CN110575436A - Nlrp3抑制剂组合物及其应用 - Google Patents

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    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Abstract

本发明涉及一种NLRP3抑制剂组合物，包含脂质体组分、NLRP3抑制剂和靶向多肽；还涉及上述组合物在制备用于治疗或预防动脉粥样硬化的药物中的应用；一种防止LDL穿过内皮细胞的方法，包括使用上述组合物处理所述内皮细胞的步骤。本发明证明了NLRP3可作为调节LDL对HUVECs的穿胞作用的靶点，并且根据该靶点制备了多肽靶向的阳离子脂质体siRNA传递系统。该脂质体siRNA传递系统可特异性的将siRNA输送至炎症激活的内皮细胞，并有效沉默相关基因表达，从而抑制LDL的穿胞和LDL在血管内皮下的沉积滞留，也可用作抗动脉粥样硬化新的靶向药物。

Description

NLRP3抑制剂组合物及其应用
技术领域
本发明涉及用于心血管防治的生物医药领域，更特别地，涉及一种NLRP3抑制剂组合物，及其在制备用于治疗或预防动脉粥样硬化的药物中的应用，以及一种防止LDL穿过内皮细胞的方法。
背景技术
动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是大多数心脑血管疾病的发病基础，是引起老年人死亡的主要原因之一，其发病机制迄今尚未完全阐明。近年来被广为接受的发病机制为“滞留-反应学说”，该学说强调动脉粥样硬化的始动环节是含apo-B的脂蛋白颗粒(主要是低密度脂蛋白LDL等)在内皮下滞留：血液中的LDL经血管内皮细胞转运至血管内膜下，LDL被氧化并引发慢性非可控性炎症，诱导免疫细胞进入血管内膜下并发生一系列反应，形成血管局部病变，进一步加重后形成粥样斑块。在此过程中，LDL穿过内皮细胞进入到内皮下至关重要。有研究显示，LDL是通过穿胞途径进入的。进一步研究显示，CRP、TNFα等炎症因子会促进LDL跨内皮细胞穿胞，进而促发动脉粥样硬。
巨噬细胞的损伤会导致内皮下和坏死组织中胆固醇小结晶的产生，激活NLRP3炎症小体，NLRP3炎症小体由感受蛋白NLRP3(NACHT,LRR and PYD domains-containingprotein 3)、含有CARD的衔接子凋亡相关的Speck样蛋白(Apoptosis associated speck-like protein containing a CARD，ASC)与炎症相关半胱天冬酶-1(Pro-caspase-1)组成。有研究显示，人颈动脉斑块中NLRP3、ASC、IL-1β的表达也明显高于正常组。
目前，已有多种针对AS的治疗方案，如抗LDL治疗、抗TNFα治疗、信号通路抑制剂等，均取得一定的效果。但是，尚无报道阐释清楚NLRP3在动脉粥样硬化中的作用，也没有报道在内皮细胞中以NLRP3为靶点来调节LDL穿胞和沉积来治疗动脉粥样硬化。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种NLRP3抑制剂组合物，其特征在于，包含脂质体组分、NLRP3抑制剂和靶向多肽。
在一个具体实施方案中，所述NLRP3抑制剂为NLRP3基因的siRNA。
在一个优选实施方案中，所述siRNA靶向的序列如SEQ ID NO:1所示。
在一个优选实施方案中，所述脂质体组分包括DOTAP、DOPC、Chol、DSPE-PEG2000和MAL-DSPE-PEG2000。
在一个优选实施方案中，DOTAP、DOPC、Chol、DSPE-PEG2000和MAL-DSPE-PEG2000的摩尔比为40:35:20:4:1。
在一个具体实施方案中，所述靶向多肽可与皮表达血管细胞粘附分子1特异性结合。
在一个优选实施方案中，所述靶向多肽的序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供了上述组合物在制备用于治疗或预防动脉粥样硬化的药物中的应用。
本发明还提供了一种防止LDL穿过内皮细胞的方法，通过使用上述组合物处理所述内皮细胞来实现。
本发明证明了NLRP3可作为调节LDL对HUVECs的穿胞作用的靶点，并且根据该靶点制备了多肽靶向的阳离子脂质体siRNA传递系统。该脂质体siRNA传递系统可特异性的将siRNA输送至炎症激活的内皮细胞，并有效沉默相关基因表达，从而抑制LDL的穿胞和LDL在血管内皮下的沉积滞留，也可用作抗动脉粥样硬化新的靶向药物。
附图说明
图1为在不同条件下HUVECs中NLRP3炎症小体相关蛋白的表达情况；
图2为配比II和III制备的脂质体的分散系数、平均粒径和计数率的统计图；
图3为不同脂质体核酸质量比下的包封效果电泳检测图；
图4为PCL和siRNA-PCL的电镜照片；
图5为在siRNA和siRNA-PCL与FBS(1:1)混合孵育不同时间后的电泳照片；
