CN112933037A - 一种抗增生性瘢痕外用药物制剂 - Google Patents

一种抗增生性瘢痕外用药物制剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗增生性瘢痕外用药物制剂，包括药物、药物载体和辅料，所述药物载体为仿病毒破膜磷脂，磷脂的亲水头部通过酰胺键或酯键连接不同代数的多精氨酸树状多肽分子。所述药物载体制成的载药可变形脂质体具有丰富的胍基结构，易于透过皮肤表皮，被细胞摄取，具有强大的破坏细胞膜的功能。最后将药物载体包裹于凝胶内形成原位递送系统，形成具有持续的药物递送能力、超强的瘢痕组织渗透能力及破坏瘢痕成纤维细胞消除增生组织的多效一体外用制剂。

Description

一种抗增生性瘢痕外用药物制剂
技术领域
本发明属于药物制剂领域，涉及一种仿病毒破膜型外用药物制剂，适用于增生性瘢痕等皮肤病的防治。
背景技术
当皮肤受到损伤(如烧伤，手术创伤)时，皮肤拥有快速愈合功能，最终以在受伤区域形成瘢痕结束。伤口愈合一般经历三个阶段：炎症期、增殖期和重塑期。干扰伤口愈合的任一过程都会导致细胞外基质沉积和降解的平衡被破坏，而增生性瘢痕(HS)就是真皮组织过度增生的结果。它的特点是真皮组织增生，持续性皮肤炎症和纤维化，瘢痕成纤维细胞过度活跃，不规则胶原蛋白沉积。这主要是增殖期活化的成纤维细胞-肌成纤维细胞的功能，它是一种特殊的收缩细胞，会过度产生胶原、蛋白多糖和纤维连接蛋白。外观上则表现为隆起的，发炎和发红，通常会导致疼痛、瘙痒和皮肤收紧，组织坚硬而致密。目前HS的常规治疗主要分为非侵入性方法(如局部用硅胶片和加压敷料)、侵入性方法(如手术切除和激光切除)及药物治疗。但是这些治疗方法都有着各种不良反应，在临床上治疗效果仍然不能令人满意，比如手术后复发率高、压力治疗效果低、放射治疗风险大、激光治疗的愈合时间长、药物多次局部注射顺应性差、普通外用制剂吸收差治疗效果微弱等。因此，可以通过创制顺应性高的外用制剂增强瘢痕组织渗透性持续递送药物和破坏瘢痕增生组织来抗增生性瘢痕。本发明涉及到的制剂及仿病毒破膜技术可以实现持续的药物递送、超强的瘢痕组织渗透能力及破坏瘢痕成纤维细胞消除增生组织的多效一体外用制剂。
发明内容
本发明的目的在于通过创制顺应性高的外用制剂增强瘢痕组织渗透性、持续递送药物和破坏瘢痕增生组织来抗增生性瘢痕。提供一种仿病毒破膜材料及其制备方法，使用该仿病毒破膜材料制备的传递体能够有效促进药物在皮肤表皮和真皮层的渗透，使药物有效抑制成纤维细胞增殖和胶原形成。
本发明具体技术方案如下：
一种仿病毒破膜型外用药物制剂，包括药物、药物载体和辅料。所述药物载体为仿病毒破膜磷脂，磷脂的亲水头部通过酰胺键或酯键连接不同代数的多精氨酸肽类树状大分子；磷脂的疏水部分是含有磷酸的脂类，分为甘油磷脂与鞘磷脂两大类，分别由甘油和鞘氨醇构成。包括磷脂酰胆碱(卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油(心磷脂)及磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂等。
进一步地，所述肽类树状大分子为一代肽类树状大分子、二代肽类树状大分子、三代肽类树状大分子及n代肽类树状大分子，其结构如下：
Figure BDA0002931729670000021
其中Phospholipid表示磷脂，K表示赖氨酸，R表示精氨酸；G1、G2、G3分别为一代肽类树状大分子、二代肽类树状大分子、三代肽类树状大分子，n代肽类树状大分子结构以此类推。
本发明所述的仿病毒破膜型外用药物制剂，可选择现有技术下外用剂型，如水溶液制剂、酊剂、醑剂、粉剂、洗剂、油剂、乳剂、软膏、糊剂、硬膏、涂膜剂、凝胶、气雾剂等。
本发明所述的仿病毒破膜型外用药物制剂，可选择用于增生性瘢痕等皮肤病预防和治疗所用的任何药物或活性成分，如类固醇类激素、抗肿瘤药物、干扰素、咪奎莫特、抗组胺药、维生素类药物、钙通道阻滞剂、生长因子相关药物、吡非尼酮、他克莫司等中的一种或几种。
