CN115040657B - 一种dna四面体-槲皮素复合物及其预防脓毒症的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种DNA四面体‑槲皮素复合物及其预防脓毒症的用途，属于医药技术领域。本发明DNA四面体‑槲皮素复合物是由DNA四面体框架核酸和槲皮素混合后形成的复合物。本发明DNA四面体‑槲皮素(tFNA‑Que)复合物以tFNA为载体进行槲皮素的协同递送。本发明tFNA‑Que复合物具有合成简单、性能稳定、缓释、水溶性好、生物相容性好等特点；此外，本发明tFNA‑Que复合物具有优异的抗炎和抗氧化作用，通过显著降低炎症水平和消除ROS，有效减弱了脓毒症的全身炎症和多器官损伤等并发症。本发明tFNA‑Que复合物中tFNA和Que发挥了协同增效作用，能有效预防和/或治疗脓毒症及脓毒症的并发症，为脓毒症的免疫预防提供新策略，具有成为脓毒症新药的巨大潜力。

Description

一种DNA四面体-槲皮素复合物及其预防脓毒症的用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种DNA四面体-槲皮素复合物及其预防脓毒症的用途。
背景技术
脓毒症(Sepsis)作为全球最致命的综合征之一，已成为重症监护病房(ICU)的主要死因之一，其死亡率约为50％。脓毒症是由细菌等病原微生物侵入机体引起的全身炎症反应综合征。据报道，脓毒症通常涉及感染的免疫反应失调，导致全身破坏性炎症和严重并发症，这些并发症包括多器官衰竭或多器官功能障碍综合征(MODS)。尽管过去十年对脓毒症引起的免疫功能障碍的机制探索有所深入，但对于其大部分并发症，尤其是多器官衰竭仍难以对其提供满意的治疗。因此，迫切需要开发新颖的、有效的脓毒症及其并发症的治疗方法。根据研究报道，脓毒症不受控制的严重炎症通常与革兰氏阴性(G-)细菌外膜的主要成分脂多糖(LPS)有关。具体而言，先天免疫系统是宿主抵御病原体入侵的主要防御机制。当机体受到病原微生物的严重感染时，被称为先天免疫系统前哨细胞的巨噬细胞参与炎症细胞因子风暴以消除病原体。病原体表面的LPS被巨噬细胞的Tolly样受体识别并通过核因子κ-轻链增强子(NF-κB)家族和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等转录因子传递信号，以诱导负责促炎介质合成和释放的基因表达，包括趋化因子、活性氧(ROS)、细胞因子，特别是白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1(IL-1)。然后过度的先天性和适应性炎症和氧化成分导致系统性炎症风暴，进而导致细胞、组织甚至肺、肝、肾等多器官损伤。因此，有效抑制过度的全身性炎症是治疗脓毒症的关键问题。
天然化合物已被用于预防和治疗各种炎症和免疫相关疾病，例如特应性皮炎、类风湿性关节炎和脓毒症。它们因其潜在的治疗效果、低成本、被人群广泛接受而引起了极大的关注。槲皮素(Que)是一种广泛存在于植物中的类黄酮化合物。它因其抗癌、抗炎、抗衰老和相对安全性(低毒性)等多效生物学特性而被广泛研究。多项研究表明，槲皮素可以抑制免疫细胞的氧化应激和过度炎症反应，从而抑制LPS引起的全身炎症和包括肾脏、心脏、肺等在内的多器官功能障碍。其具体机制涉及槲皮素通过抑制LPS诱导的NF-κB激活和核转位、细胞外信号调节激酶1/2(Erk1/2)和c-Jun N-末端激酶的磷酸化，从而降低炎症细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6的水平。此外，槲皮素通过抑制NOX2和促进Nrf2产生来减少LPS诱导的ROS。遗憾的是，由于槲皮素水溶性差、生物利用度低和在生理介质中的不稳定性，其应用受到严重限制。因此，有必要开发新型纳米材料来改善槲皮素的递送，以提高槲皮素的功效。
四面体框架核酸(tetrahedral framework nucleic acid,tFNA)又称DNA四面体(tetrahedral DNA，TDN)、四面体DNA纳米结构，它由4条单链DNA通过链间碱基互补配对形成，形态类似四面体。这种纳米结构合成效率高，合成步骤简单，具有良好的生物安全性和生物相容性。DNA四面体框架核酸已是一种研究较为深入的纳米材料，结构具有许多优点，包括可忽略的免疫原性，天然生物相容性，结构稳定性和无与伦比的可编程性，这是有效药物载体的先决条件。同时研究表明DNA四面体具有一定的生物活性，如具有抗炎作用等。因此DNA四面体有望成为一种重要的药物载体。
但是由于DNA四面体的结构特殊，且具有一定活性，因此DNA四面体负载小分子药物后两者相互作用如何，是发挥协同作用还是拮抗作用，这是未知的，不同小分子药物效果可能会出现较大的不同。目前尚未见DNA四面体载槲皮素，DNA四面体能否成功负载槲皮素，使其发挥更好的效果需要进一步研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种DNA四面体-槲皮素复合物及其预防脓毒症的用途。
本发明提供了一种DNA四面体-槲皮素复合物，它是由DNA四面体框架核酸和槲皮素混合后形成的复合物。
进一步地，所述DNA四面体框架核酸和槲皮素混合时，DNA四面体框架核酸和槲皮素的摩尔比为1:20～1:160。
进一步地，所述DNA四面体框架核酸和槲皮素混合时，DNA四面体框架核酸和槲皮素的摩尔比为1:40～1:160。
进一步地，所述DNA四面体框架核酸和槲皮素混合时，DNA四面体框架核酸和槲皮素的摩尔比为1:80。
进一步地，所述DNA四面体框架核酸由四条DNA单链自组装合成；所述四条DNA单链的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、和SEQ ID NO.4所示。
进一步地，所述DNA四面体框架核酸的合成方法包括以下步骤：将四条DNA单链加入到TM缓冲液中，95℃维持10min，快速降温到4℃维持20min以上，即得。
进一步地，所述四条DNA单链为等摩尔比的四条DNA单链。
本发明还提供了一种制备前述的DNA四面体-槲皮素复合物的方法，它包括如下步骤：
将DNA四面体框架核酸和槲皮素加入溶剂中混合反应后超滤，即得；
优选地，所述溶剂为PBS、DMSO中的一种或多种；
和/或，所述反应的温度为20～30℃；
和/或，所述反应的时间为4～6h；
和/或，所述超滤使用30KDa分子量膜。
本发明还提供了前述的DNA四面体-槲皮素复合物在制备抗炎和/或抗氧化的药物中的用途。
进一步地，所述药物为预防和/或治疗脓毒症和/或脓毒症并发症的药物；
优选地，所述脓毒症并发症为多器官损伤；
更优选地，所述多器官损伤为多器官衰竭或多器官功能障碍综合征。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、首次构建了一种DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物，其中槲皮素通过嵌入结合模式与tFNA相互结合。
2、tFNA-Que复合物提高了Que的稳定性和释放能力，并保持出色的进入细胞的能力。
3、tFNA-Que复合物通过调节ERK/NF-Kb通路，发挥协同增效作用，有效增强Que和tFNA的抗炎作用。
