KR20220030203A - 암 치료를 위한 면역 체크포인트 억제제와 조합하여 전달된 siRNA를 사용하는 TGF-베타1 및 COX2의 사일런싱 - Google Patents

암 치료를 위한 면역 체크포인트 억제제와 조합하여 전달된 siRNA를 사용하는 TGF-베타1 및 COX2의 사일런싱 Download PDF

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데이비드 엠. 에반스
패트릭 와이. 루
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서나오믹스, 인크.
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Abstract

본 발명은 특정 약제학적 분자 및 이를 사용하여 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 상기 분자는, 암을 치료하기 위해 단독으로 또는 면역 체크포인트 억제제와 조합하여 사용되는, 인간 및 다른 포유동물에서 TGF-β1 및 Cox2를 억제하는 소간섭 RNA(siRNA) 분자이다.

Description

암 치료를 위한 면역 체크포인트 억제제와 조합하여 전달된 siRNA를 사용하는 TGF-베타1 및 COX2의 사일런싱
관련 특허 출원의 상호 참조
본 출원은, 2018년 12월 27일자로 출원된 미국 가특허출원 제62/785,647호의 이익 및 우선권을 주장하고, 이의 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다.
발명의 분야
본 발명은, 특정 약제학적 분자 및 조성물, 및 암을 치료하기 위한 이의 용도, 특히, 암을 치료하기 위해, TGF-β1 및 Cox2를 단독으로 또는 면역 체크포인트 억제제와 조합하여 억제하는 소간섭(small interfering) RNA(siRNA) 분자의 용도에 관한 것이다.
최근의 연구에 의해, 면역 체크포인트 억제제(immune checkpoint inhibitor)가 암과의 투쟁(fight)에서 중요한 표적(target)으로서 동정(identify)되었다. PD-1(T-세포의 표면 상의) 등의 수용체는 종양 세포의 표면 상의 리간드(예를 들면, PD-L1)와 상호작용할 수 있고, 이들 분자들 사이의 이러한 결합은 종양이 파괴되지 않아야 한다는 신호를 T-세포에 전달한다. 결과적으로, 이러한 신호전달 메카니즘은 철저히 연구되어 이를 차단하는 방법을 시도하고 동정하여 왔고, 따라서 종양의 면역 인식을 촉진하고, 결과적으로 종양의사멸을 증가시킨다.
CTLA4, Lag3, Tim3, PD-1 및 PD-L1을 포함하는, 다수의 체크포인트가 발견되었다. 예를 들면, PD1 또는 PD-L1에 대한 항체는 PD-1 수용체와 PD-L1 리간드 사이의 상호작용을 차단하는 것으로 입증되었고, 이는 종양 세포로부터 T-세포로의 "나를 먹지 마" 신호를 억제하고, 그렇지 않으면, T-세포가 세포를 사멸시키는 효소를 방출함으로써 종양 및 다른 외래 세포에 대한 정상 반응을 일으키는 것을 방해한다.
이들 항체(펨브롤리주맙, 케이투루다 등)의 진료소로의 이동에 수반하여, 이들 약제로 환자를 치료하면, 환자의 약 30%에서 매우 강력한 면역 반응이 촉진되고, 그 결과, 이들 환자의 치료가 장기 지속하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 이 반응은 치료되는 환자들의 30%에서만 나타나는 이유가 명확히 이해되지 않았기 때문에, 연구는 면역 반응과 종양 세포를 사멸시키는 T-세포의 능력을 억제하기 위해 작용할 수 있는 다른 경로 및 신호전달 메카니즘에 광범위하게 초점을 맞추었다.
RNA 간섭(RNAi)은 서열 특이적 RNA 분해 프로세스(degradation proccess)이고, 이론적으로는 상동성 서열을 포함하는 임의의 유전자를 녹다운(knockdown) 또는 사일런싱(silencing)하기 위한 비교적 간단하고 직접적인 방법을 제공한다. 자연적으로 발생하는 RNAi에서, 이본쇄(double-stranded) RNA(dsRNA)는 RNase III/헬리카제 단백질인 다이서(Dicer)에 의해, 3' 말단에 2-nt 오버행(overhang)을 갖는 19-27 뉴클레오티드(nt)의 dsRNA인 소간섭 RNA(siRNA) 분자로 절단된다. 그 후, siRNA는 RNA-유도-사일런싱-복합체(RISC)로 불리우는 다성분-리보뉴클레아제에 도입된다. siRNA의 본쇄 하나는 RISC와 결합되어, RISC의 가이더(guider) ss-siRNA에 상보적인 서열을 갖는 동족 RNA를 향해 복합체를 유도한다. 이러한 siRNA-지향된 엔도뉴클레아제는 RNA를 소화시켜, 표적 RNA의 절단 및 불활성화를 초래한다. 최근의 연구는 포유동물 세포에서 RNAi 효과를 나타내는 화학적으로 합성된 21-27-nt siRNA의 유용성을 밝혀냈고, siRNA 하이브리드화의 열역학적 안정성(말단 또는 중간에서)은 분자의 기능을 결정하는데 있어서 중심적 역할을 한다는 것을 입증했다. RISC, siRNA 분자 및 RNAi의 보다 상세한 특징은 과학 문헌에 기재되어 있다.
포유동물 세포의 유전자 발현의 하향조절에서 RNAi의 유용성은 화학적으로 합성된 siRNA 또는 내인성 발현된 siRNA를 이용함으로써 실험실에서 성공적으로 제시되었다. 내인성 siRNA는 먼저 발현 벡터(플라스미드 또는 바이러스 벡터)에 의해 작은 헤어핀 RNA(shRNA)로 발현되고, 이어서 다이서에 의해 처리되어 기능성 siRNA가 된다.
활성을 갖고, 표적 유전자를 사일런싱할 수 있기 위해, siRNA는 이러한 세포의 형질감염에 의해 사일런싱이 발생해야 하는 세포에 전달될 수 있다. 이러한 세포로 siRNA를 전달하는 한 가지 방법은 siRNA를 운반할 수 있고 세포질에 대한 접근을 획득하여, 외부 세포막을 가로질러 siRNA의 흡수를 가능하게 하는 나노입자를 사용하는 것이다. 세포질로의 siRNA의 방출에 의해, 이들 부분이 RISC 복합체와 상호작용하고, 안티센스 쇄(antisense strand)가 센스 쇄로부터 분리되고, 센스 쇄가 분해되고, 안티센스 쇄가 RISC 복합체에 의해 사용되어, 안티센스 서열에 상보성을 갖는 서열을 위한 세포 내에서 mRNA를 감시한다. 이에 의해, 2개 서열의 하이브리드화가 가능해지고, 효소 다이서의 작용에 의해 mRNA의 절단이 일어난다.
mRNA는 mRNA 서열을 세포가 필요로 하는 생존가능한 단백질로 번역하기 위한 주형(template)을 제공한다. mRNA의 절단은 mRNA에 의해 코딩되는 펩티드 또는 단백질을 생산하는 세포의 능력을 감소시킨다. siRNA에 의한 유전자의 사일런싱은 연장된 효과를 나타낼 수 있고, 합성 속도, mRNA의 양 및 mRNA 및/또는 단백질 자체의 분해 속도 사이의 전환 및 균형에 의존한다. siRNA는 표적화된 유전자에 대해 강력한 사일런싱 효과를 갖는 것으로 밝혀졌고, 이는 단백질 생성물의 연장된 감소(수일 내지 수주)를 추가로 초래할 수 있다.
TGF-β1 수준의 상승은 종양에 근접한 영역 내로 T-세포의 침투를 억제하는 것과 관련되어 있다[1-3].
