CN114377140B - 疏水化修饰多肽在制备microRNA相关核酸传递系统中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及疏水化修饰多肽在制备microRNA相关核酸传递系统中的用途。本发明要解决的技术问题是提高microRNA相关核酸的胞内递送效果和减少载体的细胞毒性。解决技术问题的方案是提供了疏水化修饰的多肽在制备microRNA相关核酸传递系统中的用途，所述阳离子多肽的序列为VQWRIRVAVIRK，所述的疏水化修饰为在阳离子多肽的氮末端偶联疏水片段。本发明发现用疏水化修饰的VQWRIRVAVIRK多肽可高效地将microRNA相关核酸递送到细胞中，更好地发挥疫苗效果，且低毒安全，制备周期短，具有很好的应用前景。

Description

疏水化修饰多肽在制备microRNA相关核酸传递系统中的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及疏水化修饰多肽在制备microRNA相关核酸传递系统中的用途。
背景技术
RNA干扰在转录后水平上对蛋白质表达具有高效的抑制作用，因此在疾病治疗中具有广阔的应用前景。这种方法甚至可以瞄准以前无法治愈的目标，从而产生一系列潜在的治疗效果。MicroRNA是一种小的非编码RNA分子，长度为20-24个核苷酸，通过与3'-UTR(未翻译区)的不完全碱基配对，调节靶基因的mRNA降解或翻译抑制，并能靶向多个mRNA转录，从而调节靶基因的表达。microRNA的表达变化调控着肿瘤发生、生长、侵袭和转移的重要生物学过程。microRNAs的差异表达可能有助于阐明肿瘤生长和转移的调控机制。近年来，越来越多的研究表明，microRNA在肿瘤的生物学过程和化疗敏感性中起着重要的调节作用。因此，microRNA是一个很有吸引力的肿瘤诊断标记物和治疗靶点。microRNA作为肿瘤治疗靶点的优势在于，与单靶点小分子药物、抗体药物和siRNA治疗相比，microRNA有望同时在多种疾病相关信号途径中靶向多个靶点。这种特性可能导致“联合疗法”集中在一种药物中，用于治疗癌症等多基因疾病。值得注意的是，新发现的microRNAs的功能可能还不清楚，并且microRNAs在细胞内传递的效率低下，限制了microRNAs功能的研究。目前，阳离子脂质体和聚合物已被用于microRNA的传递，但由于其潜在的细胞毒性，仍需开发更安全有效的载体，且虽然在体外的传递效率较高，但其体内的递送效率却较低。
而microRNA相关核酸，如microRNA类似物，microRNA inhibitor等近年来也得到大量研究，但是，这些microRNA相关核酸在体内的递送效率也同样难以令人满意。
因此，进一步提高microRNA相关核酸在体内的递送效率、减少载体潜在细胞毒性是本领域当前迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提高microRNA相关核酸的体内递送效果和减少载体的细胞毒性，为microRNA相关核酸药物的制备提供一种新的选择。
本发明解决上述技术问题的技术方案是提供了一种疏水化修饰的阳离子多肽在制备microRNA 相关核酸传递系统中的用途，所述阳离子多肽的序列为VQWRIRVAVIRK(SEQID No.1)，所述的疏水化修饰为在阳离子多肽的氮末端偶联疏水片段。
其中，上述用途中所述的microRNA 相关核酸为microRNA、microRNA类似物(microRNA mimics)，microRNA inhibitor中的至少一种。
其中，上述用途中所述的阳离子多肽VQWRIRVAVIRK碳端酰胺化修饰为VQWRIRVAVIRK-NH2。
其中，上述用途中所述的疏水片段为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸或PEG衍生物。
其中，上述用途中所述的甾醇类化合物为胆固醇类化合物或胆酸类化合物；或者所述饱和直链脂肪酸为C6-C20中的至少一种。
其中，上述用途中所述的PEG衍生物为1，2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇中的至少一种。
其中，上述用途中所述的多肽的氮端与疏水片段偶联的方式为通过疏水片段上的-CO-OH与多肽上的-NH2酰胺化反应生成。
进一步的，上述用途中所述的所述疏水化修饰的多肽结构为：
其中，所述的R为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸或PEG衍生物。
进一步的，上述用途中所述的多肽结构中的R为：
中的至少一种。