一个具体的方案，磷脂为三代肽类树状大分子(G3)，具有如下结构：
Figure BDA0002931729670000022
本发明一个具体的实施方案，所述的仿病毒破膜型外用制剂为仿病毒破膜温敏凝胶。所述药物为曲安奈德，所述辅料为磷脂、吐温80、脱氧胆酸钠、泊洛沙姆和壳聚糖，将曲安奈德和药物载体包载于传递体双分子层中，载药的传递体包裹于泊洛沙姆和壳聚糖凝胶内。优选壳聚糖与泊洛沙姆的质量比为1：1～1：50。
上述仿病毒破膜型外用温敏凝胶一个具体制备方法为：
步骤1，载药纳米粒的制备：将肽类树状大分子、大豆卵磷脂、胆固醇、吐温80、脱氧胆酸钠和醋酸曲安奈德溶于有机溶剂中，旋转蒸发除去溶剂得到干燥的脂膜，加入去离子水水化，超声得到传递体溶液，离心，上清液即为载药纳米粒；
步骤2，含药凝胶的制备：将5％泊洛沙姆188溶液和35％泊洛沙姆407溶液：1％低密度壳聚糖溶液以及传递体溶液混合，即可得到含药凝胶。
进一步地，步骤1中，肽类树状大分子、大豆卵磷脂、胆固醇、吐温80、脱氧胆酸钠和醋酸曲安奈德的质量比为2:7.5:0.5:1:1:1。
进一步地，步骤2中，5％泊洛沙姆188溶液和35％泊洛沙姆407溶液：1％低密度壳聚糖溶液：传递体＝3：0.5：0.5(v:v:v)。
上述凝胶剂在制备抗增生性瘢痕药物中的应用。
本发明中类病毒破膜纳米粒凝胶治疗增生性瘢痕的机理可分为三个步骤：(a)首先在边缘活化剂的作用下传递体从凝胶中释放透过皮肤表皮；(b)在胍基作用下进一步促进传递体在真皮成纤维细胞中积累；(c)成纤维细胞中的醋酸曲安奈德释放会促进细胞凋亡和胶原纤维重塑从而治愈增生性瘢痕。它的优点包括疗效显著，给药途径便捷，疼痛感小，副作用低等。因此，仿病毒破膜外用制剂对于临床经皮给药具有实际意义。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供了一种新的仿病毒破膜材料，由于该材料带有丰富的胍基，具有很强的正电性，允许其与细胞膜上带负电的羧酸盐、磷酸盐和硫酸盐形成高效的双齿氢键。此外，胍基间距和灵活性的增加会增加其与细胞表面互补电荷物种相互作用的比例，从而改善与细胞膜的结合和细胞摄取。树枝状多肽通过构建类病毒纳米结构的独特蛋白质模拟物，不仅可以具有强大的破坏细胞膜的功能来实现细胞进入，而且可以有力地渗透到皮肤的深层组织发挥药效。
2.由于传递体的磷脂双分子层结构与天然的生物膜具有一定的相似性，使得传递体可以在一定程度上改变细胞膜的流动性并且可以与细胞膜融合，因此传递体在皮肤病治疗方面的运用具有不可估量的潜力。特别地，对于脂溶性且低皮肤渗透性的醋酸曲安奈德而言，以传递体为核心的载药系统具有几大明显的优点：首先，传递体可以把药物包裹在疏水内核中，在一定程度上使得药物与如光照、pH、温度和湿度等一系列可能对药物本身造成影响的外界环境隔离开来，使得药物的稳定性得到了提升；其次，传递体处方中的表面活性剂可以增强其变形能力，使其通过通道挤压至其直径的十分之一，在渗透梯度下自发穿透角质层，促进药物渗透；最后，与其他的材料相比，传递体还具有更为优秀的生物相容性与生物可降解性。
3.本发明制备原位药物递送系统在瘢痕组织处形成凝胶，凝胶缓慢降解释放出载药肽类树状大分子纳米粒，通过破膜作用促进药物的渗透，克服了静脉注射给药存在的疼痛、皮肤萎缩等副作用。
4.本发明还提供了一种类病毒破膜材料的制备方法，该方法操作简单，工艺条件温和，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是肽类树状大分子G3的核磁图与氢谱图；
图2是类病毒破膜纳米粒的粒径、zeta电位和TEM图；
图3是类病毒破膜纳米粒凝胶的SEM图；
图4是类病毒破膜纳米粒对小鼠红细胞破膜活性图；
图5是定量细胞摄取和摄取机制图；
图6是定性细胞摄取和Transwell下层细胞摄取；