예를 들면, 항-PD-Ll 항체(아테졸리주맙)로 치료된 결장암[1,2] 또는 전이성 요로상피암 환자의 종양에서, 반응의 결여는 섬유아세포에서 형질전환 성장 인자 β(TGF) 신호전달과 연관되었다. 주로, 이는, 종양 실질로부터의 CD8 + T-세포의 배제와, 전이성 요로상피암 환자에서 공통의 표현형인 섬유아세포 및 콜라겐-풍부 종양주변 간질에서 이들 T-세포의 축적을 나타낸 종양에서 관찰되었다. TGFβ 차단 항체와 항-PD-Ll 항체의 동시 투여에 의해, 간질 세포의 TGFβ 신호전달이 감소하고, 이에 의해 T 세포가 종양의 중심으로 침투하고, 이 모델에서 항종양 면역 및 종양 축퇴(tumor regression)가 유발된다[3].
[1] 및 [2]는 결장암에 초점을 맞추고, [3]은 요로상피암에 대한 영향을 나타냈지만, 양쪽 표적이 동시에 억제되는 경우의 면역 반응에 대한 TGFβ1 및 PDL1 억제의 상승효과를 조사하려고 시도한 사람은 없었다. 본 발명자들은, 폴리펩티드 나노 입자(PNP)를 사용하여, TGFβ1 및 Cox2를 표적화하는 siRNA를 간에 전달하고, 이 효과가 이러한 질환에서 PDL1 항체의 효능을 개선시킬 수 있는지를 확인했다. 내피 세포 및 정상 간세포로의 전달은 종양의 근처에서 2개의 유전자를 사일런싱할 수 있음을 시사했다.
도 1. 간의 세포내에서의 TV 투여된 STP707의 국재화(localization). AF647 형광 표지된 siRNA는 HKP로 제형화하여 나노입자를 형성했다. 나노입자는 IV 주사(꼬리 정맥 투여)에 의해 마우스에게 투여했다. 도면에 기재되어 있는 시점에서, 동물을 안락사시키고, 간을 절제하여 해부하고, 해부된 세포를, 제시된 상이한 세포형을 식별할 수 있는 표지된 항체를 사용한 유세포 분석에 제공했다. 세포 유형은 각 시점에서 쿠퍼(Kupffer) 세포(KC), 수지상 세포(DC), 간 시누소이드 내피 세포(LSEC), 간세포, Ly6c High(염증성 단핵구), Ly6c Low, PolymorphoNuclear 백혈병 세포(PMN), 림프구 및 성상 세포를 좌측으로부터 우측으로 제시한다. 이 도면은 간세포, 쿠퍼 세포 및 LSEC 세포가 최초로 1시간까지 STP707을 흡수하는 것을 나타낸다. 간 내의 성상 세포 모집단은 세포 모집단의 단지 1.4%이다. 유세포 분석은 흡수의 일부 증거를 나타냈지만, 신호가 너무 낮았기 때문에, 초대 인간 성상 세포에서의 흡수만을 검증하고, 이들 세포 내에서 우수한 흡수 및 유전자 사일런싱을 나타냈다.
도 2. 마취된 동물에게 투여된 루시페린 기질을 사용하여, 종양의 양은 각 동물로부터의 광의 유출(light efflux)을 측정함으로써 평가했다(디지탈 이미징 시스템을 사용하여 측정됨). 동물은, 모든 시험 그룹에 걸쳐 종양의 정상화에 기초하여 코호트에 할당되었다. 이 도면은, 그룹으로의 할당시에 생성된 초기 값을 나타내고, 이는 치료를 개시하기 전의 코호트(cohort) 사이의 종양 크기의 균일성을 나타낸다.
도 3. 각 치료 후에 동물의 체중량을 모니터링하고, 코호트 내의 모든 동물의 체중을 평균했다. 데이터는 투여 전의 초기 체중의 %로서 플롯팅되어 있다. 소라페닙 단독(적색 사각형)은 체중에 약간의 변화를 유도했다. 그러나, 다른 모든 치료 도식(STP707 단독 또는 +항-PDL1)은 인용성이 높고, 치료 그룹에서 유의한 체중 감소는 관찰되지 않았다.
도 4. 종양 관련 생물발광(TABL) 측정은, 마취된 동물에 루시퍼라제(루시페린)의 기질을 투여하고, IVIS 살아있는 동물 이미징 시스템(animal imaging system)에서 생성된 광을 이미지화함으로써 수행했다. 동물은, 투여 단계(회색으로 강조 표시된 영역)을 통해 치료를 실시하고, 그 이외의 경우는 치료 없이 모니터링했다. 대조군(비히클) 치료 동물은, 보다 큰 광 신호에 의해 결정된 바와 같이, 종양의 급속한 성장을 나타냈다. 소라페닙 및 항-PDL1 mAb 치료는 투여 단계에 걸쳐 종양 증식에 대해 정적 효과를 나타내는 것으로 보였다. STP707 단독(주사당 40㎍ 또는 약 2mg/kg) 또는 항-PD1 mAb와의 병용은 5 내지 6회의 투여 후에 종양 세포의 극적 감소를 나타냈다. 이들 치료 그룹에서는 종양은 발견할 수 없었다.
도 5. 대조군(비히클 치료) 동물은 동물의 생존율에 대한 제어되지 않은 종양 성장의 극적 효과를 나타냈다. 무처리 동물의 50%는 실험의 투여 단계에서의 종양 양의 증가의 결과로서 사망 또는 안락사시켰다. 소라페닙으로 37일 후에 1마리 동물을 안락사시켰다. 다른 치료 그룹에서 사망한 동물은 없었다.
도 6. 데이터는, 대조군 샘플(비-사일런싱(NS) siRNA)이 IVIS 이미징 시스템을 사용하여 동물의 외부로부터의 플럭스 판독(Flux reading)에 의해 측정된 바와 같이, 종양 세포 성장의 극적 증가를 나타냈음을 보여준다. PDL1 항체는 종양 성장에 대해 약한 억제 효과를 나타냈다. STP707 단독(1mg/kg)은 PDL1 Ab보다 더욱 큰 종양 성장 억제를 나타냈고, 항-PDL1 mAb의 존재하에서, STP707은 6회의 투여 후에 종양을 완전히 소멸시켰고, 이는 항체에 의한 효과의 일부 상가성(additivity)을 시사한다.
도 7. 동계의 동소성 HCC 종양을 갖는 동물에게 STP707을 1mg/kg으로 1회 투여하고, 이어서 간을 절제하고, 절편화하고, 염색(H&E)하여 종양의 위치 및 크기를 나타냈다. STP707을 이 단기간으로 투여하면, 종양 크기가 극적으로 감소하는 것에 유의한다. 백색 박스로 나타낸 영역에서, CD4+ 및 CD8+ T-세포의 양은 염색 또는 염색된 스팟의 계수에 의해 정량화했다. 이들 영역은 각 도면의 좌측에 확대되어 있고, STP707 치료에 의해, 간 종양 마진 내에 존재하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 수가 극적으로 증가했음을 명백히 알 수 있고, 이는 STP707 치료에 의해 종양으로의 T-세포의 침투가 촉진되는 것을 시사한다.
도 8. 도 7에 제시된 것과 유사한 이미지를 사용하여, T-세포는, 종양 마진에서 떨어져 종양을 향해 또는 간을 향해 측정된 다양한 세그먼트(segment)에서 정량화되었다. 각 세그먼트(두께 50㎛) 내에서, T-세포의 수가 정량화되고, 제시된 그래프에 플롯팅되었다. STP707 치료 및 PDL1 Ab의 병용은, 비히클 치료 단독과 비교하여, 종양의 길이 500㎛에서 CD8+ T-세포의 2배 증가를 나타냈다. 또한, 종양에 근접한 간 내의 CD8+ T-세포의 증가를 나타내고, 이는 종양을 둘러싸는 TGF-β "벽"의 저하에 의해 유도되는 T-세포의 동원 가능성(possible recruitment)을 시사한다.
