CN114569628A - Dna四面体框架纳米核酸在美容中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了DNA四面体框架纳米核酸在美容中的用途，涉及美容护肤技术领域。本发明研究发现tFNAs能够有效抑制皮肤纤维化，改善皮肤硬皮病症状，有望将tFNAs应用于制备预防和/或治疗皮肤硬皮病的药物。进一步地，由于tFNAs能够改善皮肤症状，可以将tFNAs应用于美容中，具有抗皱、紧致嫩肤、美白等作用。此外，tFNAs也是一种药物载体，可包载其他治疗皮肤疾病或美容的药物，增强效果。因此，tFNAs具有良好的应用前景。

Description

DNA四面体框架纳米核酸在美容中的用途

技术领域

本发明涉及美容护肤技术领域，具体涉及DNA四面体框架纳米核酸在美容中的用途。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，作为抵御各种内源性和外源性感染因子和损伤的第一道防线，起着至关重要的作用。同时皮肤状态与容貌也息息相关，因此皮肤状态受到人们广泛关注。不良事件影响皮肤稳态，使皮肤容易受到多种刺激和毒素的影响。当皮肤损伤的强度或持续时间超过组织修复的能力时，由组织修复反应失调引起的皮肤纤维化开始主导修复过程。皮肤组织修复反应的异质性可能导致疤痕形成，这是病理性结缔性皮肤组织修复的结果，可以在肥厚性疤痕和瘢痕疙瘩中观察到，而硬皮病或硬斑病则出现在有限或弥漫类型的系统性硬化症中。

皮肤纤维化不仅影响美观，并且会使皮肤失去弹性、丧失活性，出现许多不适症状，严重影响工作和生活。目前肥厚性疤痕和瘢痕疙瘩的治疗方法，例如局部注射皮质类固醇、手术翻修、冷冻疗法、放射治疗、甚至使用内含洋葱提取物的硅胶，均不能从根本上治疗，容易复发，必须反复进行。对于硬皮病，没有普遍接受的治疗方法，可使用类固醇激素、甲氨蝶呤注射，但副作用大。可见现有治疗方法均无法达到理想疗效。研究一种对于皮肤纤维化，特别是对于硬皮病治疗效果优异的材料，在皮肤美容上有优异的应用前景。

近年来开发了各种新型核酸材料，如纳米级材料四面体框架核酸(tFNAs)，已广泛应用于各个领域。tFNAs可以作为抗炎和抗氧化剂，促进皮肤伤口愈合。由于其独特而稳定的三维空间结构，tFNAs可渗透到各种细胞中，无需载体即可入胞发挥特定功能。鉴于其出色的生物安全性和生物相容性，tFNAs在疾病治疗方面显示出巨大的潜力。专利CN112587544A公开了DNA四面体框架核酸有望用于治疗肺部纤维化疾病，该专利在体外肺上皮细胞中验证了其抗纤维化作用。但是肺纤维化的发病机理多与感染相关，而皮肤纤维化发病机理包括机械刺激、自身免疫疾病(如系统性硬化症、硬皮病)等，因此无法知晓DNA四面体框架核酸对皮肤纤维化有抑制作用。目前尚未见DNA四面体框架核酸应用于皮肤纤维化，特别是硬皮症，以及用于抗皱、紧致嫩肤、美白等美容疗法的报道。

发明内容

本发明的目的是提供DNA四面体框架纳米核酸在美容中的用途。

本发明提供了DNA四面体框架纳米核酸在美容中的用途。

进一步地，所述DNA四面体框架纳米核酸在制备预防和/或治疗皮肤纤维化疾病的药物中的用途。

进一步地，所述DNA四面体框架纳米核酸在制备预防和/或治疗硬皮症的药物中的用途。

进一步地，所述硬皮症为皮肤硬皮症。

进一步地，所述DNA四面体框架纳米核酸是由序列如SEQ ID NO.1～4所述的单链DNA分子经过碱基互补配对形成的。

进一步地，所述DNA四面体框架纳米核酸合成方法包括以下步骤：将四条序列如SEQ ID NO.1～4所述的单链DNA分子加入到TM缓冲液中，95℃维持10min，快速降温到4℃维持20min以上，即得。

进一步地，所述四条单链DNA分子为等摩尔比的四条单链DNA分子。

本发明还提供了一种用于美容的药物，所述药物以DNA四面体框架纳米核酸为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。

进一步地，所述药物为预防和/或治疗皮肤纤维化疾病的药物；

优选地，所述药物为预防和/或治疗硬皮症的药物中的用途；

更优选地，所述硬皮症为皮肤硬皮症。

进一步地，所述DNA四面体框架纳米核酸是由序列如SEQ ID NO.1～4所述的单链DNA分子经过碱基互补配对形成的；

优选地，所述DNA四面体框架纳米核酸合成方法包括以下步骤：将四条序列如SEQID NO.1～4所述的单链DNA分子加入到TM缓冲液中，95℃维持10min，快速降温到4℃维持20min以上，即得；

