できない、および(3)特定の腫瘍型を標的化するペプチド分子を収納できる、リポソーム、ポリデキストランまたは他のポリマーを利用し得る。
あるいは、核酸/ビヒクルの組合せは、直接注射によって、または注入ポンプの使用によって、局所的に送達され得る。本発明の核酸分子の直接注射は、皮下、筋内または真皮内のいずれであれ、標準的な針およびシリンジの方法を使用して、またはConryら、1999年、Clin. Cancer Res. 5巻:2330〜2337頁およびBarryら、国際PCT公開番号WO99/31262に記載されるものなどの針を使用しないテクノロジーによって、行われ得る。当該分野における多くの例が、浸透圧ポンプ(Chunら、1998年、Neuroscience Letters 257巻:135〜138頁、D’Aldinら、1998年、Mol. Brain Research 55巻:151〜164頁、Drydenら、1998年、J. Endocrinol. 157巻:169〜175頁、Ghirnikarら、1998年、Neuroscience Letters 247巻:21〜24頁を参照のこと)または直接注入(Broaddusら、1997年、Neurosurg. Focus 3巻、論文4)による、オリゴヌクレオチドの送達方法を記載している。他の送達経路には、経口送達(例えば、錠剤または丸剤形態)および/またはくも膜下腔内送達(Gold、1997年、Neuroscience 76巻:1153〜1158頁)が含まれるがこれらに限定されない。核酸の送達および投与のより詳細な説明は、Sullivanら、PCT WO94/02595、Draperら、PCT WO93/23569、Beigelmanら、PCT WO99/05094およびKlimukら、PCT WO99/04819中に提供され、これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、オリゴヌクレオチドおよび細胞標的化部分(細胞標的化ドメインまたはCTDとも呼ばれる)を含む。ある特定の実施形態では、細胞標的化部分は、ポリペプチドである。例示的な細胞標的化ポリペプチドは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第8,680,045号に開示されている。
CTDは、任意の特定のポリペプチド配列に限定されない。これは、任意の所望の生物学的分子を標的化するように設計され得る。特定の実施形態では、生物学的分子は、所望の細胞型において特異的に発現される。任意の細胞が、標的化のために選択され得る。ある特定の実施形態では、標的細胞は、真核生物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはげっ歯類またはヒト細胞である。特定の実施形態では、標的細胞は腫瘍細胞である。本発明によって企図される腫瘍細胞の非限定的な例には、ヒト膀胱細胞、ヒト乳房細胞、ヒト結腸細胞、ヒト肝臓細胞、ヒト肺細胞、ヒト神経芽腫細胞、ヒト卵巣細胞、ヒト膵細胞、ヒト前立腺細胞またはヒト皮膚細胞である腫瘍細胞が含まれる。さらに、標的細胞は、本発明の方法によって処置される患者に影響を与える疾患または状態に基づいて選択され得る。
一態様では、CTDを、腫瘍細胞において発現されるが非腫瘍細胞では発現されない生物学的分子を標的化するように、本明細書に開示されるように設計した(例えば、腫瘍細胞標的化部分)。本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、細胞標的化部分を提示するナノ粒子を使用して、腫瘍中に特異的に送達されるように設計される。ある特定の実施形態では、ポリペプチドのCTDは、腫瘍細胞に対して特異的なペプチドリガンドを含む。これらの細胞標的化部分は、腫瘍細胞表面上の受容体へのナノ粒子の特異的結合を付与し得、エンドサイトーシス、ピノサイトーシスまたは他の細胞膜関与機構による腫瘍細胞中へのナノ粒子の特異的取込みを可能にする。一実施形態では、CTDは、L1細胞接着分子(L1CAM)に結合するペプチドリガンドを含む。特異的腫瘍細胞を標的化することは、腫瘍探索性ELPナノ粒子において送達される薬物の特異的標的化によるがん治療の副作用の低減に起因して、有利である。本明細書に開示されるように、isRNA分子とのCTDの使用は、非腫瘍細胞における自然免疫応答の活性化を低減させ得、したがって、isRNAが投与された対象における望ましくない副作用を低減させる。
他の実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子が細胞膜に透過できるように縮合していてもよい。かかる代替的実施形態では、ナノ粒子は、細胞の内側の生物学的分子、例えば、エンドソーム中のTLR、および細胞質中の他の自然免疫活性化因子と接触し得る。