본 발명은, 대상체의 암을 치료하기 위해, 대상체에서 TGF-β1 및 Cox2를 단독으로 또는 면역 체크포인트 억제제와 조합하여 억제하는 소간섭 RNA(siRNA) 분자의 용도에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간을 포함하는 임의의 포유동물을 지칭한다. 대상체는 설치류, 페렛(ferret) 또는 비-인간 영장류 등의 실험실 동물일 수 있다. 바람직하게는, 상기 대상체은 인간이다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 항-TGF-β1 siRNA를 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 암 세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다. 본 실시형태의 한 가지 측면에서, 항-TGF-β1 siRNA는 대상체에게 정맥내 투여된다. 본 실시형태의 또 다른 측면에서, 항-TGF-β1 siRNA는 대상체에서 종양에 투여된다. 본 실시형태의 또 다른 측면에서, 항-TGF-β1 siRNA는 종양에 근접하여 투여되거나 종양으로의 전달을 가능하게 하는 비히클에서 전신적으로 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 항-TGF-β1 siRNA를 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 실시형태의 한 가지 측면에서, 항-TGF-β1 siRNA는 대상체에게 정맥내 투여된다. 본 실시형태의 또 다른 측면에서, 항-TGF-β1 siRNA는 대상체에서 종양에 투여된다. 본 실시형태의 또 다른 측면에서, 항-TGF-β1 siRNA는 종양에 근접하여 투여되거나 종양으로의 전달을 가능하게 하는 비히클에서 전신적으로 투여된다.
암(및 암 세포)은 대상체를 발병하는 임의의 암이다. 이러한 암은 간암, 결장암, 췌장암, 폐암 및 방광암을 포함한다. 간암은 원발성 간암 또는 다른 조직으로부터 간으로 전이되는 암일 수 있다. 원발성 간암은 간세포암 및 간모세포종을 포함한다. 전이된 암은 결장암 및 췌장암을 포함한다.
항-TGF-β1 siRNA 분자는 표 1에서 동정된 서열을 포함한다.
표 1: 항-tgfβ1 siRNA 서열
hmTF-25-1: 센스 5'-r(GGAUCCACGAGCCCAAGGGCUACCA)-3'
안티센스 5'-r(UGGUAGCCCUUGGGCUCGUGGAUCC)-3'
hmTF-25-2: 센스 5'-r(CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU)-3'
안티센스 5'-r(AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG)-3'
hmTF-25-3: 센스 5'-r(GAGCCCAAGGGCUACCAUGCCAACU)-3'
안티센스 5'-r(AGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGGCUC)-3'
hmTF25-4: 센스, 5'-r(GAUCCACGAGCCCAAGGGCUACCAU)-3'
안티센스, 5'-r(AUGGUAGCCCUUGGGCUCGUGGAUC)-3'
hmTF25-5: 센스, 5'-r(CACGAGCCCAAGGGCUACCAUGCCA)-3'
안티센스, 5'-r(UGGCAUGGUAGCCCUUGGGCUCGUG)-3'
hmTF25-6: 센스, 5'-r(GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG)-3'
안티센스, 5'-r(CCACCAUUAGCACGCGGGUGACCUC)-3'
hmTF25-7: 센스, 5'-r(GUACAACAGCACCCGCGACCGGGUG)-3'
안티센스, 5'-r(CACCCGGUCGCGGGUGCUGUUGUAC)-3'
hmTF25-8: 센스, 5'-r(GUGGAUCCACGAGCCCAAGGGCUAC)-3'
안티센스, 5'-r(GUAGCCCUUGGGCUCGUGGAUCCAC)-3'
한 가지 측면에서, 항-TGF-β1 siRNA는 하기 서열을 포함한다: 센스: 5'- cccagggcuaccaucaacucu-3'; 안티센스: 5'-agaaguuggcaugguagcccuuggg-3'
항-TGF-β1 siRNA는 약제학적으로 허용되는 담체로 대상체에게 투여된다. 이러한 담체는 분지형 히스티딘-리신 폴리머(polymer)를 포함한다. 이러한 폴리머의 한 가지 실시형태에서, 폴리머는 식 (R)K(R)-K(R)-(R)K(X)를 갖고, 여기서 R = KHHHKHHHKHHHKHHHK 또는 R = KHHHKHHHKHHHHKHHHK, X = C(0)NH2, K = 리신 및 H = 히스티딘이다. 이러한 폴리머는 항-TGF-β1 siRNA를 갖는 나노입자를 형성한다. 나노입자는 대상체에게 정맥내 또는 종양내 투여될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 항-TGF-β1 siRNA와 함께 치료학적 유효량의 면역 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 암 세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다. 본 실시형태의 한 가지 측면에서, 항-TGF β1 siRNA와 함께 면역 체크포인트 억제제의 투여는 항-TGF β1 siRNA의 효능을 증가시킨다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 항-TGF-β1 siRNA와 함께 치료학적 유효량의 면역 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 실시형태의 한 가지 측면에서, 항-TGF β1 siRNA와 함께 면역 체크포인트 억제제의 투여는 항-TGF β1 siRNA의 효능을 증가시킨다.
상술한 바와 같이, 면역 체크포인트 억제제 및 항-TGF-β1 siRNA는 대상체에게 정맥내 투여되거나, 종양에 근접하여 대상체의 종양에 투여되거나, 종양으로의 전달을 가능하게 하는 비히클로 전신 투여된다.
본 실시형태의 한 가지 측면에서, 면역 체크포인트 억제제는, PD-1, PD-L1, CTLA4, Lag3 및 Tim3 등의 수용체와, 인간 세포 등의 포유동물 세포 상의 이들 수용체의 리간드 사이의 상호작용을 차단하는 모노클로날 항체(monoclonal antibody)이다. 특정 측면에서, 모노클로날 항체는 PD1 또는 PDL1에 대한 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체의 예는 아테졸루지맙, 두르발루맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이필리무맙을 포함한다.
본 실시형태의 또 다른 측면에서, 면역 체크포인트 억제제는, PD-1, PD-L1, CTLA4, Lag3 및 Tim3 등의 수용체와, 인간 세포 등의 포유동물 세포 상의 이들 수용체의 리간드 사이의 상호작용을 차단하는 소분자이다. 특정 측면에서, 소분자는 PD1 및 PDL1 사이의 결합을 차단한다. BMS202 및 유사한 리간드는 이러한 소분자의 예이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 항-Cox-2 siRNA를 치료학적 유효량의 항-TGF-β1 siRNA와 함께 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 암 세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다. 이 실시형태의 한 가지 측면에서, 조합물은 대상체에게 정맥내 투여된다. 이러한 실시형태의 또 다른 측면에서, 조합물은 대상체의 종양에 투여된다. 이러한 실시예의 또 다른 측면에서, 조합물은 종양에 근접하여 투여되거나, 종양으로의 전달을 가능하게 하는 비히클로 전신 투여된다.
여전히 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 항-Cox-2 siRNA를 치료학적 유효량의 항-TGF-β1 siRNA와 함께 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 실시형태의 한 가지 측면에서, 조합물은 대상체에게 정맥내 투여된다. 이러한 실시형태의 또 다른 측면에서, 조합물은 대상체의 종양에 투여된다. 이러한 실시형태의 또 다른 측면에서, 조합물은 종양에 근접하여 투여되거나, 종양으로의 전달을 가능하게 하는 비히클로 전신 투여된다.
항-Cox2 siRNA 분자는 표 2에서 동정된 서열을 포함한다.
