CN110191712A - 用于激活人成纤维细胞和肌成纤维细胞凋亡的药物组合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种激活哺乳动物组织中成纤维细胞和肌成纤维细胞凋亡的方法，包括给予组织有效剂量的组合物，该组合物含有siRNA，一种siRNA分子与哺乳动物细胞内编码TGF‑β1蛋白的mRNA结合，另一种siRNA分子与哺乳动物细胞内编码COX‑2蛋白的mRNA结合，还包含一种药学上可接受的载体，特别是药学上可接受的组氨酸‑赖氨酸聚合物。本发明也提供了使用这一组合物的方法。

Description

用于激活人成纤维细胞和肌成纤维细胞凋亡的药物组合物及 方法
交叉引用相关专利申请
本专利申请书要求2016年10月30日提交的第62/414,780号美国专利申请的权益和优先权，其全部公开内容通过引用结合到本文中。
技术领域
本发明涉及一种激活人成纤维细胞和肌成纤维细胞凋亡的药物组合物及方法。
背景技术
由于对潜在相关机制缺乏深入的了解，人的增生性瘢痕的减少和治疗是目前来临床上主要的挑战之一，目前有效的治疗手段非常少(Mustoe et al，2002)。因此，掌握纤维化的病理生理学机制有助于开发能够提高临床效益的新的治疗方法(Wynn et al，2012)。纤维化是指细胞外基质(ECM)在受损组织内和周围过度积累，可导致永久性瘢痕(Milleret al，2005)。增生性瘢痕(HTS)是皮肤创面愈合过程中ECM蛋白沉积与降解失衡的结果(Zhu et al，2013)，其特点是损伤后炎症反应延长，导致局部成纤维细胞的血管化、细胞增生和过量胶原沉积(Tredget et al，1997)。成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，在创面愈合过程中起着关键作用，并可分化为肌成纤维细胞，促进ECM合成和组织收缩(McDougall et al，2006；Nedelec et al，2001)。
许多减少增生性瘢痕的方法并没有达到令人满意的效果，这些治疗方法包括手术切除、放射、皮质类固醇注射、冷冻疗法、激光治疗、局部5-氟尿嘧啶治疗、博来霉素注射、纸带张力、消除伤疤服装压力疗法、硅胶布、短期使用橄榄油。因此，需要一种新的治疗方法来减少人体的增生性瘢痕。
我们开发了一种方法，以TGF-β1和COX-2为靶点，设计小干扰核苷酸(siRNA)双链，并从中选择最有效的siRNA，将这些选定的siRNA与组氨酸-赖氨酸共聚合物(HKP)制备成纳米颗粒制剂。该HKP/siRNA纳米颗粒制剂经皮内注射给药后，两种siRNA显示出显著地减少过量疤痕形成的协同作用。这种双靶点siRNA以全新的作用机制显示出强大的抗纤维化活性。
图片的简要描述
图1：选择两个分别靶向TGF-β1和COX-2的有效siRNA双链，用siRNA复合物转染相应的细胞后提取总RNA，进行qRT-PCR分析。所选针对TGF-β1和COX-2的siRNA序列与人类、小鼠、猴子和猪的相应基因序列具有高度同源性。
图2：人成纤维细胞转染5μg/ml的TGF-β1 siRNA或者COX-2 siRNA，或者TGF-β/COX-2siRNA后，比较目标基因(TGF-β，COX-2、a-SMA、Col1A1和Col3A1)的mRNA表达情况(*p＜0.05，**p＜0.01)。处理后的细胞提取总RNA样本，进行qRT-PCR分析。误差条和统计显著性指标结果如图所示。其中NS代表非特异性siRNA治疗的对照组。
图3：转染了TGF-β1/COX-2的siRNA的成纤维细胞的电镜图像(SEM)显示出很强的细胞凋亡活性，其中N表示细胞核，黑色箭头表示脂质体-siRNA颗粒，红色箭头表示凋亡小体。
图4：(左)FACS(流式细胞仪)分析显示，同时转染TGF-β1/COX-2 siRNA后，与未处理组和单独siRNA处理组相比，人肌成纤维细胞凋亡数量显著增加，如右下图所示。(右)成纤维细胞治疗的四个不同阶段：死亡细胞、凋亡细胞、活细胞和早期凋亡细胞。联合使用TGF-β1/COX-2 siRNA处理后，细胞凋亡明显上调。原代成纤维细胞用前述试剂(5μg/ml)处理。采用Annexin V/PI法检测细胞凋亡(Invitrogen，CA)。FACS数据用平均值表示。
图5：(左)用抗a-SMA蛋白的抗体免疫组化染色显示，与单独使用TGF-β1 siRNA或COX-2 siRNA处理组相比，使用TGF-β1/COX-2 siRNAs处理组的蛋白表达显著下降。(右)TGF-β1 siRNA或者COX-2 siRNA或者TGF-β/COX-2 siRNA处理后羟脯氨酸酸活性明显降低(*p＜0.05)。其中，TGF-β1/COX-2 siRNA表现出更强的抑制活性。
图6：(左)为延长保存时间，方便运输，HKP(siRNA)纳米颗粒经冻干后进行SEM图像分析。用粒径仪(Brookhaven 190，NY，美国)分析纳米粒子，平均直径大小为150nm±30。(右)HKP(TGF-β1/COX-2 siRNA)纳米粒子在水溶液中的SEM图像显示，其平均直径为150nm，可用于注射给药。
图7.对HKP(siRNA)纳米颗粒理化性质进行测试，包括HKP(siRNA)纳米颗粒的颗粒大小(左上和左下)和zeta-电位(右下和右下)，平均粒径约为150nm，zeta-电位为38vM。
图8.Alexa Fluor标记的siRNA与HKP包裹的相同siRNA在疤痕内注射后的持续时间和扩散情况的比较。在0、24和48小时后，从人增生性瘢痕组织植入小鼠模型上采集样本。
图9.qRT-PCR结果显示，与正常皮肤组织相比，人HTS组织中TGF-β1和COX-2表达明显上调。*p＜0.05(N＝4)。
图10.将HKP(TGF-β1/COX-2 siRNA)纳米颗粒溶液注入人增生性瘢痕后，组织中TGF-β1和COX-2表达下调。根据一次给药后的qRT-PCR分析，这种靶基因沉默活性可以持续5天。
图11.分别于移植后第0、7、14、28天(N＝3)测定人HTS组织中TGF-β1、COX-2、a-SMA的表达情况。发现TGF-β1的表达高峰出现在第14天。COX-2表达持续增加，直到第28天。同时，a-SMA表达模式与TGF-β1表达相似。