图7是含基质胶的3D细胞摄取情况；
图8是体外透皮；
图9是细胞毒性结果；
图10是体内透皮；
图11是体内抗增生性瘢痕疗效图；
图12是皮肤增生性瘢痕指数
图13是皮肤组织切片HE染色；
图14是Ι型胶原表达的qPCR和WB测试结果。
具体实施方式
以下通过实施例对比本发明所述仿病毒破膜材料及其制备方法作进一步说明。
下述各实施例中：
二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)购买自上海艾韦特医药科技有限公司；
L-赖氨酸甲酯二盐酸盐(H-Lys-OMe·2HCl)、1-羟基苯并三唑(HOBT)与苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、BOC精氨酸[BOC-Arg(Pbf)-OH]购买自吉尔生化(上海)有限公司；
N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)、三氟乙酸(TFA)购买自百灵威科技有限公司；
无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)购买自安耐吉试剂。
实施例1
肽类树状大分子的制备
本实施例中，所述仿病毒破膜材料为药物载体肽类树状大分子(G3)，其结构式为：
Figure BDA0002931729670000051
其制备方法如下：
1、赖氨酸与BOC保护赖氨酸的酰胺化反应
按照赖氨酸、BOC保护赖氨酸、缩合剂[等摩尔的1-羟基苯并三唑(HOBT)与苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)]、有机碱的摩尔比分别为1：2：2：3，计量赖氨酸、BOC保护赖氨酸、HOBT、HBTU、DIPEA以及DMF。
在冰浴、氮气保护下将上述原料加入支口瓶中，再加入有机碱和无水二甲基甲酰胺使固体药物溶解，搅拌反应24～48h，然后将反应液用乙酸乙酯萃取，并分别用饱和NaHCO3水溶液、1mol/L稀盐酸、饱和NaCl水溶液、无水MgSO4进行洗涤、盐析、干燥得到粗产物溶液。后将粗反应液进行浓缩，通过薄层色谱法进行提纯，流动相二氯甲烷和甲醇比例40：1(v：v)，得到纯的BOC保护赖氨酸的缩合产物。
2、BOC保护赖氨酸的缩合产物脱BOC反应
在冰浴、氮气保护下将上述缩合产物溶解在二氯甲烷(CH2Cl2)中，然后加入三氟乙酸，BOC保护赖氨酸的缩合产物与三氟乙酸的摩尔比分别为1：40，然后搅拌反应3-5h，减压蒸发除去溶剂，乙醚洗涤所得固态产物并将其真空干燥即得。
3、赖氨酸缩合产物与BOC保护精氨酸的酰胺化反应
按照赖氨酸缩合产物、BOC保护精氨酸、缩合剂和有机碱的摩尔比分别为1：6：7：20计量赖氨酸缩合产物、BOC保护精氨酸、缩合剂和有机碱。
在氮气保护下将DSPE、脱甲酯的缩合产物、缩合剂[等摩尔的1-羟基苯并三唑(HOBT)与苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)]加入支口瓶中，再加入有机碱、氯仿、无水二甲基甲酰胺使固体药物溶解，37℃下搅拌反应24h，反应结束用氯仿(CHCl3)进行萃取，并分别用饱和NaHCO3水溶液、1mol/L稀盐酸、饱和NaCl水溶液、无水MgSO4进行洗涤、盐析、干燥得到粗产物溶液。后将粗反应液进行浓缩，通过薄层色谱法进行提纯，流动相二氯甲烷和甲醇比例40：1(v：v)，真空干燥即得。
4、赖氨酸和BOC保护精氨酸的缩合产物脱去甲酯
在冰浴下将上一步的缩合产物溶解在氢氧化钠甲醇溶液中，药物浓度保持在0.05mol/L,然后搅拌反应4～5h，反应结束用1mol/L的稀盐酸调节pH 2-3，用乙酸乙酯进行萃取，无水MgSO4对有机相进行除水，旋转蒸发仪旋干得到固体产物，将其真空干燥得到脱去甲酯的缩合产物。
5、脱去甲酯的缩合产物与DSPE的酰胺化反应