图6为体现siRNA和siRNA-PCL在含50％FBS的条件下穿胞情况的荧光显微照片；
图7为显示不同处理条件下HUVECs对脂质体的吞胞情况的荧光显微照片；
图8为显示不同处理条件下HUVECs对LDL的摄取的荧光显微照片，以及根据该荧光显微照片得到的LDL摄取量统计图；
图9为不同处理条件下LDL对HUVECs的穿胞量统计图；
图10为显示不同处理条件下SD大鼠颈动脉中的NLRP3表达情况的荧光显微照片，以及根据该荧光显微照片得到的NLRP3表达量的统计图；
图11为显示不同处理条件下SD大鼠颈动脉内皮下的LDL沉积情况的荧光显微照片，以及根据该荧光显微照片得到的LDL沉积量的统计图
具体实施方式
1.NLRP3炎症小体在LDL穿胞中的作用
从脐静脉分离人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)。用含10％链霉素和青霉素的PBS洗涤细胞多次，然后加入ECM继续培养。当细胞长至90％后，用0.25％胰酶消化传代。实验中使用第1-9代的细胞。
合成针对NLRP3的siRNA，其靶序列为5’-GAAATGGATTGAAGTGAAA-3’(SEQ ID NO:1)，正义链序列为5’-GAAAUGGAUUGAAGUGAAA-3’(SEQ ID NO:2)。
将HUVECs种于小皿中，待到细胞密度长至60％左右时，转染NLRP3 siRNA，以Scrambled siRNA为对照。转染后的细胞培养48h，加入TNFα刺激1h，提取总蛋白进行电泳染色。结果如图1所示，TNFα可刺激细胞产生NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β)，用siRNA沉默NLRP3之后，可抑制这种作用。这表明，TNFα可以激活NLRP3炎症小体，激活caspase-1，促进IL-1β活化。
进一步的实验研究显示，NLRP3炎症小体参与了TNFα促LDL跨内皮细胞内吞摄取和穿胞的过程，转染NLRP3 siRNA可以明显抑制TNFα促LDL内吞摄取。
2.脂质体的制备及优化
选用阳离子磷脂DOTAP作为siRNA的传递载体，进行组分配比优化，载体中各磷脂组分含量如表1所示。
表1脂质体中各磷脂组分的含量
将上述五种磷脂按表1的比率超声混合(低频率)，混合均匀后，氮气旋转吹干，直至氯仿甲醇溶液完全挥发后，将成膜的磷脂置于真空干燥箱中30-60min。将盛有干燥磷脂膜的EP管取出，加入2ml无RNAase水进行水化，并超声溶解至透光均一无颗粒即可，然后用脂质体挤出器依次通过1μm，400nm和100nm PC膜。
结果显示，配比I在制作过程中不能充分乳化，因此主要评估配比II和III，如图2所示，配比II和III制备的体系在分散系数和粒径方面均无明显差异。但是，通过400nm PC膜后，配比II体系的Avg.Count Rate值无明显变化，配比III体系的Avg.Count Rate值变化较大，可见配比II的体系稳定性最好。
将上述体系II以当MAL-PEG2000-DSPE：peptides摩尔比为3:1或5:1与多肽(本实施中的多肽为靶向内皮细胞的VCAM-1识别多肽，序列如SEQ ID NO:3所示)进行混合，混合均匀后于4℃摇床振摇过夜，得到链接多肽的脂质体。链接多肽的脂质体于4℃透析72小时，每24小时更换一次PBS，得到靶向脂质体(Peptide targeted cationic liposome，PCL)。
将上述两种PCL与siRNA按照质量比为40:1、60:1、80:1、100:1、120:1分别进行混合制备siRNA-PCL，然后采用琼脂糖凝胶电泳检测siRNA包封效果。如图3所示，当MAL-PEG2000-DSPE：peptides摩尔比为3:1或5:1，脂质体与siRNA质量比为100:1的泳道内均没有siRNA残留，说明在此质量比时siRNA均可与脂质体完全结合。
得到的siRNA-PCL测定Zeta电位和粒径，结果如表2所示，两种多肽结合比的脂质体粒径均符合要求，但是多肽结合比值为3:1的脂质体，siRNA-PCL正电位略低，且连接多肽效率更高。为减小阳离子的正电荷毒性，在此确定脂质体对多肽连接比值为3:1，结合siRNA的质量比为100:1。制备的结合有多肽的脂质体复合物电镜照片如图4所示。
表2不同多肽-脂质体比例的PCL和siRNA-PCL的相关参数
3.siRNA-PCL的性质
3.1血清稳定性
通过以下方法检测siRNA-PCL中siRNA的血清稳定性：将裸siRNA和siRNA-PCL溶液分别按照1:1(V/V)加入血清，混匀，放入37℃培养箱中分别培养1、3、6、9、12h。取出siRNA血清混合液和siRNA-PCL血清混合液，加入5％Triton，室温静置10min。然后进行2％的琼脂糖凝胶电泳，46mA，20min。