更优选地，所述四条单链DNA分子为等摩尔比的四条单链DNA分子。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)本发明DNA四面体框架纳米核酸是由4条DNA单链通过碱基互补配对形成的四面体结构，生物安全性好，副作用小，稳定性强，入胞效率高；

(2)本发明DNA四面体框架纳米核酸不仅自身可用于皮肤硬皮病的治疗，还可作为载体搭载多种药物(microRNA、siRNA、寡核苷酸片段、多肽、中成药等)进入细胞发挥作用，增加治疗效果；

(3)本发明DNA四面体框架纳米核酸可以抑制TGF-β和博来霉素导致的皮肤纤维化，治疗皮肤硬皮病；

(4)本发明DNA四面体框架纳米核酸可以用于美容，具有抗皱、紧致嫩肤、美白等。

综上，本发明研究发现tFNAs能够有效抑制皮肤纤维化，改善皮肤硬皮病症状，有望将tFNAs应用于制备预防和/或治疗皮肤硬皮病的药物。进一步地，由于tFNAs能够改善皮肤症状，可以将tFNAs应用于美容中，具有抗皱、紧致嫩肤、美白等作用。此外，tFNAs也是一种药物载体，可包载其他治疗皮肤疾病或美容的药物，增强效果。因此，tFNAs具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为DNA四面体框架纳米核酸的合成和入胞检测结果：a为DNA四面体框架纳米核酸(tFNAs)的合成过程；b为tFNAs的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；c为tFNAs的射电子显微镜(TEM)和原子力显微镜(AFM)结果；d为tFNAs的粒径和zeta电位结果；e为tFNAs的入胞检测结果。

图2为tFNAs治疗硬皮病的体内实验结果：a为博来霉素造模及tFNAs注射流程图；b为给药后14天、21天皮肤组织的马松染色结果；c为马松染色结果所示皮肤厚度的数据分析；d为给药后21天皮肤组织中TGF-β免疫组化染色；e为TGF-β免疫组化染色数据分析；f为给药后21天皮肤组织中α-SMA免疫组化染色；g为α-SMA免疫组化染色数据分析。

具体实施方式

除另有说明外，本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

具体实施方式中选择HaCaT细胞作为皮肤上皮细胞的代表，选择Balb/c小鼠作为动物模型实验代表，来探究DNA四面体框架纳米核酸在美容中的作用。

实施例1、DNA四面体框架纳米核酸的合成及鉴定

1、DNA四面体框架纳米核酸的合成

将四条DNA单链(S1、S2、S3、S4)按照等摩尔比溶解于TM Buffer(10mM Tris-HCl,50mM MgCl₂,pH＝8.0)中，四条DNA单链的终浓度分别为1000nM，充分混合，迅速加热至95℃保持10分钟，之后迅速降温至4℃并维持20分钟以上，在上述温度调控下，四条单链根据碱基互补配对原则在体系内进行自组装过程，即可得到DNA四面体框架纳米核酸(tFNAs)。tFNAs的合成过程如图1a所示。四条单链的序列(5′→3′)如下：

S1：

ATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAA(SEQID NO.1)

S2：

ACATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCG(SEQID NO.2)

S3：

ACTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCC(SEQID NO.3)

S4：

ACGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGAGGATGGGCATGCTCTTCCCG(SEQID NO.4)

2、DNA四面体框架纳米核酸的鉴定

合成后的DNA四面体框架纳米核酸进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳表征，电泳结果如图1b所示，电泳可见第二泳道为S1，第三泳道为S2，第三泳道为S3，第四泳道为S4，第五泳道为S1+S2，第六泳道为S1+S2+S3，第七泳道为tFNAs。通过PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)结果显示tFNAs条带较为单一，表示tFNAs产物较为纯净。为了进一步证明四面体纳米结构的成功合成，通过透射电子显微镜(TEM)和原子力显微镜(AFM)观察产物形态(图1c)，镜下可见直径约20nm的颗粒，其中较大的为tFNAs多聚体。图1d为tFNAs的粒径和zeta电位结果。上述结果显示tFNAs成功合成。

3、DNA四面体框架纳米核酸的入胞性能验证

本实验利用荧光示踪技术对tFNAs进入细胞的性能进行检测，验证其良好的入胞性能。

将Cy5荧光物质挂于S1链上(ssDNAs)，按照上述DNA四面体框架纳米核酸的合成方法合成Cy5-tFNAs，HaCaT细胞在10％胎牛血清DMEM培养基中培养贴壁24小时后，将培养基更换为含Cy5-TFNAs终浓度分别为125nM和250nM的培养基，在培养3，6，9，12h后对细胞摄取进行免疫荧光技术检测Cy5-tFNAs的入胞情况。具体方法如下：

(a)在共聚焦小皿中接种HaCaT细胞悬液，先在孵箱预培养24小时(37℃，5％CO₂)。

(b)更换培养基为含浓度分别为125nM和250nM的Cy5-tFNAs的培养基，于孵箱分别培养3、6、9、12小时(37℃，5％CO₂)。

(c)每个时间点吸去培养基，用PBS清洗三次，每次5分钟；然后用4wt％的多聚甲醛固定25分钟，吸去多聚甲醛，用PBS清洗三次，每次5分钟；再用鬼笔环肽(FITC标记)处理，避光10～30分钟，吸去鬼笔环肽，用PBS清洗三次，每次5分钟，共聚焦显微镜检测。

