BR112021012715A2

BR112021012715A2 - Silenciamento de tgf-beta 1 e cox2 usando sirnas entregues em combinação com inibidores imune checkpoint para tratar câncer

Info

Publication number: BR112021012715A2
Application number: BR112021012715-1A
Authority: BR
Inventors: David M. Evans; Patrick Y. Lu
Original assignee: Sirnaomics, Inc.
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2021-09-21
Also published as: AU2019414427A1; IL284412A; JP2022515868A; EP3902817A4; CA3125285A1; EP3902817A1; WO2020139897A1; CN114144423A; US20210324384A1; KR20220030203A

Abstract

silenciamento de tgf-beta 1 e cox2 usando sirnas liberados em combinação com inibidores de ponto de referência imune para tratamento de câncer. a presente invenção fornece certas moléculas farmacêuticas e composições e métodos de utilização dos mesmos para o trata-mento de cancro. as moléculas são moléculas de rna de interferência pequena (sirna) que inibem tgf-beta 1 e cox2 em humanos e outros mamíferos, que são usados sozinhos ou em combinação com inibidores de ponto de controle imune, para tratar câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SILEN- CIAMENTO DE TGF-BETA 1 E COX2 USANDO SIRNAS LIBERA-

DOS EM UMA NANOPARTÍCULA DE POLIPEPTÍDEO SOZINHA E

EM COMBINAÇÃO COM INIBIDORES DE PONTO DE REFERÊNCIA IMUNE PARA TRATAMENTO DE CÂNCER". Referência-Cruzada a pedidos de patente relacionados

[0001] Este pedido de patente reivindica o benefício de, e priorida- de para pedido de patente provisório Nº: 62/785.647, depositado em 27 de dezembro de 2018, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Listagem de Sequências

[0002] O presente pedido de patente contém uma Listagem de Sequências que foi apresentada eletronicamente em formato ASCII e é aqui incorporada por referência em sua totalidade. A dita cópia AS- CIl, criada em 14 de Fevereiro de 2020, é nomeada 4690 0016i SL.txt e é de 8518 bytes em tamanho. Campo da Invenção

[0003] A invenção refere-se a certas moléculas e composições farmacêuticas e seus usos para tratamento de câncer e, em particular, ao uso de moléculas de RNA interferente pequenas que inibem TGF- beta 1 e Cox 2, sozinhas ou em combinação com inibidores de ponto de referência imunes, para tratamento de câncer. Antecedentes

[0004] Trabalho recente identificou inibidores de ponto de referên- cia imune como importantes alvos na luta contra câncer. Receptores como PD-1 (sobre a superfície de células T) podem interagir com |i- gantes (por exemplo, PD-L1) sobre a superfície de células de tumor, e esta ligação entre estas moléculas resulta em um sinal para a célula-T de que o tumor não deve ser destruído. Consequentemente, este me- canismo de sinalização foi inteiramente estudado para tentar identifi-

cação de meios para bloqueio do mesmo e, por isso, promover o reco- nhecimento imune de tumores, com o resultante aumento em morte de tumor que isto produz.

[0005] Existem muitos pontos de referência que foram descober- tos, incluindo CTLAA4, Lag3, Tim3, PD-1 e PD-L1. Anticorpos contra PD1 ou contra PD-L1, por exemplo, foram demonstrados bloquearem a interação entre o receptor PD-1 e o ligante PD-L1, e isto inibe o sinal de "não me coma" da célula de tumor para a célula-T, que de outro modo evita que a célula-T estabeleça sua resposta normal para tumo- res e outras células estranhas através de liberação de enzimas que matam as células.

[0006] Com a migração destes anticorpos (pembrolizumabe, Keyt- truda, etc.) para a clínica, foi verificado que tratamento de pacientes com estes agentes pode promover uma resposta imune muito forte em cerca de 30% de pacientes que resultou em uma cura de longa dura- ção destes pacientes. Entretanto, não foi claramente entendido porque esta resposta foi vista em somente 30% dos pacientes tratados, e en- tão pesquisa foi focada extensivamente sobre outros caminhos e me- canismos sinalizantes podem estar em desempenho para inibir a rea- ção imune e a habilidade de células-T para matar células de tumor.

[0007] Interferência de RNA (RNAi) é um processo de degradação de RNA específico de sequência que proporciona uma maneira relati- vamente fácil e direta para nocautear, ou silenciar, teoricamente qual- quer gene contendo a sequência homóloga. Em RNAi ocorrendo natu- ralmente, um RNA de fita dupla (dsRNA) é clivado por uma proteína helicase / RNase Ill, Dicer, em pequenas molécu las de RNA interfer- rente (siRNA), dsRNA de 19-27 nucleotídeos (nt) com projeções de 2- nt nas extremidades 3'. A seguir, os siRNAs são incorporados em uma ribonuclease — multicomponentes chamada complexo — silenciamento — induzido — RNA (RISC). Uma fita de siRNA permanece associada com RISC para guiar o complexo na direção de um RNA cognato que tem uma sequência complementar para o ss-siRNA guia em RISC. Es- ta endonuclease dirigida-siRNA digere o RNA, resultando em trunca- ção e inativação do RNA alvejado. Estudos recentes revelaram a utili- dade de siRNAs 21-27 nt sintetizados quimicamente que exibem efei- tos RNAi em células de mamíferos e demonstraram que a estabilidade termodinâmica de hibridização de siRNA (em terminais ou no meio) desempenha um papel central em determinação de função de molécu- la. Características mais detalhadas de RISC, moléculas de siRNA, e RNAi foram descritas na literatura científica.

[0008] A utilidade de RNAi em regulação descendente de expres- são de gene de célula de mamífero foi mostrada com sucesso no labo- ratório através de utilização tanto de sIRNAs quimicamente sintetiza- dos como siRNA expresso endogenamente. O siRNA endógeno é pri- meiro expresso como RNAs grampos de cabelo pequenos (sShRNAs) por um vetor de expressão ((vetor plasmídeo ou vírus), e então pro- cessados por Dicer para tornarem-se siRNAs funcionais.

[0009] De modo a ter-se atividade e ser capaz de silenciar os ge- nes alvos, siRNAs podem ser liberados para células onde o silencia- mento tem de ocorrer através de transfecção destas células. Uma ma- neira de obter-se liberação de siRNA para estas células é usar uma nanopartícula que pode carrear os siRNAs e permitir absorção dos SIRNAs através de membrana externa de célula, ganhando acesso ao citoplasma. Liberação de siRNAs no citoplasma permite que estas me- tades interajam como complexo RISC, onde a fita anti-sentido é sepa- rada da fita sentido, e a fita sentido é degradada, e a fita anti-sentido é usada pelo complexo RISC para fiscalizar os MRNAs dentro da célula para uma sequência com complementaridade para a sequência anti- sentido. Isto permite a hibridização das duas sequências, e a clivagem do mRNA então ocorre através de ação da enzima Dicer.

[0010] mMRNA provê o molde responsável por tradução da sequên- cia de MRNA na proteína viável necessitada pela célula. Clivagem do mMRNA reduz a habilidade da célula para produzir o peptídeo ou prote- ína codificado pelo MRNA. Silenciamento dos genes através de siRNA pode exibir um efeito prolongado e é dependente da quantidade meta- bolizada e balanço entre a taxa de síntese, a quantidade de mRNA, e a taxa de degradação do mMRNA e/ou a própria proteína. siRNAs foram mostrados ter um potente efeito de silenciamento sobre o gene alveja- do, e isto ainda pode resultar em uma diminuição prolongada (dias a semanas) do produto proteína.

[0011] Elevados níveis de TGF-beta 1 foram implicados em inibi- ção de penetração de células-T nas regiões em proximidade de tumo- res [1-3].

[0012] Por exemplo, em tumores de pacientes com câncer de có- lon [1,2] ou câncer urotelial metastático que foram tratados com um anticorpo anti-PD-L1 (atezolizumabe), uma falta de resposta foi asso- ciada com sinalização de fator de crescimento transformante B (TGFB) em fibroblastos. Primariamente isto foi observado em tumores que mostraram exclusão de células-T CD8+ do parênquima do tumor e acumulação destas células-T no estroma peritumoral rico em fibroblas- to e colágeno, um fenótipo comum entre pacientes com câncer uroteli- al metastático. Coadministração de anticorpo de bloqueio de TGFB com anticorpos anti-PD-L1 reduziu sinalização TGFB em células es- tromais, e isto, por sua vez, permitiu penetração de célula-T no centro dos tumores — provocando imunidade antitumor e regressão de tumor neste modelo [3].