本発明のさらなる実施形態では、さらなる標的化リガンドが、薬物剤を含有するリポソームまたはナノ粒子と会合され、これはアポトーシス破壊のために指定された腫瘍細胞上の受容体を標的化する。リポソームはまた、循環中でのリポソームの寿命を延長させるために、ポリエチレングリコールでコーティングされ得る(即ち、PEG化される)。同様に、ナノ粒子もそのようにコーティングされ得る。
標的化分子は、標的細胞表面上の受容体に特異的に結合する、アプタマーと称される有機の化学的リンカーであり得る。これらのアプタマーは、リポソームの脂質またはナノ粒子のポリマーに共有結合的に連結され得る。リポソームまたはナノ粒子を腫瘍細胞へと標的化するために使用され得る他の分子は、腫瘍細胞表面上の特定の受容体に対して指向される、ペプチド、タンパク質または抗体である。
ある特定の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および/またはアジュバントと一緒に、治療有効量の本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド、ナノ粒子および/または薬物剤を含む医薬組成物が、本明細書に開示される。用語「医薬組成物」とは、本明細書で使用する場合、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤、および患者に適切に投与された場合に所望の治療効果を誘導することが可能な本明細書に記載される化合物、ペプチドまたは組成物を含む、組成物を指す。用語「治療有効量」とは、哺乳動物において治療応答を生じるように決定された、本発明のスクリーニング方法において同定された本発明の医薬組成物または化合物の量を指す。かかる治療有効量は、本明細書に記載される方法を使用して、当業者に容易に確認される。
本発明は、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド、ポリペプチド、ナノ粒子または薬物剤を含む医薬組成物をさらに提供する。特に、isRNAオリゴヌクレオチドおよび他の薬物剤は、ELPナノ粒子、例えば、ELP−Lナノ粒子と会合させて送達される。
許容される製剤材料は、好ましくは、使用される投薬量および濃度において、レシピエントにとって非毒性である。医薬組成物は、例えば、組成物のpH、モル浸透圧濃度、粘度、透明性、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着または浸透を修飾、維持または保存するための製剤材料を含有し得る。適切な製剤材料には、アミノ酸(例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン);抗菌薬;抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム);緩衝剤(例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、Tris−HCl、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸);充填剤(例えば、マンニトールまたはグリシン);キレート剤(例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA));錯化剤(例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン);フィラー;単糖、二糖および他の炭水化物(例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン);タンパク質(例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン);着色剤、香味剤および希釈化剤;乳化剤;親水性ポリマー(例えば、ポリビニルピロリドン);低分子量ポリペプチド;塩形成性対イオン(例えば、ナトリウム);防腐剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素);溶媒(例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール);糖アルコール(例えば、マンニトールまたはソルビトール);懸濁剤;界面活性剤もしくは湿潤剤(例えば、プルロニック、ポリエチレングリコール(PEG)、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート20およびポリソルベート80、Triton、トリメタミン(trimethamine)、レシチン、コレステロールまたはチロキサポール(tyloxapal));安定性増強剤(例えば、スクロースまたはソルビトール);浸透圧増強剤(例えば、アルカリ金属ハライド、好ましくは塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム、マンニトールまたはソルビトール);送達ビヒクル;希釈剤;賦形剤ならびに/または医薬品アジュバントが含まれるがこれらに限定されない。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第18版(A. R. Gennaro編)、1990年、Mack Publishing Companyを参照のこと。