图12.人增生性瘢痕植入小鼠模型的建立过程。用于裸鼠移植的增生性瘢痕组织的大小和厚度。瘢痕组织植入后创面闭合的外观。建立这样一个模型的关键是在移植皮肤上缝针。一个星期后，通过丰富的血管网络判定人HTS移植成功。
图13.人增生性瘢痕植入后的外观图像，包括移植组织后第1天、第1周、第2周、第3周、第4周、第1个月到第6个月的外观。
图14.人体皮肤样本植入裸鼠背部的顶部和侧面视图。采集组织标本，用H&E染色，表明植入的组织已生长到周围组织内。
图15.人体皮肤组织植入裸鼠背部后两周到六个月的外观情况。从2周开始观察到1个月，2个月，3个月，一直到6个月。
图16.HTS植入物的图像分析，HKP(TGF-β1/COX-2 siRNA)及对照品处理后第0天和第28天，HTS植入物的图像(d)处理组(N＝4)的瘢痕组织大小减少约45％(*P＜0.05)。(e)TGF-β1、COX-2、a-SMA、Col1A1 mRNA在HKP(TGF-β1/COX-2 siRNA)处理瘢痕植入物中的表达，N＝3，*P＜0.05。
图17.HKP(TGF-β1/COX-2 siRNA)处理组的瘢痕组织大小减少约45％(N＝4)，*P＜0.05。(e)TGF-β1、COX-2、a-SMA、Col1A1 mRNA在HKP(TGF-β1/COX-2 siRNA)处理瘢痕植入物中的表达，N＝3，*P＜0.05。
图18.(左)HKP(TGF-β1/COX-2 siRNA)及对照品处理后第0天和第28天后的人皮肤植入物的图像。(右)人体皮肤植入物的尺寸变化的定量分析。HKP(TGF-β1/COX-2 siRNA)治疗组(N＝4)皮肤组织大小减少高达38％，*P＜0.05。
图19.HKP(TGF-β1/COX-2 siRNA)处理的皮肤移植物中TGF-β1、COX-2、a-SMA、Col1A1的mRNA的表达显著下调(n＝3)。*p＜0.05。
图20.HKP(TGF-β1/COX-2 siRNA)处理后，在人类疤痕组织植入物(a)中羟脯氨酸酸下调70％，在人体皮肤组织植入物(b)下调40％，n＝3，*p＜0.05。
图21.组织样本用H&E和Masson三色染色，用人VEGF、CD31和a-SMA蛋白抗体进行免疫组织化学染色，揭示用HKP(TGF-β1/COX-2 siRNA)重复处理后血管生成、微型血管标记物和纤维化下调。红色箭头表示皮肤的表皮层。
图22.HKP(TGF-β1/COX-2 siRNA)处理诱导移植的HTS组织和皮肤组织成纤维细胞及肌成纤维细胞凋亡(黑色箭头)，如左图所示，右图为定量分析。
图23.图示为本发明所述预防和减少皮肤纤维化瘢痕的新机制。一个正常的皮肤伤口愈合过程包括三个阶段：炎症、增殖和重塑。瘢痕预防：STP705治疗可下调TGF-β1和COX-2的表达，减少成纤维细胞的增殖，从而维持ECM沉积和降解之间的平衡，促进无疤痕创面愈合。瘢痕治疗：最佳剂量的STP705有望下调瘢痕组织中TGF-β1和COX-2的表达，导致瘢痕组织中成纤维细胞/肌成纤维细胞的凋亡通路被激活。STP705的治疗作用是逆转纤维化疤痕形成过程，减少增生性瘢痕。
发明说明
本发明提供了一种由siRNA分子和医药上可接受的组氨酸-赖氨酸聚合物载体组成的复合物，一个siRNA分子可以结合到编码哺乳动物细胞中TGFβ1蛋白的mRNA上，一个siRNA分子可以结合到编码哺乳动物细胞中COX-2蛋白的mRNA上。本发明还提供了使用该复合物的方法。在一个实施例中，它提供了一种在哺乳动物组织的细胞中下调促纤维化因子和纤维化通路的方法，包括给予组织有效剂量的复合物。在另一个实施例中，它提供了一种在哺乳动物的组织中激活成纤维细胞和肌成纤维细胞凋亡的方法，包括给予组织有效剂量的复合物。在另一个实施例中，它提供了在哺乳动物的组织中减小增生性瘢痕大小的方法，包括给予治疗瘢痕有效剂量的组合物。在另一个实施例中，本发明提供了一种减少哺乳动物组织中纤维化的方法，包括给予组织有效剂量的复合物。
根据特定分子的组成和结构，siRNA分子可以在细胞中产生附加或协同作用。在优选的实施例中，它们产生协同效应。
本发明所使用的“siRNA分子”是一种双寡核苷酸，是一种短的双链多核苷酸，在进入细胞后干扰产生RNA的细胞中基因的表达。例如，它以单链(ss)靶RNA分子(如mRNA或微RNA(miRNA))中的互补核苷酸序列为靶标并与之结合。然后靶标RNA被降解。这些分子是由专业人员通过相关技术设计和构建的。这种技术在美国第5,898,031、6,107,094、6,506,559、7,056,704号专利和欧洲第1214945和1230375专利中有描述，均在本发明的参考文献中列出。根据本领域的惯例，当一个siRNA分子被一个特定的核苷酸序列识别时，这个序列指的是这个双链分子的正义链。
siRNA分子可以由天然产生的核糖核酸组成，即在活细胞中发现的，或其一个或多个核苷酸可以通过现有技术进行化学修饰。除了在一个或多个核苷酸的水平上被修饰外，寡核苷酸的主干也可以被修饰。附加的修改包括将小分子(如糖分子)、氨基酸分子、多肽、胆固醇和其他大分子结合到siRNA分子上。
在一个实施例中，该分子是长度约为19至35个碱基对的寡核苷酸。在本实施例的一个方面，该分子是长度约为19至27个碱基对的寡核苷酸。另一方面，这种分子是一种寡核苷酸，长度约为21到25个碱基对。在所有这些实施例中，分子可能在两端都有平末端，或者两端都有粘性末端，或者一端平末端另一端为粘性末端。
在本发明的组合物中，两种不同分子和共聚物的相对量可以不同。在一个实施例中，两个不同siRNA分子的比例约为1∶1。在另一个实施例中，这些分子与共聚物的比例约为1∶4、1∶4.5或1∶5。最好是两个不同siRNA分子的质量比例是1∶1的质量，这些分子与共聚物的质量比例大约是1∶4、1∶4.5或1∶5。通过这些比例，该组合物形成了平均直径约为150纳米的纳米颗粒。
在一个实施例中，从表1中siRNA分子中筛选siRNA分子。表中指定的一对hmTF-25-2和hmCX-25-1就是一个例子，它具有以下序列：
hmTF-25-2：正义链，5′-r(CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU)-3′；反义链，5′-r(AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG)-3′，及hmCX-25-1：正义链，5′-r(GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU)-3′；反义链，5’-r(ACAUCAUCAGACCAGGCACCAGACC)-3’。