[0013] Embora [1] e [2] tenham focado em câncer de cólon e [3] mostre efeitos em câncer urotelial, ninguém tentou olhar na sinergia entre inibição de PDL1 e TGFB1 sobre uma resposta imune quando ambos alvos foram inibidos ao mesmo tempo. Foi usada uma nanopar-

tícula de polipeptídeo (PNP) para liberar siRNAs alvejando TGFRB1 e Cox2 para o fígado para ver se este efeito pode aperfeiçoar eficácia de anticorpos PDL1 nesta doença. Liberação para as células endoteliais assim como os hepatócitos normais sugeriu que se pode silenciar os dois genes dentro de vizinhança do tumor. Breve Descrição das Figuras

[0014] Figura 1. Localização de STP707 administrado IV dentro de células do fígado. siRNA rotulado fluorescente AF647 foi formulado com HKP para formar uma nanopartícula. As nanopartículas foram administradas em camundongos através de injeção IV (administração em veia de cauda). Nos pontos de tempo notados na figura, os ani- mais sofreram eutanásia, fígados foram excisados e dissecados e cé- lulas dissociadas foram submetidas a citometria de fluxo com anticor- pos rotulados capazes de discriminar os diferentes tipos de células mostrados. Tipos de células são mostrados da esquerda para direita sob cada ponto de tempo, células Kupffer (KC), células dendríticas (DC), células endoteliais sinosoidais de fígado (LSEC), hrpatócitos, Ly6c Alta (monócitos inflamatórios), Ly6c Baixa, células leucócitos po- limorfonucleares (PMN), linfócitos e células Stellate. Esta figura mostra que hepatócitos, células Kupífer e células LSEC inicialmente absorvem STP707 por 1h. A população de células stellate dentro de fígado é somente 1,4% da população de células. Embora a citometria de fluxo tenha mostrado alguma evidência de absorção, o sinal foi muito baixo, assim foi validada a absorção em células stellate humanas primárias e foi mostrada excelente absorção e silenciamento de gene dentro des- tas células.

[0015] Figura 2. Usando substrato luciferina administrado a ani- mais anestesiados, a quantidade de tumor foi avaliada através de me- dição de efluxo de luz de cada animal (medido usando um sistema de formação de imagem digital). Animais foram designados para uma co-

orte baseado na normalização de tumor através de todos os grupos de teste. Esta figura mostra os valores iniciais produzidos em designação para os grupos — mostrando uniformidade de tamanho de tumor entre coortes antes de início de tratamentos.

[0016] Figura 3. Pesos de corpos dos animais foram monitorados após cada tratamento e os pesos de corpos feitos médias através de todos os animais na coorte. Os dados foram plotados como % de peso de corpo inicial antes de dosagem.

[0017] Sorafenibe sozinho (quadrados vermelhos) induziu uma le- ve mudança em pesos de corpos. Entretanto, todos os outros esque- mas de tratamento (STP707 sozinho ou +anti-PDL1) foram bem tole- rados e nenhuma perda de peso de corpo significante foi observada nos braços de tratamento.

[0018] Figura 4. Medições de bioluminescência associada a tumor (TABL) foram feitas através de administração do substrato para lucife- rase (luciferina) para animais anestesiados e então formação de ima- gem de luz gerada com um sistema de formação de imagem de animal vivo IVIS. Animais foram administrados com tratamentos por toda a fase de dosagem (região salientada Cinza) e foram de outro modo monitorados sem tratamento nos outros tempos. Animais tratados com controle (veículo) mostraram um rápido crescimento de tumores como determinado por um maior sinal de luz. Tratamentos com mAb anti- PDL1 e Sorafenibe pareceram mostrar um efeito estático sobre cres- cimento de tumor sobre a fase de dosagem. STP707 sozinho (40 ug por injeção ou -2 mg/kg) ou com o mAb anti-PDL1 mostrou uma dra- mática redução em células de tumor após 5-6 doses. Tumores não fo- ram visíveis nestes braços de tratamento.

[0019] Figura 5. Animais controles (tratados com veículo) mostra- ram um efeito dramático de crescimento descontrolado de tumor sobre viabilidade dos animais. 50% dos animais não tratados morreram ou sofreram eutanásia como um resultado de aumentada carga de tumor durante a fase de dosagem do experimento. 1 animal sofreu eutanásia após 37 dias com Sorafenibe. Nenhum animal morreu em qualquer um dos outros braços de tratamento.

[0020] Figura 6. Os dados mostram que amostras controles (PNP carregado com siRNA não silenciamento (NS)) mostraram um dramá- tico aumento em crescimento de célula de tumor como medido pela leitura Flux a partir do exterior do animal usando um sistema de forma- ção de imagem IVIS. Anticorpo PDL1 mostrou um fraco efeito inibidor sobre crescimento de tumor. STP707 sozinho (1 mg/kg) mostrou uma inibição mesmo maior de crescimento de tumor que o Ab PDL1 e, na presença do mAb anti-PDL1, STP707 aboliu completamente o tumor após 6 doses — sugerindo alguma aditividade de efeito com o anticor- po.

[0021] Figura 7. STP707 foi administrado em 3 doses em 1 mg/kg em animais com um tumor HCC ortotópico singenéico e então fígados foram excisados, seccionados e manchados (H&E) para mostrar loca- lização e tamanho de tumor. Notar a redução dramática em tamanho de tumor quando STP707 foi administrado por este curto período de tempo. Nas regiões mostradas pelas caixas brancas, a quantidade de células T CD4+ e CD8+ foi quantificada através de manchamento e contagem de pontos manchados. Estas regiões são expandidas na direita de cada figura e pode ser claramente visto que tratamento STP707 produziu um dramático aumento no número de células-T CD4+ e CD8+ presentes dentro de margem de tumor — fígado - suge- rindo que tratamento de STP707 permite maior penetração de célula-T no tumor.

[0022] Figura 8. Usando imagens similares àquelas mostradas na Fig. 7, células-T foram quantificadas em vários segmentos medidos afastando-se da margem de tumor — tanto em direção ao tumor, ou fora na direção de fígado. Dentro de cada segmento (50 micrometros de espessura), o número de células-T foi quantificado e plotado no gráfico mostrado. Tratamento STP707 junto com o Ab anti-PDL1 mos- trou um aumento de 2-vezes em células-T CD8+ a 500um profundo no tumor comparado com o único tratamento de veículo. Isto mostra tam- bém um aumento em células-T CD8+ dentro do fígado perto de tumor — sugerindo possível recrutamento de células-T induzido pela diminui- ção da "parede" TGF-beta circundando o tumor. Descrição da Invenção

[0023] A invenção refere-se ao uso de moléculas de RNA interfe- rente pequeno (siRNA) que inibem TGF-beta e Cox2 em um indivíduo, sozinhas ou em combinação com inibidores de ponto de referência imunes, para tratar câncer no indivíduo. Como aqui usado, o termo "indivíduo" refere-se a qualquer mamífero, incluindo humanos. O indi- víduo pode ser um animal de laboratório, tal como um roedor, furão, ou primata não humano. Preferivelmente, o indivíduo é um ser humano.

[0024] Em uma modalidade, a invenção é direcionada a um méto- do de morte de células de câncer em um indivíduo através de adminis- tração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um SIiRNA anti-TGF-beta 1. Em um aspecto desta modalidade, siRNA anti- TGF-beta 1 é administrado intravenosamente ao indivíduo. Em um ou- tro aspecto desta modalidade, siRNA anti-TGF-beta 1 é administrado em um tumor no indivíduo. Ainda em um outro aspecto desta modali- dade, siRNA anti-TGF-beta 1 é administrado na proximidade do tumor ou administrado sistemicamente em um veículo que permite liberação para o tumor.

[0025] Em uma outra modalidade, a invenção é direcionada a um método de tratamento de câncer em um indivíduo através de adminis- tração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um SIiRNA anti-TGF-beta. Em um aspecto desta modalidade, siRNA anti-

TGF-beta é administrado intravenosamente ao indivíduo. Em u m outro aspecto desta modalidade, siRNA anti-TGF-beta 1 é administrado em um tumor no indivíduo. Ainda em um outro aspecto desta modalidade, SIiRNA anti-TGF-beta 1 é administrado na proximidade do tumor ou administrado sistemicamente em um veículo que permite liberação pa- ra o tumor.

[0026] O câncer (e as células de câncer) é qualquer câncer que aflige um indivíduo. Tais cânceres incluem câncer de fígado, cólon, pancreático, pulmão e bexiga. O câncer de fígado pode ser um câncer de fígado primário ou um câncer que sofreu metástase para o fígado a partir de um outro tecido. Cânceres de fígado primários incluem carci- noma hepatocelular e hepatoblastoma. Cânceres que sofreram metás- tase incluem câncer de cólon e pancreático.