本发明同时还提供了一种microRNA相关核酸传递系统。该microRNA相关核酸传递系统是由疏水化修饰多肽装载核酸制成，所述多肽的序列为VQWRIRVAVIRK，所述的疏水化修饰为在多肽的氮末端偶联疏水片段。
其中，上述microRNA相关核酸传递系统中所述的microRNA相关核酸为microRNA、microRNA类似物，microRNA inhibitor中的至少一种。
其中，上述microRNA相关核酸传递系统中所述的多肽VQWRIRVAVIRK碳端酰胺化修饰为VQWRIRVAVIRK-NH2。
其中，上述microRNA相关核酸传递系统中所述的疏水片段为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸或PEG衍生物。
其中，上述microRNA相关核酸传递系统中所述的甾醇类化合物为胆固醇类化合物或胆酸类化合物；或者所述饱和直链脂肪酸为C6-C20中的至少一种。
其中，上述microRNA相关核酸传递系统中所述的PEG衍生物为1，2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇中的至少一种。
其中，上述microRNA相关核酸传递系统中所述的多肽的氮端与疏水片段偶联的方式为通过疏水片段上的-CO-OH与多肽上的-NH2酰胺化反应生成。
进一步的，上述microRNA相关核酸传递系统中所述的疏水化修饰的多肽结构为：
其中，所述的R为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸或PEG衍生物。
进一步的，上述microRNA相关核酸传递系统中所述的多肽结构中的R为：
中的至少一种。
其中，上述microRNA相关核酸传递系统中所述的多肽和核酸按质量比1～20︰1作为原料制备而成。
其中，上述microRNA相关核酸传递系统中疏水化修饰多肽与核酸按质量比1～10︰1作为原料制备而成。
其中，上述microRNA相关核酸传递系统是由疏水化修饰阳离子多肽与核酸共孵育制得。
进一步的，上述核酸传递系统是由多肽与核酸在水中或液态培养基中共孵育5～15min而得。
本发明上述核酸传递系统可用于在制备原位肿瘤疫苗。原位肿瘤疫苗是由上述核酸传递系统添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。
本发明的有益效果在于：本发明创造性地发现用疏水化修饰的VQWRIRVAVIRK多肽可高效地将microRNA相关核酸递送到细胞中；尤其是可高效地将microRNA、microRNA类似物和microRNA inhibitor递送到细胞中，增强microRNA、microRNA类似物和microRNAinhibitor在细胞内发挥疫苗效果的能力。在本发明实施例中使用装载microRNA和microRNA inhibitor的修饰后的阳离子多肽自组装形成的胶束进行瘤内给药，显示出较好的抗肿瘤效果和抑制肿瘤迁移的能力，说明本发明传递系统能够出人意料地通过瘤内高效递送microRNA、microRNA类似物和microRNA inhibitor抑制肿瘤生长和迁移。同时，本发明技术方案制备方便、成本低廉、低毒安全，且制备周期短，相比现有载体具有更高的转染效率和更低的细胞毒性具有很好的应用前景。
附图说明
图1：DP7-C胶束与microRNA和microRNA inhibitor复合的粒径电位情况。a.DP7-C的粒径分布及Zeta电位。b.DP7-C/microRNA复合物的粒径分步及Zeta电位。c.DP7-C/inhibitor复合物的粒径分步及Zeta电位。
图2：DP7-C、DP7-C/microRNA复合物和DP7-C/inhibitor复合物的电镜结构。a.DP7-C电镜结构图。b.DP7-C/microRNA复合物的电镜结构图。c.DP7-C/inhibitor复合物的电镜结构图。
图3：DP7-C复合microRNA和inhibitor的凝胶阻滞实验。a.DP7-C复合microRNA的凝胶阻滞结果。b.DP7-C复合inhibitor的凝胶阻滞结果。
图4：DP7-C、Lipo2000、PEI25K转染FAM-microRNA和FAM-inhibitor进入CT26细胞和4T1细胞的效率。a.DP7-C、Lipo2000、PEI25K转染FAM-microRNA进入CT26细胞和4T1细胞的效率。b.DP7-C、Lipo2000、PEI25K转染FAM-inhibitor进入CT26细胞和4T1细胞的转染效率。
图5：DP7-C、Lipo2000、PEI25K转染FAM-microRNA和FAM-inhibitor的血清稳定性实验。a.DP7-C、Lipo2000、PEI25K转染CY3-microRNA在含有10％、20％、30％血清的培养基中的转染效率。b.DP7-C、Lipo2000、PEI25K转染FAM-inhibitor在含有10％、20％、30％血清的培养基中的转染效率。