4、tFNA-Que复合物通过调节Nrf2/HO-1通路，同样发挥协同增效作用，有效增强Que和tFNA的抗氧化作用。
5、tFNA-Que复合物治疗减少了LPS诱导的全身炎症，并保护包括肺、肝和肾在内的多个器官受脓毒症损伤。
本发明的目的是制备一种DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物，其以tFNA为载体进行槲皮素的协同递送。本发明tFNA-Que复合物具有合成简单、性能稳定、缓释、水溶性好、生物相容性好等特点；此外，本发明tFNA-Que复合物具有优异的抗炎和抗氧化作用，通过显著降低炎症水平和消除ROS，有效减弱了脓毒症的全身炎症和多器官损伤等并发症。本发明tFNA-Que复合物中tFNA和Que发挥了协同增效作用，能有效预防和/或治疗脓毒症及脓毒症的并发症，为脓毒症的免疫预防提供新策略，具有成为脓毒症新药的巨大潜力。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为tFNA-Que复合物的合成及表征：A为tFNA-Que复合物合成过程的示意图；B为通过PAGE验证tFNA的成功合成，泳道1为S1，泳道2为S1+S2，泳道3为S1+S2+S3，泳道4为tFNA；C为通过PAGE验证tFNA-Que复合物的成功合成，泳道1为tFNA，泳道2为tFNA：Que摩尔比＝1:40的tFNA-Que复合物(实施例2)，泳道3为tFNA：Que摩尔比＝1:80的tFNA-Que复合物(实施例3)，泳道4为tFNA：Que摩尔比＝1:160的tFNA-Que复合物(实施例4)；D为不同tFNA、Que摩尔比合成的tFNA-Que复合物与Gel-Red染料(λex＝312nm)结合后激发的荧光与单纯tFNA结合Gel-Red染料激发荧光的比值；E为Que、tFNA和tFNA-Que复合物(tFNA：Que摩尔比＝1:80，实施例3)在200nm波长和500nm波长之间的光谱；F为tFNA和tFNA-Que复合物(tFNA：Que摩尔比＝1:80，实施例3)的粒径尺寸；G为tFNA和tFNA-Que复合物(tFNA：Que摩尔比＝1:80，实施例3)的Zeta电位；H为tFNA-Que复合物(tFNA：Que摩尔比＝1:80，实施例3)的原子力显微镜(AFM)图像，比例尺：200nm；I为tFNA-Que复合物(tFNA：Que摩尔比＝1:80，实施例3)的透射电镜(TEM)图像，比例尺：50nm；J为图I的放大图像，比例尺：20nm；数据表示为平均值±标准偏差(SD)(n＝3)。
图2为tFNA、Que和tFNA-Que复合物的大体照片；等浓度、等体积的tFNA(250nM)、Que(40μM)和tFNA-Que复合物(制备时tFNA为250nM、Que为40μM)溶解在PBS中的大体照片。
图3为tFNA-Que复合物的稳定性检测和释放试验：A为等浓度和体积的Que(40μM)和tFNA-Que复合物(按照实施例4制备而成，tFNA：250nM，Que：40μM)在PBS(pH＝7.4,37℃)中的稳定性测定；B为tFNA-Que复合物(按照实施例4制备而成，tFNA：250nM，Que：40μM)在PBS(pH＝7.4,37℃)中Que的体外释放试验；C为等浓度和体积的tFNA和tFNA-Que复合物(按照实施例4制备而成，tFNA：250nM，Que：40μM)在胎牛血清(2％，37℃)中的稳定性；数据表示为平均值±标准偏差(SD)(n＝3)。
图4为tFNA-Que复合物的入胞性能检测：A为通过共聚焦显微镜检测Cy5-tFNA和Cy5-tFNA-Que复合物进入细胞的性能(Cy5：红色；细胞骨架：绿色；细胞核：蓝色)；B为通过流式细胞仪检测Cy5-tFNA和Cy5-tFNA-Que复合物进入细胞的性能(control：绿色；Cy5-tFNA：红色；Cy5-tFNA-Que：蓝色)；C为对图B各组带有Cy5荧光的细胞占全部细胞占比百分数进行统计；数据表示为平均值±标准偏差(SD)(n＝3)；统计分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns，无意义。
图5为tFNA-Que的细胞活性试验和NO浓度筛选试验：A为用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que复合物(tFNA：250nM，Que：20μM)预处理然后用LPS处理的RAW264.7细胞的细胞活力结果；B为用不同摩尔比制备的tFNA-Que复合物预处理然后用LPS处理的RAW264.7细胞的细胞活力结果；C为不同tFNA-Que复合物预处理然后用LPS处理的RAW264.7细胞的NO结果；数据表示为平均值±SD(n＝3)；统计分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns，无意义。
图6为tFNA-Que减少LPS诱导的炎症的结果：A为不同处理后RAW264.7细胞的NO水平；B-D分别为TNF-α、IL-6和IL-1β表达的RT-PCR分析结果；E为ELISA检测到的炎性细胞因子分泌，包括TNF-α(i)和IL-6(ii)；F为免疫印迹结果和iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平的定量分析；G为不同处理后细胞中iNOS表达的免疫荧光图像；细胞骨架：绿色；细胞核：蓝色；iNOS：红色；3D热图：重建iNOS的荧光强度；比例尺：20μm；H为不同处理后细胞中TNF-α表达的免疫荧光图像；细胞骨架：绿色；细胞核：蓝色；TNF-α：红色；3D热图：重建TNF-α的荧光强度；比例尺：20μm；I为不同处理后细胞中IL-6表达的免疫荧光图像；细胞骨架：绿色；细胞核：蓝色；IL-6：红色；3D热图：重建IL-6的荧光强度；比例尺：20μm；J为不同处理后细胞中IL-1β表达的免疫荧光图像；细胞骨架：绿色；细胞核：蓝色；IL-1β：红色；3D热图：重建IL-1β的荧光强度；比例尺：20μm；数据表示为平均值±标准偏差(SD)(n＝3)；统计分析：*p<0.05，**p 0.01，和***p<0.001。
图7为tFNA-Que对关键炎症信号分子的调节结果：A为参与tFNA-Que复合物抗炎作用的关键炎症信号分子示意图；B为磷酸-p65(p-p65)、IκBα、总-ERK 1/2(t-ERK 1/2)和磷酸-ERK1/2(p-ERK 1/2)表达水平的蛋白质印迹结果；C为对图B中蛋白质的表达水平进行定量分析；D为不同处理后细胞中总p65表达和核转位的免疫荧光图像；细胞骨架：绿色；细胞核：蓝色；p65：红色；比例尺：20μm；E为不同处理后细胞中p-p65表达的免疫荧光图像；细胞骨架：绿色；细胞核：蓝色；p-p65：红色；3D热图：重建p-p65的荧光强度；比例尺：20μm；F为不同处理后细胞中IκBα表达的免疫荧光图像；细胞骨架：绿色；细胞核：蓝色；IκBα：红色；3D热图：IκBα荧光强度的重建；比例尺：20μm；G为不同处理后细胞中磷酸-ERK1/2(p-ERK1/2)表达的免疫荧光图像；细胞骨架：绿色；细胞核：蓝色；p-ERK1/2：红色；3D热图：重建p-ERK1/2的荧光强度；比例尺：20μm；数据表示为平均值±标准偏差(SD)(n＝3)；统计分析：*p<0.05，**p 0.01和***p<0.001。