按照DSPE、脱甲酯的缩合产物、缩合剂和有机碱的摩尔比分别为1：1.4：1.4：1计量DSPE、脱甲酯的缩合产物、缩合剂和碱。
在氮气保护下将DSPE、脱甲酯的缩合产物、缩合剂[等摩尔的1-羟基苯并三唑(HOBT)与苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)]加入支口瓶中，再加入有机碱、氯仿、无水二甲基甲酰胺使固体药物溶解，37℃下搅拌反应24h，反应结束用氯仿(CHCl3)进行萃取，并分别用饱和NaHCO3水溶液、1mol/L稀盐酸、饱和NaCl水溶液、无水MgSO4进行洗涤、盐析、干燥得到粗产物溶液。后将粗反应液进行浓缩，通过薄层色谱法进行提纯，流动相二氯甲烷和甲醇比例10：1(v：v)，真空干燥即得纯的DSPE缩合产物。
6、DSPE缩合产物脱去BOC保护基团
在冰浴、氮气保护下将上述缩合产物溶解在二氯甲烷(CH2Cl2)中，然后加入三氟乙酸，DSPE缩合产物与三氟乙酸的摩尔比分别为1：40，然后搅拌反应3-5h，减压蒸发除去溶剂，乙醚洗涤所得固态产物并将其真空干燥即得最终产物，即为具有仿病毒破膜材料。
该类病毒破膜材料的核磁谱图和质谱图如图1所示。
并以富含赖氨酸的肽类树状大分子为对照，其结构式为：
Figure BDA0002931729670000061
其制备方法与G3类似。
实施例2
类病毒破膜纳米粒的制备
将实施例1制备的药物载体肽类树状大分子(G3)2mg、大豆卵磷脂7.5mg、胆固醇0.5mg、吐温80 1mg、脱氧胆酸钠1mg和醋酸曲安奈德TA 1mg溶于25mL氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿:甲醇＝2:1(v:v))，然后减压旋转蒸发除去溶剂，得到干燥的脂膜，用2mL去离子水水化，在40℃水浴中超声15min，继以探头超声5min，得到脂质体溶液。然后以1000rpm/min的转速离心10min以除去游离药物，所得上清液即为载曲安奈德的类病毒破膜传递体。
将实施例1制备的富含赖氨酸肽类树状大分子2mg、大豆卵磷脂7.5mg、胆固醇0.5mg和Dil 20μg溶于25mL氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿:甲醇＝2:1(v:v))，然后减压旋转蒸发除去溶剂，得到干燥的脂膜，用2mL去离子水水化，在50℃水浴中超声15min，继以探头超声5min，过膜得到载曲安奈德的赖氨酸传递体。
将大豆卵磷脂7.5mg、胆固醇0.5mg、吐温80 1mg、脱氧胆酸钠1mg和醋酸曲安奈德TA1mg溶于25mL氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿:甲醇＝2:1(v:v))，然后减压旋转蒸发除去溶剂，得到干燥的脂膜，用2mL去离子水水化，在50℃水浴中超声15min，继以探头超声5min，得到脂质体溶液。然后以1000rpm/min的转速离心10min以除去游离药物，所得上清液即为载曲安奈德的普通传递体。
采用马尔文激光粒度仪，分别于上述传递体稀释完毕后取1mL检测粒径、zeta电位，结果如图2所示。TA-Ts表示载曲安奈德的普通传递体，K/TA-Ts表示载曲安奈德的赖氨酸传递体，R-Ts未载曲安奈德的类病毒破膜传递体，R/TA-Ts表示载曲安奈德的类病毒破膜传递体。
实施例3
类病毒破膜纳米粒凝胶的制备
将泊洛沙姆溶液、壳聚糖溶液以及传递体溶液混溶，5％泊洛沙姆188和35％泊洛沙姆407：1％低密度壳聚糖：传递体的比例是3：0.5：0.5(v：v：v)，按此比例制备的黏性透明流体在37℃下形成凝胶，在常温及低温下不能形成凝胶，具有热敏性，凝胶SEM图如图3所示。
实施例4
小鼠红细胞破膜活性