图6：DP7-C的细胞毒性检测。
图7：DP7-C、Lipo2000、PEI25K瘤内递送CY3-microRNA和CY3-inhibitor的效率。
图8：DP7-C转染microRNA542-3p、microRNA497a-5p和inhibitor9-5p进入4T1影响细胞迁移和侵袭。(***p<0.001)
图9：DP7-C转染microRNA542-3p、microRNA497a-5p和inhibitor9-5p后对HUVEC细胞血管生成的影响。(**p<0.01，***p<0.001)
图10：DP7-C/microRNA542-3p、DP7-C/microRNA497a-5p和DP7-C/inhibitor9-5p瘤内给药治疗转移性小鼠乳腺癌的体内药效评价。a.给药过程中小鼠肿瘤生长曲线。b.小鼠肿瘤重量统计。c.治疗后小鼠后肺部肿瘤情况。d.小鼠后肺部结节数统计。(**p<0.01，***p<0.001)
图11：安全性评价。通过HE染色评估DP7-C/microRNA复合物和DP7-C/inhibitor复合物瘤内给药的安全性。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的介绍对本发明进行具体的说明。
在本发明的前期研究中，获得了一种具有抗菌作用的多肽，其序列为VQWRIRVAVIRK(SEQ ID No.1)，将其命名为DP7。在进一步的研究中，发现对DP7多肽进行疏水化修饰后成为具有自组装成胶束能力的两亲化合物，一方面能降低DP7多肽的细胞毒性，保持抗菌活性；另一方面作为组装成纳米粒子后能作为一些药物的传输载体。
在随后的研究中，发明人使用疏水化修饰的DP7明显提高了将microRNA相关核酸转染到细胞中的效率；同时疏水化修饰的DP7还具有低的细胞毒性。并且使用疏水化修饰的DP7与microRNA类似物和microRNA inhibitor复合物瘤内给药显著抑制了乳腺癌原位肿瘤的生长和转移，出人意料地大大优于PEI25K和Lipo2000等本领域常用的传递体系。在此基础上，获得了本发明的各项技术方案。
本发明中的疏水化修饰阳离子多肽是在VQWRIRVAVIRK多肽的氮端连接疏水片段进行的修饰。而VQWRIRVAVIRK多肽的碳端可酰胺化修饰为VQWRIRVAVIRK-NH2。
用于VQWRIRVAVIRK多肽疏水化修饰的疏水片段可以为甾醇类化合物、饱和直链脂肪酸或PEG衍生物。所述的甾醇类化合物为胆固醇类化合物或胆酸类化合物。比如可在丁二酰化胆固醇、胆酸或去氧胆酸中选择。所述饱和直链脂肪酸为C6～C20中的至少一种。优选的，所述饱和直链脂肪酸为C8～C18中的至少一种。比如，可以在硬脂酸(C18)、软脂酸(C16)、月桂酸(C12)或正辛酸(C8)中选择。所述PEG衍生物可选自1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DOPE-PEG)或二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇(DPPE-PEG)。
一般来说，所述阳离子多肽的氮端与疏水片段(疏水化合物)偶联的方式为通过疏水片段(疏水化合物)上的-CO-OH与抗菌肽上的-NH2酰胺化反应而偶联。
疏水化修饰阳离子多肽的结构可以表示为：
其中，所述的R为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸或PEG衍生物。
在一些实例中，上述结构式中的R为：
中的至少一种。
在本发明的一个实施例中，以胆固醇作为疏水化片段修饰上述阳离子多肽，即上式中的R为：这个胆固醇修饰VQWRIRVAVIRK-NH2得到的多肽在本发明中命名为DP7-C。
本发明提供的上述疏水化修饰阳离子多肽具有装载核酸并传递至细胞中的作用，因此可以装载核酸形成核酸传递系统。这些目标细胞可以是各种动植物包括人的细胞。可以是在体或者处于离体培养状态中的细胞。
该核酸传递系统可用于microRNA相关核酸的传递。
此核酸传递系统可广泛地应用于传递各种特定的microRNA相关核酸，比如microRNA、microRNA类似物，microRNAinhibitor中的至少一种。