本发明包括一种鉴别所需siRNA分子的方法，其步骤包括：(a)创建一组siRNA分子，其设计目标是目标mRNA分子中的互补核苷酸序列，其中siRNA分子的目标链包含各种核苷酸序列；(b)通过体外细胞实验选择对目标mRNA分子表现出最高预期效果的siRNA分子；(c)在动物创伤模型中评估选定的siRNA分子；(d)选择模型中对其沉默活性和治疗效果最有效的siRNA分子。
重要的是，目前还不可能高度有把握地预测，在许多可能针对疾病基因mRNA序列的候选siRNA序列中，哪些序列实际上会表现出有效的RNAi活性。相反，必须在哺乳动物细胞培养(如体外器官培养试验)中对单独的候选siRNA多核苷酸或寡核苷酸序列进行测试，以确定目标基因的表达是否发生了预期的干扰。siRNA的独特优势使其能够与多个siRNA双链联合，在同一治疗中靶向多个致病基因，因为所有siRNA双链在化学上均为同源，来源相同，制造工艺相同。
首选的动物创伤模型是Balb/c小鼠的背部皮肤切除创伤模型或猪的背部皮肤切除创伤模型。其次，动物伤口模型是猪的皮肤烧伤模型。再次，动物创伤模型是转基因糖尿病(db+/db+)小鼠背部皮肤切除创伤模型。siRNA分子最好在至少两个动物模型中进行评估。在一个实施例中，该方法还包括向上述步骤(b)所选形成药物组合物的每个siRNA分子添加药学上可接受的载体的步骤，以及在动物创伤模型或其它模型中评估每个药物组合物。
在一个实施例中，siRNA序列的制备方法是，每个序列至少可以针对人和小鼠，或人类和非人类灵长类动物，并抑制相同的基因。一方面，siRNA分子同时与人类mRNA分子和同源的小鼠mRNA分子结合。也就是说，人类和老鼠的mRNA分子编码的蛋白质在结构或功能上基本相同。因此，在小鼠疾病模型中观察到的疗效和毒性反应可以很好地预测在人体中将发生什么。更重要的是，在小鼠模型中测试的siRNA分子是人类药物的良好候选。siRNA药物制剂的人类/小鼠同源性设计可以消除单克隆抗体药物中观察到的物种特异性的毒性和不良反应。
在一个实施例中，本发明提供了一种组合物，包括两个或多个不同的siRNA分子，它们与哺乳动物细胞中编码TGF-β1蛋白的mRNA结合，与哺乳动物细胞中编码COX-2蛋白的mRNA结合。这些分子可能与靶mRNA内的不同核苷酸序列结合。根据特定分子的组成和结构，siRNA分子可以在细胞中产生附加或协同作用。在优选的实施例中，它们产生协同效应。在这些实施例的应用中，siRNA分子是从表1中标识的分子中选择的。
siRNA分子与药学上可接受的载体结合，成为给哺乳动物使用的药物组合物。在本实施例的一个方面，哺乳动物是实验动物，包括狗、猫、猪、非人类灵长类动物和啮齿动物，如小鼠、大鼠和豚鼠。在另一方面，哺乳动物是人类。
载体为组氨酸-赖氨酸共聚物，形成含有siRNA分子的纳米颗粒，纳米颗粒直径为100-400nm。在本实施例的一个方面，所述载体是从HKP清单中的H3K4b和PT73选择的，这些HKP具有赖氨酸主干，其四个分支包含多个重复的组氨酸、赖氨酸或天冬酰胺。当HKP水溶液与siRNA按质量比为4∶1混合时，纳米颗粒(平均直径100-200纳米)自组装形成。在本实施例的另一个方面，HKP结构如下：
(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)，其中R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK，或R＝KHHHKHHHNHHHNHHHN，X＝C(0)NH2，K＝赖氨酸，H＝组氨酸，N＝天冬酰胺。
在本实施例的另一个方面，HKP结构如下：
(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)，其中R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK，X＝C(0)NH2，K＝赖氨酸，H＝组氨酸。
本发明的组合物可以用于下调哺乳动物细胞或组织中的促纤维化因子的表达，如平滑肌肉肌动蛋白(a-SMA)、羟脯氨酸酸、Smad-3和结缔组织生长因子(CTGF)和纤维化的通路，比如TGF-β1/Smad-3/a-SMA/胶原蛋白1-3。给予所述哺乳动物组织有足够疗效的所述组合物。我们假设使用RNAi阻断通路上游因子，如TGF-β1，是一种更有效的抑制剂。根据纤维化通路所涉及的复杂网络，我们假设抑制另一通路中的相关因子，如COX-2，可能会产生协同作用，加强对纤维化通路及其相关网络的控制。在一个实施例中，该组织是皮肤疤痕、肝、肺、肾或心脏组织。在本实施例的一个方面，该组织是皮肤疤痕组织。在另一个实施例中，细胞包括成纤维细胞和肌成纤维细胞。在本实施例的一个方面，纤维母细胞和肌纤维母细胞是真皮纤维母细胞和肌纤维母细胞。优选的，所述哺乳动物是人类。
本发明组合物还可用于激活哺乳动物组织中的成纤维细胞和肌成纤维细胞凋亡，这可以减少组织慢性炎症发生后疤痕形成引起的组织纤维化。所述组合物能够对所述哺乳动物的组织产生有效治疗效果。通过流式细胞仪(FACS)分析凋亡细胞情况，计数细胞数量，检测体内外TGF-β1、COX-2、a-SMA、胶原I、胶原III、羟脯氨酸等蛋白的表达水平。在一个实施例中，该组织是皮肤疤痕、肝、肺、肾或心脏组织。在另一个实施例中，该组织是皮肤疤痕组织。在另一个实施例中，纤维母细胞和肌纤维母细胞是真皮纤维母细胞和肌纤维母细胞。优选的，哺乳动物是人类。