图8为tFNA-Que复合物通过Nrf2/HO-1途径减少LPS诱导的ROS结果：A为细胞内ROS水平通过荧光显微镜观察和热图呈现；比例尺：100μm；绿色：ROS；B为流式细胞仪定量检测(i)和分析(ii)细胞内ROS水平；C为RAW264.7细胞不同处理后的SOD水平；D为Nrf2和HO-1表达水平的蛋白质印迹结果；E为Nrf2(i)和HO-1(ii)的蛋白质印迹结果的统计分析；F为不同处理后细胞中HO-1表达的免疫荧光图像；细胞骨架：绿色；细胞核：蓝色；HO-1：红色；3D热图：重建HO-1的荧光强度；比例尺：20μm；数据表示为平均值±SD(n＝3)；统计分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图9为tFNA-Que复合物减弱LPS诱导的全身炎症并分散在多个器官中：A为tFNA、Que或tFNA-Que复合物预处理及体内动物模式建立示意图；B为ELISA检测血清中的炎症细胞因子，包括TNF-α(i)、IL-6(ii)分泌；C为ELISA检测包括TNF-α(i)、IL-6(ii)腹膜液分泌的炎症细胞因子；D为Cy5标记的tFNA-Que复合物在1小时、3小时、6小时、12小时、24小时后腹腔注射后在主要器官中的分布；E为肺中H&E染色的图像；比例尺：50μm；箭头：炎症细胞浸润；F为肝脏中H&E染色的图像；比例尺：50μm；箭头：炎症细胞浸润；圆圈：细胞坏死(染色质颜色增强，核固缩)；G为肾脏H&E染色图像；比例尺：50μm；箭头：炎症细胞浸润；数据表示为平均值±SD(n＝4)；统计分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns，无意义。
图10为tFNA-Que复合物治疗对LPS诱导的多器官损伤的保护作用：A为各组小鼠血清中BUN水平；B为各组小鼠血清中CRE水平；C为各组小鼠血清中ALT水平；D为各组小鼠血清中AST水平；E为各组小鼠肺中HO-1表达的免疫荧光图像和HO-1相对荧光强度的定量分析；比例尺：200μm；细胞核：蓝色；HO-1：绿色；F为各组小鼠肺、肝、肾中CD68表达的免疫荧光图像和CD68相对荧光强度的定量分析；比例尺：200μm；细胞核：蓝色；CD68：红色；数据表示为平均值±SD(n＝6)；统计分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1、DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物的合成
1、DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成
DNA四面体框架核酸(tFNA)是由独特设计的四条DNA单链(S1，S2，S3，S4)通过一个PCR程序(95℃维持10min，快速降温到4℃维持20min以上)自组装合成的。具体制备方法如下：
四条DNA单链S1、S2、S3和S4(具体序列如表1所示)按照等摩尔比溶解于TM缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH 8.0)中，使得四条DNA单链的终浓度分别为1000nM，充分混匀后迅速加热至95℃维持10min，之后迅速降温至4℃并维持20min以上，即自组装合成得到DNA四面体框架核酸(tFNA)。
表1.本发明四条DNA单链的具体序列
Figure BDA0003688783010000071
2、tFNA-Que复合物的合成
将溶解在DMSO中的槲皮素(Que)与上述制备的tFNA加入到PBS中溶解，并混合均匀，使得溶液中Que的浓度为5μM，tFNA的浓度为250nM(溶液中tFNA和Que的摩尔比为1:20)。将混合后的溶液在25℃震荡6小时，然后，通过在25℃的条件下，以4000rpm的转速超滤(30kDa分子量膜，Millipore，USA)10分钟去除残留的ssDNA和Que，得到tFNA-Que复合物。
实施例2、DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物的合成
1、DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成
DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成方法同实施例1。
2、tFNA-Que复合物的合成
将溶解在DMSO中的槲皮素(Que)与上述制备的tFNA加入到PBS中溶解，并混合均匀，使得溶液中Que的浓度为10μM，tFNA的浓度为250nM(溶液中tFNA和Que的摩尔比为1:40)。将混合后的溶液在25℃震荡6小时，然后，通过在25℃的条件下，以4000rpm的转速超滤(30kDa分子量膜，Millipore，USA)10分钟去除残留的ssDNA和Que，得到tFNA-Que复合物。
实施例3、DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物的合成
1、DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成
DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成方法同实施例1。
2、tFNA-Que复合物的合成
将溶解在DMSO中的槲皮素(Que)与上述制备的tFNA加入到PBS中溶解，并混合均匀，使得溶液中Que的浓度为20μM，tFNA的浓度为250nM(溶液中tFNA和Que的摩尔比为1:80)。将混合后的溶液在25℃震荡6小时，然后，通过在25℃的条件下，以4000rpm的转速超滤(30kDa分子量膜，Millipore，USA)10分钟去除残留的ssDNA和Que，得到tFNA-Que复合物。
实施例4、DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物的合成
1、DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成
DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成方法同实施例1。
2、tFNA-Que复合物的合成
将溶解在DMSO中的槲皮素(Que)与上述制备的tFNA加入到PBS中溶解，并混合均匀，使得溶液中Que的浓度为40μM，tFNA的浓度为250nM(溶液中tFNA和Que的摩尔比为1:160)。将混合后的溶液在25℃震荡6小时，然后，通过在25℃的条件下，以4000rpm的转速超滤(30kDa分子量膜，Millipore，USA)10分钟去除残留的ssDNA和Que，得到tFNA-Que复合物。
实施例5、DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物的合成
1、DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成
DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成方法同实施例1。
2、tFNA-Que复合物的合成