通过以下方法检测siRNA-PCL在血清下的穿胞稳定性：培养HUVECs，培养过夜，待细胞密度长至60％-70％时，加入500μl的ECM完全培养基(含50％血清)，然后加入脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)10μg/ml，孵育4h后加入Cy3-siRNA-PCL作用1、3、6h，4％多聚甲醛固定10min。0.2％Triton处理15min，DAPI染核2min。在荧光显微镜下观察Cy3-siRNA-PCL被细胞吸收的情况。
结果如图5和6所示，裸siRNA在1h时有所降解，3h已完全降解，而siRNA-PCL可以长时间保护siRNA。在含有50％血清的培养基中，Cy3-siRNA-PCL孵育HUVECs 1h、3h和6h，均能稳定入胞，且随着时间的增长，细胞内siRNA荧光明显增强。这说明，说明与PCL相结合的siRNA可以长时间存于富含血清的溶液中，相比裸siRNA，siRNA-PCL对核酸酶的稳定性显著增强。在血清存在的情况下，siRNA至少在6小时内能有效的进入经LPS预处理的细胞中，血清不会干扰其转染效果。
3.2体外靶向性
我们检测了siRNA-PCL对炎症激活的内皮细胞的靶向性，实验分为四组：1)siRNA-CL(按照上文中的靶向脂质体的多肽比值，将半胱氨酸与脂质体连接制备的非靶向脂质体)；2)LPS+siRNA-CL；3)siRNA-PCL；4)LPS+siRNA-PCL。由于HUVECs在正常状态下不表达VCAM-1，因此我们选用LPS刺激4h诱导HUVECs表达VCAM-1，然后采用脂质体作用1h。如图7所示，没有预先给予LPS刺激的的内皮细胞中，siRNA-PCL与siRNA-CL组中siRNA的荧光表达均较弱，但是在给予LPS预刺激后，siRNA-PCL组内皮细胞中siRNA荧光明显增强，而siRNA-CL组无明显变化。
结果证实，siRNA-PCL由于带有VCAM-1结合小肽，能够特异性识别LPS诱导表达VCAM-1的内皮细胞，促进siRNA被这些细胞内吞。但是对正常的内皮细胞无明显影响，说明siRNA-PCL对炎症激活的内皮细胞具有高度靶向性。
3.3 siRNA-PCL的毒性检测
用Lipo2000、siRNA-Lipo2000、PCL、siRNA-PCL、LPS+siRNA-Lipo2000、LPS+siRNA-PCL分别处理HUVECs，孵育24h，检测细胞活性。结果显示，Lipo2000对细胞毒性较大，细胞存活率下降92％，而PCL对细胞毒性较Lipo2000小，细胞存活率下降61％。当与siRNA混合之后，由于正电荷被siRNA中和，Lipo2000与PCL的细胞毒性都有所降低，但是二者相比，siRNA-Lipo2000组细胞存活率下降80％，而siRNA-PCL组细胞存活率仅下降40％。与PCL组相比，siRNA-PCL组毒性降低，细胞存活率增加了22％。
本节的实验证明，我们制备的siRNA-PCL血清稳定性高，靶向性好，细胞毒性低，可用于进一步的治疗实验。
4.细胞实验
4.1 siRNA-PCL沉默内皮细胞中的NLRP3基因
实验分为六组：1)Scrambled siRNA-PCL；2)LPS+Scrambled siRNA-PCL；3)LPS+Scrambled siRNA-PCL+TNFα；4)NLRP3 siRNA-PCL；5)LPS+NLRP3siRNA-PCL；6)LPS+NLRP3siRNA-PCL+TNFα。
在无血清的ECM培养基中，加入10μg/ml的LPS刺激4h，然后加入300nM的siRNA脂复合物作用24h，洗涤后加入含血清的ECM完全培养基继续培养24h，以排除LPS对后续实验的影响。然后加入30ng/ml TNFα刺激1h，检测各处理组细胞NLRP3、Pro-caspase-1、Caspase-1、Pro-IL-1β和IL-1β的表达。结果显示，TNFα可以上调NLRP3炎症小体相关蛋白表达(NLRP3、Pro-caspase-1、Caspase-1、Pro-IL-1βand IL-1β)。在LPS预刺激的内皮细胞中，NLRP3 siRNA-PCL可以下调NLRP3炎症小体相关蛋白表达，并能够抑制TNFα引起的NLRP3表达上调。而在没有接受过LPS预刺激的内皮细胞中，NLRP3 siRNA-PCL对NLRP3的表达没有明显影响。以上结果表明，LPS刺激内皮细胞表达VCAM-1，而siRNA-PCL能够特异性的靶向表达VCAM-1的内皮细胞，并且可有效沉默NLRP3基因。
4.2 siRNA-PCL抑制TNFα诱导的LDL内吞摄取和穿胞
用LPS激活内皮细胞，并观察了siRNA-PCL对内皮细胞LDL跨细胞作用的影响。结果如图8和9所示，TNFα可促进LDL的摄取和穿胞。在LPS刺激的内皮细胞中，NLRP3 siRNA-PCL显著抑制LDL的摄取和穿胞，而在未受LPS刺激的内皮细胞中，NLRP 3siRNA-PCL对LDL的摄取和穿胞无明显影响。上述结果表明LPS刺激内皮细胞表达VCAM-1，而siRNA-PCL可特异性靶向表达VCAM-1的内皮细胞，并能有效沉默靶基因NLRP3，从而抑制LDL摄取和穿胞作用。