[0027] As moléculas de siRNA anti-TGF-beta 12 incluem as se- quências identificadas na Tabela 1. Tabela 1: Sequências de siRNA anti-TGFbeta 1 hmTF-25-1: sentido 5-r((GGAUCCACGAGCCCAAGGGCUACCA)-3' (SEQ ID NO: 1) anti-sentido 58-r((UGGUAGCCCUUVUGGGCUCGUGGAUCC)-3' (SEQ ID NO: 2) hmTF-25-2: sentido 5-r((CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU)-3' (SEQ ID NO: 3) anti-sentido 5-r((AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG)-3' (SEQ ID NO: 4) hmTF-25-3: sentido 5-r((GAGCCCAAGGGCUACCAUGCCAACU)-3' (SEQ ID NO: 5) anti-sentido 5-r(AGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGGCUC)-3' (SEQ ID NO: 6) hmTF25-4: sentido, 5-r((GAUCCACGAGCCCAAGGGCUACCAU)-3' (SEQ ID NO: 7)

anti-sentido, 5-r((AUGGUAGCCCUUGGGCUCGUGGAUC)-3' (SEQ ID NO: 8) hmTF25-5: sentido, 5-r((CACGAGCCCAAGGGCUACCAUGCCA)-3' (SEQ ID NO: 9) anti-sentido, 58 -r((UGGCAUGGUAGCCCUUGGGCUCGUG)-3' (SEQ ID NO: 10) hmTF25-6: sentido, 5-r((GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG)-3' SEQ ID NO: 11) anti-sentido, 58-r((CCACCAUUAGCACGCGGGUGACCUC)-3' (SEQ ID NO: 12) hmTF25-7: sentido, 5-r((GUACAACAGCACCCGCGACCGGGUG)-3' (SEQ ID NO: 13) anti-sentido, 58-r(CACCCGGUCGCGGGUGCUGUUGUAC)-3' (SEQ ID NO: 14) hmTF25-8: sentido, 5-r((GUGGAUCCACGAGCCCAAGGGCUAC)-3' (SEQ ID NO: 15) anti-sentido, 58-r(GUAGCCCUUGGGCUCGUGGAUCCAC)-3' (SEQ ID NO: 16)

[0028] Em um aspecto, o siRNA anti-TGF-beta 1 compreende a seguinte sequência: sentido: 5-cccaagggcuaccaugecaacuucu-3' (SEQ ID NO: 3); antisentido: 5-agaaguuggcaugguagcecuugag-3' (SEQ ID NO: 4).

[0029] O siRNA anti-TGF-beta 1 é administrado ao indivíduo em um carreador farmaceuticamente aceitável. Tais carreadores incluem políme- rois lisina — histidina ramificados. Em uma modalidade de tais polímeros, o polímero tem a fórmula (R)K(R)-K(R)-(R)K(X), onde R= KHHHKHH- HKHHHKHHHK (SEQ ID NO: 17) ou R=KHHHKHHHKHHHHKHHHK (SEQ ID NO: 18), X=C(O)NH2, K= lisina, e H = histidina. Tais políme- ros formam uma nanopartícula com o siRNA anti-TGF-beta 1. A nano- partícula pode ser administrada intravenosamente ou intratumoralmen-

te para o indivíduo.

[0030] Em uma outra modalidade, a invenção é direcionada a um método de morte de células de câncer em um indivíduo através de administração para o indivíduo de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um inibidor de ponto de referência imune com a quantidade terapeuticamente efetiva do siRNA anti-TGF-beta 1. Em um aspecto desta modalidade, a administração do inibidor de ponto de referência imune com o siRNA anti-TGF-beta 1 aumenta a eficácia do siRNA anti- TGF beta 1.

[0031] Em uma outra modalidade, a invenção é direcionada a um método de tratamento de um câncer em um indivíduo através de ad- ministração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um inibidor de ponto de referência imune com a quantidade tera- peuticamente efetiva do siRNA anti-TGF-beta 1. Em um aspecto desta modalidade, a administração do inibidor de ponto de referência imune com o siRNA anti-TGF-beta 1 aumenta a eficácia do siRNA anti-TGF- beta 1.

[0032] Como estabelecido acima, o inibidor de ponto de referência imune e o siRNA anti-TGF-beta 1 são administrados intravenosamente ao indivíduo, em um tumor no indivíduo em proximidade do tumor, ou sistemicamente em um veículo que permite liberação para o tumor.

[0033] Em um aspecto desta modalidade, o inibidor de ponto de referência imune é um anticorpo monoclonal que bloqueia a interação entre receptores, tais como PD-1, PD-L1, CTLAA4, Lag3, e Tim3, e li- gantes para aqueles receptores sobre células de mamíferos, tais como células humanas. Em um particular aspecto, o anticorpo monoclonal é um anticorpo monoclonal para PD1 ou PDL1. Exemplos de anticorpos monoclonais incluem Atezoluzimabe, Durvalumabe, Nivolumabe, Pembrolizumabe, e Ipilimumabe.

[0034] Ainda em um outro aspecto desta modalidade, o inibidor de ponto de referência imune é uma molécula pequena que bloqueia a interação entre receptores, tais como PD-1, PD-L1, CTLAA4, Lag3, e Tim3, e ligantes para aqueles receptores sobre células de mamíferos, tais como células humanas. Em um particular aspecto, a molécu la pe- quena bloqueia ligação entre PD1 e PDL1. BMS202 e ligantes simila- res são exemplos de tais moléculas pequenas.

[0035] Ainda em uma modalidade, a invenção é direcionada a um método de morte de células de câncer em um indivíduo através de administração ao su jeito de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um siRNA anti-Cox-2 com a quantidade terapeuticamente efetiva de siRNA anti-TGF-beta 1. Em um aspecto desta modalidade, a com- binação é administrada intravenosamente para o su jeito. Em um outro aspecto desta modalidade, a combinação é administrada em um tumor em um indivíduo . Ainda em um outro aspecto desta modalidade, a combinação é administrada na proximidade do tumor ou administrada sistemicamente em um veículo que permite liberação para o tumor.

[0036] Ainda em uma outra modalidade, a invenção é direcionada a um método de tratamento de um câncer em um indivíduo através de administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente efeti- va de um siRNA anti-Cox-2 com a quantidade terapeuticamente efetiva de si-RNA anti-TGF-beta 1. Em um aspecto desta modalidade, a com- binação é administrada intravenosamente para o indivíduo. Em um ou- tro aspecto desta modalidade, a combinação é administrada em um tumor em um indivíduo. Ainda em um outro aspecto desta modalidade, a combinação é administrada na proximidade do tumor ou administra- da sistemicamente em um veículo que permite liberação para o tumor.

[0037] As moléculas de siRNA anti-Cox2 incluem as sequências identificadas na Tabela 2. Tabela 2: Sequências de siRNA Anti-Cox2 hmCX-25-1:sentido— 5-r((GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU)-3'

(SEQ ID NO: 19)

anti-sentido — 5-r((ACAUCAUCAGACCAGGCACCAGACC)-3' (SEQ ID NO: 20) hmCX-25-2: sentido 5-r((GAGCACCAUUCUCCUUGAAAGGACU)-3' (SEQ ID NO: 21)

anti-sentido — 5-r((AGUCCUUUCAAGGAGAAUGGUGCUC)-3' (SEQ ID NO: 22) hmCX-25-3:sentido — 5-r((CCUCAAUUCAGUCUCUCAUCUGCAA)-3' (SEQ ID NO: 23)

anti-sentido — 5-r((UUGCAGAUGAGAGACUGAAUUGAGG)-3' (SEQ ID NO: 24) hmCX25-4: sentido, 5-r((GAUGUUUGCAUUCUUUGCCCAGCAC)-3' (SEQ ID NO: 25)

anti-sentido, 5-r((GUGCUGGGCAAAGAAUGCAAACAUC)-3' (SEQ ID NO: 26) hmCX25-5: sentido, 5-rGUCUUVUGEUCUGEGUGCCUGGUCUGA)-3' (SEQ ID NO: 27)

anti-sentido, 5-r((UCAGACCAGGCACCAGACCAAAGAC)-3' (SEQ ID NO: 28) hmCX25-6: sentido, 5-r(GUGCCUGEGUCUGAUGAUGUAUGCCA)-3' (SEQ ID NO: 29)

anti-sentido, 5-r((UGGCAUACAUCAUCAGACCAGGCAC)-3' (SEQ ID NO: 30) hmCX25-7: sentido, 5-r((CACCAUUCUCCUUGAAAGGACUUAU)-3' (SEQ ID NO: 31)

anti-sentido, 5-r((AUAAGUCCUUUCAAGGAGAAUGGUG)-3' (SEQ ID NO: 32) hmCX25-8: sentido, 5-r((CAAUUCAGUCUCUCAUCUGCAAUAA)-3' (SEQ ID NO: 33)

anti-sentido, 5-r((UUAUUGCAGAUGAGAGACUGAAUUG)-3'

(SEQ ID NO: 34)

[0038] Em um aspecto, o siRNA anti-Cox2 compreende as seguin- tes sequências: sentido: 5-ggucuggugccuggucugaugaugu-3' (SEQ ID NO: 19); anti sentido: 5-acaucaucagaccaggcaccagacc-3' (SEQ ID NO: 20).

[0039] O siRNA anti-TGF-beta 1 e siRNA anti-Cox2 são adminis- trados em um carreador farmaceuticamente aceitável. Tais carreado- res incluem polímeros histidina — lisina ramificados. Em uma modali- dade de tais polímeros, o polímero tem a fórmula (R)K(R)-K(R)- (R)K(X), onde R=KHHHKHHHKHHHKHHHK (SEQ ID NO: 17) ou R=KHHHKHHHKHHHHKHHHK (SEQ ID NO: 18), X=C(O)NH?2, K=lisina, H=histidina, e N=asparagina. Tais polímeros formam uma nanopartícula com o siRNA anti-TGF-beta 1 e o siRNA anti-Cox2. À nanopartícula pode ser administrada intravenosamente ou intratumo- ralmente para o indivíduo.