microRNA是一类长度约为22nt的内源性单链非编码RNA，成熟的单链microRNAs可与一系列蛋白形成microRNA诱导的沉默复合物(miRISC)，结合于靶mRNA的3’-UTR区，阻止所结合的mRNA的翻译或直接降解靶miRNA。microRNA mimics是运用化学合成的方法合成的成熟microRNAs模拟物，为双链结构，能够增强内源性microRNA的功能，降低蛋白表达量。而microRNA inhibitor为专门针对细胞中特异的靶microRNA的抑制剂，特异的靶向和敲除单个的microRNA分子，可以削弱内源microRNA的基因沉默效应，提高蛋白表达量。本发明实施例使用的microRNA是指经过特殊化学修饰的双链microRNA mimics分子。修饰方式为：mimics仅在反义链上进行化学修饰，3’端胆固醇修饰，5’端两个硫代修饰，3’端4个硫代修饰，反义链全碱基甲基化修饰。实施例使用的microRNA inhibitor为单链，序列及修饰方式同microRNA mimics的反义链。
更为重要的是，这个传递系统可以非常简单地制备获得。一种典型的简便制备方案就是将上述疏水化修饰阳离子多肽与核酸在液体中共孵育制得。共孵育可以在水溶液中或者在常用的液体培养基中进行，比如RPMI 1640培养基、DMEM培养基、Optim培养基等细胞培养常用的培养基以及他们之间组配后得到的混合培养基。在体系中共孵育5～15min的时间一般已经足够将足够量的核酸负载到此脂质体上而得到该核酸传递系统。此核酸传递系统可由疏水化修饰阳离子多肽和核酸按质量比1～20︰1制得。优选的，由上述脂质体与核酸按质量比1～10︰1制得。
使用DP7-C递送microRNA类似物和microRNA inhibitor在293T、CT26和4T1三种不同的细胞中显示出高的microRNA类似物和microRNA inhibitor的递送效率，同时也显著地优于商品化的转染试剂Lipo2000和PEI25K。
而在更进一步的实验中，本发明发现DP7-C并不仅仅是提高了microRNA类似物和microRNA inhibitor等microRNA相关核酸的递送效率，还具有较好的血清稳定性和较低的细胞毒性。
由此，基本可以确定疏水修饰后的DP7特别适合于作为传递载体向细胞传送是microRNA相关核酸，特别是采用瘤内给药的方式能取得很好的效果，并具有较低的细胞毒性。这正好可以解决本领域在制备装载microRNA类似物和microRNA inhibitor的载体，如Lipo2000和PEI25K等广泛存在的细胞内递送效率低以及载体细胞毒性限制microRNA类似物和microRNA inhibitor发挥效果的问题。
比如在本发明的一个实施例中，使用DP7-C复合microRNA542-3p类似物和microRNA9-5p inhibitor瘤内给药能抑制小鼠原位乳腺癌的生长和转移。表现出了显著的抗肿瘤效果。
本发明还进一步提供了上述的microRNA相关核酸传递系统在制备原位肿瘤疫苗中的用途。
本发明也提供了由上述的microRNA相关核酸传递系统为主要活性成分制备而成的原位肿瘤疫苗。这种疫苗还可以包括其他的活性成分和/或药学上可接受的辅助性成分。
这些药学上可接受的辅助性成分为保护剂、赋型剂、免疫佐剂、分散剂或细胞培养基中的至少一种。
比如该传递系统的制备会在溶液中操作、配制、孵育和使用，溶液中会可能因此包含药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂和各种培养基。
而为了制备成合适的剂型，可以添加各种型药学上可接受的稳定剂、赋型剂、冻干保护剂等辅助性成分。本发明用于传递microRNA相关核酸的传递系统制备的疫苗的主要剂型为注射剂，可制成注射液或者冻干制剂。使用途径可为直接瘤内注射。
如果需要，疫苗还可以进一步包括佐剂，从而协助免疫应答的诱导或再刺激，包括延长或加强免疫应答。佐剂可以在本领域已知的各种佐剂中实际使用情况进行选取。
本发明实施例中使用装载microRNA类似物(microRNA mimic)和microRNAinhibitor的修饰后的阳离子多肽瘤内给药，在皮下肿瘤中显示出出人意料地抗肿瘤效果和抑制肿瘤迁移的能力，说明本发明技术方案能够通过瘤内高效递送microRNA类似物和microRNA inhibitor抑制肿瘤生长和迁移,如无特殊说明，以下实施例中使用的microRNA均是指microRNA类似物(microRNA mimic)。同时，本发明技术方案制备方便、成本低廉、低毒安全，且制备周期短，相比现有载体具有更高的转染效率和更低的细胞毒性具有很好的应用前景。以下通过对实施例对本发明进行更进一步的详细描述。
实施例中主要使用的实验材料和设备如下：
1、实验用细胞株及实验动物
293T、CT26、4T1、HUVEC细胞系均购自美国模式菌种收藏所(American TypeCulture Collection,ATCC)。用含10％胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS,Gibico公司)的DMEM或RPMI-1640(Gibico公司)培养基进行细胞培养。实验所用6-8周龄的BalBC雌性小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司，饲养于SPF级环境中。