5.动物实验
8周龄的SD大鼠购于华中科技大学同济医学院实验动物房，随机分成6组(n＝6)，在麻醉状态下分离出大鼠左侧颈动脉，扎紧远心端后插管，通过插管导管用微注射器给左侧颈动脉局部给药：
1)Scrambled siRNA-PCL组：局部给予PBS 2h后注入Scrambled siRNA-PCL(0.2mg/kg)；
2)LPS+Scrambled siRNA-PCL组：局部给予10μg/ml的LPS刺激2h后注入LPS+Scrambled siRNA-PCL(0.2mg/kg)；
3)LPS+Scrambled siRNA-PCL+TNFα组：局部给予10μg/ml的LPS刺激2h后注入LPS+Scrambled siRNA-PCL(0.2mg/kg)，继续饲养24h后腹腔注射TNFα(20ng/g)作用1h；
4)NLRP3 siRNA-PCL组：局部给予PBS 2h后注入siRNA-PCL(0.2mg/kg)；
5)LPS+NLRP3 siRNA-PCL：局部给予10μg/ml的LPS刺激2h,后注入LPS+NLRP3siRNA-PCL(0.2mg/kg)；
6)LPS+NLRP3 siRNA-PCL+TNFα：局部给予10μg/ml的LPS刺激2h,后注入LPS+NLRP3siRNA-PCL(0.2mg/kg)，继续饲养24h后腹腔注射TNFα(20ng/g)作用1h。
给药结束后，给予大鼠尾静脉注射FITC-LDL(200μg/rat)，取一侧局部给药的劲动脉，进行免疫荧光观察局部血管内皮NLRP3的表达情况，同时染核后观察内皮下LDL的沉积情况。
结果如图10和11所示，TNFα可以上调颈动脉NLRP3表达。在LPS预刺激的颈动脉中，NLRP3 siRNA-PCL可以下调NLRP3的表达，并能够抑制TNFα引起的NLRP3表达上调。而在没有接受过LPS预刺激的颈动脉中，NLRP3siRNA-PCL对NLRP3的表达没有明显影响。
以上结果表明，LPS刺激内皮细胞表达VCAM-1，而siRNA-PCL能够特异性的靶向表达VCAM-1的内皮细胞，并且可有效沉默目的基因NLRP3。经尾静脉注射进入血液循环的FITC-LDL可被吞噬入动脉血管壁并在内皮下沉积。在LPS预刺激的颈动脉局部血管，NLRP3siRNA-PCL可以减少LDL在内皮下的沉积，并能够抑制TNFα促进LDL在内皮下沉积的作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中科技大学同济医学院附属梨园医院
<120> NLRP3抑制剂组合物及其应用
<141> 2019-08-23
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gaaatggatt gaagtgaaa 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gaaauggauu gaagugaaa 19
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Val His Pro Lys Gln His Arg Gly Gly Ser Lys
1 5 10

Claims (9)

1.一种NLRP3抑制剂组合物，其特征在于，包含脂质体组分、NLRP3抑制剂和靶向多肽。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述NLRP3抑制剂为NLRP3基因的siRNA。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述siRNA靶向的序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述脂质体组分包括DOTAP、DOPC、Chol、DSPE-PEG2000和MAL-DSPE-PEG2000。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，DOTAP、DOPC、Chol、DSPE-PEG2000和MAL-DSPE-PEG2000的摩尔比为40:35:20:4:1。
6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述靶向多肽可与皮表达血管细胞粘附分子1特异性结合。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述靶向多肽的序列如SEQ ID NO:3所示。
8.权利要求1-7中任一项所述的组合物在制备用于治疗或预防动脉粥样硬化的药物中的应用。
9.一种防止LDL穿过内皮细胞的方法，其特征在于，使用权利要求1-7中任一项所述的组合物处理所述内皮细胞。
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