CN115919816B

CN115919816B - 姜黄素-四面体框架核酸载药系统在制备预防或治疗放射性口腔黏膜炎的药物中的用途

Info

Publication number: CN115919816B
Application number: CN202211183683.XA
Authority: CN
Inventors: 林云锋; 张格铷; 蔡潇潇
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2022-09-27
Filing date: 2022-09-27
Publication date: 2024-04-09
Anticipated expiration: 2042-09-27
Also published as: CN115919816A

Abstract

本发明提供了姜黄素‑四面体框架核酸载药系统在制备预防或治疗放射性口腔黏膜炎的药物中的用途，属于医药领域。本发明将水溶性差的姜黄素搭载进入四面体框架核酸得到了一种姜黄素‑四面体框架核酸载药系统，该载药系统增强了姜黄素的水溶性，提高了姜黄素的穿膜能力和组织渗透性，具有更好的稳定性、生物利用度和药物缓释作用。本发明的载药系统可以减少放射后活性氧和炎症因子的产生，保护放射后DNA的损伤，延缓放射后细胞的衰老，增加放射后细胞的迁移能力。体内实验也验证了该载药系统能够明显减少放射后小鼠舌头的溃疡形成面积，明显减少炎症细胞浸润，能够有效预防和减缓放射性口腔黏膜炎的发生。

Description

姜黄素-四面体框架核酸载药系统在制备预防或治疗放射性口腔黏膜炎的药物中的用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及姜黄素-四面体框架核酸载药系统在制备预防和/或治疗放射性口腔黏膜炎的药物中的用途。

背景技术

放射性口腔黏膜炎，又称放射性口腔炎、放射性口咽炎，是一种因放射线电离辐射引起的口腔黏膜损伤。在鼻咽部恶性淋巴瘤、鼻咽癌、口腔肿瘤等放疗过程中，常会出现放射性损伤。由于黏膜上皮细胞对放射线比较敏感，所以放射性口腔黏膜炎是放疗过程中常见的并发症，也是导致患者放疗中断乃至治疗失败的原因。据统计，在头颈部恶性肿瘤常规放疗患者中，放射性口腔黏膜炎平均发生率为46.0％-78.1％。

研究表明，射线的直接作用、氧化应激、转录因子、促炎细胞因子、病原微生物均参与放射性口腔黏膜炎的发病过程，其病理过程可分为起始、上调、放大、溃疡和愈合5个阶段。这5个阶段是相互重叠、相互影响的连续过程。最开始，放射线电离辐射会引起活性氧(ROS)的释放，同时造成DNA损伤，如DNA链断裂。作为一个直接的结果，受伤的细胞会释放出内源性损伤相关模式分子(DAMP)，这些分子一旦与相应的受体结合，就会被认为是炎症信号级联的快速启动器。炎症因子的激活和出现会引起进一步的细胞损伤，同时也会放大辐射引起的原始毒性，导致细胞死亡、上皮完整性丧失和溃疡发展。最后，上皮的愈合和修复是通过细胞外基质和抗炎因子介导的。值得注意的是，在疾病发展过程中，NF-KB途径始终被激活，以确保炎症因子(如TNF-a、IL-6和IL-1β)的转录和表达。同时，这些炎症细胞因子的持续存在促进了粘膜的不完整性，加速了口腔粘膜炎的演变。

放射性口腔黏膜炎的特点是表皮和粘膜上皮细胞的完全破坏，以及继发感染。口腔粘膜上皮完整性的丧失使大量的神经末梢暴露在外，造成进食和咀嚼的疼痛，这迫使病人只能食用液体食物或通过鼻饲管完成营养摄入。口腔内固有的微生物菌落稳定性被辐射严重破坏，加上唾液腺分泌受损，使病原微生物在口腔内定植并引起继发感染，加剧了上皮完整性丧失的不良结果，使溃疡愈合更加困难。与无法吞咽相关的营养不良、局部疼痛和缺乏有效管理导致的感染，会增加肿瘤治疗的成本和风险，给患者带来巨大的身体痛苦和经济负担，降低患者的依从性，导致他们中断放疗计划。放射性口腔黏膜炎直接影响着患者的生活质量和生存期，寻求安全有效的药物预防或治疗放射性口腔黏膜炎具有重要意义。