2、主要试剂材料及试剂盒
实验用细胞培养基：1640培养基(RPMI-1640)、DMEM培养基和胎牛血清(Fetalbovine serum,FBS)均购自于美国Gibco公司。
microRNA、microRNA inhibitor购自上海吉玛基因。
0.8μm的24孔Transwell小孔和基质胶购自BD公司。
PEI25K、CCK-8试剂购自Sigma-aldrich公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自Invitrogen公司。
3、主要仪器设备
马尔文粒径仪：ZetaSizer Nano-ZS Zen 3600；Malvern；透射电镜：H-600透射电子显微镜，日立；流式细胞仪：FACSCalibur，BD；倒置荧光显微镜：IX50，Olympus；普通光学显微镜：CHS，Olympus；酶标仪：Multiskan Mk3，Thermo Scientific。
实施例1 DP7-C/microRNA复合物和DP7-C/inhibitor复合物的制备及表征
1.DP7-C分别与microRNA和inhibitor复合的粒径电位情况
DP7-C的合成及DP7-C胶束的制备可参见申请号为201710527268.4的中国专利申请(文献号CN 107446019 A)。取4℃保存的10mg/ml DP7-C母液稀释到20μg/ml，取1ml加入4μg microRNA或者5μg microRNA inhibitor混匀室温孵育10min。将配置好的溶液放入粒径电位杯中，使用马尔文粒径电位仪(Malvern ZetaSizer，英国)对DP7-C胶束及其分别复合microRNA和inhibitor后的复合物进行粒径分布和zeta电位大小的表征测定。所有实验均重复三次取其中间值。
结果表明DP7-C的粒径为37.3±2.3nm，zeta电位为43.3±3.4mV(图1a)；DP7-C/microRNA复合物的粒径为78.2±3.5nm，zeta电位为23.1±2.2mV(图1b)；DP7-C/inhibitor复合物的粒径为64.7±2.3nm，zeta电位为29.4±2.1mV(图1c)。
2.DP7-C、DP7-C/microRNA复合物、DP7-C/inhibitor复合物的透射电镜结构
取1ml 20μg/ml的DP7-C加入4μg microRNA或者5μg microRNA inhibitor混匀室温孵育10min。将样品吸附于铜网上，使用1％的磷钼酸染色2min后，置于透射电子显微镜下拍摄。
从结果看DP7-C、DP7-C/microRNA复合物、DP7-C/inhibitor复合物均呈现均匀的球形结构，大小与粒径分析结果基本一致(图2)。
3.DP7-C复合microRNA和inhibitor的凝胶阻滞实验
取0.5μg的microRNA或者0.5μg的inhibitor分别加入不同浓度的DP7-C溶液中(DP7-C的含量为0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3μg)，保持最终体积为10μl，室温混匀后孵育10min。将样品加入配制1％的琼脂糖凝胶孔中，120V电泳15min，用凝胶成像系统拍照。
结果显示，当DP7-C：microRNA为5:1时，microRNA条带被完全阻滞；当DP7-C：inhibitor为4：1时，inhibitor条带被完全阻滞。因此得到DP7-C：microRNA的最佳孵育比例为5:1，DP7-C：inhibitor的最佳孵育比例为4：1(图3)。
实施例2 DP7-C转染microRNA和inhibitor的效率及血清稳定性
1.DP7-C转染microRNA和inhibitor到CT26细胞和4T1细胞的效率
将CT26细胞和4T1细胞分别用1640双有培养基(RPMI 1640+10％FBS+1％PS)铺板于24孔板中培养，CT26细胞每孔铺1×105，4T1细胞每孔铺2×105。铺板24h后将培养液换为200μl的1640双无培养基，分别加入30μl在双无1640中孵育10min的载体/FAM-microRNA或者载体/FAM-inhibitor复合物，载体材料分别为DP7-C、PEI25K和Lipo2000。分组如下：