표 2: 항-Cox2 siRNA 서열
hmCX-25-1: 센스 5'-r(GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU)-3'
안티센스 5'-r(ACAUCAUCAGACCAGGCACCAGACC)-3'
hmCX-25-2: 센스 5'-r(GAGCACCAUUCUCCUUGAAAGGACU)-3'
안티센스 5'-r(AGUCCUUUCAAGGAGAAUGGUGCUC)-3'
hmCX-25-3: 센스 5'-r(CCUCAAUUCAGUCUCUCAUCUGCAA)-3'
안티센스 5'-r(UUGCAGAUGAGAGACUGAAUUGAGG)-3'
hmCX25-4: 센스, 5'-r(GAUGUUUGCAUUCUUUGCCCAGCAC)-3'
안티센스, 5'-r(GUGCUGGGCAAAGAAUGCAAACAUC)-3'
hmCX25-5: 센스, 5'-r(GUCUUUGGUCUGGUGCCUGGUCUGA)-3'
안티센스, 5'-r(UCAGACCAGGCACCAGACCAAAGAC)-3'
hmCX25-6: 센스, 5'-r(GUGCCUGGUCUGAUGAUGUAUGCCA)-3'
안티센스, 5'-r(UGGCAUACAUCAUCAGACCAGGCAC)-3'
hmCX25-7: 센스, 5'-r(CACCAUUCUCCUUGAAAGGACUUAU)-3'
안티센스, 5'-r(AUAAGUCCUUUCAAGGAGAAUGGUG)-3'
hmCX25-8: 센스, 5'-r(CAAUUCAGUCUCUCAUCUGCAAUAA)-3'
안티센스, 5'-r(UUAUUGCAGAUGAGAGACUGAAUUG)-3'
한 가지 측면에서, 항-Cox2 siRNA는 하기 서열을 포함한다: 센스: 5'-ggucugguccuggucugaugaugu-3'; 안티센스:5'-acaucagaccaggcaccagac-3'
항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA는 약제학적으로 허용되는 담체로 투여된다. 이러한 담체는 분지형 히스티딘-리신 폴리머를 포함한다. 이러한 폴리머의 한 가지 실시형태에서, 폴리머는 식 (R)K(R)-K(R)-(R)K(X)를 갖고, 여기서 R = KHHHKHHHKHHHKHHHK 또는 R = KHHHKHHHKHHHHKHHHK, X = C(0)NH2, K = 리신, H = 히스티딘 및 N = 아스파라긴이다. 이러한 폴리머는 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA를 갖는 나노입자를 형성한다. 나노입자는 대상체에게 정맥내 또는 종양내 투여될 수 있다.
항-TGF-β1 siRNA와 관련하여 상술한 바와 같이, 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA의 조합에 의해 표적화된 암(및 암 세포)은 대상체를 발병하는 임의의 암일 수 있다. 이러한 암은 간암, 결장암, 췌장암, 폐암 및 방광암을 포함한다. 간암은 원발성 간암 또는 다른 조직으로부터 간으로 전이된 암일 수 있다. 원발성 간암은 간세포암 및 간모세종을 포함한다. 전이된 암은 결장암 및 췌장암을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은, 치료학적 유효량의 항-TGF-β1 siRNA 및 치료학적 유효량의 항-Cox2 siRNA와 함께 치료 유효량의 면역 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 암 세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법이 대상으로 하는 암 세포 및 암은 상술한 바와 같은 것들을 포함하는, 대상체를 발병하는 임의의 암이다. 본 실시형태의 한 가지 측면에서, 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA와 함께 면역 체크포인트 억제제의 투여는 siRNA 중 어느 하나만의 효능을 증가시킨다.
여전히 또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 치료학적 유효량의 항-TGF-β1 siRNA 및 치료학적 유효량의 항-Cox2 siRNA와 함께 치료학적 유효량의 면역 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법이 대상으로 하는 암 세포 및 암은 상술한 바와 같은 것들을 포함하는, 대상체를 발병하는 임의의 암이다. 본 실시형태의 한 가지 측면에서, 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA와 함께 면역 체크포인트 억제제의 투여는 siRNA 중 어느 하나만의 효능을 증가시킨다.
상술한 바와 같이, 면역 체크포인트 억제제, 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA는 대상체에게 정맥내 투여되거나, 종양에 근접하여 대상체의 종양에 투여되거나, 종양으로의 전달을 가능하게 하는 비히클로 투여된다.
siRNA 분자의 조합으로 투여되는 면역 체크포인트 억제제는 상술한 바와 같은 모노클로날 항체 또는 소분자이다. 이는 siRNA 분자의 조합물과 전에, 후에 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명은 특정 약제학적 조성물에 관한 것이다. 한 가지 실시형태에서, 조성물은 본원에 기재된 약제학적으로 허용되는 담체 중에 본원에 기재된 바와 같은 항-TGF-β1 siRNA를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 본원에 기재된 면역 체크포인트 억제제와 관련하여 사용된다. 따라서, 본 발명의 이러한 실시형태는, 본 발명의 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 치료 약물, 및 본원에 기재된 약제학적으로 허용되는 담체 중에 항-TGF-β1 siRNA를 포함하는 약제학적 조성물의 조합물에 관한 것이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 치료 약물, 및 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA, 및 본원에 기재된 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물의 조합물에 관한 것이다.
본원에 기재된 치료학적 약물 조합은 또한 암을 갖는 대상체에서 면역 체크포인트 억제제의 항-종양 효능을 증진시키는데 유용하다. 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA를 포함하는 치료학적 유효량의 약학적 조성물이, 치료학적 유효량의 면역 체크포인트 억제제와 함께 대상체에게 투여된다. 항-TGF-β1 siRNA는 암에 대한 대상체의 염증 반응을 감소시키고, T-세포 및 다른 면역세포의 종양으로의 보다 양호한 침투를 가능하게 한다. 또한, 체크포인트 억제제 단독에 의해 생성된 면역 반응보다 대상체의 암에 대해 보다 강력한 면역 반응을 생성한다. 이러한 반응은 보다 큰 T-세포 활성화 및 암으로의 침투를 포함한다. 항-Cox2 siRNA는 암에 대한 대상체의 염증 반응을 감소시키고/시키거나, 암 주변의 고갈된 T-세포 또는 조절성 T-세포의 형성을 감소시킨다.
본원에 기재된 치료학적 약물 조합물은 또한 대상체의 암 세포를 인식 및 사멸시키기 위해 T 세포를 항원적으로 프라이밍하기 위해, 및 대상체의 암에 대한 T-세포-매개된 면역을 촉진시키기 위해 유용하다. 치료학적 유효량의 조합물이 대상체에게 투여된다. 암은 본원에 기재된 것들이다.
한 가지 특정 실시형태에서, 본 발명은, 치료학적 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물 또는 본 발명의 치료학적 약물 조합물을 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 간암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 실시형태의 한 가지 측면에서, 간암은 원발성 간암이다. 특정 측면에서, 원발성 간암은 간세포암 또는 간모세포종이다. 이러한 실시형태의 또 다른 측면에서, 간암은 대상체의 체내의 다른 조직으로부터 간으로 전이된 암이다. 이러한 전이된 암은 결장암 및 췌장암을 포함한다. 이러한 실시형태의 한 가지 측면에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명은, 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA와 함께 나노입자를 형성하는 분지형 히스티딘-리신 폴리머를 포함하는 약제학적으로 허용되는 담체 중에 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA를 포함하는 치료학적 유효량의 약제학적 조성물을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 간세포 암성 세포를 사멸시키는 방법으로서,
상기 항-TGF-β1 siRNA는 서열: 센스: 5'-cccagggcuaccaugccaacucu-3'; 안티센스: 5'-gagucuggugguagcccuuggg-3'을 포함하고;
상기 항-Cox2 siRNA는 서열: 센스: 5'-ggucugguccuggucugaugu-3'; 안티센스: 5'-acaucaucagaccaggcaccagacc-3'을 포함하는, 방법에 관한 것이다.