目前，西医对急性放射性口腔黏膜炎的预防和治疗尚无特效药物，多采用大剂量维生素、高蛋白营养和补液、抗炎等治疗，并同时给于口腔清洁、利多卡因局部麻醉、西瓜霜局部喷涂或维斯克局部喷雾等，但疗效多不令人满意。姜黄素(Curcumin，简称Cur)是一种天然多酚化合物，可以从姜黄的根茎中提取。研究表明，姜黄素具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗肿瘤等特性。此外，姜黄素具有优越的生物安全性。研究还发现(中华放射医学与防护杂志，2013年6月，第33卷第3期)姜黄素具有一定的辐射保护作用，它对电离辐射所致的辐射损伤显现出一定的预防和治疗效果。但是，一方面，放射性口腔黏膜炎是一种因放射线电离辐射引起的口腔黏膜损伤，目前还未见姜黄素能够预防和治疗放射性口腔黏膜炎的报道；另一方面，姜黄素的水溶性很低(11ng/mL，25℃)，稳定性较差，在体内的吸收率差、生物利用率低，限制了其临床应用。为了解决上述问题，亟需开发出一种具有更好的稳定性和生物利用度的能够有效预防和治疗放射性口腔黏膜炎的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供姜黄素-四面体框架核酸载药系统在制备预防和/或治疗放射性口腔黏膜炎的药物中的用途。

本发明提供了姜黄素-四面体框架核酸载药系统在制备预防和/或治疗放射性口腔黏膜炎的药物中的用途，所述姜黄素-四面体框架核酸载药系统是以姜黄素和四面体框架核酸为原料制备得到的，其中，四面体框架核酸和姜黄素的摩尔比为1：(100-800)。

进一步地，所述放射性口腔黏膜炎为放射治疗引起的口腔黏膜损伤。

进一步地，所述药物是减少放射治疗后舌头溃疡面积的药物。

进一步地，所述药物是减少放射治疗后活性氧产生的药物，减少放射治疗后炎症因子产生的药物，减少放射治疗后炎症细胞浸润的药物，减少放射治疗后DNA损伤的药物，延缓放射治疗后细胞衰老的药物，和/或增加放射治疗后细胞迁移能力的药物。

进一步地，所述四面体框架核酸和姜黄素的摩尔比为1：200。

进一步地，所述四面体框架核酸由四条DNA单链通过碱基互补配对形成，所述四条DNA单链的序列如SEQ ID NO.1～4所示。

进一步地，所述四面体框架核酸的制备方法包括以下步骤：将四条DNA单链于85～105℃下维持5-15min，然后于2～8℃下维持10-30min。

进一步地，所述四面体框架核酸的制备方法包括以下步骤：将四条DNA单链于95℃下维持10min，然后于4℃下维持20min。

进一步地，所述药物为注射制剂。

本发明将水溶性差的姜黄素搭载进入四面体框架核酸得到了一种姜黄素-四面体框架核酸载药系统，该载药系统增强了姜黄素的水溶性，提高了姜黄素的穿膜能力和组织渗透性，具有更好的稳定性、生物利用度和药物缓释作用。

本发明的载药系统可以对放射后的细胞行为进行调控，可以减少放射后活性氧和炎症因子的产生，保护放射后DNA的损伤，延缓放射后细胞的衰老，增加放射后细胞的迁移能力，具有优良的放射防护作用。体内实验也验证了本发明的载药系统能够明显减少放射后小鼠舌头的溃疡形成面积，明显减少炎症细胞浸润，说明本发明的姜黄素-四面体框架核酸载药系统能够有效预防和减缓放射性口腔黏膜炎的发生。

本发明的载药系统仅使用小分子姜黄素和核酸作为原料，合成成本低，生物安全性高，体内以及体外实验已经证明了该载药系统的药理作用，为放射性口腔黏膜炎的预防和治疗提供了切实可行的解决方案。

本发明首次将核酸作为小分子药物载体用于放射防护的研究，拓宽了放射防护领域的研究，为放射防护提供了新的思路。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：四面体框架核酸的表征。a为透射电镜，b为电位，c为粒径。