別の態様では、本明細書に開示されるisRNAオリゴヌクレオチドは、化学療法剤、抗生物質または第2のRNA剤であり得る第2の治療薬と併せても使用され得る。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるisRNAオリゴヌクレオチドは、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて医薬組成物中で使用される。薬物のこの組合せは、免疫チェックポイント阻害剤によって付与されるように、腫瘍細胞における免疫応答の遮断を除去することが可能であり、一方で本明細書に開示されるisRNAは、自然免疫系を活性化する。このように、免疫応答活性化に対する相乗効果が、薬剤のこの組合せを使用して観察され得る。例示的な免疫チェックポイント標的は、表2中に列挙される。
免疫チェックポイント阻害剤は、例えば、治療抗体、阻害的ヌクレオチドまたは小分子阻害剤であり得る。例えば、免疫チェックポイント阻害剤として作用する多くの抗体、例えば、ペンブロリズマブ(MK−3475、Merck)、ニボルマブ(BMS−936558、Bristol−Myers Squibb)、ピディリズマブ(CT−011、CureTech Ltd.)、AMP−224(Merck)、MDX−1105(Medarex)、MEDI4736(MedImmune)、MPDL3280A(Genentech)、BMS−936559(Bristol−Myers Squibb)、イピリムマブ(Bristol−Myers Squibb)およびトレメリムマブ(Pfizer)が、当該分野で公知である。免疫系を抑制する他の化合物もまた、PKR経路の妨害を含め、がんを処置する際に有用であり得る(Pikarskyら、Nature、2004年、431巻、461〜466頁;Huberら、J. Clin. Invest.、2004年、114巻、569〜581頁)。
持続送達性製剤または制御送達性製剤において本発明のナノ粒子または化合物を含む製剤を含むさらなる医薬組成物が、当業者に明らかである。種々の他の持続送達手段または制御送達手段、例えば、リポソーム担体、生体浸食性(bio−erodible)微粒子または多孔性ビーズおよびデポー注射を製剤化するための技術もまた、当業者に公知である。例えば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマー性微粒子の制御放出を記載するPCT出願番号PCT/US93/00829を参照のこと。持続放出性調製物として、成型物品、例えば、フィルムもしくはマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックス、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号およびEP058,481)、L−グルタミン酸およびガンマエチル−L−グルタメートのコポリマー(Sidmanら、1983年、Biopolymers 22巻:547〜556頁)、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)(Langerら、1981年、J. Biomed. Mater. Res. 15巻:167〜277頁)およびLanger、1982年、Chem. Tech. 12巻:98〜105頁)、エチレン酢酸ビニル(Langerら、同上)またはポリ−D(−)−3−ヒドロキシ酪酸(EP133.988)が挙げられ得る。徐放性組成物として、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製され得るリポソームが挙げられ得る。例えば、Eppsteinら、1985年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82巻:3688〜3692頁;EP036,676;EP088,046およびEP143,949を参照のこと。
本発明は、さらなる限定として解釈すべきではない以下の実施例によって、さらに説明される。配列表、図面、ならびに本出願を通じて引用される全ての参考文献、特許および特許出願公開の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