여전히 또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명은, 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA와 함께 나노입자를 형성하는 분지형 히스티딘-리신 폴리머를 포함하는 약제학적으로 허용되는 담체 중에 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA를 포함하는 약제학적 조성물 및 치료학적 유효량의 면역 체크포인트 억제제를 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 간세포 암성 세포를 사멸시키는 방법으로서,
상기 항-TGF-β1 siRNA는 서열: 센스: 5'-cccagggcuaccaugccaacucu-3'; 안티센스: 5'-gagucuggugguagcccuuggg-3'을 포함하고;
상기 항-Cox2 siRNA는 서열: 센스: 5'-ggucugguccuggucugaugu-3'; 안티센스: 5'-acaucaucagaccaggcaccagacc-3'을 포함하고;
상기 체크포인트 억제제는, PD1 및 PDL1에 결합하여 상호작용을 차단할 수 있는 모노클로날 항체인, 방법에 관한 것이다. 이러한 모노클로날 항체는 아테졸루지맙, 두르발루맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이필리무맙을 포함한다.
추가의 특정 실시형태에서, 본 발명은, 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 치료 약물, 및 약제학적으로 허용되는 담체 중에 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox 2 siRNA를 포함하는 약제학적 조성물의 조합물로서,
상기 체크포인트 억제제는, 아테졸루지맙, 두르발루맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이필리무맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 모노클로날 항체를 포함하고,
상기 항-TGF-β1 siRNA는 서열: 센스: 5'-cccagggcuaccaugccaacucu-3'; 안티센스: 5'-gagucuggugguagcccuuggg-3'을 포함하고;
상기 항-Cox2 siRNA는 서열: 센스: 5'-ggucugguccuggucugaugu-3'; 안티센스: 5'-acaucaucagaccaggcaccagacc-3'을 포함하고;
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA와 함께 나노입자를 형성하는 분지형 히스티딘-리신 폴리머를 포함한다. 이러한 실시형태의 한 가지 측면에서, 분지형 히스티딘-리신 폴리머는 식 (R)K(R)-K(R)-(R)K(X)를 갖고, 여기서 R = KHHHKHHHKHHHKHHHK 또는 KHHHKHHHKHHHHKHHHK, X = C(0)NH2, K = 리신, H = 히스티딘, 및 N = 아스파라긴이다.
정의
간암은 간내의 임의의 원발성 암, 즉 간에서 발생하는 것; 또는 간 내의 임의의 2차 암, 즉 포유동물의 체내의 다른 조직으로부터 간으로 전이하는 암이다. 원발성 간암의 예는 간세포암이다. 2차 간암의 예는 결장암이다.
암은 임의의 악성 종양이다.
악성 종양은 신생물성 세포의 매스(mass)이다.
치료하는/치료는 암 세포의 일부 또는 전부를 사멸시키고, 암의 크기를 감소시키고, 암의 성장을 억제하거나, 또는 대상체에서 암의 성장 속도를 감소시키는 것이다.
항-TGF-β1 siRNA는, TGF-β1 단백질의 합성을 코딩하는 포유동물 세포에서 유전자의 발현을 감소 또는 방지하는 siRNA 분자이다.
항-Cox2 siRNA는, Cox2 단백질의 합성을 코딩하는 포유동물 세포에서 유전자의 발현을 감소 또는 방지하는 siRNA 분자이다
siRNA 분자는, 이본쇄 올리고뉴클레오티드, 즉 짧은 이본쇄 폴리뉴클레오티드이고, 이는, 분자가 세포 내로 도입된 후, 세포 내의 유전자의 발현을 방해한다. 예를 들면, 이는 일본쇄의 표적 RNA 분자에서 상보적인 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 결합한다. siRNA 분자는 당업자에게 공지된 기술에 의해 화학적으로 합성되거나, 달리 구성된다. 이러한 기술은 미국 특허 제5,069,09호, 제5,898,031호, 제6,107,094호, 제6,506,559호, 제7,056,704호 및 유럽 특허 제1214945호 및 제1230375호에 기재되어 있고, 참조에 의해 이의 전체가 본원에 도입된다. 현장에서의 관례에 의해, siRNA 분자가 특정 뉴클레오티드 서열에 의해 동정되는 경우, 상기 서열은 이본쇄 분자의 센스 쇄를 지칭한다. 분자를 포함하는 하나 이상의 리보뉴클레오티드는 당해 기술분야에 공지된 기술에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 하나 이상의 개별 뉴클레오티드의 수준에서 변형되는 것에 추가하여, 올리고뉴클레오타이드의 골격을 변형시킬 수 있다. 추가의 변형은, siRNA 분자로의 결합을 위한 소분자(예를 들면, 당 분자), 아미노산, 펩티드, 콜레스테롤 및 다른 거대 분자의 사용을 포함한다.
분지된 히스티딘-리신 폴리머는 히스티딘 및 리신의 아미노산으로 구성된 펩티드이다. 공통의 리신 코어로부터 복수의 아미노산을 합성함으로써, 펩티드는 4개의 암 또는 브랜치(branch)로 구성된다. 이러한 폴리머는 2006년 7월 4일자로 허여된 미국 특허 제7,070,807 B2호, 2007년 1월 6일자로 허여된 제7,163,695 B2호, 2010년 8월 10일자로 허여된 미국 특허 제7,772,201 B2호에 기재되어 있고, 이들은 참조에 의해 그 전체가 본원에 도입된다.
면역 체크포인트 억제제는 T 세포 및 일부 암 세포 등의 일부 유형의 면역 시스템 세포에 의해 제조된 특정 단백질을 차단하는 약물이다. 이들 체크포인트 단백질은 체크시에 면역 반응을 유지하는데 도움을 주고, T 세포가 암 세포를 사멸시키는 것을 방지할 수 있다. 이러한 체크포인트 단백질이 차단되면, 면역 시스템 상의 "브레이크(brake)"는 해방되고, T 세포는 암 세포를 보다 잘 사멸시킬 수 있다. T 세포 또는 암 세포에서 발견되는 체크포인트 단백질의 예는 PD-1/PD-L1 및 CTLA-4/B7-1/B7-2를 포함한다.
종양에 근접하고 있는 것은, 종양 또는 일련의 종양 세포에 근접 또는 주변의 조직 또는 세포내를 의미한다.
항종양 효능을 증진시키는 것은, 종양 세포의 성장 속도의 보다 큰 감소, 종양 세포의 사멸 및/또는 종양 매스의 감소에서 보다 큰 효과를 제공하고, 따라서 최종적으로는 종양을 갖는 대상체의 수명을 연장시킴으로써 보다 양호한 치료 효과를 생성하는 것을 의미한다. 이러한 효과는, 종양 세포 자체로의 직접 작용 또는 T-세포의 활성의 증가, 또는 T-세포가 종양 세포로의 보다 양호한 액세스를 제공하고/하거나, 최초의 치료 후에도 종양 세포를 인식하는 능력의 유무에 따라, 활성화되어 종양에 대한 보다 강력한 면역 반응을 촉진하는 메카니즘에 의해 매개될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 양태를 예시하고, 그 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실험 결과
STP707은, 분지형 폴리펩티드 HKP(히스티딘 리신 폴리머)로 이루어진 폴리펩티드 전달 나노입자에 의해 보호된 2개의 siRNA(TGF-β1 및 Cox2 유전자를 표적화하는)로 구성되어 있다. STP707은 2018년 5월 9일자의 미국 특허 제9,642,873 B2호 및 2018년 5월 29일자의 미국 재발행 특허 제RE46,877 E호에 기재되어 있고, 그 개시는 참조에 의해 그 전체가 본원에 도입된다.
히스티딘 및 리신 아미노산(HKP)으로 이루어진 분지형 폴리펩티드 나노입자를 사용하여, IV 주사에 의해 나노입자가 간내의 세포에 의해 보다 높은 효율로 흡수될 수 있음을 입증했다. 유세포 분석법(flow cytometry)을 사용하여 나노입자로부터 형광 태그된 siRNA의 흡수를 측정하고, 성상 세포, LSEC 세포, 간세포, 쿠퍼 세포를 포함하여, 간 내의 특정 세포 유형으로의 전달을 입증했다(도 1). 따라서, 이는 간내의 이들 세포에 대한 siRNA의 매우 우수한 전달 효율을 수득할 수 있고, 따라서 이들 세포 내에서 목적 표적을 사일런싱할 수 있다는 것을 시사한다.