本发明的一个具体实施例提供了一种在人体组织中激活成纤维细胞和肌成纤维细胞凋亡的方法，包括向组织中注入有效剂量的含有siRNA分子的组合物，这些siRNA包括hmTF-25-2：正义链，5’-r(CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU)-3’，反义链，5’-r(AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG)-3’，hmCX-25-1：正义链，5’-r(GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU)-3’，反义链，5’-r(ACAUCAUCAGACCAGGCACCAGACC)-3’，以及药学可接受的载体，包括药学可接受的组氨酸-赖氨酸共聚合物。在一个实施例种，组氨酸-赖氨酸共聚物包括H3K4b类组氨酸-赖氨酸共聚物或PT73类组氨酸-赖氨酸共聚物。在另一个实施例，组氨酸-赖氨酸共聚物具有该结构式(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)，其中R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK，X＝C(O)NH2，K＝赖氨酸，H＝组氨酸，N＝天冬酰胺。在另一个实施例中，组氨酸-赖氨酸共聚物具有该结构式(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)，其中R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK，或者R＝KHHHKHHHKHHHHKHHHK，X＝C(0)NH2，K＝赖氨酸，H＝组氨酸。
本发明的组合物还可用于减小哺乳动物组织中增生性瘢痕的大小，以有效剂量将该组合物用于疤痕组织。这些组织包括但不限于皮肤、肝、肺、肾和心脏组织。在一个实施例中，疤痕包括成纤维细胞和肌成纤维细胞。在另一个实施例中，疤痕包括真皮成纤维细胞和真皮肌成纤维细胞。哺乳动物可以是实验动物，如狗、猫、猪、非人灵长类动物，或啮齿动物，如老鼠、大鼠或豚鼠。优选的，哺乳动物是人类。在一个实施例中，增生性疤痕的形成被逆转。
本发明提供了一种方法的详细说明，以减少人类的皮肤组织增生性瘢痕的大小，方法包括有效治疗剂量的含siRNA分子的组合物，这些siRNA包括，hmTF-25-2：正义链，5’-r(CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU)3’，反义链，5’-r(AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG)-3’，hmCX-25-1：正义链，5’-r(GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU)3’，反义链，5’-r(ACAUCAUCAGACCAGGCACCAGACC)-3’。药学上可接受的载体包括药学接受组氨酸-赖氨酸化学共聚体。本实施例的一方面，所述组氨酸-赖氨酸共聚物包括H3K4b类组氨酸-赖氨酸共聚物或PT73类组氨酸-赖氨酸共聚物。本实施例的另一方面，组氨酸-赖氨酸共聚合物的结构式为(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)，其中R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK，X＝C(0)NH2，K＝赖氨酸，H＝组氨酸，N＝天冬酰胺。在本实施例的另一方面，组氨酸-赖氨酸共聚合物具有(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)结构式，其中R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK，或R＝KHHHKHHHKHHHHKHHHK，X＝C(O)NH2，K＝赖氨酸，H＝组氨酸。
本发明中，将有效剂量的所述组合物导入组织内，还可用于减少哺乳动物组织中的纤维化。这些组织包括但不限于皮肤、肝、肺、肾和心脏组织。在一个实施例中，纤维化组织包括成纤维细胞和肌成纤维细胞。该组合物可以通过注射到组织中、皮下注射或静脉注射到哺乳动物中来传递。哺乳动物可以是实验动物，如狗、猫、猪、非人灵长类动物，或啮齿动物，如老鼠、大鼠或豚鼠。优选的，哺乳动物是人类。
剂量、给药方式和给药时间由本领域有经验的人来决定，并将相关的教义包含在此处。在一个实施例中，该组合物通过注射到组织中来给药。在另一个实施例中，所述组合物通过皮下注射到所述哺乳动物的方式给药。在另一个实施例中，所述组合物通过静脉注射给所述哺乳动物。在优选实施例中，哺乳动物是人类。
表1
下面的实施例阐述了本发明的部分内容，但本发明的内容不限于这些实施例所述的内容。
具体实施例
实施例1、同时沉默TGF-β1和COX-2基因的表达
我们首先通过计算机编制的特定算法设计了针对人类TGF-β1和COX-2mRNA的siRNA序列，然后基于高效的细胞转染研究和qRT-PCR分析对这些序列进行检测(图1)。根据对基因沉默的效率和对细胞的毒性来选择有效的siRNA。当从增生性瘢痕组织中分离的成纤维细胞分别或联合转染以TGF-β1或COX-2为靶点的选定的siRNA时，我们观察到不同阶段(从初始的内吞阶段到siRNA在细胞内泌体中的释放阶段)都有有效剂量的siRNA进入细胞。转染后对靶基因沉默的检测结果表明，无论是使用TGF-β1 siRNA还是COX-2 siRNA，还是联合使用TGF-β1/COX-2两种siRNA(TGF-β1/COX-2siRNA)时，靶基因表达均显著下调。有意思的是，不仅TGF-β1 siRNA和TGF-β1/COX-2siRNA联合能够抑制TGF-β1表达，COX-2 siRNA也能够下调TGF-β1表达。这一结果提示TGF-β1和COX-2通路之间存在潜在的相互作用。同样，TGF-β1 siRNA也能显著抑制COX-2的表达。除了靶标基因被沉默外，其他促纤维化因子如a-SMA，胶原蛋白1(Col1A1)和胶原蛋白3(Col3A1)在细胞中的表达也有所下调(图2)。这些结果表明，同时抑制成纤维细胞中的TGF-β1和COX-2因子，会同时激活多个促纤维化的调节因子和纤维化通路的下调。
实施例2、同时沉默TGF-β1和COX-2基因表达可激活成纤维细胞/肌成纤维细胞的凋亡
我们进一步研究了当这些促纤维细胞因子下调时，成纤维细胞的变化。用TGF-β1或COX-2或TGF-β1/COX-2siRNA联合转染的成纤维细胞的电镜图像(图3)表明，联合治疗激活哦了成纤维细胞的凋亡活性，但没有发生在单独一种siRNA的治疗组。用TGF-β1/COX-2siRNA联合治疗的人成纤维细胞的FACS分析显示，与单独用TGF-β1 siRNA或COX-2 siRNA治疗的人相比，凋亡细胞群急剧增加(图4)。TGF-β1/COX-2siRNA联合治疗的成纤维细胞/肌成纤维细胞显示出较低的细胞密度和不同于正常细胞的形态。当我们在TGF-β1/COX-2siRNA联合治疗后用免疫荧光染色测定检测人成纤维细胞中a-SMA蛋白的表达时，观察到与单个siRNA治疗相比，a-SMA蛋白的表达显著降低(图5)。我们还测量了细胞培养中的羟脯氨酸(HPC)水平，这是一个ECM蛋白合成活性的指标，也是组织纤维化的标志，表明使用TGF-β1/COX-2 siRNA组合能降低人类成纤维细胞中HPC的水平(图5)。以上结果都清楚地表明，当人成纤维细胞中TGF-β1和COX-2基因表达同时沉默时，多个纤维化因子的表达出现了一系列下调。因此，治疗后的成纤维细胞活性降低，凋亡增加。