さらに、本発明によれば、当業者の技術範囲内の従来の分子生物学、微生物学および組換えDNA技術が使用され得る。かかる技術は、文献中で完全に説明されている。例えば、Sambrook、FritschおよびManiatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(1989年)Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York(本明細書で「Sambrookら、1989年」);DNA Cloning: A Practical Approach、第IおよびII巻(D.N. Glover編、1985年);Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait編、1984年);Nucleic Acid Hybridization[B.D. HamesおよびS.J.Higgins編(1985年)];Transcription And Translation[B.D. HamesおよびS.J. Higgins編(1984年)];Animal Cell Culture[R.I. Freshney編(1986年)];Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press(1986年)];B. Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning(1984年);F.M. Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, Inc.(1994年)を参照のこと。
(実施例1)
末梢血単核球(PBMC)へのisRNA送達および取込みの評価
(実施例1)
末梢血単核球(PBMC)へのisRNA送達および取込みの評価
全血由来の末梢血単核球(PBMC)を購入し(Allcells、Alameda、CA)、6ウェルプレート中で培養した。一般に、PBMCは、リンパ球(T細胞、B細胞、NK細胞などが含まれる)および単球から構成される。
PBMC中へのisRNAの取込みを評価するために、蛍光標識した非標的化siGLO対照siRNA(Dharmacon)を、市販のリポソーム製剤DharmaFect 4(DF4)(Dharmacon)または任意の目的のためにその全体が参照により組み込まれる米国特許第8,680,045号に記載されるポリペプチドベースのナノ粒子ELP−Lのいずれかと縮合させた。
isRNA:ELP−Lナノ複合体を、100pmol(1.33μg)のisRNAを漸増濃度のELP−Lタンパク質と共に室温で30分間にわたってインキュベートすることによって確認した。次いで、これらの産物を、1×TAE緩衝液中の1%アガロースゲル上での、120Vで30分間の電気泳動分離に供した。ELP−Lナノ粒子へのisRNAの特異的結合は、そのサイズを、35,000ダルトンからおよそ500倍増加させる。したがって、isRNA/ELP−Lナノ複合体の形成を、その高い分子量に起因する、アガロースゲルのウェル内でのナノ複合体の観察された保持によって確認した(データ示さず)。isRNA/ELP−Lのナノ複合体は、全てのインビトロおよびインビボ研究について、この様式で組み立てた。
PBMC中への縮合siGLO siRNAの取込みを、フローサイトメトリーによって定量化し、40×の倍率でOlympus IMT−2蛍光顕微鏡を使用して観察した。図2に示されるように、DF4のナノ複合体よりも、ELP−Lナノ複合体に曝露された細胞においてsiGLOのはるかに多い取込みが存在した。
(実施例2)
PBMCによって活性化された、ヒト卵巣がん細胞に対するisRNAの効果
(実施例2)
PBMCによって活性化された、ヒト卵巣がん細胞に対するisRNAの効果
ホタルルシフェラーゼを安定に発現するSKOV−3細胞株(ヒト卵巣がん細胞)を、従来の分子生物学技術を使用して、pGL−3プラスミド(Promega)から生成した。この細胞株(SKOV−3 GL3と呼ばれる)からのルシフェラーゼ発現を、以下の研究において、細胞生存度のサロゲートとして使用した。
isRNA二重鎖は、Dharmacon(Lafayette、CO)によって生成された。簡潔に述べると、配列番号1および配列番号2に従うオリゴヌクレオチドを合成し、2’−ヒドロキシル形態に変換し、アニーリングし、脱塩し、透析し、無菌濾過し、こうしてisRNA二重鎖を生成した。二本鎖RNA二重鎖の形成および他のisRNA調製技術に関するさらなる詳細は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるJudge、2006年に開示されている。二重鎖の正体を、MALDI−TOF質量分析を使用して確認した。次いで、このisRNA二重鎖を、上記のようにDF4またはELP−Lのいずれかと縮合させ、siGLOを対照siRNA分子とした。