将溶解在DMSO中的槲皮素(Que)与上述制备的tFNA加入到PBS中溶解，并混合均匀，使得溶液中Que的浓度为60μM，tFNA的浓度为250nM(溶液中tFNA和Que的摩尔比为1:240)。将混合后的溶液在25℃震荡6小时，然后，通过在25℃的条件下，以4000rpm的转速超滤(30kDa分子量膜，Millipore，USA)10分钟去除残留的ssDNA和Que，得到tFNA-Que复合物。
实施例6、DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物的合成
1、DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成
DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成方法同实施例1。
2、tFNA-Que复合物的合成
将溶解在DMSO中的槲皮素(Que)与上述制备的tFNA加入到PBS中溶解，并混合均匀，使得溶液中Que的浓度为80μM，tFNA的浓度为250nM(溶液中tFNA和Que的摩尔比为1:320)。将混合后的溶液在25℃震荡6小时，然后，通过在25℃的条件下，以4000rpm的转速超滤(30kDa分子量膜，Millipore，USA)10分钟去除残留的ssDNA和Que，得到tFNA-Que复合物。
实施例7、DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物的合成
1、DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成
DNA四面体框架核酸(tFNA)的合成方法同实施例1。
2、tFNA-Que复合物的合成
将溶解在DMSO中的槲皮素(Que)与上述制备的tFNA加入到PBS中溶解，并混合均匀，使得溶液中Que的浓度为160μM，tFNA的浓度为250nM(溶液中tFNA和Que的摩尔比为1:640)。将混合后的溶液在25℃震荡6小时，然后，通过在25℃的条件下，以4000rpm的转速超滤(30kDa分子量膜，Millipore，USA)10分钟去除残留的ssDNA和Que，得到tFNA-Que复合物。
以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。
细胞培养和处理
巨噬细胞系RAW264.7细胞在含有高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基、10％胎牛血清(FBS，HyClone，Logan，USA)和1％青霉素-链霉素溶液(HyClone，Logan，USA)的完全培养基中培养。添加到培养基中的脂多糖(LPS，Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri，USA)的浓度为1μg/mL，以引发巨噬细胞的炎症。为了验证药物的抗炎和抗氧化作用，细胞用Que、tFNA或tFNA-Que复合物预处理2小时，然后用或不用LPS处理24小时。
试验例1、DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物的相关表征
1、表征方法
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、透射电子显微镜(TEM)、原子力显微镜(AFM)验证tFNA-Que复合物是否成功合成，并观察其大小和形状。动态光散射DLS(Nano ZS,Malvern,England)用于测量tFNA和tFNA-Que复合物的粒径和Zeta电位。tFNA、Que和tFNA-Que复合物的吸光度曲线用超微分光光度计描绘。GelRed的荧光由Varioskan LUX酶标仪(Thermo Scientific，USA)检测。
2、表征结果
如图1A所示的示意图，tFNA-Que复合物的合成分为两个步骤：(1)tFNA由四个等摩尔量的ssDNA自组装，并且通过PAGE检测到tFNA成功合成(图1B)；(2)tFNA通过震荡6h与Que复合，得到tFNA-Que复合物，tFNA-Que复合物的成功合成也在PAGE中得到验证(图1C)。
同时通过改变溶液中Que的用量，使制备tFNA-Que复合物的溶液中tFNA和Que的摩尔比分别为1:40、1:80和1:160，按照实施例方法制备不同Que含量的tFNA-Que复合物，图1C中显示tFNA-Que复合物的位置随着Que比例的增加而逐渐上移。应用GelRed染料竞争测定Que和tFNA之间的结合方法。当tFNA与1x GelRed孵育20分钟时，荧光被激发，而由不同摩尔比tFNA和Que制备的tFNA-Que复合物与GelRed一起孵育，GelRed的荧光强度随着Que浓度的增加而降低(图1D)。这意味着Que与tFNA相互作用的位置是与GelRed相同的双链DNA双螺旋槽区。
此外，图1E中的光谱表明tFNA-Que复合物的特征吸收峰接近tFNA(260nm)和Que(260nm、377nm)，这表明Que被tFNA成功搭载，没有副产物。通过DLS检测tFNA和tFNA-Que复合物的粒径和zeta电位，也证实了tFNA-Que复合物的成功合成。在图1F中，tFNA的大小为10.7±3.2nm，而tFNA-Que复合物的大小为15.7±2.3nm。在图1G中，tFNA的zeta电位为-7.41±0.68mV，而tFNA-Que复合物的zeta电位为-13.2±0.55mV。这些差异表明新的纳米颗粒tFNA-Que复合物已生成。
为了表征tFNA-Que复合物的形状和大小，进行了AFM和TEM。AFM图像显示tFNA-Que复合物约为20nm(图1H)。从TEM图像中获得了相同的结果，并且通过TEM观察到类三角形的结构(图1I和图1J)。
除了微观水平的变化外，tFNA-Que复合物、tFNA和Que之间还存在一些肉眼明显的差异。更具体地说，图2中所示的tFNA-Que复合物是透明的黄色液体，而带有未溶解颗粒的单纯Que液体黄色程度明显低于tFNA-Que复合物。同时tFNA是无色透明液体。三种颗粒外观的差异表明tFNA-Que复合物比单纯的Que具有更好的水溶性，这对于溶解性差的Que的利用非常有利。
总的来说，上述结果表明本发明首次构建了一种新型纳米药物系统tFNA-Que复合物，其中Que通过嵌入结合模式与tFNA相互结合。制备得到的tFNA-Que复合物稳定性更好，且溶解率提高。
试验例2、体外和稳定性释放测定
1、实验方法
在释放实验中，释放介质PBS(0.01M,pH 7.4)通过透析膜(30kDa；Solarbio,Beijing,China)分为内液(3mL)和外液(30mL)。tFNA-Que复合物(按照实施例4制备而成，tFNA：250nM，Que：40μM)溶解在内液中。将整个系统置于37℃，在几个时间点通过波长377nm处的OD值测量外液中Que的释放量。类似地，在稳定性测试中，将等浓度、体积的Que(40μM)和tFNA-Que复合物(按照实施例4制备而成，tFNA：250nM，Que：40μM)置于等量的PBS中，在不同时间点通过测量波长377nm处的OD值以检测溶解于PBS后Que和tFNA-Que复合物中的残留的Que。
2、实验结果