Hepa 1-6 세포주의 생물발광 변이체를 사용하여 경시적 종양 부하의 모니터링을 가능하게 하는 동소성 뮤린 간세포암 모델에서, STP707을 단일요법으로서, 또는 항-PD-L1 모노클로날 항체(mAb)(BioXcell, West Lebanon, NH 03784의 항-PD-L1 모노클로날 Ab 클론 10F.9G2)와 조합하여 검사했다.
본 발명자들은 동소성 이식 모델을 사용했고, 이 모델은 HCC 간암 종양 세포(Hepa 1-6 세포)가 이들이 유래하는 기관(간)에 외과적으로 이식되었다. 마우스 간암 세포주는 루시퍼라제(Hepa 1-6-Lux)를 발현하도록 변형시켰다. 이어서, 기질을 동물에 첨가하면, 이들 동물의 간에서 종양 성장의 정도는, 발광 검출 시스템을 사용하여 모니터링할 수 있다. 이에 의해, 동물에 해를 미치지 않는 비침습적 방법으로 종양의 성장을 측정할 수 있다. 이 방법을 사용하여, 종양의 성장율을 모니터링했다. 인간에서 간세포암 치료의 골드 스탠다드(소라페닙-키나제 억제제; 50mg/Kg 투여된 QD) 및 검증된 마우스 항-PDL1 항체를 사용하여, 임의의 치료 부재하에서의 성장율(대조군)을 조사했고, 동소성 Hepa1-6 종양(5mg/Kg에서 BIW를 투여)의 동물에서 종양 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
또한, 본 발명자들은 HKP 펩티드 입자(주사당 40㎍ 또는 20㎍의 용량으로 IV BIW를 투여)를 사용하여 전달된 TGF-β 및 Cox2(STP707)을 억제하는 것으로 밝혀진 siRNA의 효과를 비교했다. 추가로, 항-PDL1 항체와 함께 투여한 경우의 STP707의 효과를 분석했다.
본 발명자들은 STP707을, Hepa 1-6 세포주의 생물발광 변이체를 사용한 동계의 동소성 마우스 간세포암 모델을 사용하여 HCC의 치료 효과에 대해 조사하여, 경시적으로 종양 부하의 모니터링을 가능하게 했다.
실험은 챨스 리버 랩의 C57BL/6J 마우스 계통을 사용하여 실시했다.
비히클(HKP + 비-사일런싱 siRNA; 대조군) 또는 STP707을 둘 다 정맥내 투여했다(iv).
8마리 동물을 각 치료 그룹에 무작위로 할당했다. 치료 그룹은 다음과 같다:
1. 비히클
2. 소라페닙(50mg/Kg) po, QD
3. 항-PD-Ll(5mg/Kg), ip, BIW
4. 항-PD-Ll(5mg/Kg), ip, BIW + 20㎍ STP707/주입 iv BIW
5. 항-PD-Ll(5mg/Kg), ip, BIW + 40㎍ STP707/주입 iv BIW
6. 40㎍ STP707/주입 iv BIW 단독
동물은, 체중을 기준으로 하여 실험의 개시시에 무작위화되었다. 무작위화는, 도 2에 도시된 바와 같이, 각 그룹 내의 선택된 동물에서 매우 유사한 체중 분포를 제공했다.
동물의 체중은, 효능 연구의 투여 단계 중에 매일 측정했다. 각 그룹의 평균 체중을 플롯팅했다(도 3). 소라페닙 단독에서는 체중에 약간의 변화가 유도되었다. 그러나, 모든 다른 치료 방식(STP707 단독 또는 + 항-PDL1)은 내용성이 높고, 치료 그룹에서 유의한 체중 감소는 관찰되지 않았다.
종양 성장은 생물발광 이미지화에 의해 모니터링되고, 종양 관련 생물발광(TABL)의 정량화에 의해 반영되었다. TABL은 연구 일자에 의해 플롯팅되었고, 도 4에 제시되어 있다.
예정된 투약 단계의 완료시에, 종양의 성장을 그룹 2-6에 대해 모니터링했다. 연구의 최종일(50일차)의 전에 종양 재성장은 관찰되지 않았고, 이는 치료가 종양 성장을 억제하고 재성장을 방지하는데 매우 효과적이고, 종양 생존율에 대한 현저한 효과를 시사한다.
병용 요법의 효과는 연구에서 모든 마우스에 대한 생존 분석(인간 대리 종점을 사용하여)에 의해 추가로 강조되었다(도 5). 인도적 종료의 종점은, 종양이 최대 허용 크기에 도달했을 때, 또는 종양이 유해한 임상 징후를 나타냈을 때의 어느 하나로서 정의되었다. 로그-랭크(log-rank)(Mantel-Cox) 검정(p=0.0001) 및 Gehan-Breslow-Wilcoxon 검정(p=0.0002)에서 입증된 바와 같이, 모든 치료 섭생에서 통계적으로 유의하게 개선된 생존율이 수득되었다. 치료 그룹 사이에서 생존율의 차이는 관찰되지 않았다.
상기 수득된 결과를 검증하기 위해, 저용량의 STP707(1mg/kg)을 사용하여 연구를 반복했다(도 6).
수득된 데이터는, STP707가 종양에 대해 단일 약제 작용을 나타내고, 대조군(무처리) 코호트와 비교하여 성장이 감소한다는 관찰 결과를 뒷받침했다. STP707 그룹은 항체 그룹(PDL1) 단독보다도 우수한 효능을 나타냈다.
이 연구에서, STP707은 항-PDl 항체 단독보다 우수한 단일 약제 활성을 나타낸다. 그러나, STP707을 항체 치료와 조합하는 것은 4회 투여후에 종양을 검출불가능한 수준으로 감소시켰다.
STP707의 어느 하나의 치료 그룹에서도 종양이 명백하지 않았기 때문에, 연구를 반복했지만, 1mg/Kg으로 STP707의 3회 용량만 사용했다. 3회차 투여 후, 동물을 안락사시키고, 간을 제거하고, 절편화하고, 면역조직화학을 사용하여 CD4+ 및 CD8+ T-세포를 염색했다.
이러한 감소된 용량 연구에서도, 전체적 종양 크기와 관련하여, 무처리(대조군) 샘플과 STP707 처리된 샘플 사이의 극적인 차이가 발견된다. 무처리 동물에서, 종양은 거의 완전히 간의 크기이지만, STP707 샘플에서 종양은 대폭 축소되었다(도 7).
추가로, CD4+ 및 CD8+ T-세포에 대한 IHC 염색은 STP707 처리된 샘플의 종양을 침투하는 이들 T-세포의 극적인 증가를 나타냈다(도 7 및 도 8). 이미지 분석은, 종양 샘플의 착색 라인에 의해 나타낸 바와 같이, 종양 및 간 사이의 마진에서 CD4+ 및 CD8+ T-세포를 정량하기 위해 실행했다. 이들 라인은 종양 마진으로부터 50㎛의 거리에서, 종양을 향해, 또는 종양으로부터 떨어져 간을 향해 있다. 각 50㎛ 세그먼트에서 모든 CD8 T-세포를 계수하고, 데이터를 도 8에 도시된 바와 같이 플롯팅했다.
항-PDLl Ab와 함께 STP707 치료는 종양에 대해 500㎛에서 CD8+ T-세포의 2배 증가를 나타냈다. 또한, 이는 종양에 근접한 간 내의 CD8+ T-세포의 증가를 나타내고, 이는 종양을 둘러싸는 TGF-β "벽"의 저하에 의해 유도된 T-세포의 동원의 가능성을 시사한다.
결론
이 연구의 주요 목적은, STP707(TGF β1 및 Cox2에 대한 siRNA를 포함하는 HKP 폴리펩티드 입자)의 내약성 및 효능을, 단일요법으로서 및 항-PD-L1과 조합하여, Hepa 1-6 세포주의 생물발광 변이체를 사용한 동소성 마우스 간세포암 모델에서 결정하는 것이었다.