PBMCを、DharmaFECT(DF4)またはELP−Lナノ粒子を使用して、50nMの、DF4またはELP−Lのいずれかと複合体化したisRNAまたはsiGLOで16時間にわたって処理した。SKOV−3 GL3細胞を、24ウェルプレートの1ウェル当たり2,000細胞の密度で播種し、16時間にわたってインキュベートし、その後、処理されたPBMCを、1ウェル当たり20,000の細胞密度で添加した。SK−OV−3 GL3細胞のルシフェラーゼ活性を、4日間の共培養の後に測定した(図3、グラフA)。
サロゲートとしてルシフェラーゼ発現を使用して、これらの研究は、縮合isRNA二重鎖が、PBMCと共培養したSKOV−3細胞において、細胞生存度を低減できることを実証した。これらの生存度の減少は、ELP−Lナノ粒子を使用して送達されたisRNAオリゴヌクレオチドが、共培養された腫瘍細胞の生存度を低減または排除することが可能な種を生じるPBMCの活性化を可能とすることを示した。
図3(グラフA)に示されるように、16時間にわたって50nMのisRNA二重鎖に曝露させたPBMCと共培養したSK−OV−3 GL−3細胞は、対照siGLO siRNAに曝露させた細胞よりも、有意に低量のルシフェラーゼを発現した。具体的には、isRNA:DF4複合体に曝露させたPBMCと共培養したSK−OV−3 GL−3細胞は、siGLO:DF4複合体に曝露させたPBMCと共培養したSK−OV−3 GL−3細胞よりも、95%低いRLUを生じ、isRNA:ELP−L複合体に曝露させた細胞は、siGLO:ELP−L複合体に曝露させた細胞よりも、30%低いRLUを生じた。対照として、PBMC共培養なしで、50nMのisRNA:DF4二重鎖または50nMのsiGLO:DF4二重鎖に曝露させたSKOV−3 GL3細胞では、ルシフェラーゼ活性に対する影響は存在しなかった(図3、グラフB)。
(実施例3)
PBMCによって活性化された、ヒト膵がん細胞に対するisRNAの効果
(実施例3)
PBMCによって活性化された、ヒト膵がん細胞に対するisRNAの効果
前の実施例(実施例2)の実験を、ヒト膵がん細胞株(Panc1)を使用して繰り返した。ホタルルシフェラーゼを安定に発現するPanc1細胞株を、従来の分子生物学技術を使用して、pGL−3プラスミド(Promega)から生成し、したがって、これを本明細書でPanc1 GL3と称した。isRNA投与およびPBMCの共培養の時間経過は、実施例2で使用したものと同一であった。Panc1 GL3細胞株からのルシフェラーゼ発現を、実質的に実施例2において上に示されるように実施した以下の研究において、細胞生存度のサロゲートとして使用した。
図4(グラフA)に示されるように、16時間にわたって50nMのisRNA二重鎖に曝露させたPBMCと共培養したPanc1 GL−3細胞は、50nMの対照siGLO siRNAに曝露させたPBMCと共培養したPanc1 GL−3細胞よりも、有意に低い量のルシフェラーゼを発現した。対照として、PBMC共培養なしで、50nMのisRNA:DF4二重鎖または50nMのsiGLO:DF4二重鎖に曝露させたPanc1 GL3細胞では、ルシフェラーゼ発現に対する影響は存在しなかった(図4、グラフB)。
これらの結果は、本明細書に提供されるisRNA試薬による処理後にPBMCにおいて誘導される腫瘍細胞死滅能の普遍性、および実施例2に示される抗腫瘍効果がヒト卵巣がん細胞だけに限定されなかいことを確認した。
(実施例4)
RT−PCRによる、処理されたPBMCにおけるサイトカインの発現の測定
(実施例4)
RT−PCRによる、処理されたPBMCにおけるサイトカインの発現の測定
PBMCは、自然免疫系のナチュラルキラー(NK)細胞、樹状細胞および単球細胞ならびに細胞傷害性T細胞を活性化するサイトカインを産生および放出して対象からがん細胞を除去する。isRNA複合体がPBMCを活性化してサイトカインを産生させるかどうかを評価するために、RT−PCRを、共培養した細胞に対して実施して、TLR活性化に応答する代表的サイトカインの産生を評価した。IL−6およびインターフェロンアルファ(INF−α)を、RT−PCR分析のための代表的サイトカインとして選択した。
実施例2および3に示されるようにisRNA複合体で処理した共培養したPBMC由来のRNAを、GeneJET RNA Purification Kit(Fermentas)を使用して精製し、定量化した。各試料由来のRNAおよそ100ngを、Verso cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific Inc.、MA)を使用する第1鎖cDNA合成に使用した。第1鎖cDNAのごく一部(試料のおよそ1/25)を、DreamTaq Green Mix(Fermentas)を使用し、IL−6またはINF−αを増幅するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いたPCRに使用した。β−アクチンの発現もまた増幅し、標準化対照として測定した。記載したとおりのRT−PCRを、さらなる対照としてsiGLOで処理したPBMCに対しても実施した。IL−6、INF−αおよびβ−アクチンcDNAのPCR増幅に使用したプライマーを、以下の表3に列挙する。