[0040] Como estabelecido acima com relação ao siRNA anti-TGF- beta 1, o câncer (e as células de câncer) alvejado pela combinação de SIiRNA anti-TGF-beta 1 e siRNA anti-Cox2 pode ser qualquer câncer que aflija um indivíduo. Tais cânceres incluem câncer de fígado, cólon, pancreático, pulmão e bexiga. O câncer de fígado pode ser um câncer de fígado primário ou um câncer que sofreu metástase para o fígado a partir de um outro tecido. Cânceres de fígado primários incluem carci- noma hepatocelular e hepatoblastoma. Cânceres que sofreram metás- tase incluem câncer de cólon e pancreático.

[0041] Ainda em uma modalidade, a invenção é direcionada a um método de morte de células de câncer em um indivíduo através de administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente efeti- va de um inibidor de ponto de referência imune com uma quantidade terapeuticamente efetiva de um siRNA de anti-TGF-beta 1 e uma quantidade terapeuticamente efetiva de um siRNA anti-Cox2. As célu-

las de câncer e cânceres aos quais este método é direcionado são quaisquer cânceres que afligem um indivíduo, incluindo aqueles des- critos acima. Em um aspecto desta modalidade, a administração de um inibidor de ponto de referência imune com o siRNA anti-TGF-beta 1eosiRNA anti-Cox2 aumenta a eficácia de qualquer um dos siRNAs sozinho.

[0042] Ainda em uma modalidade, a invenção é direcionada a um método de tratamento de um câncer em um indivíduo através de ad- ministração a um indivíduo de uma quantidade terapeuticamente efeti- va de um inibidor de ponto de referência imune com uma quantidade terapeuticamente efetiva de um siRNA anti-TGF-beta 1 e uma quanti- dade terapeuticamente efetiva de um siRNA anti-Cox2. As células de câncer e cânceres aos quais este método é direcionado são quaisquer cânceres que afligem um indivíduo, incluindo aqueles descritos acima. Em um aspecto desta modalidade, a administração de um inibidor de ponto de referência imune com o siRNA anti-TGF-beta 1 e o siRNA anti-Cox2 aumenta a eficácia de qualquer um dos siRNAs sozinho.

[0043] Como estabelecido acima, o inibidor de ponto de referência imune, o siRNA anti-TGF-beta 1, e o siRNA anti-Cox2 são administra- dos intravenosamente para o indivíduo, em um tumor no indivíduo na proximidade do tumor, ou sistemicamente em um veículo que permita liberação para o tumor.

[0044] O inibidor de ponto de referência imune administrado com a combinação das moléculas de siRNA é um anticorpo monoclonal ou uma molécula pequena como descrito acima. Ele pode ser administra- do antes, após, ou simultaneamente com a combinação das moléculas de siRNA.

[0045] A invenção é direcionada a certas composições farmacêuti- cas. Em uma modalidade, a composição compreende um siRNA anti- TGF-beta 1 como aqui descrito em um carreador farmaceuticamente aceitável como aqui descrito.

[0046] Em uma outra modalidade, esta composição farmacêutica é usada em conexão com um inibidor de ponto de referência imune co- mo aqui descrito. Assim, esta modalidade da invenção é direcionada a uma combinação de fármacos terapêuticos compreendendo um inibi- dor de ponto de referência imune e uma composição farmacêutica compreendendo um siRNA anti-TGF-beta 1 em um carreador farma- ceuticamente aceitável como aqui descrito.

[0047] Ainda em uma outra modalidade, a invenção é direcionada a uma combinação de fármacos terapêuticos compreendendo um ini- bidor de ponto de referência imune e uma composição farmacêutica compreendendo um siRNA anti-TGF-beta 1 e um siRNA anti-Cox2 e um carreador farmaceuticamente aceitável como aqui descrito.

[0048] A combinação de fármacos terapêuticos aqui descrita tam- bém é útil para aperfeiçoamento de eficácia antitumor de um inibidor de ponto de referência imune em um indivíduo com um câncer. Uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma composição farmacêutica compreendendo um siRNA anti-TGF-beta 1 e um siRNA anti-Cox2 é administrada ao indivíduo junto com uma quantidade terapeuticamente efetiva de um inibidor de ponto de referência. O siRNA anti-TGF-beta 1 diminui a resposta inflamatória do indivíduo para o câncer e permite melhor penetração de células-T e outras células imunes no tumor. Ele também cria uma resposta imune mais forte para câncer no indivíduo do que a resposta imune criada pelo inibidor de ponto de referência sozinho. Esta resposta envolve maior ativação e penetração de célula- T no câncer. O siRNAanti-Cox2 diminui a resposta inflamatória do indi- víduo para o câncer e/ou diminui a formação de células T exauridas ou células T reguladoras ao redor do câncer.

[0049] A combinação de fármacos terapêuticos aqui descrita tam- bém é útil para células T de imprimagem antigênica para reconheci-

mento e morte de células de câncer em um indivíduo e para promoção de imunidade mediada por célula-T contra um câncer em um indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente ativa da combinação é administra- da ao indivíduo. Os cânceres são aqueles aqui descritos.

[0050] Em uma particular modalidade, a invenção é direcionada a um método de tratamento de um câncer de fígado em um indivíduo através de administração para o indivíduo de uma quantidade terapeu- ticamente efetiva de uma composição farmacêutica da invenção ou uma combinação de fármacos terapêuticos da invenção. Em um as- pecto desta modalidade, o câncer de fígado é um câncer de fígado primário. Em um particular aspecto, o câncer de fígado primário é um carcinoma hepatocelular ou um hepatoblastoma. Em um outro aspecto desta modalidade, o câncer de fígado é um câncer que sofreu metás- tase para o fígado a partir de um outro tecido no corpo do indivíduo. Tais cânceres que sofreram metástase incluem câncer de cólon e cân- cer pancreático. Em um aspecto desta modalidade, o indivíduo é um ser humano.

[0051] Em uma outra modalidade particular, a invenção é direcio- nada a um método de morte de células de carcinoma hepatocelular em um ser humano compreendendo administração ao humano de uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma composição farmacêutica compreendendo um siRNA anti-TGF-beta 1 e um siRNA anti-Cox2 em um carreador farmaceuticamente aceitável compreendendo um polímero de lisina — histidi na ramificado que forma uma nanopartícula com o siR- NA anti-TGF-beta 1 e o siRNA anti-Cox2, onde o siRNA anti-TGF-beta 1 compreende as sequências: sentido: 5-cccaagggcuaccaugecaacuucu-3 (SEQ ID NO: 3); anti-sentido: 5-agaaguuggcaugguageceuugag-3' (SEQ ID NO: 4) e o sSiRNA anti-Cox2 compreende as sequências sen- tido: 5-ggucuggugecuggucugaugaugu-3' SEQ ID NO: 19); anti-sentido: 5'-acaucaucagaccaggcaccagacc-3' (SEQ ID NO: 20).

[0052] Ainda em uma outra particular modalidade, a invenção é direcionada a um método de morte de células de carcinoma hepatoce- lular em um ser humano compreendendo administração ao humano de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um inibidor de ponto de referência imune e uma composição farmacêutica compreendendo um SIiRNA anti-TGFbeta 1 e um siRNA anti-Cox2 em um carreador farma- ceuticamente aceitável compreendendo um polímero de histidina - lisi- na ramificado que forma uma nanopartícula como siRNA anti-TGFbeta 1eosiRNA anti-Cox2, onde o siRNA anti-TGF-beta 1 compreende as sequências: sentido: 5-cccaagggcuaccaugccaacuucu-3' SEQ ID NO: 3); anti-sentido: 5-agaaguuggcaugguagcecuuggg-3' (SEQ ID NO: 4) e o siRNA anti-Cox2 compreende as sequências: sentido: 5- ggucuggugccuggucugaugaugu-3' (SEQ ID NO: 19); anti-sentido: 5"- acaucaucagaccaggcaccagacc-3' (SEQ ID NO: 20) e onde o inibidor de ponto de referência compreende um anticorpo monoclonal capaz de ligar a, e bloquear interações entre PD1 e PDL1. Tais anticorpos mo- noclonais e Ipilimumabe.