모든 치료 섭생은 시험된 용량 및 제형에서 충분히 허용되었고; 임의의 치료 그룹에서도 유해한 임상 징후 및 체중 감소는 발견되지 않았다.
모든 치료 섭생은. 대조군과 비교하는 경우, 통계적으로 유의한 종양 성장의 감소를 생성했다. 그러나, STP707 단일요법(2mg/kg)는 종양 성장의 저하를 초래했고, 이는 또한 항-pdl Ab와 조합하는 경우에도 관찰되었다. STP707의 용량을 1mg/kg으로 감소시키면, STP707 단독의 효과는 저하되지만, 항-PD1 Ab와의 상가성은 보다 명백해졌다.
항-PD-L1 5mg/kg 및 STP705(주사당 20㎍(1mg/kg))의 조합은, 항-PD-L1 5mg/kg보다 더욱 효과적인 STP705 단일요법보다도 더 효과적인 것으로 나타났다.
본 발명의 결과는, STP707이 항-PDL1 항체의 작용을 증진시키고, 2주간 이상 투여를 정지한 후에도, 종양 세포의 복귀 없이 종양의 생존율이 극적으로 저하되는 것을 나타낸다. IV 제공된 제형으로 간으로의 전달을 나타내는 사실은, 이 섭생에서 간에 잠복하는 종양을 치료할 수 있음을 시사한다. 이는 간에서 자연적으로 발생하는 종양(간모세포종 또는 간세포암(HCC)) 또는 간으로 전이되는 종양(예를 들면, 결장암)을 포함할 것이다.
추가로, 이전의 연구에서, 생성물을 주사(예를 들면, 피내)에 의해 투여한 경우에, 이들 2개의 유전자 표적의 유전자 발현을 감소시키는 능력을 입증했다. 이는, 생성물이 종양에 근접하여 주사에 의해 투여된 경우, 종양에 대한 면역 반응을 촉진시키는 동일한 치료상의 효과를 수득할 수 있다는 것을 시사한다. 이는 진피 암(예를 들면, 비-흑색종 피부암 또는 흑색종 종양), 또는 동일한 효과를 촉진하기 위해 종양 부위에 근접하여 물질을 주입할 수 있는 다른 기관의 종양에서 사용될 수 있다.
참고문헌
[1] Liu et al., Cancer Cell Int (2015) 15:106-112 "Cyclooxygenase-2 promotes tumor growth and suppresses tumor immunity"
[2] Zelenay et al., Cell (2015) 162: 1257-1270 "Cyclooxygenase-Dependent Tumor Growth through Evasion of Immunity"
[3] Mariathasan et al., Nature (2018) 554; 544-548 "TGFβ attenuates tumour response to PD-L1 blockade by contributing to exclusion of T cells"
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Claims (81)

  1. 치료학적 유효량의 항-TGF-β1 siRNA를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암 세포를 사멸시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-TGF-β1 siRNA가 대상체에게 정맥내 투여되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 암 세포가 악성 종양을 포함하고, 상기 항-TGF-β1 siRNA가 상기 종양 내로 또는 상기 종양에 근접하여 투여되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 간암, 결장암, 췌장암, 폐암 또는 방광암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 암이 간암인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 간암이 원발성 간암(primary liver ccancer)을 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 원발성 간암이 간세포암(hepatocellular carcinoma ) 또는 간모세포종(hepatoblastoma)을 포함하는, 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 암이 상기 대상체의 체내의 다른 조직으로부터 상기 간으로 전이된 것인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 전이된 암이 결장암을 포함하는, 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 전이된 암이 췌장암을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-TGF-β1 siRNA가 표 1의 서열로부터 선택되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-TGF-β1 siRNA가 서열:
    센스: 5'-cccagggcuaccaucaacucu-3';
    안티센스: 5'-agaaguuggcaugguagcccuuggg-3'을 포함하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-TGF-β1 siRNA가 약제학적으로 허용되는 담체로 투여되는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체가 분지형 히스티딘-리신 폴리머(branched histidine-lysine polymer)를 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 분지형 히스티딘-리신 폴리머가 항-TGF-β1 siRNA와 함께 나노입자를 형성하는, 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 분지형 히스티딘-리신 폴리머가 식 (R)K(R)-K(R)-(R)K(X)를 갖고, 여기서 R = KHHHKHHHKHHHKHHHK 또는 R = KHHHKHHHKHHHHKHHHK, X = C(0)NH2, K = 리신, H = 히스티딘인, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 나노입자가 대상체에게 정맥내로 투여되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 치료학적 유효량의 항-Cox2 siRNA를 치료학적 유효량의 항-TGF-β1 siRNA와 함께 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 항-Cox2 siRNA가 표 2의 서열로부터 선택되는, 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 항-Cox2 siRNA가 서열:
    센스: 5'-ggucugguccuggucugaugaugu-3';
    안티센스: 5'-acauc auccagaccaggcaccagac-3'을 포함하는, 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA가 약제학적으로 허용되는 담체로 투여되는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체가 분지형 히스티딘-리신 폴리머를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 분지형 히스티딘-리신 폴리머가 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA와 함께 나노입자를 형성하는, 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 분지형 히스티딘-리신 폴리머가 식 (R)K(R)-K(R)-(R)K(X)를 갖고, 여기서 R=KHHHKHHHKHHHKHHHK 또는 R = KHHHKHHHKHHHHKHHHK, X = C(0)NH2, K = 리신, H = 히스티딘인, 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 나노입자가 대상체에게 정맥내로 투여되는, 방법.
  26. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 치료학적 유효량의 면역 체크포인트 억제제를 치료학적 유효량의 항-TGF-β1 siRNA와 함께 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 항-TGF β1 siRNA와 함께 면역 체크포인트 억제제를 투여하는 것이 항-TGF β1 siRNA의 효능을 증가시키는, 방법.
  28. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 치료학적 유효량의 면역 체크포인트 억제제를 치료학적 유효량의 항-TGF-β1 siRNA 및 치료학적 유효량의 항-Cox2 siRNA와 함께 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 항-TGF β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA와 함께 면역 체크포인트 억제제를 투여하는 것이 siRNA의 어느 하나만의 효능을 증가시키는, 방법.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제가 모노클로날 항체(monoclonal antibody)를 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 PD-1, PD-L1, CTLA4, Lag3 및 Tim3로 이루어진 그룹으로부터 선택된 대상체 세포 상의 수용체와 이들 수용체의 리간드 사이의 상호작용을 차단하는, 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 PD1 또는 PDL1에 대한 모노클로날 항체인, 방법.
  33. 제30항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 아테졸루지맙, 두르발루맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이필리무맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  34. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제가 소분자를 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 소분자가 PD-1, PD-L1, CTLA4, Lag3 및 Tim3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 대상체 세포 상의 수용체와 이들 수용체의 리간드 사이의 상호작용을 차단하는, 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 소분자가 PD1과 PDL1 사이의 결합을 차단하는, 방법.
  37. 제34항에 있어서, 상기 소분자가 BMS202 및 유사한 리간드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  38. 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 치료 약물(therapeutic drug)과, 약제학적으로 허용되는 담체 중에 항-TGF-β1 siRNA를 포함하는 약제학적 조성물의 조합물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 항-TGF-β1 siRNA가 표 1의 서열로부터 선택되는, 조합물.
  40. 제38항에 있어서, 상기 항-TGF-β1 siRNA가 서열:
    센스: 5'-cccagggcuaccaucaacucu-3';
    안티센스: 5'-agaaguuggcaugguagcccuuggg-3'을 포함하는, 조합물.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체가, 항-TGF-β1 siRNA와 함께 나노입자를 형성하는 분지형 히스티딘-리신 폴리머를 포함하는, 조합물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 분지형 히스티딘-리신 폴리머가 식 (R)K(R)-K(R)-(R)K(X)를 갖고, 여기서 R = KHHHKHHHKHHHKHHHK 또는 R = KHHHKHHHKHHHHKHHHK, X = C(0)NH2, K = 리신, H = 히스티딘인, 조합물.