取鼠血10-20mL于三角烧瓶中振摇10min，或用玻璃棒搅动血液，除去纤维蛋白质，使成脱纤血液。加PBS 10mL，摇匀，1000rpm离心10min,除去上清液，沉淀的红细胞再用PBS洗2-3次，至上清液不显红色为止。所得红细胞用PBS溶液(1：10)稀释，4度保存。用PBS将实施例2制备的传递体分别稀释，使材料浓度分别为1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL。将200μL稀释的红细胞与800μL不同浓度的传递体混合作用2h，以去离子水为阳性对照，以PBS为阴性对照。接下来，将样品以2000rpm/min的速度离心5分钟。然后取200μL上清液，用酶标仪在570nm处检测。用以下公式计算红细胞的溶血率：溶血率％＝(OD样本-OD阴性)/(OD阳性-OD阴性)×100％。
结果如图4所示，类病毒破膜纳米粒(R/TA-Ts)引起显著的溶血，说明其有很强的膜破裂活性来诱导血红蛋白的释放。
实施例5
定量细胞摄取和摄取机制
将实施例1制备的药物载体肽类树状大分子(G3)2mg、大豆卵磷脂7.5mg、胆固醇0.5mg、吐温80 1mg、脱氧胆酸钠1mg和细胞膜红色荧光探针Dil 20μg溶于25mL氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿与甲醇的体积比为2:1)，然后减压旋转蒸发除去溶剂，得到干燥的脂膜，用2mL去离子水水化，在50℃水浴中超声15min，继以探头超声5min，过膜得到含Dil的类病毒破膜传递体(R-Ts)。
将实施例1制备的富含赖氨酸肽类树状大分子2mg、大豆卵磷脂6mg、胆固醇0.5mg和Dil 20μg溶于25mL氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿与甲醇的体积比为2:1)，然后减压旋转蒸发除去溶剂，得到干燥的脂膜，用2mL去离子水水化，在50℃水浴中超声15min，继以探头超声5min，过膜得到含Dil赖氨酸传递体(K-Ts)。
将大豆卵磷脂6mg、胆固醇0.5mg、吐温80 1mg、脱氧胆酸钠1mg和Dil 20μg溶于25mL氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿与甲醇的体积比为2:1)，然后减压旋转蒸发除去溶剂，得到干燥的脂膜，用2mL去离子水水化，在50℃水浴中超声15min，继以探头超声5min，过膜得到含Dil的普通传递体(Ts)。
将密度为2.5×104个/mL的NIH 3T3细胞悬液接种于六孔板内(1mL)，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中孵育24h。分别将以上所制备的三组Dil传递体作为试验组，另设立空白组(n＝3)。24h后吸出培养液加入传递体溶液，使Dil的终浓度分别为500ng/mL。将各试验组置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中继续培养，于2h后弃去上清液，以PBS缓冲液洗涤3次，每孔用500μl胰酶消化并收集于2mL离心管内。离心后弃去上清液，再用1mL PBS洗涤两次。通过C6-小型流式细胞仪测量细胞对荧光物质的摄取率。
将密度为2.5×104个/mL的NIH 3T3细胞悬液接种于六孔板内(1mL)，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中孵育24h。然后吸取培养基，分别加入各种内吞抑制剂，包括1mL 10μg/mL氯丙嗪(抑制网格蛋白介导的胞吞途径)，1mL 5mg/mL甲基-β-环糊精(抑制小窝蛋白介导的胞吞途径)，1mL 10μg/mL细胞松弛素D(抑制巨胞饮介导的胞吞途径)，1mL NaN3(抑制能量介导的胞吞途径)和4℃放置处理0.5h。再将以上制备的三组Dil传递体(Dil最终浓度为500ng/mL)于细胞中孵育，2h后弃去上清液，以PBS缓冲液洗涤3次，每孔用300μl胰酶消化并收集于2mL离心管内。离心后弃去上清液，再用1mL PBS洗涤两次。通过C6-小型流式细胞仪测量细胞对荧光物质的摄取率。