图2：四面体框架核酸的PAGE胶图。

图3：释放活性氧的调控作用实验中的ROS检测结果。

图4：释放活性氧的调控作用实验中的WB检测结果。

图5：释放活性氧的调控作用实验中的免疫荧光检测结果。

图6：释放炎症因子的调控作用实验中的qpcr检测结果。

图7：释放炎症因子的调控作用实验中的炎症因子免疫荧光检测结果。

图8：释放炎症因子的调控作用实验中的炎症WB结果。

图9：DNA损伤WB结果。

图10：小鼠舌体溃疡结果，图中No IR表示未经放射处理，S-IR表示单次大剂量放射处理，F-IR表示多次小剂量放射处理。

图11：小鼠舌体组织HE切片。

图12：小鼠舌体组织免疫组化切片结果以及统计。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

姜黄素(Curcumin，简称Cur)为市售产品，纯度＞98％。

实施例1：制备姜黄素-四面体框架核酸载药系统：Cur-TFNAs

1.制备四面体框架核酸

将四条DNA单链(S1、S2、S3、S4)按照等摩尔比加入到TM缓冲液(10mM Tris-HCl,50mM MgCl₂,pH 8.0)中，四条DNA单链的终浓度为1μM，将反应液加热到95℃维持10min，然后迅速降温至4℃维持20min，得到四面体框架核酸，命名为TFNAs。

四面体框架核酸的表征如图1和图2所示。

表1.四条DNA单链的序列

2.制备姜黄素-四面体框架核酸载药系统

将姜黄素溶解在细胞培养级DMSO中，得到浓度为40μM的姜黄素溶液，将姜黄素溶液加入浓度为200nM的TFNAs溶液中，在室温下摇晃6小时，随后用截留分子量为30kDa的超滤离心管离心，除去残留的游离的姜黄素，得到姜黄素-四面体框架核酸载药系统，简称为Cur-TFNAs。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1：姜黄素-四面体框架核酸载药系统的筛选实验

1.实验方法

参照实施例1的制备方法，区别仅在于改变Cur与TFNAs之间的摩尔比例(控制TFNAs溶液的浓度为200nM，根据表2比例改变姜黄素溶液的浓度)，得到不同的姜黄素-四面体框架核酸载药系统。

分别测试上述姜黄素-四面体框架核酸载药系统的包封率。包封率测试方法如下：制备方法中，用截留分子量为30kDa的超滤离心管离心后，姜黄素-四面体框架核酸载药系统留存于内液，游离的姜黄素留存于外液，通过定量测试内、外液紫外吸光度计算包封率，计算公式如下：包封率＝(总Cur-游离Cur)/总Cur×100％。

2.实验结果

表2.不同Cur与TFNAs摩尔比例下所得姜黄素-四面体框架核酸载药系统的包封率和载药量

编号	TFNAs：Cur	包封率
			1	1：200	92.1％
2	1：400	82.7％
			3	1：600	65.9％
4	1：800	52.6％

可以看出，当控制TFNAs：Cur＝1：200时，所得姜黄素-四面体框架核酸载药系统的包封率最高。因此，本发明在制备姜黄素-四面体框架核酸载药系统时，TFNAs与Cur之间的优选摩尔比为1：200。

实验例2：姜黄素-四面体框架核酸载药系统对放射后人口腔粘膜角质形成细胞生物学行为的影响

1.释放活性氧的调控作用探究

(1.1)实验方法

分组：1—空白组，2—放射组，3—放射+Cur组(其中Cur处理浓度为10uM)，4—放射+TFNAs组(其中TFNAs处理浓度为50nM)，5—放射+Cur-TFNAs组(其中Cur-TFNAs中的TFNAs与Cur的处理浓度之比为1:200，Cur-TFNAs是参照实施例1的方法由10uM Cur溶液与50nMTFNAs溶液制备得到的)。

使用药物预先处理人口腔粘膜角质形成细胞，通过ROS检测试剂盒，检测放射后活性氧产量之间的差异，使用流式细胞术对这一结果进行定量的统计，同时使用免疫荧光技术和Western blot技术检测活性氧调节相关通路蛋白的表达情况。具体操作如下：

ROS检测试剂盒(ROS,Beyotime,中国)用于检测ROS水平。细胞与DCF-DA探针(1:1000)共同培养30分钟。使用荧光显微镜对反应孔板中DCF探针的荧光强度进行拍照。此外，用同样的处理方法将HOK细胞接种到96孔板中，并在488纳米处测量DCF的荧光水平。

使用免疫荧光染色评估目标蛋白的表达水平。细胞在冷冻多聚甲醛中固定15分钟，洗净后用0.5％Triton X-100处理10分钟，然后用5％羊血清直接处理2小时。将处理过的细胞与一抗在4℃下孵育12小时，然后用适当的二抗染色并清洗。用鬼笔环肽对细胞骨架进行20分钟的染色，用DAPI对细胞核进行10分钟的染色。通过共聚焦激光显微镜获得图像。