  43. 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 치료 약물과, 약제학적으로 허용되는 담체 중에 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA를 포함하는 약제학적 조성물의 조합물.
  44. 제43항에 있어서, 상기 항-TGF-β1 siRNA가 표 1의 서열로부터 선택되고, 상기 항-Cox2 siRNA가 표 2의 서열로부터 선택되는, 조합물.
  45. 제43항에 있어서, 상기 항-TGF-β1 siRNA가 서열: 센스: 5'-cccagggcuaccaucaacucu-3'; 안티센스: 5'-agaaguuggcaugguagcccuuggg-3'을 포함하고;
    상기 항-Cox2 siRNA가 서열: 센스: 5'-ggucugguccuggucugaugu-3'; 안티센스: 5'-acaucaucagaccaggcaccagacc-3'을 포함하는, 조합물.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체가, 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA와 함께 나노입자를 형성하는 분지형 히스티딘-리신 폴리머를 포함하는, 조합물.
  47. 제46항에 있어서, 상기 분지형 히스티딘-리신 폴리머가 식 (R)K(R)-K(R)-(R)K(X)를 갖고, 여기서 R = KHHHKHHHKHHHKHHHK 또는 KHHHKHHHKHHHHKHHHK, X = C(0)NH2, K = 리신, H = 히스티딘인, 조합물.
  48. 제38항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제가 모노클로날 항체를 포함하는, 조합물.
  49. 제48항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 PD-1, PD-L1, CTLA4, Lag3 및 Tim3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 대상체 세포 상의 수용체와 이들 수용체의 리간드 사이의 상호작용을 차단하는, 조합물.
  50. 제48항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 PD1 또는 PDL1에 결합하여 이들의 상호작용을 차단하는, 조합물.
  51. 제48항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 아테졸루지맙, 두르발루맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이필리무맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조합물.
  52. 제38항 내지 제47항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제가 소분자를 포함하는, 조합물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 소분자가, PD-1, PD-L1, CTLA4, Lag3 및 Tim3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 대상체 세포 상의 수용체와 이들 수용체의 리간드 사이의 상호작용을 차단하는, 조합물.
  54. 제52항에 있어서, 상기 소분자가 PD1과 PDL1 사이의 결합을 억제하는, 조합물.
  55. 제52항에 있어서, 상기 소분자가 BMS202 또는 유사한 구조로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조합물.
  56. 치료학적 유효량의 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA를 체크포인트 억제제와 함께 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 갖는 대상체에서 면역 체크포인트 억제제의 항-종양 효능을 증진시키는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 제38항 내지 제55항 중 어느 한 항의 조합물의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 항-TGF-β1 siRNA가 암에 대한 대상체의 염증 반응을 감소시키고, T-세포 및 다른 면역세포의 종양으로의 보다 양호한 침투를 가능하게 하는, 방법.
  59. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 항-TGF-β1 siRNA가 상기 체크포인트 억제제에 의해서만 생성된 면역 반응보다 대상체에서 암에 대해 보다 강력한 면역 반응을 생성하는, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 보다 강력한 면역 반응이 보다 큰 T-세포 활성화 및 암으로의 침투를 포함하는, 방법.
  61. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 항-Cox2 siRNA가, 암에 대한 대상체의 염증 반응을 감소시키고/시키거나, 암 주변의 고갈된 T-세포 또는 조절성 T-세포의 형성을 감소시키는, 방법.
  62. 제38항 내지 제55항 중 어느 한 항의 조합물을 치료학적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암 세포를 포함하는 종양 내로의 T-세포 침투를 증진시키는 방법.
  63. 제38항 내지 제55항 중 어느 한 항의 조합물을 치료학적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암 세포를 인식하고 사멸시키기 위해 T 세포를 항원적으로 프라이밍(priming)하는 방법.
  64. 제38항 내지 제55항 중 어느 한 항의 조합물을 치료학적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암에 대한 T-세포-매개 면역을 촉진시키는 방법.
  65. 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 간암, 결장암, 췌장암, 폐암 또는 방광암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 암이 간암인, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 간암이 원발성 간암을 포함하는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 원발성 간암이 간세포암 또는 간모세포종을 포함하는, 방법.
  69. 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 상기 대상체의 체내의 다른 조직으로부터 상기 간으로 전이된 것인, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 전이된 암이 결장암을 포함하는, 방법.
  71. 제69항에 있어서, 상기 전이된 암이 췌장암을 포함하는, 방법.
  72. 제38항 내지 제55항 중 어느 한 항의 조합물의 치료학적 유효량을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 간암을 치료하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 간암이 원발성 간암을 포함하는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 원발성 간암이 간세포암 또는 간모세포종을 포함하는, 방법.
  75. 제72항에 있어서, 상기 암이 인체 내의 다른 조직으로부터 상기 간으로 전이된 것인, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 전이된 암이 결장암을 포함하는, 방법.
  77. 제75항에 있어서, 상기 전이된 암이 췌장암을 포함하는, 방법.
  78. 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA와 함께 나노입자를 형성하는 분지형 히스티딘-리신 폴리머를 포함하는 약제학적으로 허용되는 담체 중에 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA를 포함하는 치료학적 유효량의 약제학적 조성물을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 간세포 암성 세포를 사멸시키는 방법으로서,
    상기 항-TGF-β1 siRNA는 서열: 센스: 5'-cccagggcuaccaugccaacucu-3'; 안티센스: 5'-gagucuggugguagcccuuggg-3'을 포함하고;
    상기 항-Cox2 siRNA는 서열: 센스: 5'-ggucugguccuggucugaugu-3'; 안티센스: 5'-acaucaucagaccaggcaccagacc-3'을 포함하는, 방법.
  79. 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA와 함께 나노입자를 형성하는 분지형 히스티딘-리신 폴리머를 포함하는 약제학적으로 허용되는 담체 중에 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA를 포함하는 약제학적 조성물 및 치료학적 유효량의 면역 체크포인트 억제제를 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 간세포 암성 세포를 사멸시키는 방법으로서,
    상기 항-TGF-β1 siRNA는 서열: 센스: 5'-cccagggcuaccaugccaacucu-3'; 안티센스: 5'-gagucuggugguagcccuuggg-3'을 포함하고;
    상기 항-Cox2 siRNA는 서열: 센스: 5'-ggucugguccuggucugaugu-3'; 안티센스: 5'-acaucaucagaccaggcaccagacc-3'을 포함하고;
    상기 체크포인트 억제제는, 아테졸루지맙, 두르발루맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이필리무맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 PDL1 및 PDL1에 결합하고, 이들 사이의 상호작용을 차단할 수 있는 모노클로날 항체를 포함하는, 방법.
  80. 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 치료 약물과, 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA를 약제학적으로 허용되는 담체에 포함하는 약제학적 조성물의 조합물로서,
    상기 체크포인트 억제제는 아테졸루지맙, 두르발루맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이필리무맙로 이루어진 그룹으로부터 선택된 모노클로날 항체를 포함하고,
    상기 항-TGF-β1 siRNA는 서열: 센스: 5'-cccagggcuaccaugccaacucu-3'; 안티센스: 5'-gagucuggugguagcccuuggg-3'을 포함하고;
    상기 항-Cox2 siRNA는 서열: 센스: 5'-ggucugguccuggucugaugu-3'; 안티센스: 5'-acaucaucagaccaggcaccagacc-3'을 포함하고;
    상기 약제학적으로 허용되는 담체는 항-TGF-β1 siRNA 및 항-Cox2 siRNA와 함께 나노입자를 형성하는 분지형 히스티딘-리신 폴리머를 포함하는, 조합물.
  81. 제1항 내지 제37항 및 제56항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
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