结果如图5所述，在相同条件下，类病毒破膜传递体的摄取率显著高于其他对照组，证明了实例1中制备的载体材料的优越性。在加入各种内吞抑制剂后，类病毒破膜传递体的内化没有影响，从而可以推断类病毒破膜传递体内化完全不依赖于特定的内吞途径，也进一步推测其通过一个一个穿孔的形式进入细胞膜。
实施例6
定性细胞摄取和Transwell细胞摄取
将密度为2.5×104个/mL的NIH 3T3细胞悬液接种于共聚焦皿(1mL)，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中孵育24h。然后吸取培养基，加入实施例5所制备的三组Dil传递体(Dil的终浓度分别为500ng/mL)于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中继续培养孵育2h。2h后弃去上清液，以PBS缓冲液洗涤3次，再用Hoechast 3342染核10min，PBS缓冲液洗涤3次后加入200μl PBS以保持细胞形态。采用激光共聚焦进行观察。
将密度为2.5×104个/mL的NIH 3T3细胞悬液接种于Transwell上室(0.4μm，聚碳酸酯膜)，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中孵育24h。然后吸取培养基，加入实施例5所制备的三组Dil传递体(Dil的终浓度分别为500ng/mL)于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中继续培养孵育2h。2h后弃去上清液，以PBS缓冲液洗涤3次，加入新鲜培养基使其与下室细胞继续孵育24h。24h后弃去上清液，以PBS缓冲液洗涤3次，再用Hoechast3342对下室细胞染核10min，PBS缓冲液洗涤3次后加入200μL PBS以保持细胞形态。采用激光共聚焦进行观察。
如图6所示，摄取2h后，NIH 3T3细胞具有较强的MBN红色荧光，且在下室细胞中观察到明显的红色荧光。说明部分类病毒传递体突破了单层细胞的膜屏障，穿透到下室的细胞中。
实施例7
3D细胞摄取
将NIH 3T3细胞(1×104)与10μL基质胶在4℃混合，然后将含基质胶的10μL NIH3T3细胞在4℃速度快速接种到血管生成载玻片(3Dμ-slide chamber)中。将含基质胶的NIH3T3细胞在37℃下孵育10min凝胶化后，在上室中加入50μL完全培养基培养24h。然后吸去培养基，在上室分别加入实施例5所制备的三组Dil传递体(Dil的终浓度分别为1μg/mL)于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中继续培养孵育24h。去除多余培养液，用PBS洗涤3次。将细胞用Hoechst 33342染色30min，用激光共聚焦显微镜进行观察。
如图7所述，基质胶主要成分包括层黏连蛋白、胶原IV等，同时含TGF-β成纤维细胞生长因子、组织纤维酶原活化因子等，使体外模型更接近体内微环境。激光共聚焦图像直观展现了类病毒破膜传递体(R-Ts)具有优异的破膜能力，能够克服细胞外基质，穿透增生性瘢痕深层组织。
实施例8
体外透皮
取小鼠，断颈处死，减去腹部绒毛，用脱毛剂(8％硫化钠)涂抹均匀脱毛，3min后用生理盐水洗净，剥离皮肤，除去皮下脂肪组织，用生理盐水洗净，4度冰箱放置备用。将正常小鼠腹部切除的皮肤安装在Franz扩散池的供受室之间，角质层面向供体室。在供体小室的皮肤表面加入实施例3制备的不同组凝胶。接受室充满生理盐水和乙醇(4：1，v：v)的混合介质，在恒温水浴中37℃、300rpm持续搅拌。2h、4h、6h、8h、10h、12h和24h从受体小室取样1mL培养基，再补充等体积的混合介质。各时间点样品加1mL甲醇破乳，过0.22um滤膜，液相测定药物含量。最后采用高效液相方法检测醋酸曲安奈德的含量，检测条件为：安捷伦C18色谱柱(250×4.6mm,5μm,Agilent,USA)，检测波长为240nm，流动相为甲醇-水(70∶30)，流速为1.0mL/min，柱温为40℃。