[0053] Ainda em uma particular modalidade, a invenção é direcio- nada a uma combinação de fármacos terapêuticos compreendendo um inibidor de ponto de referência imune e uma composição farma- cêutica compreendendo um siRNA anti-TGF-beta 1 e um siRNA anti- Cox2 em um carreador farmaceuticamente aceitável, onde o inibidor de ponto de referência compreende um anticorpo monoclonal selecio- nado do grupo consistindo em Atezoluzimabe, Durvaluzimabe, Nivo- lumabe, Pembrolizumabe, e Ipilimumabe, o siRNA anti-TGF-beta 1 compreende as sequências: sentido: 5-cccaagggcuaccaugecaacuucu- 3' (SEQ ID NO: 3); antisentido: 5-agaaguuggcaugguagccecuuggg-3 (SEQ ID NO: 4), o siRNA anti-Cox2 compreende as sequências: senti- do: 5-ggucuggugccuggucugaugaugu-3' (SEQ ID NO: 19); anti-sentido: 5'-acaucaucagaccaggcaccagacc-3' (SEQ ID NO: 20), e o carreador farmaceuticamente aceitável compreende um polímero de histidina — lisina ramificado que forma uma nanopartícula com o siRNA atni-TGF- beta 1 e o sSiRNA anti-Cox2. Em um aspecto desta modalidade, o po- límero de histidina — lisina ramificado tem a fórmula (R)K(R)-K(R)- (R)K(X), onde R=KHHHKHHHKHHHKHHHK (SEQ ID NO: 17) ou KHHHKHHHKHHHHKHHHK (SEQ ID NO: 18), X=C(O)NH2, K=lisina, H=histidina, e N=asparagina. Definições

[0054] Câncer de fígado é qualquer câncer primário dentro do fí- gado, isto é, um que se inicia no fígado; ou qualquer câncer secundá- rio dentro do fígado, isto é, um câncer que teve metástase para o fíga- do a partir de um outro tecido no corpo de mamífero. Um exemplo de um câncer de fígado primário é carcinoma hepatocelular. Um exemplo de um câncer de fígado secundário é um câncer de cólon.

[0055] Um câncer é qualquer tumor maligno.

[0056] Um tumor maligno é uma massa de células neoplásticas.

[0057] Tratando / tratamento é morte de algumas ou todas as célu- las de câncer, redução de tamanho do câncer, inibição de crescimento do câncer, ou redução de taxa de crescimento do câncer em um indi- víduo.

[0058] SIiRNA anti-TGF-beta 1 é uma molécula de siRNA que re- duz ou evita a expressão do gene em uma célula mamífera que codifi- ca a síntese de proteína TGF-beta 1.siRNA anti-Cox2 é uma molécula de siRNA que reduz ou evita a expressão do gene em uma célula mamífera que codifica a síntese de proteína Cox2.

[0059] Uma molécula de siRNA é um oligonucleotídeo duplex, que é um polinucleotídeo de fita dupla, curta, que interfere com a expressão de um gene em uma célula, após a molécula ser introduzida na célula. Por exemplo, ela alveja e se liga a uma sequência de nucleotídeos com- plementar em uma molécula de RNA alvo de fita simples. Moléculas de

SIiRNA são sintetizadas quimicamente ou de outro modo construídas através de técnicas conhecidas por aqueles versados. Tais técnicas são descritas nas patentes U.S. Nº*-5 898 031, 6 107 094, 6 506 559, 7 056 704 e patente Europeia Nº: 1214945 e 1230375, que são aqui in- corporadas por referência em suas totalidades. Por convenção no campo, quando uma molécula de siRNA é identificada por uma parti- cular sequência de nucleotídeos, a sequência refere-se à fita sentido da molécula duplex. Um ou mais dos ribonucleotídeos compreendendo a molécula podem ser quimicamente modificados através de técnicas conhecidas. Em adição a ser modificada no nível de um ou mais de seus nucleotídeos individuais, a cadeia principal do oligonucleotídeo pode ser modificada. Adicionais modificações incluem o uso de molé- culas pequenas (por exemplo, moléculas de açúcar), aminoácidos, peptídeos, colesterol, e outras moléculas grandes para conjugação sobre a molécula de siRNA.

[0060] Um polímero de histidina — lisina ramificado é um peptídeo consistindo em aminoácidos histidina e lisina. Através de síntese de múltiplos aminoácidos a partir de um centro de lisina comum, o peptí- deo é composto por 4 braços ou ramificações. Tais polímeros são descritos em patentes US números 7 070 807 B2, expedida em 4 de julho de 2006, 7 163 695 B2, expedida em 6 de janeiro de 2007 e 7 772 201 B2, expedida em 10 de agosto de 2010, que são aqui incorpo- radas por referência em suas totalidades.

[0061] Um inibidor de ponto de referência imune é um fármaco que bloqueia certas proteínas fabricadas por alguns tipos de células do sis- tema imune, tais como células T, e algumas células de cânceres. Es- tas proteínas de ponto de referência ajudam a manter respostas imu- nes em verificação e podem abster células T de matar as células de câncer. Quando estas proteínas de ponto de referência são bloquea- das, os "freios" sobre o sistema imune são liberados, e células T são capazes de matar melhor as células de câncer. Exemplos de proteínas de ponto de referência encontradas sobre células T ou células de cân- cer incluem PD-1/PD-L1 e CTLA-4/B7-1/B7-2.

[0062] Na proximidade de câncer significa em tecido ou células próximas a, ou circundando, um tumor ou séries de células de tumor.

[0063] Aperfeiçoamento de eficácia antitumor significa provimento de uma maior redução em taxa de crescimento das células de tumor, maior efeito em morte de células de tumor e/ou redução de massa de tumor e eventualmente produção de um melhor efeito terapêutico atra- vés de prolongamento de vida do indivíduo com o tumor. Tais efeitos podem ser mediados por uma ação direta sobre as próprias células de tumor ou um aumento da atividade das células-T ou um mecanismo através do qual as células-T são ofertadas com melhor acesso às célu- las de tumor e/ou são ativadas para promoção de uma mais forte rea- ção imune contra o tumor com ou sem um aumento na habilidade para reconhecer células de tumor mesmo após o tratamento inicial.

[0064] Os exemplos que se seguem ilustram certos aspectos da invenção e não devem ser construídos como limitação de seu escopo. Exemplos Resultados Experimentais

[0065] STP707 consiste em 2 siRNAs (alvejando genes TGF-beta 1 e Cox2) protegidos por uma nanopartícula de liberação de polipeptí- deo consistindo no polipeptídeo ramificado HKP (polímero histidina lisina). STP707 é descrito na patente US 9 642 873 B2, datada de 9 de maio de 2017, e patente reexpedida US RE46873 E, datada de 29 de maio de 2018, as exposições das quais são aqui incorporadas por re- ferência em suas totalidades.

[0066] Usando uma nanopartícula de polipeptídeo ramificado con- sistindo em aminoácidos histidina e lisina (HKP), foi demonstrado que injeção IV permite que as nanopartículas sejam absorvidas com maio r eficiência por células dentro do fígado. Usando citometria de fluxo para medir a absorção de siRNAs etiquetados fluorescentes das nanopartí- culas, a liberação foi demonstrada para específicos tipos de células dentro de fígado, incluindo as células Stellate, células LSEC, e os he- patócitos assim como as células Kupífer (Fig. 1). Isto pode por isso sugerir que se pode obter eficiência de liberação muito boa de siRNAs para estas células dentro de fígado e se pode por isso silenciar alvos de interesse dentro destas células.

[0067] Examinou-se STP707, como uma monoterapia e em com- binação com um anticorpo monoclonal anti-PD-L1 (mAb) (anti-PD-L1 monoclonal Ab clone 10F.9G2 de BioXcell, West Lebanon, NH 03784), em um modelo de carcinoma hepatocelular murino ortotópico usando uma variante bioluminescente da linha de células Hepa 1-6 para per- mitir monitoramento de carga de tumor sobre tempo.

[0068] Foi usado um modelo de implante ortotópico, onde células de tumor de câncer do fígado HCC (células Hepa 1-6) foram cirurgi- camente implantadas no órgão do qual elas foram derivadas (o fíga- do). A linha de células de câncer de fígado de camundongo foi modifi- cada para expressar luciferase (Hepa 1-6-Lux). Então, com adição do substrato aos animais, o grau de crescimento dos tumores nos fígados destes animais pode ser monitorado usando um sistema de detecção luminescente. Isto permite medição do crescimento de tumor em uma maneira não invasiva que não é danosa para os animais. Monitorou-se a taxa de crescimento dos tumores usando este método. Examinou-se a taxa de crescimento na ausência de qualquer tratamento (grupo Controle), usando o padrão ouro de cuidados para tratamento de car- cinoma hepatocelular em seres humanos (Sorafenibe — um inibidor de cinase; 50 mg/kg administrados QD) e um anticorpo anti-PDL1 de ca- mundongo validado mostrado inibir crescimento de tumor em animais com tumores Hepa1-6 ortotópicos (administrado BIW em 5 mg/kg).

[0069] Comparou-se também o efeito de siRNAs mostrados inibi- rem TGF-beta e Cox2 (STP707) liberados usando as nanopartículas de peptídeo HKP (administradas IV BIW em uma dose de 40 ug ou 20 ug por injeção). Analisou-se ainda o efeito de STP707 quando admi- nistrado junto com o anticorpo anti-PDL1.