DP7-C(1.2μg)/FAM-microRNA(0.24μg)、DP7-C(0.96μg)/FAM-inhibitor(0.24μg)、Lipo2000(0.48μg)/FAM-microRNA(0.24μg)、Lipo2000(0.48μg)/FAM-inhibitor(0.24μg)、PEI25K(0.48μg)/FAM-microRNA(0.24μg)、PEI25K(0.48μg)/FAM-inhibitor(0.24μg)。4h后，将培养液吸出换为1640双有培养基。继续培养20h后于荧光显微镜下拍照。同时收取细胞，洗去多余培养基后用200μl PBS重悬后，使用流式细胞仪检测带荧光的细胞所占比例。
从结果可知DP7-C将microRNA和inhibitor转入CT26的效率大于80％，并且转染效率与PEI和Lipo2000相当；DP7-C将inhibitor转入4T1的效率约为80％，并且转染效率与PEI和Lipo2000相当(图4a-b)。
2.DP7-C转染microRNA和inhibitor到CT26细胞的血清稳定性实验
将CT26细胞用1640双有培养基铺板于24孔板中培养，每孔1×105个细胞。铺板24h后将孔中培养液分别换为200μl的1640+10％FBS+1％PS、1640+20％FBS+1％PS、1640+30％FBS+1％PS，分别加入30μl在不同血清浓度中孵育10min的载体/FAM-microRNA或者载体/FAM-inhibitor复合物，载体材料分别为DP7-C、PEI25K和Lipo2000。
分组如下：DP7-C(1.2μg)/FAM-microRNA(0.24μg)、DP7-C(0.96μg)/FAM-inhibitor(0.24μg)、Lipo2000(0.48μg)/FAM-microRNA(0.24μg)、Lipo2000(0.48μg)/FAM-inhibitor(0.24μg)、PEI25K(0.48μg)/FAM-microRNA(0.24μg)、PEI25K(0.48μg)/FAM-inhibitor(0.24μg)。继续培养24h后收取细胞，洗去多余培养基后用200μl PBS重悬后，使用流式细胞仪检测带荧光的细胞所占比例。
从结果可知，从转染效率上看DP7-C、Lipo2000、PEI25K转染microRNA和inhibitor到CT26的效率在不同血清浓度中基本一致，转染效率不随血清浓度上升而下降，具有血清稳定性。从荧光强度来看，DP7-C在不同浓度血清中转染microRNA和inhibitor到CT26的荧光强度远高于PEI25K和Lipo2000(图5a-b)，说明进入细胞的RNA明显更多。
实施例3 DP7-C的细胞毒性检测
用不同浓度的DP7-C、PEI25K或Lipo2000处理细胞24h，比较不同浓度载体的细胞毒性。具体方法为将293T细胞铺于96孔板上，每孔1×104个细胞。培养24h后，用不同浓度的DP7-C、PEI25K或Lipo2000处理细胞24h，然后在每个孔中加入10μL的CCK-8，在37℃下培养2h。最后，使用SpectramaxM5微量板光度计(分子器件，Sunnyvale，CA，USA)读取570nm处的吸光度值。
结果发现随着PEI25K和Lipo2000浓度的增加，细胞活力显著降低，说明这两个转染试剂细胞毒性较大。而DP7-C处理后的细胞活力随浓度升高基本未见变化，说明DP7-C的细胞毒性显著低于Lipo2000和PEI25K，具有更好的安全性(图6)。
实施例4 DP7-C瘤内递送microRNA和inhibitor的效率检测
在小鼠皮下接种4T1细胞，待肿瘤长至100mm3左右。瘤内注射DP7-C(250μg)/Cy3-microRNA(50μg)、Lipo2000(100μg)/Cy3-microRNA(50μg)、PEI25K(50μg)/Cy3-microRNA(50μg)、DP7-C(125μg)/Cy3-inhibitor(25μg)、Lipo2000(50μg)/Cy3-inhibitor(25μg)、PEI25K(25μg)/Cy3-inhibitor(25μg)。24h后，处死小鼠，取出肿瘤组织，放入液氮中速冻。然后进行冰冻切片，将切好的片子平衡至室温，然后使用多聚甲醛进行固定后加入DAPI染色，抗荧光淬灭剂封片。最后将片子置于普通显微镜下拍照。
从结果看，DP7-C/microRNA和DP7-C/inhibitor瘤内递送效率显著高于Lipo2000/microRNA和Lipo2000/inhibitor及PEI25K/microRNA和PEI25K/inhibitor(图7)。
实施例5 DP7-C转染microRNA和inhibitor的体外功能性实验
1.细胞迁移和侵袭实验
本研究所使用的microRNA542-3p序列为(SEQ ID No.2)：UGUGACAGAUUGAUAACUGAAA；microRNA497-5p序列为(SEQ ID No.3)：CAGCAGCACACUGUGGUUUGUA；microRNA 9-5p序列为(SEQ ID No.4)：AGUAUGUCGAUCUAUUGGUUUCU。