实施例3、HKP增强siRNA有效导入到增生性瘢痕内
为了确保向增生性瘢痕有效输送siRNA，我们选择了一种生物可降解的组氨酸赖氨酸多肽(HKP)，该多肽已被证明能够在体内有效输送siRNA(Leng et al，2008年和Yan etal，2008年)。当HKP和siRNA以经过优化的N/P比(4/1)的比例的水溶液中混合时，纳米颗粒通过静电结合自组装形成。这些纳米颗粒可以冻干成干粉或直接用水溶液配制(图6)。HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)纳米颗粒冻干粉末平均粒径约150纳米，Zeta电位约40毫伏，在4℃条件中高度稳定，保存长达12个月后依然对TGF-β1表达有显著抑制活性(图7)。
为了进一步了解局部输送siRNA的持续时间和分布，我们使用了人类增生性瘢痕组织植入小鼠模型。进行两次瘢痕内注射，一组含有荧光标记的裸露FAM siRNA，另一组含有HKP包裹的FAM siRNA纳米颗粒制剂(图8)。在治疗后4小时、24小时和48小时采集组织样本，并在荧光显微镜下进行分析。
裸siRNA注入瘢痕组织后迅速分散，24小时后无法检测到。经HKP包裹的siRNA显示出快速分散和持久释放，即使在48小时后也能检测到。因此，我们预测，HKP包装的siRNA纳米颗粒制剂可以在体内有效抑制靶基因的表达。当HKP包裹的TGF-β1/COX-2siRNA组合通过瘢痕内注射给药时，我们观察到治疗后第1天、第3天和第5天有显著的靶基因抑制效果。这种抑制活性导致TGF-β1和COX-2同时下调，在第5天表现出最大的抑制作用(图9)。
实施例4、HKP包裹的TGF-β1/COX-2 siRNA减少人增生性瘢痕的大小
与预期的一致，我们首先发现，与正常皮肤组织相比，患者瘢痕活检组织中TGF-β1和COX-2的表达明显过高(图10)。将人增生性瘢痕(HTS)组织植入裸鼠皮下，研究增生性瘢痕的病理生理及其新的治疗方案。在植入HTS组织后第7天、第14天和第28天收集其中一些组织，这些组织样本中分离出mRNA，用qRT-PCR分析评估TGF-β1、COX-2和a-SMA的表达动态(图11)。在植入的人瘢痕组织中，TGF-β1和COX-2的表达呈现出独特的模式，TGF-β1的表达立即升高，而COX-2的表达则稳步增加。TGF-β1的表达在第14天达到峰值，而COX-2的表达在最初植入后第28天仍然上调。
图12显示了将HTS植入裸鼠背部的详细流程。记录第一周到第6个月的HTS植入物的外观(图13)。同样，图14也显示了裸鼠背部皮肤植入的详细流程。从第一周的图像到第六个月的图像(图15)显示了皮肤植入物的外观。
根据图10和图11的数据，我们决定在手术后4周开始对植入的人类增生性疤痕进行治疗。在每个瘢痕植入物上使用5等份在瘢痕5个不同的部位进行给药，剂量为20μg/50μl/cm3HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)，每隔5天重复注射3次。HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)联合治疗的HTS植入物在治疗后第28天导致植入组织的体积显著减小(图16)，与未治疗组相比减小约为40％。从这些植入物中提取组织样本进一步qRT-PCR分析发现，不仅靶基因TGF-β1和COX-2显著沉默，其他因素如a-SMA和col1A1表达也显著下调(图17)。这一结果为同时抑制TGF-β1和COX-2可显著减少瘢痕形成提供了可靠的证据。
实施例5、HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)减少人皮肤移植的大小
与人类增生性瘢痕植入物相似，移植到裸鼠身上的人类皮肤在受到全层皮肤创伤后能够再生，这种方法已被用于分析在浅表损伤后结缔组织修复过程中所涉及的细胞类型。此外，该模型还被用于人体皮肤伤口愈合过程的研究。增生性瘢痕模型是通过将人皮肤移植到裸鼠身上而建立的，其结果是形成明显的、持久的增生性瘢痕，其宏观和组织学性质与人类增生性瘢痕相似，该模型为观察增生性瘢痕形成的全过程提供了可能。因此，它是研究增生性瘢痕的理想工具(Yang et al，2007)。初始给药时间和给药方案与上述植入人增生性瘢痕的小鼠相似。术后4周，药物分成5等份在瘢痕的5个不同部位将20μg/50p 1/cm3HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)溶液注射到每个皮肤移植物中，每隔5天重复注射3次。经HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)联合治疗的人皮肤移植物在治疗后第28天体积显著下降(图18)，与未治疗组相比降低约为40％。从这些皮肤移植物中提取组织样本进行进一步分析后，发现不仅靶基因TGF-β1和COX-2显著沉默，其他因素如a-SMA和col1A1表达也显著下调(图19)。这一结果与我们观察到的人类增生性瘢痕植入物相似，并进一步证明同时抑制TGF-β1和COX-2的表达有助于皮肤瘢痕的减少。
实施例6、HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)具有全新的抗纤维化机制
为探讨在HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)治疗后人增生性瘢痕组织和人皮肤组织移植裸鼠瘢痕模型的生物学基质，我们首先分析组织样本中羟脯氨酸的水平，并比较治疗组和对照组样本之间的差异。与预期的一致，无论是瘢痕组织还是皮肤植入，与对照组相比，治疗组羟脯氨酸表达水平都明显下调(图20)。此外，分离HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)治疗或未治疗组的组织，采用H&E、Masson三色染色S或抗aSMA、VEGF和CD3抗体进行免疫组化染色(IHC)，分析两个组织间的差异。结果表明，治疗组和未治疗组在组织结构和促纤维化因子表达水平上都有显著不同(图21)。