[0070] Examinou-se STP707 para eficácia em tratamento de HCC usando um modelo de carcinoma hepatocelular murino ortotópico, sin- genéico usando uma variante bioluminescente da linha de células He- pa 1-6 para permitir monitoramento de carga de tumor sobre tempo.

[0071] Os experimentos foram realizados usando a linhagem de camundongos C57BL/6J de Charles River labs.

[0072] Veículo (HKP + siRNA não silenciador; controle) ou STP707 foram ambos administrados intravenosamente (iv).

[0073] 8 animais foram randomicamente designados para cada grupo de tratamento. Os grupos de tratamento foram como se segue:

1. Somente veículo

2. Sorafenibe (50 mg/kg) p.o., QD

3. Anti-PD-L1 (5 mg/kg), i.p., BIW

4. Anti-PD-L1 (5 mg/kg), i.p., BIW + 20 ug STP707/injeção iv BIW

5. Anti-PD-L1 (5 mg/kg), i.p., BIW + 40 ug STP707/injeção iv BIW

6. 40 ug STP707/injeção iv BIW sozinho

[0074] Os animais foram randomizados no início do experimento baseado em peso. A randomização proporcionou distribuições de pe- sos muito similares nos animais selecionados dentro de cada grupo como mostrado na Fig. 2.

[0075] Os pesos de corpos dos animais foram medidos diariamen- te durante a fase de dosagem do estudo de eficácia, Pesos médios de corpos de cada grupo foram plotados (Figura 3). Sorafenibe sozinho induziu uma leve mudança em pesos de corpos. Entretanto, todos os outros esquemas de tratamento (STP707 sozinho ou +anti-PDL1) fo- ram bem tolerados e nenhuma significante perda de peso de corpo foi observada nos braços de tratamento.

[0076] Crescimento de tumor foi monitorado por formação de ima- gem de bioluminescência e refletido por quantificação de biolumines- cência associada a tumor (TABL). TABL foi plotada através de dia de estudo e mostrada na Figura 4.

[0077] Com término da fase de dosagem programada, crescimento de tumor foi monitorado para grupos 2-6. Nenhum novo crescimento de tumor foi observado antes do último dia do estudo (dia 50), suge- rindo que os tratamentos foram muito eficazes em inibição de cresci- mento de tumor e prevenindo novo crescimento sugerindo um efeito pronunciado sobre viabilidade de tumor.

[0078] O efeito das terapias de combinação ainda foi enfatizado por análise de sobrevivência (usando pontos finais substitutos huma- nos) sobre todos camundongos no estudo (Figura 5). O ponto final pa- ra terminação humana foi definido quando tumores atingindo um ta- manho máximo permissível ou quando tumores mostraram adversos sinais clínicos. Todos os regimes de tratamento produziram sobrevi- vência estatisticamente significantemente aperfeiçoada como demons- trado por Teste Log-rank (Mantel-Cox) (p=0,0001) e Gehan-Breslow- Wilcoxon Test (p=0,0002). Nenhuma diferença em sobrevivência foi observada entre os grupos de tratamento.

[0079] Para validar os resultados obtidos acima, repetiu-se o estu- do usando uma dose menor de STP707 (1 mg/kg) (Fig. 6).

[0080] Os dados obtidos suportaram a observação de que STP707 mostra ação de agente simples contra diminuição de crescimento de tumor em relação à coorte controle (não tratada). O braço STP707 mostrou melhor eficácia que o braço de anticorpo (PDL1) sozinho.

[0081] Neste estudo, STP707 mostra atividade de agente simples melhor que anticorpo anti-PDL1 sozinho. Entretanto, combinação de STP707 com o tratamento de anticorpo reduziu o tumor para níveis indetectáveis após 4 doses.

[0082] Uma vez que não houve tumor evidente nos grupos de tra- tamento com STP707, repetiu-se o estudo mas usando somente 3 do- ses de STP707 em 1 mg/kg. Após a terceira dose, animais sofreram eutanásia, fígados removidos e seccionados e manchados para célu- las-T CD4+ e CD8+ usando imuno histoquímica.

[0083] Mesmo nestes estudos de dose reduzida, observa-se uma dramática diferença entre amostras não tratadas (controles) e amos- tras tratadas com STP707 em termos do tamanho total de tumor. Em animais não tratados o tumor é quase completamente o tamanho do fígado, enquanto em amostras de STP707 o tumor foi muito reduzido (Fig. 7).

[0084] Além disso, manchamento IHC para células-T CD4+ e CD8+ mostrou um aumento dramático nestas células-T penetrando o tumor da amostra tratada com STP707 (Fig. 7 e Fig. 8). Análise de imagem foi realizada para quantificar as células-T CD4+ me CD8+ nas margens entre o tumor e o fígado como mostrado pelas linhas colori- das nas amostras de tumores. Estas linhas são desenhadas em dis- tâncias de 50 micrometros afastadas da margem de tumor — tanto na direção de tumor ou fora, afastando de tumor mas na direção do fíga- do. Análise de imagem contou todas as células-T CD8+ em cada seg- mento de 50 micrometros e os dados foram plotados como mostrado na Figura 8.

[0085] Tratamento com STP707 junto com o Ab anti-PDL1 mos- trou um aumento de 2-vezes em células-T CD8+ em 500 um no tumor. Ele também mostra um aumento em células-T CD8+ dentro de fígado próximo do tumor — sugerindo possível recrutamento de células T in-

duzido pela diminuição da "parede" de TGF-beta circundando o tumor. Conclusões

[0086] O objetivo primário deste estudo foi determinar a tolerabili- dade e eficácia de STP707 (nanopartículas de polipeptídeo HKP con- tendo siRNAs contra TGF beta1 e Cox2), como uma monoterapia e em combinação com anti-PD-L1, em um modelo de carcinoma hepatocelu- lar murino ortotópico usando uma variante bioluminescente da linha de células Hepa 1-6.

[0087] Todos os regimes de tratamento foram bem tolerados nas doses e formulações testadas; nenhum sinal clínico adverso ou perda de peso de corpo foi notado em qualquer dos grupos de tratamento. Todos os regimes de tratamento produziram reduzido crescimento de tumor estatisticamente significante quando comparados com controle. Entretanto, monoterapia de STP707 (2 mg/kg) resultou em reduzido crescimento de tumor que também foi observado quando combinado com o Ab anti-PDL1. Redução de dose de STP707 para 1 mg/kg de- monstrou um menor efeito do STP707 sozinho mas agora a aditividade com o Ab anti-PDL1 foi mais evidente.

[0088] Combinação de anti-PD-L1 5 mg/kg e STP705(??) (20 ug por injeção (1 mg/Kkg)) pareceu ser mais eficaz que monoterapia com STP705 que é mais eficaz que anti-PD-L1 5 mg/kg.

[0089] Os resultados mostram que STP707 aumenta a ação do anticorpo anti-PDL1 — resultando em uma dramática redução de viabi- lidade de tumor sem retorno das células de tumor — mesmo após inter- rupção de dosagem por 2+ semanas. O fato de se mostrar a liberação para o fígado com esta formulação dada IV sugere que se pode tratar tumores que são abrigados no fígado com este regime. Isto pode inclu- ir quaisquer tumores que ocorrem naturalmente no fígado (hepatoblas- toma ou carcinoma hepatocelular (HCC)) ou tumores que sofrem me- tástase para o fígado (por exemplo, câncer de cólon).

[0090] Além disso, em estudos prévios, foi demonstrada a habili- dade para reduzir expressão de gene para estes 2 alvos genes quan- do o produto é administrado através de injeção (por exemplo, intra- dermicamente). Isto pode sugerir que se pode ser capaz de obter o mesmo benefício terapêutico de promoção de uma resposta imune pa- ra os tumores quando o produto é administrado via injeção na proximi- dade do tumor. Isto pode ser usado para cânceres dérmicos (por exemplo, cânceres de pele não melanoma ou tumores de melanoma na pele), ou em tumores em outros órgãos onde material pode ser inje- tado próximo ao local de tumor para promover o mesmo efeito. Referências

[1] Liu et al., Cancer Cell Int (2015) 15:106-112 "Cyclo- oxygenase-2 promotes tumor growth and suppresses tumor immunity"

[2] Zelenay et al., Cell (2015) 162: 1257-1270 "Cyclooxyge- nase-Dependent Tumor Growth through Evasion of Immunity"

[3] Mariathasan et al., Nature (2018) 554; 544-548 "TGFB attenuates tumour response to PD-L1 blockade by contributing to ex- clusion of T cells"

[0091] Todas as publicações aqui identificadas, incluindo patentes expedidas e pedidos de patentes publicados, e todas as entradas de bases de dados identificadas por endereços url ou números de acesso são aqui incorporados por referência em suas totalidades.