结果：如图1e所示，HaCaT细胞对tFNAs摄取较多，tFNAs入胞后主要分布在胞浆内。实验结果说明本发明DNA四面体框架纳米核酸的入胞性能良好。

实施例2、DNA四面体框架纳米核酸治疗皮肤硬皮病的研究

将60只体重18-22g的6-8周龄雄性Balb/c小鼠随机分为四组(空白对照组(Ctrl)、模型组(B)、125nM剂量治疗组(B+125nM T)和250nM剂量治疗组(B+250nM T))，并保持在具有12h/12h光/暗循环的环境中。在最初的7天适应性饲养后，使用永久性记号笔在上背皮肤上2cm×2cm剃毛区域中心标记1cm×1cm的正方形。将盐酸博来霉素溶解在PBS中(浓度为0.5mg/mL)，治疗组和模型组中的每只小鼠均注射博来霉素溶液(100μl/次)，隔日一次注射在小鼠背部，共注射21天，制造硬皮病模型，空白对照组小鼠注射等量PBS溶液；完成后接下来的21天，两个治疗组小鼠每隔一天分别注射100μl浓度为125nM和250nM的tFNAs溶液(PBS稀释)，模型组和空白对照组小鼠注射等量PBS溶液，在注射tFNAs的第14天和第21天分别处死小鼠，对收获的皮肤和内脏进行尸检。随后进行Masson染色(马松染色)，α-SMA和TGF-β的免疫组化染色。图2a为博来霉素造模及tFNAs注射流程图。

结果及结论：

如图2b和2c所示，与模型组相比，注射tFNAs后硬皮病小鼠的皮肤厚度有所减小；同时研究发现注射tFNAs后α-SMA和TGF-β含量显著减少(图2d～2g)，标志性蛋白含量减少，表明tFNAs能够有效抑制皮肤纤维化，改善皮肤硬皮病症状，可用于治疗皮肤硬皮病。

综上，本发明研究发现tFNAs能够有效抑制皮肤纤维化，改善皮肤硬皮病症状，有望将tFNAs应用于制备预防和/或治疗皮肤硬皮病的药物。进一步地，由于tFNAs能够改善皮肤症状，可以将tFNAs应用于美容中，具有抗皱、紧致嫩肤、美白等作用。此外，tFNAs也是一种药物载体，可包载其他治疗皮肤疾病或美容的药物，增强效果。因此，tFNAs具有良好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> DNA四面体框架纳米核酸在美容中的用途

<130> GYKH1118-2022P0114746CC

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atttatcacc cgccatagta gacgtatcac caggcagttg agacgaacat tcctaagtct 60

gaa 63

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acatgcgagg gtccaatacc gacgattaca gcttgctaca cgattcagac ttaggaatgt 60

tcg 63

<210> 3

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

actactatgg cgggtgataa aacgtgtagc aagctgtaat cgacgggaag agcatgccca 60

tcc 63

<210> 4

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acggtattgg accctcgcat gactcaactg cctggtgata cgaggatggg catgctcttc 60

ccg 63

Claims (10)

1.DNA四面体框架纳米核酸在美容中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述DNA四面体框架纳米核酸在制备预防和/或治疗皮肤纤维化疾病的药物中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述DNA四面体框架纳米核酸在制备预防和/或治疗硬皮症的药物中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述硬皮症为皮肤硬皮症。

5.根据权利要求1～4任一项所述的用途，其特征在于：所述DNA四面体框架纳米核酸是由序列如SEQ ID NO.1～4所述的单链DNA分子经过碱基互补配对形成的。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述DNA四面体框架纳米核酸合成方法包括以下步骤：将四条序列如SEQ ID NO.1～4所述的单链DNA分子加入到TM缓冲液中，95℃维持10min，快速降温到4℃维持20min以上，即得。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述四条单链DNA分子为等摩尔比的四条单链DNA分子。

8.一种用于美容的药物，其特征在于：所述药物以DNA四面体框架纳米核酸为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。

9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于：所述药物为预防和/或治疗皮肤纤维化疾病的药物；

优选地，所述药物为预防和/或治疗硬皮症的药物中的用途；

更优选地，所述硬皮症为皮肤硬皮症。

10.根据权利要求8所述的药物，其特征在于：所述DNA四面体框架纳米核酸是由序列如SEQ ID NO.1～4所述的单链DNA分子经过碱基互补配对形成的；

优选地，所述DNA四面体框架纳米核酸合成方法包括以下步骤：将四条序列如SEQ IDNO.1～4所述的单链DNA分子加入到TM缓冲液中，95℃维持10min，快速降温到4℃维持20min以上，即得；

更优选地，所述四条单链DNA分子为等摩尔比的四条单链DNA分子。

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