结果如图8所示，使用本发明所述类病毒破膜传递体(R/TA-Ts)与其他对照组相比，本发明所述类病毒破膜传递体凝胶具有更好的释放效果，药物释放量明显高于其他三组，进一步说明采用本发明的类病毒破膜传递体凝胶可以促进药物释放，提高生物利用度。
实施例9
细胞毒性
将NIH 3T3细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔板(200μl/孔)，培养24h后去除培养基，分别将实施例2所制备的传递体用完全培养基稀释作为试验组，使曲安奈德的终浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL L和300μg/mL。以完全培养基为阴性对照组，各试验组和阴性对照组均设平行样品6个。继续培养24h后吸去培养基，PBS洗3次，每孔加入100μL含10％MTT溶液(5mg/mL，pH＝7.4PBS)的培养基，37℃继续孵育4h。弃去上清液，每孔加入150μL DMSO，室温振荡10min，用酶联免疫测定仪于570nm测定吸光度。以未处理的细胞作为对照，计算细胞生存率，细胞生存率(％)＝OD570(实验组)/OD570(对照组)×100。
结果如图9所示，本发明制备的类病毒破膜传递体(R/TA-Ts)对NIH 3T3细胞具有最高的抗增殖活性，间接证明了实施例1制备的树状肽类大分子具有通过破膜促进药物内化的优越性。
实施例10
体内透皮
将实施例1制备的药物载体肽类树状大分子(G3)2mg、大豆卵磷脂7.5mg、胆固醇0.5mg、吐温80 1mg、脱氧胆酸钠1mg和Dil 20μg溶于25mL氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿与甲醇的体积比为2:1)，然后减压旋转蒸发除去溶剂，得到干燥的脂膜，用2mL去离子水水化，在50℃水浴中超声15min，继以探头超声5min，过膜得到含Dil的类病毒破膜传递体(R-Ts)。
将实施例1制备的富含赖氨酸肽类树状大分子2mg、大豆卵磷脂6mg、胆固醇0.5mg和Dil 20μg溶于25mL氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿与甲醇的体积比为2:1)，然后减压旋转蒸发除去溶剂，得到干燥的脂膜，用2mL去离子水水化，在50℃水浴中超声15min，继以探头超声5min，过膜得到含Dil赖氨酸传递体(K-Ts)。
将大豆卵磷脂6mg、胆固醇0.5mg、吐温80 1mg、脱氧胆酸钠1mg和Dil 20μg溶于25mL氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿与甲醇的体积比为2:1)，然后减压旋转蒸发除去溶剂，得到干燥的脂膜，用2mL去离子水水化，在50℃水浴中超声15min，继以探头超声5min，过膜得到含Dil的普通传递体(Ts)。
将制备好的5％泊洛沙姆188和30％泊洛沙姆407、1％低密度壳聚糖、上述制备的Dil传递体按照比例8：1：1(v：v：v)混合，在37℃下形成载Dil的传递体凝胶。
将新西兰大白兔12只分为6组，其中2只为正常组。另将10只新西兰大白兔建立增生性瘢痕模型(每只耳朵有4个创面)。在兔耳腹侧中段沿长轴避开可见血管，在耳部内侧制造1cm×1cm创面，创面间隔1cm以上距离，手术刀切除全层皮肤至软骨，并用刮勺彻底刮除软骨膜，止血后无菌纱布包扎或用0.1％苯扎氯铵溶液冲洗创面。让家兔恢复7天，然后再次麻醉，并从伤口处撕下痂以加速增殖过程。术后创面暴露，待其自行愈合。第21天形成增生性瘢痕模型。将每组分别抹上对应的凝胶，使Dil最终浓度为500ng/mL。抹凝胶12h后处死，取皮肤组织冷冻切片，通过荧光显微镜观察体内透皮情况。