図5に示されるように、INF−αおよびIL−6 mRNAの増加した発現が、siGLO処理したPBMCと比較して、isRNA処理したPBMCにおいて観察された。これらの結果は、isRNAがPBMCにおいてサイトカイン産生を増加させることを示し、これは、自然免疫系の細胞、例えば、NK細胞、樹状細胞および単球細胞ならびに細胞傷害性T細胞の増加した活性化を示す。
(実施例5)
腫瘍小結節のサイズおよび数に対するisRNAの効果
(実施例5)
腫瘍小結節のサイズおよび数に対するisRNAの効果
isRNAの効果をインビボで試験するために、胸腺欠損Balb/cマウスに、SKOV−3 GL3細胞(ルシフェラーゼを発現するヒト卵巣がん細胞)を注射し、腫瘍を、4週間にわたって増殖させた。次いで、マウスに、ビヒクル(5%デキストロース)、または2mg/kg(1用量当たり約0.4mg)もしくは10mg/kg(1用量当たり約1.2mg)の濃度で、ELP−Lと縮合したisRNA二重鎖を、4週間にわたって1週間に2回投薬した。isRNA:ELP−L複合体を、上記のように調製した。
図6(パートA)に示されるように、ルシフェラーゼ発光を、生きたマウスにおいて測定した。生物発光を定量化したところ、最後の用量の後に、生物発光における50%超の減少が示された(図6、パートB)。
腫瘍を、マウスから摘除し、計数し、計量した。結果を表4および図7に示す。示されるように、腫瘍の重量(図7、グラフA)および腫瘍小結節の数(図7、グラフB)は、用量依存的様式で減少した。これらの結果は、実施例1で調製した、ELP−Lと縮合したisRNA二重鎖が、インビボで抗腫瘍活性を示すことを示している。
(実施例6)
isRNA二重鎖による腫瘍の処置後のマウスにおけるサイトカインの発現の測定
isRNA二重鎖による腫瘍の処置後のマウスにおけるサイトカインの発現の測定
マウスに投与された場合にisRNA二重鎖が自然免疫応答を活性化できるかどうかを決定するために、RT−PCRを使用して、10mg/mlのisRNA二重鎖で処置したマウスから摘除した腫瘍におけるIL−6およびINF−αの発現を測定した。ビヒクル(5%デキストロース)を投薬したマウスから摘除した腫瘍におけるIL−6およびINF−αの発現もまた、対照として測定した。RT−PCRを、実施例4に既に記載したように実施した。
図8に示されるように、10mg/mlのisRNA二重鎖の投薬レジメンを受けたマウスは、INF−αの増加した発現を示した。この特定の実験では、2つの群間で、IL−6発現における有意差は観察されなかった。
(実施例7)
isRNA処置を受けているマウスにおける肝臓および腎臓の損傷の評価
(実施例7)
isRNA処置を受けているマウスにおける肝臓および腎臓の損傷の評価
isRNAおよびビヒクルを投薬したマウスにおける肝臓および腎臓の損傷の評価を、肝臓および腎臓の機能の従来のバイオマーカーを測定することによって実施した。結果を以下の表5に示す。10mg/kgのisRNA投薬レジメンを受けたマウスは、ビヒクルを投薬したマウスより、約67%の平均AST増加および約128%の平均ALT増加を示した(表5、列1〜2を参照のこと)。この増加にもかかわらず、10mg/kgのisRNAを投薬したマウスについてのASTおよびALTの数字は、正常な許容範囲内に入った。血中尿素窒素(BUN)対クレアチニンの比率は、isRNA投薬群とビヒクル投薬群との間で、いずれの有意な増加も示さなかった(表5、列3〜5を参照のこと)。肝臓および腎臓毒性のこの欠如は、isRNAが腫瘍細胞に首尾よく送達されたが、正常な健康細胞には影響を与えなかったことを示した。これらの結果は、安全かつ有効な抗腫瘍剤である、ELP−Lナノ粒子を使用したisRNAの送達と一致している。
本発明を、その具体的実施形態を参照して詳細に記載してきたが、改変およびバリエーションが、添付の特許請求の範囲に規定された本発明の範囲から逸脱することなしに可能であることが明らかである。より具体的には、本発明の一部の態様は、特に有利であるとして本明細書で特定されているが、本発明は、本発明のこれらの特定の態様に必ずしも限定されないことが企図される。
引用文献
引用文献
Claims (27)
- 腫瘍細胞増殖を標的化および阻害するための組成物であって、
腫瘍内の自然免疫応答を活性化することが可能な単離されたオリゴヌクレオチド;
腫瘍細胞標的化部分;および
その薬学的に許容される塩