由于缺乏稳定性，Que的广泛应用受到了很大限制。如图3A所示，当置于PBS中时，大量单纯Que在前1小时内迅速降解，6小时后Que的残留量仅不到40％。而tFNA-Que复合物在6h后可以维持在60-70％左右，比单纯Que更稳定。此外，tFNA-Que复合物在血清中的稳定性通过PAGE显示在图3C中，这表明tFNA-Que复合物作为一种基于核酸的材料可以持续存在至12-24小时，稳定性优异。释放能力方面，tFNA搭载的Que释放缓慢。24h后tFNA-Que复合物的释放效率达到62.0±2.6％(图3B)，这有利于Que的充分利用。
试验例3、Cy5标记的tFNA和tFNA-Que复合物的细胞摄取
1、实验方法
使用Cy5荧光标记后的S1单链(S1-Cy5)，按照本发明实施例所述方法制备Cy5标记的tFNA和tFNA-Que复合物(制备tFNA-Que复合物的溶液中tFNA：250nM，Que：20μM)。
为了检查tFNA和tFNA-Que复合物的细胞进入性能，首先用Cy5标记的tFNAs和tFNA-Que复合物处理RAW264.7细胞3小时。然后收集细胞并用PBS冲洗3次。最终，通过流式细胞仪(CytoFLEX，Beckman Coulter Inc.，Brea，USA)获得具有荧光Cy5的细胞占所有细胞的比例。此外，通过共聚焦显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)获得了Cy5标记的tFNA和tFNA-Que复合物分散在细胞中的图像。
2、实验结果
使用流式细胞术和共聚焦显微镜检验了Cy5标记的tFNA和tFNA-Que复合物进入RAW264.7细胞的情况。从激光共聚焦显微镜的图像(图4A)中可以观察到Cy5标记的tFNAs和tFNA-Que复合物广泛分布在细胞的细胞质中。根据流式细胞术的结果(图4B和4C)，可检测到tFNA-Que复合物和tFNA荧光的细胞比例均达到90％以上，tFNA和tFNA-Que复合物之间没有统计学差异。该现象表明将tFNA与Que复合后不会干扰tFNA的优异的入胞性能。上述结果表明，tFNA-Que复合物中，Que的稳定性和释放能力显著提高，并保持出色的进入细胞的能力。
试验例4、tFNA-Que在体外降低LPS诱导的炎症
1、实验方法
(1)RAW264.7细胞处理后的细胞活力
将RAW264.7细胞接种在96孔板中(8000个细胞/孔)。然后用tFNA、Que以及不同tFNA和Que摩尔比制备的tFNA-Que复合物(tFNA和Que摩尔比分别为1:40、1:80、1:160、1:240、1:320，如实施例2～6，tFNA的浓度为250nM，Que对应的浓度分别是10μM，20μM，40μM，60μM，80μM)预培养细胞2h，然后除对照组(正常细胞组)外用1μg/mL LPS处理24h。然后将细胞在10％CCK-8溶液(KeyGEN Biotech)中于37℃培养1小时。通过450nm处的OD值测量细胞活力。
为了验证tFNA-Que复合物、Que和tFNA处理对LPS诱导的RAW264.7细胞活力的影响，用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que复合物(按照实施例3制备而得，tFNA：250nM，Que：20μM)预处理细胞2h，然后用LPS(1μg/mL)处理24h。如上述过程进行细胞活力测定。
(2)NO水平检测测定
Griess检测试剂盒(Beyotime，上海，中国)用于检测NO水平。具体而言，将RAW264.7细胞接种在96孔板中(8000个细胞/孔)，用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que复合物(按照实施例3制备而得，tFNA：250nM，Que：20μM)预处理细胞2h，然后用LPS(1μg/mL)处理24h，将处理后的巨噬细胞上清液(50μL)加入新的96孔板中，然后与Griess测定试剂盒试剂1(50μL)和试剂2(50μL)混合。测量540nm处的吸光度以计算NO水平。
(3)逆转录-PCR(RT-PCR)
将RAW264.7细胞接种在6孔板中(10000个细胞/孔)，用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que复合物(按照实施例3制备而得，tFNA：250nM，Que：20μM)预处理细胞2h，然后用LPS(1μg/mL)处理24h，提取巨噬细胞总RNA，并获得cDNA。在ABI QuantStudio 6实时PCR系统(Thermo Scientific，美国)中通过
Figure BDA0003688783010000121
Green I PCR预混液检测靶mRNA的表达。将所有靶mRNA(表2)的表达与作为对照的GAPDH进行比较。
表2.靶基因引物序列
Figure BDA0003688783010000122
(4)蛋白质印迹分析
将RAW264.7细胞接种在6孔板中(10000个细胞/孔)，用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que复合物(按照实施例3制备而得，tFNA：250nM，Que：20μM)预处理细胞2h，然后用LPS(1μg/mL)处理24h，用PBS冲洗样品并用蛋白质提取试剂(KeyGen Biotech，南京，中国)处理以提取蛋白质。然后将纯化的样品与上样缓冲液(Beyotime，上海，中国)混合并在100℃加热10分钟。目标蛋白通过SDS-PAGE凝胶分离并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。之后，PVDF膜在室温下用封闭液(Beyotime，Shanghai，China)封闭20分钟，并与包括抗TNF-α一抗(1:1000；Abcam，英国剑桥)、抗IL-6一抗(1:1000；CST，美国波士顿)、抗IL-1β一抗(1:1000；CST，美国波士顿)、抗iNOS一抗(1:1000；CST，美国波士顿)和抗GAPDH一抗(1:1000；CST，美国波士顿)在4℃下过夜。用TBST洗涤后，将膜与二抗(1:5000；Beyotime，上海，中国)一起孵育1小时。最后，通过化学发光检测系统(Bio-Rad，Hercules，USA)检测膜上的蛋白质条带。
(5)免疫荧光染色
为进一步观察蛋白表达，进行免疫荧光染色。将RAW264.7细胞接种在6孔板中(10000个细胞/孔)，用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que复合物(按照实施例3制备而得，tFNA：250nM，Que：20μM)预处理细胞2h，然后用LPS(1μg/mL)处理24h，将样品在冷的4％多聚甲醛中固定20分钟，随后用0.5％Triton X-100处理10分钟。然后，将样品在5％山羊血清中封闭1小时，并与目标一抗在4℃下孵育过夜。第二天冲洗3次后，将样品与二抗(1:500；Invitrogen，Carlsbad，USA)一起孵育1小时。然后，细胞核用DAPI染色，细胞骨架用鬼笔环肽染色。最后，使用共焦激光显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)观察所有样品。
2、实验结果