[0092] Embora esta invenção tenha sido descrita em relação a cer- tas suas realizações, e muitos detalhes tenham sido mostrados para propósitos de ilustração, será aparente para aqueles versados na téc- nica que a invenção é suscetível a adicionais realizações e que certos detalhes aqui descritos podem ser variados sem fugir dos princípios básicos da invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de matar células de câncer em um indivíduo ca- racterizado por compreender administração ao indivíduo de uma quan- tidade terapeuticamente efetiva de um siRNA anti-beta 1.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por SiRNA anti-TGF-beta 1 ser administrado intravenosamente no indi- víduo.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por células de câncer compreenderem um tumor maligno e o siRNA anti-TGF-beta 1 ser administrado no tumor ou na proximidade do tu- mor.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por câncer ser selecionado do grupo consistindo em câncer de fígado, cólon, pancreático, pulmão, ou bexiga.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por câncer ser câncer de fígado.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por câncer de fígado compreender um câncer de fígado primário.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por câncer de fígado primário compreender um carcinoma hepatocelu- lar ou um hepatoblastoma.

8. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por câncer ter sofrido metástase para o fígado a partir de um outro te- cido no corpo de indivíduo.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por câncer que sofreu metástase compreender um câncer de cólon.

10. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por câncer que sofreu metástase compreender um câncer pancreático.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado por siRNA anti-TGF-beta 1 ser selecionado das sequências na Tabela 1.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado por siRNA anti-TGF-beta 1 compreender as sequências: sentido: 5"-cccaagggcuaccaugecaacuucu-3' (SEQ ID NO: 3); anti-sentido: 5'-agaaguuggcaugguagcccuuggag-3(SEQ ID NO: 4).

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado por siRNA anti-TGF-beta 1 ser administrado em um carreador farmaceuticamente aceitável.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do por carreador farmaceuticamente aceitável compreender um polí- mero histidina — lisina ramificado.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do por polímero de histidina — lisina ramificado formar uma nanopartí- cula com o siRNA anti-TGF-beta 1.

16. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, carac- terizado por polímero de histidina — lisina ramificado ter a fórmula (R)K(R)-K(R)-(R)K(X), onde R=KHHHKHHHKHHHKHHHK (SEQ ID NO: 17) ou R=KHHHKHHHKHHHHKHHHK (SDEQ ID NO: 18), X=C(O)NH2, K=lisina, H=histidina.

17. Método de acordo com a reivindicação 15 ou 16, carac- terizado por nanopartícula ser administrada intravenosamente para o indivíduo.

18. Método de acordo com qualquer uma de reivindicações 1 a 12, caracterizado por compreender administração de uma quanti- dade terapeuticamente efetiva de um siRNA anti-Cox2 com a quanti- dade terapeuticamente efetiva do siRNA anti-TGF-beta 1.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracteriza- do por siRNA anti-Cox2 ser selecionado das sequências na Tabela 2.

20. Método de acordo com a reivindicação 18, caracteriza-

do por siRNA anti-Cox2 compreender as sequências: sentido: 5'-ggucuggugccuggucugaugaugu-3'(SEQ ID NO: 19); anti-sentido: 5'-acaucaucagaccaggcaccagace-3'(SEQ ID NO: 20).

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 18 a 20, caracterizado por siRNA anti-TGF-beta 1 e o siRNA anti- Cox2 serem administrados em um carreador farmaceuticamente acei- tável.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracteriza- do por carreador farmaceuticamente aceitável compreender um polí- mero histidina — lisina ramificado.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracteriza- do por polímero de histidina — lisina ramificado formar uma nanopartí- cula com o siRNA anti-TGF-beta 1 e o siRNA anti-Cox2.

24. Método de acordo com a reivindicação 22 ou 23, carac- terizado por polímero de histidina — lisina ramificado ter a fórmula (R)K(R)-K(R)-(R)K(X), onde R=KHHHKHHHKHHHKHHHK (SEQ ID NO: 17) ou R=KHHHKHHHKHHHHKHHHK (SEQ ID NO: 18), X=C(O)NH2, K=lisina, H=histidina.

25. Método de acordo com a reivindicação 23 ou 24, carac- terizado por nanopartícula ser administrada intravenosamente ao indi- víduo.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, caracterizado por ainda compreender administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um inibidor de ponto de referência imune com a quantidade terapeuticamente efetiva do sSIRNA anti-TGF-beta 1.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracteriza- do por administração de um inibidor de ponto de referência imune com o SIRNA anti-TGF-beta 1 aumenta a eficácia do siRNA anti-TGF-beta

1.

28. Método de acordo com qualquer uma de reivindicações 18 a 25 caracterizado por ainda compreender administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um inibidor de ponto de refe- rência imune com a quantidade terapeuticamente efetiva do siRNA an- ti-TGF-beta 1 e a quantidade terapeuticamente efetiva do siRNA anti- Cox2.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracteriza- do por administração de um inibidor de ponto de referência imune com o SIRNA anti-TGF-beta e e o siRNA anti-Cox2 aumenta a eficácia de qualquer um dos siRNA's sozinhos.

30. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 29, caracterizado por inibidor de ponto de referência imune compreender um anticorpo monoclional.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracteriza- do por anticorpo monoclonal bloquear a interação entre receptores so- bre uma célula objeto selecionado do grupo consistindo em PD-1, PD- L1, CTLAA, Lag3, e Tim3 e os ligantes para aqueles receptores.

32. Método de acordo com a reivindicação 30, caracteriza- do por anticorpo monoclonal ser um anticorpo monoclonal para PD1 ou PDL1.

33. Método de acordo com a reivindicação 30, caracteriza- do por anticorpo monoclonal ser selecionado do grupo consistindo em Atezoluzimabe, Durvalumabe, Nivolumabe, Pembrolizumabe, e lIpi- limumabe.

34. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 29, caracterizado por inibidor de ponto de referência imune compreender uma molécula pequena.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracteriza- do por molécula pequena bloquear a interação entre receptores em uma célula de indivíduo selecionada do grupo consistindo em PD-1,

PD-L1, CTLAA, Lag3, e Tim3 e os ligantes para aqueles receptores.

36. Método de acordo com a reivindicação 34, caracteriza- do por molécula pequena bloquear ligação entre PD1 e PDL1.

37. Método de acordo com a reivindicação 34, caracteriza- do por molécula pequena ser selecionada do grupo consistindo em BMS2O02 e ligantes similares.

38. Combinação de fármacos terapêuticos caracterizada por compreender um inibidor de ponto de referência imune e uma composição farmacêutica compreendendo um siRNA anti-TGF-beta 1 em um carreador farmaceuticamente aceitável.

39. Combinação de acordo com a reivindicação 38, caracte- rizada por siRNA anti-TGF-beta 1 ser selecionado das sequências de Tabela 1.

40. Combinação de acordo com a reivindicação 38, caracte- rizada por siRNA anti-TGF-beta 1 compreender as sequências: senti- do: 5'-cccaagggcuaccaugecaacuucu-3' (SEQ ID NO: 3); anti-sentido: 5'-agaaguuggcaugguagccecuuggag-3( SEQ ID NO: 4).

41. Combinação de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 38 a 40, caracterizada por carreador farmaceuticamente acei- tável compreender um polímero de histidina — lisina ramificado que forma uma nanopartícula com o siRNA anti-TGF-beta 1.

42. Combinação de acordo com a reivindicação 41, caracte- rizada por polímero de histidina — lisina ramificado ter a fórmula (R)K(R)-K(R)-(R)K(X), onde R=KHHHKHHHKHHHKHHHK (SEQ ID NO: 17) ou R=KHHHKHHHKHHHHKHHHK (SEQ ID NO: 18), X=C(O)NH2, K=lisina, H=histidina.

43. Combinação de fármacos terapêuticos caracterizada por compreender um inibidor de ponto de referência imune e uma composição farmacêutica compreendendo um siRNA anti-TGF-beta 1 e um siRNA anti-Cox2 em um carreador farmaceuticamente aceitável.

44. Combinação de acordo com a reivindicação 43, caracte- rizada por siRNA anti-TGF-beta 1 ser selecionado das sequências na Tabela 1 e o siRNA anti-Cox2 ser selecionado das sequências na Ta- bela 2.

45. Combinação de acordo com a reivindicação 43, caracte- rizada por siRNA anti-TGF-beta 1 compreender as sequências: senti- do: 5"-cccaagggcuaccaugecaacuucu-3' SEQ ID NO: 3); anti-sentido: 5'-agaaguuggcaugguagccecuugag-3' (SEQ ID NO: 4) e o siRNA anti- Cox2 compreende as sequências: sentido: 5'-ggucuggugccuggucugaugaugu-3' (SEQ ID NO: 19); anti-sentido: 5'-acaucaucagaccaggcaccagacc-3' (SEQ ID NO: 20).

46. Combinação de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 43 a 45, caracterizada por carreador farmaceuticamente acei- tável compreender um polímero histidina — lisina ramificado que forma uma nanopartícula com o siRNA anti-TGF-beta 1 e o siRNA anti-Cox2.

47. Combinação de acordo com a reivindicação 46, caracte- rizada por polímero de histidina — lisina ramificado ter a fórmula (R)K (R)-K(R)-(R)K(X), onde R=KHHHKHHHKHHHKHHHK (SEQ ID NO: 17) ou R=KHHHKHHHKHHHHKHHHK (SEQ ID NO: 18), X=C(O)NH2, K=lisina, H=histidina.