实施例例7、HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)在体内诱导成纤维细胞/肌成纤维细胞凋亡
我们进一步采用TUNEL方法测量了体内成纤维细胞的凋亡活性，组织学图像显示治疗组的组织样本中凋亡的成纤维细胞数量显著增加(图21)。进一步的定量分析显示进入凋亡阶段的细胞数量显著增加(图22)。
实施例例8、HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)是一种新型抗纤维化治疗制剂
细胞培养和HTS组织中成纤维细胞凋亡的上调证实了HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)在维持优化的成纤维细胞增殖、ECM产生沉积和降解之间的平衡中的关键作用，从而避免纤维化疤痕形成。HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)治疗后，人成纤维细胞和HTS组织中a-SMA、胶原蛋白1、胶原蛋白3和羟脯氨酸的下调与调节皮肤纤维化瘢痕形成的复杂网络有关(图21)。这些结果进一步加深了我们对皮肤纤维化瘢痕的病理生理学作用机制的认识。HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)在皮肤创面愈合过程的增殖期和重塑期抑制TGF-β1和COX-2的协同作用，为防止皮肤纤维化瘢痕形成和逆转皮肤肥厚瘢痕形成提供了有力证据。因此，我们提出了一种新的siRNA治疗方法，即用HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)治疗增生性瘢痕。
讨论
皮肤伤口愈合过程可分为三个阶段：炎症、细胞增殖和基质重构，这涉及到促纤维化和抗纤维化分子复杂相互作用调控网络(Dabiri et al，2006)。皮肤损伤后，聚集的炎症细胞成为生长因子和细胞因子的来源。当活性血管生成和胶原合成与组织重构过程一致时，成纤维细胞表达的ECM的沉积和降解的微妙平衡决定了皮肤伤口是正常愈合还是伴有HTS形成的愈合。成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，也是皮肤伤口愈合过程中的关键参与者，其功能是维持结缔组织的物理完整性，参与伤口闭合，促进ECM生成和重构(Wanget al，2011)。在伤口愈合过程中，成纤维细胞增殖、向肌成纤维细胞的转化及其凋亡活性的调节是治疗干预的重要手段。
我们发现在人成纤维细胞中沉默TGF-β1可下调COX-2的表达，反之亦然(图2)。尽管有报导表明，在细胞培养研究中，高水平的COX-2能够将TGF-β1逆转为抗纤维化的调节因子，但这些观察所用的细胞处于终末阶段，并不反映TGF-β1和COX-2途径对体内损伤的早期反应(Su et al，2010)，这两个靶点在人类增生性瘢痕组织中表达上调的证据(图9)支持我们选择这两个靶点进行治疗。
我们通过瘢痕内给药评估了HKP(siRNA)纳米颗粒制剂，以确定临床活性的siRNA治疗产品能否用于治疗皮肤肥厚性瘢痕(Yang et al，2007；Rossio Pasquier et al，1999)。我们还为开发建立了HKP(siRNA)纳米颗粒制剂的规模放大水平的制备，这不仅有助于有效的siRNA输送，而且有助于减低不良反应和毒副作用。与目前正在实施临床研究的两种使用寡核苷酸抑制剂治疗疤痕的临床研究(EXC001和RXI109)相比，我们使用的HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)制剂的治疗剂量至少比其他2种药物的治疗剂量低2个数量级(数据未显示)。我们认为，HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)的卓越效果不仅来自于双靶向药物设计，也来自于HKP对药物导入的增强作用，这在本研究中也得到了证实(图7、8)。
通过人体增生性瘢痕模型观察到的治疗效果进一步证实了同时抑制两个基因靶标确实能成为一种新的治疗手段。采用疤痕内注射，HKP有效增强siRNA的体内导入，即便是微克级别的siRNA抑制剂，也可以显著抑制TGF-β1和COX-2的表达约40％(图4e、图5c)。HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)治疗后可以在体内和体外都激活和上调成纤维细胞凋亡，揭示了一种新的作用机制。因此，我们假设同时抑制人体增生性瘢痕内TGF-β1和COX-2的表达能够抑制炎症活性和成纤维细胞增殖，使受损伤组织周围细胞外基质(ECM)的聚集最小化。这一抑制作用也减少了ECM的沉积，促进了过量胶原的降解，最终结果是增生性瘢痕的减小甚至消除。因此，HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)代表一种临床调控活性的新型siRNA治疗策略，可有效减少人体皮肤损伤后过量疤痕的形成。
在培养的细胞、人类HTS或皮肤组织植入物中上调成纤维细胞凋亡，确证了HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)的关键治疗潜力，表明这一组合物在维持最佳状态的成纤维细胞增殖、ECM产生和降解之间的平衡从而避免纤维化疤痕方面的重要作用。HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)治疗后，降低人成纤维细胞和HTS组织中α-SMA、一型胶原、三型胶原和羟脯氨酸mRNA和蛋白两个水平的含量，涉及皮肤疤痕形成过程中的复杂调控网络。这一研究结果进一步加深了我们对增生性瘢痕形成过程中所涉及病理生理学机制的理解。在皮肤伤口愈合的增殖和重构阶段，HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)可以协同抑制TGF-β1和COX-2，为激活疤痕内成纤维细胞凋亡从而逆转皮肤增生性瘢痕的形成提供了强有力的证据。