通过蛋白印迹法对细胞中含有的Nrf2、SOD2、HO-1的水平进行量化。提取HOK细胞的总蛋白。然后，测定蛋白质浓度，将蛋白质加入到加载缓冲液混合物中并煮沸。目标蛋白通过8-15％的SDS-PAGE分离。目标蛋白的条带被转移到PVDF膜上并封闭。在PVDF膜上浸润初级抗体并在4℃下孵育。12小时后，用TBST冲洗PVDF膜，用第二抗体浸润处理过的PVDF膜0.5小时，用TBST冲洗。最后，用凝胶和印迹成像系统(Syngene,Bangalore,India)进行曝光。

(1.2)实验结果

实验结果如图3-图5所示，结果表明姜黄素-四面体框架核酸载药系统可以明显的激活细胞内抗氧化通路，抵抗放射后细胞内活性氧的产生。

2.释放炎症因子的调控作用探究

(2.1)实验方法

使用药物预先处理人口腔粘膜角质形成细胞，使用qPCR技术检测放射后各种细胞内炎症相关因子的表达情况，使用免疫荧光技术和Western blot技术检测炎症相关通路蛋白的表达情况。具体操作如下：

通过qPCR测定IL-6、IL-1β、TFN-α、TGF-β的基因表达。使用TRIzol(Thermo FisherScientific,MA)从目标HOK细胞中提取细胞内总RNA。然后，经过纯化和反转录，RNA被反转录成cDNA。然后使用Prime Script RT-PCR试剂盒(TaKaRa,Tokyo,Japan)按照说明书中规定的程序进行qPCR过程。

通过蛋白印迹法对细胞中含有的NF-KB、p-NF-KB、IKB-α、IL-1β、IL-6水平进行量化。提取HOK细胞的总蛋白。然后，测定蛋白质浓度，将蛋白质加入到加载缓冲液混合物中并煮沸。目标蛋白通过8-15％的SDS-PAGE分离。目标蛋白的条带被转移到PVDF膜上并封闭。在PVDF膜上浸润初级抗体并在4℃下孵育。12小时后，用TBST冲洗PVDF膜，用第二抗体浸润处理过的PVDF膜0.5小时，用TBST冲洗。最后，用凝胶和印迹成像系统(Syngene,Bangalore,India)进行曝光。

(2.2)实验结果

结果如图6-图8所示，结果表明姜黄素-四面体框架核酸载药系统处理后细胞内炎症因子相关mRNA含量明显降低，细胞内炎症因子相关mRNA含量明显降低可以明显抑制放射后细胞内炎症通路的激活。

3.对放疗后DNA修复作用的调控探究，对维持细胞的增殖能力，延缓放疗后的细胞衰老的研究

(3.1)实验方法

使用药物预先处理人口腔粘膜角质形成细胞，然后进行放射处理，使用DNA损伤标志物标示细胞核内DNA损伤，使用Western blot技术检测衰老相关蛋白的表达情况。具体操作如下：

通过蛋白印迹法对细胞中含有的P16、Cyclin D1和γH2AX的水平进行量化。提取HOK细胞的总蛋白。然后，测定蛋白质浓度，将蛋白质加入到加载缓冲液混合物中并煮沸。目标蛋白通过8-15％的SDS-PAGE分离。目标蛋白的条带被转移到PVDF膜上并封闭。在PVDF膜上浸润初级抗体并在4℃下孵育。12小时后，用TBST冲洗PVDF膜，用第二抗体浸润处理过的PVDF膜0.5小时，用TBST冲洗。最后，用凝胶和印迹成像系统(Syngene,Bangalore,India)进行曝光。

(3.2)实验结果

结果如图9所示，结果表明，姜黄素-四面体框架核酸载药系统处理过的细胞DNA损伤的数量明显减少，且损伤恢复的时间明显缩短。结果还发现，与姜黄素-四面体框架核酸载药系统处理过的细胞相比，未经姜黄素-四面体框架核酸载药系统处理的细胞在放射后衰老相关蛋白表达更多，且细胞迁移能力明显下降。上述结果表明，本发明的姜黄素-四面体框架核酸载药系统可以减少放射后活性氧和炎症因子的产生，保护放射后DNA的损伤，延缓放射后细胞的衰老，增加放射后细胞的迁移能力，具有优良的放射防护作用。