48. Combinação de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 38 a 47, caracterizada por inibidor de ponto de referência imu- ne compreender um anticorpo monoclonal.

49. Combinação de acordo com a reivindicação 48, caracte- rizada por anticorpo monoclonal bloquear a interação entre receptores sobre uma célula objeto selecionada do grupo consistindo em PD-1, PD-L1, CTLAA, Lag3, e Tim3 e os ligantes para aqueles receptores.

50. Combinação de acordo com a reivindicação 48, caracte- rizada por anticorpo monoclonal ligar-se a PD1 ou a PDL1 e bloquear sua interação.

71H

51. Combinação de acordo com a reivindicação 48, caracte- rizada por anticorpo monoclonal ser selecionado do grupo consistindo em Atezoluzimabe, Durvalumabe, Nivolumabe, Pembrolizumabe, e Ipilimumabe.

52. Combinação de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 38 a 47, caracterizada por inibidor de ponto de referência imu- ne compreender uma molécula pequena.

53. Combinação de acordo com a reivindicação 52, caracte- rizada por molécula pequena bloquear a interação entre receptores sobre uma célula de indivíduo selecionada do grupo consistindo em PD-1, PD-L1, CTLAA4, Lag3, e Tim3 e os ligantes para aqueles recep- tores.

54. Combinação de acordo com a reivindicação 52, caracte- rizada por molécula pequena inibir ligação entre PD1 e PDL1.

55. Combinação de acordo com a reivindicação 52, caracte- rizada por molécula pequena ser selecionada do grupo consistindo em BMS202 ou estruturas similares.

56. Método de aperfeiçoamento de eficácia antitumor de um inibidor de ponto de referência imune em um indivíduo com um câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administração ao humano de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um siRNA anti-TGF- beta 1 e um siRNA anti-Cox2 com um inibidor de ponto de referência.

57. Método de acordo com a reivindicação 56, caracteriza- do por compreender administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente efetiva da combinação como definida em qualquer uma de reivindicações 38 a 55.

58. Método de acordo com a reivindicação 56 ou 57, carac- terizado por siRNA anti-TGF-beta 1 diminuir a resposta inflamatória de indivíduo para o câncer e permitir melhor penetração de células-T e outras células imunes no tumor.

59. Método de acordo com a reivindicação 56 ou 57, carac- terizado por siRNA anti-TGF-beta 1 criar uma resposta imune mais for- te para o câncer no indivíduo do que a resposta imune criada pelo ini- bidor de ponto de referência sozinho.

60. Método de acordo com a reivindicação 59, caracteriza- do por resposta imune mais forte compreender maior ativação e pene- tração de célula-T no câncer.

61. Método de acordo com a reivindicação 56 ou 57, carac- terizado por siRNA anti-Cox2 diminuir a resposta inflamatória de indi- víduo para o câncer e/ou diminuir a formação de células-T exauridas ou células-T reguladoras ao redor de câncer.

62. Método para aperfeiçoamento de penetração de célula- T em um tumor compreendendo células de câncer em um indivíduo, caracterizado por compreender administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente efetiva da combinação como definida em qualquer uma de reivindicações 38 a 55.

63. Método para imprimar antigenicamente células-T para reconhecimento e morte de células de câncer em um indivíduo, carac- terizado por compreender administração ao indivíduo de uma quanti- dade terapeuticamente efetiva da combinação como definida em qual- quer uma de reivindicações 38 a 55.

64. Método para promoção de imunidade mediada por célu- la-T contra um câncer em um indivíduo, caracterizado por compreen- der administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente efetiva da combinação como definida em qualquer uma de reivindica- ções 38 a 55.

65. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 56 a 64, caracterizado por câncer ser selecionado do grupo con- sistindo em câncer de fígado, cólon, pancreático, pulmão ou bexiga.

66. Método de acordo com a reivindicação 65, caracteriza-

do por câncer ser câncer de fígado.

67. Método de acordo com a reivindicação 66, caracteriza- do por câncer de fígado compreender um câncer de fígado primário.

68. Método de acordo com a reivindicação 67, caracteriza- do por câncer de fígado primário compreender um carcinoma hepato- celular ou um hepatoblastoma.

69. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 56 a 64, caracterizado por câncer ter sofrido metástase para o fígado a partir de um outro tecido no corpo de indivíduo.

TO. Método de acordo com a reivindicação 69, caracteriza- do por câncer que sofreu metástase compreender um câncer de cólon.

71. Método de acordo com a reivindicação 69, caracteriza- do por câncer que sofreu metástase compreender um câncer pancreá- tico.

72. Método de tratamento de um câncer de fígado em um ser humano caracterizado por compreender administração para o ser humano de uma quantidade terapeuticamente efetiva da combinação como definida em qualquer uma de reivindicações 38 a 55.

73. Método de acordo com a reivindicação 72, caracteriza- do por câncer de fígado compreender um câncer de fígado primário.

74. Método de acordo com a reivindicação 73, caracteriza- do por câncer de fígado primário compreender um carcinoma hepato- celular ou um hepatoblastoma.

75. Método de acordo com a reivindicação 72, caracteriza- do por câncer ter sofrido metástase para o fígado a partir de um outro tecido no corpo humano.

76. Método de acordo com a reivindicação 75, caracteriza- do por câncer que sofreu metástase compreender um câncer de cólon.

77. Método de acordo com a reivindicação 75, caracteriza- do por câncer que sofreu metástase compreender um câncer pancreá-

tico.

78. Método de morte de células de carcinoma hepatocelular em um ser humano caracterizado por compreender administração ao humano de uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma compo- sição farmacêutica compreendendo um siRNA anti-TGF-beta 1 e um SIiRNA anti-Cox2 em um carreador farmaceuticamente aceitável com- preendendo um polímero histidina — lisina ramificado que forma uma nanopartícula com o siRNA anti-TGF-beta 1 e o siRNA anti-Cox2, on- de o siRNA anti-TGF-beta 1 compreende as sequências: sentido: 5"-cccaagggcuaccaugecaacuucu-3' (SEQ ID NO: 3); anti-sentido: 5'-agaaguuggcaugguagccecuugag-3' (SEQ ID NO: 4) e o siRNA anti- Cox2 compreende as sequências: sentido: 5'-ggucuggugccuggucugaugaugu-3' (SEQ ID NO: 19); anti-sentido: 5'-acaucaucagaccaggcaccagacc-3' (SEQ ID NO: 20).

79. Método de morte de células de carcinoma hepatocelular em um ser humano caracterizado por compreender administração ao humano de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um inibidor de ponto de referência imune e uma composição farmacêutica com- preendendo um siRNA anti-TGF-beta 1 e um siRNA anti-Cox2 em um carreador farmaceuticamente aceitável compreendendo um polímero de histidina — lisina ramificado que forma uma nanopartícula com o SIiRNA anti-TGF-beta 1 e o siRNA anti-Cox2, onde o siRNA antiTGF- beta 1 compreende as sequências: sentido: 5'-cccaagggeuaccaugecaacuucu-3' SEQ ID NO: 3); anti-sentido: 5'-agaaguuggcaugguagccecuugag-3' (SEQ ID NO: 4) e o siRNA anti- Cox2 compreende as sequências: sentido: 5'-ggucuggugccuggucugaugaugu-3' (SEQ ID NO: 19); anti-sentido: 5'-acaucaucagaccaggcaccagacc-3' (SEQ ID NO: 20) e onde o inibidor de ponto de referência compreende um anticorpo monoclonal capaz de ligar-se a, e bloquear, interações entre PD1 e PDL1 selecionados do grupo consistindo em Atezoluzimabe, Durvalumabe, Nivolumabe, Pembrolizumabe, e Ipilimumabe.

80. Combinação de fármacos terapêuticos caracterizada por compreender um inibidor de ponto de referência imune e uma composição farmacêutica compreendendo um siRNA anti-TGF-beta 1 e um siRNA anti-Cox2 em um carreador farmaceuticamente aceitável, onde o inibidor de ponto de referência compreende um anticorpo mo- noclonal selecionado do grupo consistindo em Atezoluzimabe, Durva- lumabe, Nivolumabe, Pembrolizumabe, e Ipilimumabe, e o siRNA anti- TGF-beta 1 compreende as sequências: sentido: 5"-cccaagggcuaccaugecaacuucu-3' (SEQ ID NO: 3); anti-sentido: 5'-agaaguuggcaugguagccecuugag-3' (SEQ ID NO: 4), o siRNA anti- Cox2 compreende as sequências: sentido: 5'-ggucuggugccuggucugaugaugu-3' (SEQ ID NO: 19); anti-sentido: 5'-acaucaucagaccaggcaccagacc-3' (SEQ ID NO: 20), e o carreador farmaceuticamente aceitável compreende um polímero histidina — lisi- na ramificado que forma uma nanopartícula com o siRNA anti-TGF- beta 1 e o sSIRNA anti-Cox2.

81. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 37 e 56 a 71, caracterizado por indivíduo ser um ser humano.