材料与方法
siRNA设计与筛选
本发明所涉及的siRNA为25个核苷酸长度的平末端siRNA(表1)，靶向TGF-β1和COX-2的mRNA。在人PC3细胞系中，根据qRT-PCR分析结果，对每个基因选出八条siRNA。
体外生长抑制
细胞以100ul培养基含2×103个细胞加入96孔板的每个孔，6小时候用含Lipofectamine 2000(Liop2000)的新鲜培养基：Lipo(TGF-β1/COX-2siRNA)，或Liop2000，或Lipo2000(TGF-β1siRNA)，或Lipo2000(COX-2siRNA)。细胞培养48小时后，测定生长抑制情况，分析靶标基因抑制情况，流式细胞仪分析(FACS)，检测α-SMA和羟脯氨酸的表达。
纳米颗粒制各
优化过的组氨酸-赖氨酸聚合物(HKP)用于siRNA的体内导入。HKP的一种，H3K4b，具有四个分支的赖氨酸骨架，含有多个重复的组氨酸和赖氨酸，用于包裹靶向TGF-β1和COX-2的siRNA，载体与药物负载的质量比例为4∶1，纳米颗粒(平均直径150nm)自动形成。
小鼠
从中国上海实验动物中心购买8周龄的裸鼠(nu/nu Balb/c)。动物饲养和操作规程经过上海市第九人民医院IACUC委员会批准。
人增生性瘢痕和皮肤组织移植模型
经过知情同意后，从外科手术皮肤增生性瘢痕组织并植入裸鼠背部皮下。瘢痕组织固定在小鼠深筋膜后用4-5号缝合线缝合。实验用的皮肤组织样本来源于三位23-26岁的患有乳房肥大症、需要实施乳房重构手术妇女的皮肤切口(签署知情同意书)。皮肤组织填充到切割的皮下筋膜和周围的小鼠皮肤中，用缝合线缝合。
用人组织植入物模型评估疗效
人增生性瘢痕植入模型建立四周后，HKP(TGF-β1/COX-2siRNA)注射到瘢痕内，qRT-PCR分析TGF-β1、COX-2、α-SMA、Col1a1和Col3a1的mRNA水平，用罗氏的原委细胞凋亡检测试剂盒(Roche，South SF，CA，USA)分析细胞凋亡情况。
数据统计
细胞实验结果以“平均值±标准差”表示，体内实验结果以“平均值±标准误”表示。样品之间的比较以不等方差双尾学生t检验进行比较，p＜0.05视为具有显著性差异。
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本发明中涉及的所有出版物的公开内容，包括已授权的专利和公开的专利申请，所有数据条目通过URL地址或登录号识别，通过引用整体并入本文。
尽管某些实施例对本发明进行了描述，并且为了充分说明而阐述了许多细节，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可能其他实施例的影响，本发明所描述的特定细节可能会有所变动，但这并不脱离本发明的基本原理。

Claims (53)

1.一种激活哺乳动物组织成纤维细胞和肌成纤维细胞凋亡的方法，包括给予组织有效剂量的由siRNA分子组成的组合物，这些siRNA分子中的一种与哺乳动物细胞内编码TGF-β1蛋白的mRNA结合，另一种与哺乳动物细胞内编码COX-2蛋白的mRNA结合，还包含一种药学上可接受的载体，特别是药学上可接受的组氨酸-赖氨酸聚合物。
2.权利要求1所述的方法，组织选自由皮肤疤痕、肝脏、肺脏、肾脏、心脏组织构成的集合。
3.权利要求1所述的方法，所述组织包含皮肤疤痕组织。
4.权利要求1所述的方法，所述组织含有成纤维细胞和肌成纤维细胞。
5.权利要求1所述的方法，所述组织包含真皮成纤维细胞和肌成纤维细胞。
6.权利要求1-5中任何一条所述的方法，所述组合物通过注射进入组织。
7.权利要求1-5中任何一条所述的方法，所述组合物通过皮下注射进入到哺乳动物体内。
8.权利要求1-5中任何一条所述的方法，所述组合物通过静脉注射进入到哺乳动物体内。
9.权利要求1-5中任何一条所述的方法，所述哺乳动物是人类。
10.一种激活人体组织成纤维细胞和肌成纤维细胞凋亡的方法，包括注射有效剂量的组合物进入组织，该组合物包括siRNA分子hmTF-25-2：正义链，5'-r(CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU)-3’，反义链，5’-r(AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG)-3’，siRNA分子hmCX-25-1：正义链，5’-r(GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU)-3’，反义链，5'-r(ACAUCAUCAGACCAGGCACCAGACC)-3’，
以及一种药学上可接受的组氨酸-赖氨酸聚合物。
11.权利要求10所述的组氨酸-赖氨酸聚合物，包括H3K4b类组氨酸-赖氨酸聚合物和PT73类组氨酸-赖氨酸聚合物。
12.权利要求10所述的组氨酸-赖氨酸聚合物，其结构式为(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)，其中R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK，或R＝KHHHKHHHNHHHNHHHN，X＝C(O)NH2，K＝赖氨酸，H＝组氨酸，N＝天门冬酰胺。
13.权利要求10所述的组氨酸-赖氨酸聚合物，其结构式为(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)，其中R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK，或R＝KHHHKHHHKHHHHKHHHK，X＝C(O)NH2 K＝赖氨酸，H＝组氨酸。
14.一种下调哺乳动物组织细胞内促纤维化因子的方法，包括给予组织有效剂量的由siRNA分子组成的组合物，这些siRNA分子中的一种与哺乳动物细胞内编码TGF-β1蛋白的mRNA结合，另一种与哺乳动物细胞内编码COX-2蛋白的mRNA结合，还包含一种药学上可接受的载体，特别是药学上可接受的组氨酸-赖氨酸聚合物。
15.权利要求14所述的方法，组织选自由皮肤疤痕、肝脏、肺脏、肾脏、心脏组织构成的集合。
16.权利要求14所述的方法，所述组织包含皮肤疤痕组织。