脓毒症以先天免疫系统紊乱为特征，与大量促炎细胞因子直接相关，包括TNFα、IL-1β、IL-6、NO等。因此，有研究证明了在急性炎症动物模型中阻断或消除这些细胞因子的保护性策略是治疗脓毒症的有效方法。为了验证tFNA-Que复合物的抗炎性能，本发明应用了LPS刺激RAW264.7细胞作为体外模型。首先，本发明进行了细胞活力测定，以确保tFNA-Que复合物的生物安全性，这是用于细胞实验的前提。如图5A和5B所示，tFNA-Que复合物组促进了RAW264.7细胞的活力，特别是与LPS组相比。该结果证实了tFNA-Que复合物良好的生物安全性。值得注意的是，tFNA-Que复合物对细胞活力的促进呈现出一定的浓度剂量依赖性。具体而言，制备tFNA-Que复合物时，当tFNA浓度为250nM，Que浓度为20μM或40μM时(即制备tFNA-Que复合物时，tFNA和Que摩尔比为1:80或1:160时)，细胞活力最佳，以上两种浓度无统计学差异。
在正常生理条件下，少量的NO作为重要的信使和效应分子对机体有益。然而，组织中的过量产生也会导致组织损伤，甚至败血症休克等。因此，抑制NO的产生对于治疗败血症至关重要。浓度相关性同样适用于tFNA-Que复合物对NO的抑制作用。具体而言，制备tFNA-Que复合物时，当tFNA浓度为250nM，Que浓度范围为5μM至40μM时，均会产生一定的NO抑制作用，而Que浓度为20μM是抑制NO的最佳浓度(图5C)。因此，后续的实验均采用该浓度进行处理。
此外，如图6A所示，tFNA组和Que组对NO的产生有轻微的抑制作用，而tFNA-Que复合物组的抑制作用明显强于上述两组。研究报道，iNOS与LPS诱导的NO的产生有关。LPS处理增加了iNOS的表达，从而调节NO的产生。本研究通过蛋白质印迹分析和免疫荧光染色研究了iNOS的表达，发现iNOS的表达趋势与NO相同(图6F和6G)。除了NO和iNOS蛋白的变化外，每个表达水平还检测到炎症因子的变化。RT-PCR检测基因水平，如图6B、6C和6D所示。经LPS刺激后，TNFα、IL-1β、IL-6基因表达水平显着升高，tFNA组和Que组能轻微抑制LPS组相关基因的增加。但与LPS组、tFNA组和Que组相比，tFNA-Que复合物的抗炎作用显着提高。这一发现在蛋白质水平上也得到了支持。通过western blot分析和免疫荧光染色检测上述炎症因子的细胞内表达，ELISA试剂盒检测细胞外分泌情况。如图6E、6F、6H、6I、6J所示，一致的结果表明tFNA-Que复合物具有比单纯tFNA和Que更好的抗炎特性，tFNA负载Que得到的tFNA-Que复合物抗炎发挥了协同增效作用。
试验例5、关键炎症信号分子的调节
1、实验方法
(1)蛋白质印迹分析
将RAW264.7细胞接种在6孔板中(100000个细胞/孔)，用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que(按照实施例3制备而得，tFNA：250nM，Que：20μM)预处理细胞2h，然后用LPS(1μg/mL)处理细胞24h，用PBS冲洗样品并用蛋白质提取试剂(KeyGen Biotech，南京，中国)处理以提取蛋白质。然后将纯化的样品与上样缓冲液(Beyotime，上海，中国)混合并在100℃加热10分钟。目标蛋白通过SDS-PAGE凝胶分离并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。之后，PVDF膜在室温下用封闭液(Beyotime，Shanghai，China)封闭20分钟，并与包括抗GAPDH一抗(1:1000；CST，美国波士顿)、抗-phospho-p65一抗(1:1000；CST，美国波士顿)，抗-IκBα一抗(1:1000；CST，美国波士顿)，抗-total ERK一抗(1:1000；CST，美国波士顿)，抗-phoso-ER一抗K(1:1000；CST，美国波士顿)在4℃下过夜。用TBST洗涤后，将膜与二抗(1:5000；Beyotime，上海，中国)一起孵育1小时。最后，通过化学发光检测系统(Bio-Rad，Hercules，USA)检测膜上的蛋白质条带。
(2)免疫荧光染色
为进一步观察蛋白表达，进行免疫荧光染色。将RAW264.7细胞接种在12孔板中(50000个细胞/孔)，用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que(按照实施例3制备而得，tFNA：250nM，Que：20μM)预处理细胞2h，然后用LPS(1μg/mL)处理细胞24h，将样品在冷的4％多聚甲醛中固定20分钟，随后用0.5％Triton X-100处理10分钟。然后，将样品在5％山羊血清中封闭1小时，并与目标一抗在4℃下孵育过夜。第二天冲洗3次后，将样品与二抗(1:500；Invitrogen，Carlsbad，USA)一起孵育1小时。然后，细胞核用DAPI染色，细胞骨架用鬼笔环肽染色。最后，使用共焦激光显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)观察所有样品。
2、实验结果
在LPS诱导的脓毒症中，NF-κB在炎症中起关键调节作用。当NF-κB处于静息状态时，它由P50和P65的异源二聚体组成，由于NF-κB的核定位信号被抑制剂IκBα覆盖，它始终保留在细胞质中。一旦NF-κB被LPS激活，IKK对IκBα的磷酸化和降解会触发NF-κB(尤其是p65亚基)的磷酸化，并促进p65进入细胞核并与炎症相关基因发生反应，从而导致各种促炎细胞因子的表达，包括IL-6、IL-1β和TNF-α。ERK作为MAPKs之一在炎症过程中多种炎症相关基因的上调和NF-κB的激活中起着至关重要的作用。在LPS激活其受体TLR之后，ERK发生磷酸化，这种变化可促进TNF-α、IL-1β和IL-6的产生。如图7A所示，假设tFNA-Que复合物抑制炎症的出色能力与抑制LPS诱导的NF-κB活化、核转位和ERK磷酸化有关。通过蛋白质印迹分析和免疫荧光染色研究了NF-κB、IκBα、total-ERK1/2和phospho-ERK1/2的表达，发现tFNA和Que抑制NF-κB的活化和向细胞核的传递，以及ERK磷酸化，而tFNA-Que复合物的抑制作用与两者相比显着增加(图7B、7C、7D、7E、7G)。此外，本发明证实了NF-κB抑制剂IκBα表达的变化。免疫印迹分析和免疫荧光染色结果表明，tFNA和Que可以略微阻止IκBα的降解，而tFNA-Que显着增加IκBα的表达(图7B、7C、7F)。总之，上述结果证实了tFNA-Que复合物是通过调节ERK/NF-κB途径来抑制LPS诱导的炎症。
试验例6、TFNA-Que在体外通调节Nrf2/HO-1途径降低LPS诱导的ROS
1、实验方法
(1)ROS水平检测测定
DCFH-DA检测试剂盒用于检测活性氧(ROS)的水平。将RAW264.7细胞接种在12孔板中(50000个细胞/孔)，用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que复合物(按照实施例3制备而得，tFNA：250nM，Que：20μM)预处理细胞2h，然后用LPS(1μg/mL)处理细胞24h，用PBS冲洗3次。然后将各组与DCFH-DA一起孵育20分钟。最后，通过显微镜捕获ROS的荧光图像。此外，定量的荧光强度检测可以通过流式细胞仪和热图获得。
(2)蛋白质印迹分析