细胞迁移实验：在24孔板底部加入600μl的1640双有培养基，将Transwell小室放入孔板中，向小室中加入用1640双无重悬的5×104个PBS、DP7-C(1.2μg)、DP7-C(1.2μg)+microRNA negative control(miNC 0.24μg)、DP7-C(1.2μg)/microRNA542-3p(mi542-3p0.24μg)，DP7-C(1.2μg)/microRNA497-5p(mi497-5p 0.24μg)，DP7-C(0.96μg)/inhibitornegative control(inNC 0.24μg)，DP7-C(0.96μg)/inhibitor9-5p(in9-5p 0.24μg)处理24h的4T1细胞，于孵箱中培养48h。取出Transwell小室，将其放置于4％多聚甲醛中室温固定10min，使用PBS洗去多聚甲醛，用棉签擦掉小室上层细胞。将小室放置于结晶紫中室温染色10min，洗去多余的结晶紫，晾干小室，然后在显微镜下拍照，随机选取5个视野进行细胞计数。
细胞侵袭实验：在24孔板底部加入600μl的1640双有培养基，将Transwell小室放入孔板中，取1:20稀释的基质胶100μl加入Transwell小室中，于37℃静置1h。待基质胶凝固后，吸出多余液体，向小室中加入用1640双无重悬的1×105个PBS、DP7-C(1.2μg)、DP7-C(1.2μg)/miNC(0.24μg)、DP7-C(1.2μg)/mi542-3p(0.24μg)、DP7-C(1.2μg)/mi497-5p(0.24μg)、DP7-C(0.96μg)/inNC(0.24μg)，DP7-C(0.96μg)/in9-5p(0.24μg)处理24h的4T1细胞，于孵箱中培养48h。取出Transwell小室，将其放置于4％多聚甲醛中室温固定10min，使用PBS洗去多聚甲醛，用棉签擦掉小室上层细胞。将小室放置于结晶紫中室温染色10min，洗去多余的结晶紫，晾干小室，然后在显微镜下拍照，随机选取5个视野进行细胞计数。
从结果看，DP7-C/mi542-3p、DP7-C/mi497-5p和DP7-C/in9-5p转染进入4T1细胞后，能有效地抑制4T1的迁移和侵袭(图8)。
2.HΜVEC血管生成实验
在96孔板中加入50μl的基质胶，并置于37℃培养箱中。待其凝固后，将分别使用PBS，DP7-C(2.16μg)，DP7-C(2.16μg)/miNC(0.24μg)，DP7-C(2.16μg)/mi542-3p(0.24μg)，DP7-C(2.16μg)/mi497-5p(0.24μg)，DP7-C(2.16μg)/mi9(0.24μg)，DP7-C(2.16μg)/mi9-5p(0.24μg)/inNC(0.24μg)，DP7-C(2.16μg)/mi9-5p(0.24μg)+in9-5p(0.24μg)处理24h的HΜVEC细胞用F12K培养基重悬后每孔铺1×104细胞。4-6h后显微镜下观察血管形成情况并拍照，使用imageJ软件分析血管结节数。
结果表明，DP7-C/mi542-3p、DP7-C/mi497-5p和DP7-C/in9-5p进入细胞可抑制HUVEC血管形成(图9)。
实施例6 DP7-C/microRNA复合物和DP7-C/inhibitor复合物瘤内给药的抗肿瘤效果
1.4T1原位肿瘤小鼠模型的建立及DP7-C/microRNA和DP7-C/inhibitor瘤内给药的治疗效果体内治疗效果
将6-8周龄Balbc雌性小鼠随机分组如下(每组6只小鼠)：PBS组，DP7-C组，DP7-C/miNC组，DP7-C/mi542-3p组，DP7-C/mi497-5p组，DP7-C/inNC组，DP7-C/in9-5p组。
在第0天向每只小鼠第四乳房垫接种5×105个使用100μl的1640双无培养基重悬的4T1细胞，然后每天观察并记录小鼠肿瘤生长情况。当肿瘤体积达到80-100mm3时开始给药，给药方式为瘤内给药，体积为50μl。瘤内给药分组如下PBS，DP7-C(50μg)，DP7-C(50μg)/miNC(10μg)，DP7-C(50μg)/mi542-3p(10μg)，DP7-C(50μg)/mi497-5p(10μg)，DP7-C(40μg)/inNC(10μg)，DP7-C(40μg)/inhibitor(10μg)，每两天给药一次，共给药7次。在接种第24天处死小鼠，记录肿瘤重量，同时取出小鼠肺部拍照并对肺结节数进行统计。
从结果可看到DP7-C/mi542-3p、DP7-C/mi497-5p和DP7-C/in9-5p组小鼠肿瘤生长曲线和瘤重明显低于其他组，并且肺转移结节数明显少于其他组(图10a-d)。