を含む、組成物。 - 前記オリゴヌクレオチドが、1つまたは複数のUGリッチモチーフを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、3’末端近傍に高い割合のグアノシンおよびウリジン残基を含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号1の核酸配列を含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号2の核酸配列を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが二本鎖である、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
- 前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、
配列番号1の核酸配列を含む鎖、および
配列番号2の核酸配列を含む鎖
を含む、請求項6に記載の組成物。 - 前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、
配列番号3の核酸配列を含む鎖、および
配列番号4の核酸配列を含む鎖
を含む、請求項6に記載の組成物。 - 前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、
配列番号5の核酸配列を含む鎖、および
配列番号6の核酸配列を含む鎖
を含む、請求項6に記載の組成物。 - 前記オリゴヌクレオチドが、細胞において前記自然免疫系の活性化を促進する少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドを含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
- 前記修飾されたヌクレオチドが、修飾されたリボースを含む、請求項10に記載の組成物。
- 前記修飾されたヌクレオチドが、O−メチルまたはフルオロ修飾を含む、請求項10に記載の組成物。
- 前記修飾されたヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの5’末端から2番目の位置に配置されている、請求項10に記載の組成物。
- 前記腫瘍細胞標的化部分が、タンパク質、ペプチドまたはアプタマーである、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
- ナノ粒子をさらに含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
- 前記ナノ粒子が、脂質、シクロデキストリン、キトサン、炭水化物ポリマー、エラスチン様ポリマー(ELP)、リン酸カルシウムポリマーまたはそれらの組合せを含む、請求項15に記載の組成物。
- 前記ナノ粒子がPEG化されている、請求項15に記載の組成物。
- 前記ナノ粒子がELP−Lである、請求項15に記載の組成物。
- リポソームにカプセル化されている、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
- 前記リポソームがPEG化されている、請求項19に記載の組成物。
- 上記請求項のいずれかに記載の組成物;および
薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバント
を含む、医薬組成物。 - 化学療法薬または化学療法剤をさらに含む、請求項21に記載の医薬組成物。
- 免疫チェックポイント阻害剤をさらに含む、請求項21に記載の医薬組成物。
- 腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法であって、
前記腫瘍細胞において自然免疫応答を活性化することが可能なオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供するステップ、および
前記腫瘍細胞を、腫瘍細胞増殖を阻害するのに十分な量の前記組成物と接触させるステップ
を含む、方法。 - 前記組成物が、上記請求項のいずれかに記載の組成物である、請求項24に記載の方法。
- 対象の自然免疫応答を前記対象の腫瘍細胞において特異的に活性化するための方法であって、
腫瘍細胞において前記自然免疫応答を活性化することが可能なオリゴヌクレオチドを取得するステップ;
前記オリゴヌクレオチドを腫瘍細胞標的化部分と接触させて、前記対象中の腫瘍細胞に前記オリゴヌクレオチドを特異的に送達するような組成物を形成するステップ;および
薬学的有効量の前記組成物を前記対象に投与するステップ
を含む、方法。 - 前記腫瘍細胞が、ヒト膀胱細胞、ヒト乳房細胞、ヒト結腸細胞、ヒト肝臓細胞、ヒト肺細胞、ヒト神経芽腫細胞、ヒト卵巣細胞、ヒト膵細胞、ヒト前立腺細胞またはヒト皮膚細胞である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
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