将RAW264.7细胞接种在6孔板中(100000个细胞/孔)，用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que复合物(按照实施例3制备而得，tFNA：250nM，Que：20μM)预处理细胞2h，然后用LPS(1μg/mL)处理细胞24h，用PBS冲洗样品并用蛋白质提取试剂(KeyGen Biotech，南京，中国)处理以提取蛋白质。然后将纯化的样品与上样缓冲液(Beyotime，上海，中国)混合并在100℃加热10分钟。目标蛋白通过SDS-PAGE凝胶分离并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。之后，PVDF膜在室温下用封闭液(Beyotime，Shanghai，China)封闭20分钟，并与包括抗GAPDH一抗(1:1000；CST，美国波士顿)，抗Nrf2一抗(1:1000；剑桥，英国)，抗HO-1一抗(1:1000；CST，美国波士顿)在4℃下过夜。用TBST洗涤后，将膜与二抗(1:5000；Beyotime，上海，中国)一起孵育1小时。最后，通过化学发光检测系统(Bio-Rad，Hercules，USA)检测膜上的蛋白质条带。
(3)免疫荧光染色
为进一步观察蛋白表达，进行免疫荧光染色。将RAW264.7细胞接种在12孔板中(50000个细胞/孔)，用tFNA(250nM)、Que(20μM)、tFNA-Que复合物(按照实施例3制备而得，tFNA：250nM，Que：20μM)预处理细胞2h，然后用LPS(1μg/mL)处理细胞24h，将样品在冷的4％多聚甲醛中固定20分钟，随后用0.5％Triton X-100处理10分钟。然后，将样品在5％山羊血清中封闭1小时，并与目标一抗在4℃下孵育过夜。第二天冲洗3次后，将样品与二抗(1:500；Invitrogen，Carlsbad，USA)一起孵育1小时。然后，细胞核用DAPI染色，细胞骨架用鬼笔环肽染色。最后，使用共焦激光显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)观察所有样品。
2、实验结果
LPS刺激机体后会发生大量内源性活性氧(ROS)，这是由多种来源引起的，包括血小板和来自血管内皮的细胞，活化的炎症细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞。过多的氧化物会导致细胞损伤，这可能会成为打破免疫的稳态，导致败血症。因此，对过度氧化应激使用抗氧化疗法可能是一种治疗选择。为了检测对RAW264.7细胞的氧化损伤程度，本发明使用荧光显微镜测定了ROS的荧光强度。如图8A所示，巨噬细胞在LPS刺激下产生大量ROS。tFNA、Que或tFNA-Que复合物预处理2h后，tFNA和Que呈现一定的抗氧化作用，而tFNA-Que复合物显著降低ROS。流式细胞术也验证了类似的结果，与LPS组、tFNA组和Que组相比，tFNA-Que组中ROS荧光细胞的比例显著降低(图8B)。同时，本发明发现超氧化物歧化酶(SOD)和血红素加氧酶-1(HO-1)这两种清除ROS的蛋白质的表达也发生了变化(图8C、8D、8E、8F)。具体而言，通过western blot分析和免疫荧光染色检测，LPS组HO-1蛋白的表达受到抑制，而tFNA和Que可以略微缓解这种抑制作用，tFNA-Que组可以显着提高HO-1的表达(图8D、8E、8F)。在SOD中也检测到类似的趋势(图8C)。western blot分析证实Nrf2表达的趋势与HO-1和SOD相似，这表明tFNA、Que和tFNA-Que复合物的抗氧化性能可能与Nrf2的活化有关(图8D、8E)。
试验例7、tFNA-Que治疗对LPS诱导的体内全身炎症和多器官损伤的保护作用
1、实验方法
(1)动物模型的建立和治疗
体内实验选用C57BL/6J小鼠(8周龄，成都，中国)，动物实验获得四川大学伦理委员会的批准。将小鼠随机分为五组(每组6只)：对照组(正常小鼠)、LPS组、LPS-Que组、LPS-tFNA组和LPS-tFNA-Que组。用盐水、tFNA、Que或tFNA-Que复合物(按照实施例所述方法制备而得，制备时溶液中tFNA浓度为1μM，Que浓度为80μM)分别对小鼠进行腹腔内连续给药3天，每天给药1次，每次给药等体积盐水、tFNA、Que或tFNA-Que复合物溶液，tFNA浓度为1μM，Que浓度为80μM。然后LPS组、LPS-Que组、LPS-tFNA组和LPS-tFNA-Que组小鼠腹腔注射LPS 1次(5mg/kg)。最后，24小时后处死小鼠，取肺、肝、肾进行苏木精和伊红(H&E)染色，组织免疫荧光染色CD68或HO-1。收集血清和腹腔液以测量细胞因子的产生和BUN、CRE、ALT、AST的水平。
(2)细胞因子产生的测量
利用市售的ELISA试剂盒(MULTI SCIENCES，杭州，中国)在体外和体内测量TNF-α和IL-6的分泌。在LPS注射后24小后获得小鼠血清和腹膜液。用ELISA试剂盒所述处理细胞、血清和腹膜液的上清液。
2、实验结果
为了验证药物在体内的保护作用，将等体积的生理盐水、tFNA、Que或tFNA-Que复合物腹腔注射给C57BL/6J小鼠(8周龄)，持续3天。然后在第3天给小鼠腹腔注射LPS，建立脓毒症动物模型。最后，在24小时后收集器官、血清和腹膜液(图9A)。本发明发现LPS组血清中TNF-α、IL-6较对照组明显升高，提示动物模型建立成功。提前注射tFNA或Que后，炎症细胞因子水平下降，但作用非常有限。与上述各组相比，tFNA-Que组炎性细胞因子水平明显下降，这与体外实验结果一致(图9B)。大量炎性细胞聚集的腹膜液是衡量炎性细胞因子的关键指标。同样，tFNA-Que组在腹膜液中的抗炎作用在所有治疗组中也是最佳的(图9C)。上述结果表明tFNA-Que复合物可以有效缓解LPS引起的全身炎症，与单独使用tFNA或Que相比，tFNA-Que复合物抗炎发挥了协同增效作用。
然后，本发明在图9D中观察了腹腔注射后主要器官中Cy5标记的tFNA-Que复合物的分布。结果表明，Cy5-Labeled tFNA-Que复合物可以到达小鼠的多个器官，包括肝脏、肾脏、肺、脾脏，尤其是肝脏和肾脏。这些器官正是脓毒症的靶向损伤器官。而tFNA-Que复合物可以在肝脏、肾脏维持12-24小时，有利于tFNA-Que长期有效保护小鼠免受LPS引起的多器官损伤。之后进行组织学染色分析，观察炎性细胞因子对器官的损害。
如图9E所示，HE染色显示LPS处理引起肺泡壁增厚、急性出血和肺部炎症细胞浸润。与LPS组、tFNA组和Que组相比，tFNA-Que复合物对这些损伤有明显的抑制作用。此外，tFNA-Que复合物还可以减轻由全身炎症引起的肝脏和肾脏的严重损伤。更具体地说，与其他组相比，tFNA-Que复合物治疗的小鼠表现出较少的急性出血、细胞坏死和募集到肝脏血管的炎症细胞(图9F)；tFNA-Que复合物减轻肾脏急性出血、细胞坏死、炎性细胞浸润(图9G)。H&E染色的差异进一步支持了tFNA-Que复合物对多器官损伤的保护作用。