实施例7 DP7-C/microRNA复合物和DP7-C/inhibitor复合物瘤内给药的安全性评价
1.HE染色
处死小鼠时，取各组小鼠的主要脏器立即浸泡于4％多聚甲醛固定，大于72小时。
将组织切成厚度为5mm的块状，包埋，切片，烤片，将切片脱蜡至水，然后Mayer氏苏木素染色，1～2min；自来水冲洗15～20min；伊红复染，30s～1min；自来水漂洗30秒，放置过夜蒸发水分。中性树胶封片，第二天拍片。
通过HE染色，分析了DP7-C/microRNA和DP7-C/inhibitor瘤内给药的安全性。结果显示各个组未见明显器官毒性，初步提示DP7-C/microRNA和DP7-C/inhibitor瘤内给药安全性良好(图11)。
本发明上述实例使用了胆固醇修饰的阳离子肽共轭物(DP7-C)。DP7-C可以在水中自组装成胶束，将microRNA-542-3p(mi542)、microRNA-497-5p(mi497)和microRNA9-5p抑制剂(in9)转运至肿瘤，从而抑制血管生成和转移。DP7(VQWRIRVAVIRK)是由12个氨基酸组成的阳离子肽。胆固醇是最常用的具有刚性平面四环单元和柔性脂族链的疏水分子之一。DP7-C可以在水中自发形成带正电的胶束。因此，带负电荷的microRNA或microRNA抑制剂可通过静电相互作用吸附在胶束的外部，随后可通过胶束装载到细胞中。在此实验中，我们将DP7-C与Lipo2000和PEI25K进行了比较，发现了DP7-C在转染效率和安全性方面具有优势。DP7-C通过将mi542、mi497或in9递送至乳腺癌细胞，在体外和体内证明了对肿瘤转移和血管生成的抑制作用。总之，本发明提供了一种潜在的通用microRNA递送载体DP7-C，具有低毒性和高转染效率。该研究为解决microRNA的胞内递送效率低的问题提供了一种选择，为进一步研究microRNA的功能奠定了基础。
序列表
<110> 四川大学华西医院
<120> 疏水化修饰多肽在制备microRNA相关核酸传递系统中的用途
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ugugacagau ugauaacuga aa 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagcagcaca cugugguuug ua 22
<210> 4
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aguaugucga ucuauugguu ucu 23

Claims (9)

1.microRNA相关核酸传递系统，其特征在于是由疏水化修饰多肽装载microRNA相关核酸制成，所述疏水化修饰的多肽结构为：
其中，所述的R为：
所述的microRNA相关核酸为microRNA542-3p mimics、microRNA497-5p mimics或microRNA9-5p inhibitor中的至少一种；
所述microRNA542-3p序列为(SEQ ID No.2)：UGUGACAGAUUGAUAACUGAAA；microRNA497-5p序列为(SEQ ID No.3)：CAGCAGCACACUGUGGUUUGUA；microRNA9-5pinhibitor对应的microRNA9-5p序列为(SEQ ID No.4)：AGUAUGUCGAUCUAUUGGUUUCU。
2.根据权利要求1所述的microRNA相关核酸传递系统，其特征在于疏水化修饰多肽和核酸按质量比1～20︰1作为原料制备而成。
3.根据权利要求2所述的microRNA相关核酸传递系统，其特征在于：疏水化修饰多肽与核酸按质量比1～10︰1作为原料制备而成。
4.根据权利要求1～3任一项所述的microRNA相关核酸传递系统，其特征在于：是由疏水化修饰多肽与核酸共孵育制得。
5.根据权利要求4所述的microRNA相关核酸传递系统，其特征在于：是由疏水化修饰多肽与核酸在水中或液态培养基中共孵育5～15min而得。
6.权利要求1～5任一项所述的microRNA相关核酸传递系统在制备肿瘤疫苗中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，所述的肿瘤疫苗为原位肿瘤疫苗。
8.权利要求1～5任一项所述的microRNA相关核酸传递系统在制备抗血管生成的药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的抗血管生成为抗肿瘤组织血管生成。
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