如图10所示，本发明的类病毒破膜传递体凝胶组较其他凝胶组具有更强的透皮效果。
实施例11
抗增生性瘢痕活性
将新西兰大白兔12只分为6组，其中2只为正常组。另将10只新西兰大白兔建立增生性瘢痕模型(每只耳朵有4个创面)。在兔耳腹侧中段沿长轴避开可见血管，在耳部内侧制造1cm×1cm创面，创面间隔1cm以上距离，手术刀切除全层皮肤至软骨，并用刮勺彻底刮除软骨膜，止血后无菌纱布包扎或用0.1％苯扎氯铵溶液冲洗创面。让家兔恢复7天，然后再次麻醉，并从伤口处撕下痂以加速增殖过程。术后创面暴露，待其自行愈合。治疗开始于皮肤切除后第22天(建模成功后)，将实施例3所制备的类病毒破膜传递体凝胶均匀涂抹于瘢痕处，一次给药剂量为0.25mg，每周三次，连续三周(d22、29和36)，并以游离药物组、普通传递体组、富含赖氨酸的肽类树状大分子传递体组为对照组。分别于第22天(给药前)、第29天(给药后一周)、第36天(给药后两周)和第43天(给药后三周)拍摄照片，测量增生性瘢痕指数(增生性瘢痕指数＝瘢痕中部最高点至软骨表面距离/正常皮肤至软骨表面距离)，切取标本进行HE染色，并检测治疗第三周后Ι型胶原的mRNA和蛋白表达。
如图11-14所示，本发明制备的类病毒破膜纳米粒与其他对照组相比，表皮和真皮厚度较薄，成纤维细胞稀疏且排列整齐，Ι型胶原表达有效减少，与正常对照组相似。这说明其可有效抑制增生性瘢痕，证明了类病毒肽类树状大分子可以通过强大破膜能力促进药物在皮肤深层组织的递送，具有显著的优越性。
实施例1-11结果表明，本发明构建的一种类病毒破膜纳米粒凝胶药物递送系统在增生性瘢痕治疗方面有着广阔的应用前景。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种抗增生性瘢痕外用制剂，其特征在于：该外用制剂由药物、药物载体和辅料制成；所述药物载体为仿病毒破膜磷脂，磷脂的亲水头部通过酰胺键或酯键连接不同代数的多精氨酸肽类树状大分子。
2.根据权利要求1所述的抗增生性瘢痕外用制剂，其特征在于：所述磷脂是含有磷酸的脂类，疏水部分为甘油磷脂或鞘磷脂。
3.根据权利要求1所述的抗增生性瘢痕外用制剂，其特征在于：所述肽类树状大分子为一代肽类树状大分子、二代肽类树状大分子、三代肽类树状大分子及n代肽类树状大分子。
4.根据权利要求1所述的抗增生性瘢痕外用制剂，其特征在于：所述的磷脂亲水头部为三代精氨酸、疏水尾部为磷脂酰乙醇胺，具有如下结构：
Figure FDA0002931729660000011
5.根据权利要求1所述的抗增生性瘢痕外用制剂，其特征在于：所述外用制剂可选择以下外用剂型：水溶液制剂、酊剂、醑剂、粉剂、洗剂、油剂、乳剂、软膏剂、糊剂、硬膏剂、涂膜剂、凝胶剂或气雾剂。
6.根据权利要求1所述的抗增生性瘢痕外用制剂，其特征在于：所述药物为增生性瘢痕等皮肤病预防和治疗所用的任何药物或活性成分，选自类固醇类激素、抗肿瘤药物、干扰素、咪奎莫特、抗组胺药、维生素类药物、钙通道阻滞剂、生长因子相关药物、吡非尼酮、他克莫司中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的抗增生性瘢痕外用药物制剂，其特征在于：所述制剂为仿病毒破膜型抗增生性瘢痕温敏凝胶，所述药物为曲安奈德，所述辅料为磷脂、吐温80、脱氧胆酸钠、泊洛沙姆和壳聚糖，将曲安奈德和药物载体包载于传递体双分子层中，载药的传递体包裹于泊洛沙姆和壳聚糖凝胶内。
8.根据权利要求7所述的抗增生性瘢痕外用药物制剂，其特征在于：所述壳聚糖与泊洛沙姆的质量比为1：1～1:50。
9.权利要求1所述的外用制剂在制备抗增生性瘢痕药物中的应用。
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