17.权利要求14所述的方法，所述组织含有成纤维细胞和肌成纤维细胞。
18.权利要求14所述的方法，所述组织包含真皮成纤维细胞和肌成纤维细胞。
19.权利要求14-18中任何一条所述的方法，所述组合物通过注射进入组织。
20.权利要求14-18中任何一条所述的方法，所述组合物通过皮下注射进入到哺乳动物体内。
21.权利要求14-18中任何一条所述的方法，所述组合物通过静脉注射进入到哺乳动物体内。
22.权利要求14-18中任何一条所述的方法，所述哺乳动物是人类。
23.一种减少哺乳动物组织增生性瘢痕的方法，包括给予疤痕有效剂量的由siRNA分子组成的组合物，这些siRNA分子中的一种与哺乳动物细胞内编码TGF-β1蛋白的mRNA结合，另一种与哺乳动物细胞内编码COX-2蛋白的mRNA结合，还包含一种药学上可接受的载体，特别是药学上可接受的组氨酸-赖氨酸聚合物。
24.权利要求23所述的方法，组织选自由皮肤疤痕、肝脏、肺脏、肾脏、心脏组织构成的集合。
25.权利要求23所述的方法，所述组织包含皮肤疤痕组织。
26.权利要求23所述的方法，所述组织含有成纤维细胞和肌成纤维细胞。
27.权利要求23所述的方法，所述组织包含真皮成纤维细胞和肌成纤维细胞。
28.权利要求23-27中任何一条所述的方法，所述组合物通过注射进入组织。
29.权利要求23-27中任何一条所述的方法，所述组合物通过皮下注射进入到哺乳动物体内。
30.权利要求23-27中任何一条所述的方法，所述组合物通过静脉注射进入到哺乳动物体内。
31.权利要求23-27中任何一条所述的方法，所述哺乳动物是人类。
32.一种减少哺乳动物组织纤维化的方法，包括给予组织有效剂量的由siRNA分子组成的组合物，这些siRNA分子中的一种与哺乳动物细胞内编码TGF-β1蛋白的mRNA结合，另一种与哺乳动物细胞内编码COX-2蛋白的mRNA结合，还包含一种药学上可接受的载体，特别是药学上可接受的组氨酸-赖氨酸聚合物。
33.权利要求32所述的方法，组织选自由皮肤疤痕、肝脏、肺脏、肾脏、心脏组织构成的集合。
34.权利要求32或33所述的方法，所述组合物通过注射进入组织。
35.权利要求32或33所述的方法，所述组合物通过皮下注射进入到哺乳动物体内。
36.权利要求32或33所述的方法，所述组合物通过静脉注射进入到哺乳动物体内。
37.权利要求32-36中任何一条所述的方法，所述哺乳动物是人类。
38.一种组合物，包含一种与哺乳动物细胞内编码TGF-β1蛋白的mRNA结合的siRNA分子，一种与哺乳动物细胞内编码COX-2蛋白的mRNA结合的siRNA分子，以及一种药学上可接受的载体，特别是药学上可接受的组氨酸-赖氨酸聚合物。
39.权利要求38所述的组合物，所含siRNA分子在细胞内产生协同效应。
40.权利要求38或39所述的组合物，所述细胞位于哺乳动物皮肤组织、眼部组织或内脏器官组织内。
41.权利要求40所述组合物，所述内脏器官包括肝脏、肺脏、肾脏或心脏。
42.权利要求38-41任意一条所述组合物，所述细胞包含一种成纤维细胞或一种肌成纤维细胞。
43.权利要求38-41任意一条所述组合物，所述细胞包含一种真皮成纤维细胞或一种真皮肌成纤维细胞。
44.权利要求38所述的组合物，两种siRNA分子之间的比例大约是质量比1∶1。
45.权利要求44所述组合物，siRNA分子与聚合物之间的比例大约是质量比1∶4、1∶45或1∶5。
46.权利要求45所述的组合物，包含平均直径约为150nm的纳米颗粒。
47.权利要求38-46任意一条所述的组合物，所述siRNA分子选自表1中鉴定出来的siRNA分子。
48.权利要求38-46任意一条所述的组合物，所述siRNA为靶向TGFβ1的mRNA，hmTF-25-2：正义链，5’-r(CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU)-3’，反义链，5’-r(AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG)-3’，和靶向COX-2的mRNA，hmCX-25-1：正义链，5'-r(GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU)-3’，反义链，5’-r(ACAUCAUCAGACCAGGCACCAGACC)-3’。
49.权利要求38-48任意一条所述的组合物，所述药学上可接受的组氨酸-赖氨酸聚合物包括H3K4b类组氨酸-赖氨酸聚合物和PT73类组氨酸-赖氨酸聚合物。
50.权利要求38-48任意一条所述的组合物，所述组氨酸-赖氨酸聚合物的结构式为(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)，其中R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK，或R＝KHHHKHHHNHHHNHHHN，X＝C(O)NH2，K＝赖氨酸，H＝组氨酸，N＝天门冬酰胺。
51.权利要求38-48任意一条所述的组合物，所述组氨酸-赖氨酸聚合物的结构式为(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)，其中R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK，或R＝KHHHKHHHKHHHHKHHHK，X＝C(O)NH2K＝赖氨酸，H＝组氨酸。
52.权利要求50所述的组合物，所述组氨酸-赖氨酸聚合物的结构式为(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)，R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK，X＝C(O)NH2，K＝赖氨酸，H＝组氨酸，N＝天门冬酰胺。
53.权利要求51所述的组合物，所述组氨酸-赖氨酸聚合物的结构式为(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)，其中R＝KHHHKHHHKHHHKHHHKX＝C(O)NH2 K＝赖氨酸，H＝组氨酸。
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