实验例3：体内实验

1.实验方法

(1)动物实验：Balb/c小鼠雄性，6-8周

(2)本次造模的方法分为单次放射研究药物对射线的抵抗作用，分次放射研究药物是否提高口腔粘膜对射线的耐受程度。

a)在单次辐照条件下共使用了25只小鼠，空白组(1组)、对照组(2组)、Cur组(3组)、TFNAs组(4组)和Cur-TFNAs组(5组)，每组5只小鼠。从辐照前3天(-3天)到样品采集，Cur组、TFNAs组和Cur-TFNAs组分别通过尾静脉注射150μl Cur(浓度40μM)、TFNAs(浓度200nM)、Cur-TFNAs(按照实施例1的方法由40uM Cur溶液与200nM TFNAs溶液制备得到的)进行处理，对照组则等量的生理盐水处理，空白组不处理。放射治疗当天，小鼠接受了一次28Gy的辐照，仅限于从下眼眶到鼻尖的区域。在第8天，小鼠被人道地处死，收获整个舌头。

b)在分次照射条件下共使用了36只小鼠，对照组、Cur组和Cur-TFNAs组，每组12只小鼠。从第3天到第4天，从第7天到第11天，Cur组和Cur-TFNAs组分别通过尾静脉注射150μlCur(浓度40μM)和Cur-TFNAs(按照实施例1的方法由40uM Cur溶液与200nM TFNAs溶液制备得到的)处理，对照组注射等量的生理盐水。这些小鼠被多次照射，仅限于从眶下到鼻尖的区域，每天3Gy，共10次，最后再照射12Gy，之此之后在第8天对小鼠进行人道处决，收获整个舌头。

(3)收获的小鼠的舌头用1％甲苯胺蓝(TB)染色，用醋酸洗去多余的染色，观察溃疡形成的面积。

(4)记录造模期间小鼠的体重变化、进食量变化、活动范围和活动频率的变化。

(5)HE染色观察小鼠舌体组织细胞层数，上皮细胞厚度、炎症细胞浸润等改变、免疫组织化学染色观察目标蛋白表达量的改变。

2.实验结果

结果如图10-12所示，结果表明，姜黄素-四面体框架核酸载药系统处理能够明显减少放射后小鼠舌头的溃疡形成面积，明显减少炎症细胞浸润，说明姜黄素-四面体框架核酸载药系统处理能够有效预防和减缓放射性口腔黏膜炎的发生。

综上，本发明提供了姜黄素-四面体框架核酸载药系统在制备预防和/或治疗放射性口腔黏膜炎的药物中的用途。本发明将水溶性差的姜黄素搭载进入四面体框架核酸得到了一种姜黄素-四面体框架核酸载药系统，该载药系统增强了姜黄素的水溶性，提高了姜黄素的穿膜能力和组织渗透性，具有更好的稳定性、生物利用度和药物缓释作用。本发明的载药系统可以减少放射后活性氧和炎症因子的产生，保护放射后DNA的损伤，延缓放射后细胞的衰老，增加放射后细胞的迁移能力。体内实验也验证了该载药系统能够明显减少放射后小鼠舌头的溃疡形成面积，明显减少炎症细胞浸润，能够有效预防和减缓放射性口腔黏膜炎的发生。

Claims

1.姜黄素-四面体框架核酸载药系统在制备预防和/或治疗放射性口腔黏膜炎的药物中的用途，所述姜黄素-四面体框架核酸载药系统是以姜黄素和四面体框架核酸为原料制备得到的，其中，四面体框架核酸和姜黄素的摩尔比为1：（100-800），所述四面体框架核酸由四条DNA单链通过碱基互补配对形成，所述四条DNA单链的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述放射性口腔黏膜炎为放射治疗引起的口腔黏膜损伤。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物是减少放射治疗后舌头溃疡面积的药物。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述四面体框架核酸和姜黄素的摩尔比为1：200。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述四面体框架核酸的制备方法包括以下步骤：将四条DNA单链于85~105℃下维持5-15min，然后于2～8℃下维持10-30min。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述四面体框架核酸的制备方法包括以下步骤：将四条DNA单链于95℃下维持10min，然后于4℃下维持20min。

7.根据权利要求1-5任一项所述的用途，其特征在于：所述药物为注射制剂。