血清中BUN和CRE的水平被认为是反映肾脏功能的标志。同时，血清ALT、AST水平反映肝功能。血清中BUN、CRE、ALT、AST的定量分析如图10A-10D所示，LPS治疗组的BUN、CRE、ALT、AST水平显著升高，代表小鼠的肾脏和肝脏受到LPS的严重损害。然而，这些损伤可以通过tFNA、Que或tFNA-Que复合物治疗得到缓解，并且tFNA-Que组的这种效果最为显著。此外，免疫荧光染色检测肺中抗氧化蛋白HO-1的表达，其趋势也证明了tFNA-Que复合物可以增加HO-1的表达。该结果表明tFNA-Que复合物发挥了良好的抗氧化作用并防止了LPS对肺的损伤(图10E)。
脓毒症炎症期间的过量细胞因子包括TNF-α和IL-1β是单核细胞/巨噬细胞的关键化学引诱物。在激活细胞因子后，它们可以启动单核细胞/巨噬细胞的局部浸润，这是脓毒症初期的重要特征之一。本发明通过免疫荧光染色研究了特异性标志物CD68的表达，以观察肺、肝和肾中单核细胞/巨噬细胞的局部浸润。值得注意的是，与LPS组、tFNA组、Que组相比，tFNA-Que组在肝脏、肺和肾脏中局部单核细胞/巨噬细胞浸润明显减少(图10F)。总之，tFNA-Que复合物作为一种新型核酸纳米系统，通过调节巨噬细胞保护小鼠免受LPS诱导的全身炎症和多器官损伤，与单独使用tFNA或Que相比，tFNA-Que复合物抑制全身炎症和多器官损伤效果优异，发挥了协同增效作用。
综上，本发明的目的是制备一种DNA四面体-槲皮素(tFNA-Que)复合物，其以tFNA为载体进行槲皮素的协同递送。本发明tFNA-Que复合物具有合成简单、性能稳定、缓释、水溶性好、生物相容性好等特点；此外，本发明tFNA-Que复合物具有优异的抗炎和抗氧化作用，通过显著降低炎症水平和消除ROS，有效减弱了脓毒症的全身炎症和多器官损伤等并发症。本发明tFNA-Que复合物中tFNA和Que发挥了协同增效作用，能有效预防和/或治疗脓毒症及脓毒症的并发症，为脓毒症的免疫预防提供新策略，具有成为脓毒症新药的巨大潜力。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 一种DNA四面体-槲皮素复合物及其预防脓毒症的用途
<130> GYKH1118-2022P0115133CC
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atttatcacc cgccatagta gacgtatcac caggcagttg agacgaacat tcctaagtct 60
gaa 63
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acatgcgagg gtccaatacc gacgattaca gcttgctaca cgattcagac ttaggaatgt 60
tcg 63
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
actactatgg cgggtgataa aacgtgtagc aagctgtaat cgacgggaag agcatgccca 60
tcc 63
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acggtattgg accctcgcat gactcaactg cctggtgata cgaggatggg catgctcttc 60
ccg 63
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aggtcggtgt gaacggattt g 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgtagaccat gtagttgagg tca 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccctcacact cagatcatct tct 23
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gctacgacgt gggctacag 19
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tagtccttcc taccccaatt tcc 23
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<211> 21
<212> DNA
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ttggtcctta gccactcctt c 21
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 11
caaccacaca agtgatattc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ggatccacac tctccagctg 20

Claims (10)

1.一种用于抗炎和/或抗氧化的DNA四面体-槲皮素复合物，其特征在于：它是由DNA四面体框架核酸和槲皮素混合后形成的复合物；
所述DNA四面体框架核酸和槲皮素混合时，DNA四面体框架核酸和槲皮素的摩尔比为1:20～1:160；
所述DNA四面体框架核酸由四条DNA单链自组装合成；所述四条DNA单链的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、和SEQ IDNO.4所示。
2.根据权利要求1所述的DNA四面体-槲皮素复合物，其特征在于：所述DNA四面体框架核酸和槲皮素混合时，DNA四面体框架核酸和槲皮素的摩尔比为1:40～1:160。
3.根据权利要求2所述的DNA四面体-槲皮素复合物，其特征在于：所述DNA四面体框架核酸和槲皮素混合时，DNA四面体框架核酸和槲皮素的摩尔比为1:80。
4.根据权利要求1所述的DNA四面体-槲皮素复合物，其特征在于：所述DNA四面体框架核酸的合成方法包括以下步骤：将四条DNA单链加入到TM缓冲液中，95℃维持10min，快速降温到4℃维持20min以上，即得。
5.根据权利要求4所述的DNA四面体-槲皮素复合物，其特征在于：所述四条DNA单链为等摩尔比的四条DNA单链。
6.一种制备权利要求1～5任一项所述的DNA四面体-槲皮素复合物的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
将DNA四面体框架核酸和槲皮素加入溶剂中混合反应后超滤，即得。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于：所述溶剂为PBS、DMSO中的一种或多种；
和/或，所述反应的温度为20～30℃；
和/或，所述反应的时间为4～6h；
和/或，所述超滤使用30KDa分子量膜。
8.权利要求1～5任一项所述的DNA四面体-槲皮素复合物在制备抗炎和/或抗氧化的药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述药物为预防和/或治疗脓毒症和/或脓毒症并发症的药物；
所述脓毒症并发症为多器官损伤。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述多器官损伤为多器官衰竭或多器官功能障碍综合征。
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