CN113058042A - 一种可鼻喷的稳定递载rna分子的脂质纳米颗粒制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法,利用成膜水化法制备脂质纳米颗粒,基础合成材料为摩尔比8:1~1:1的磷脂和胆固醇,所述磷脂为DPPC或者PC‑98T;制备Mal‑PEG2000‑DSPE脂质体胶束,利用LHRH肽修饰所述胶束,利用LHRH肽与Mal‑PEG2000‑DSPE交联后的胶束修饰脂质体。本发明通过设计适于经鼻递送一直到肺部给药的基因药物和疫苗分子载体,使其能够以温和方便的给药方式,顺利克服肺部的各种生理障碍直接作用于效应细胞,以促进生物大分子类药物的实际应用效率,提高疾病的治疗或预防效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域,尤其涉及一种可鼻喷的脂质纳米颗粒制备方法。
背景技术
随着生物医药领域的高速发展,生物治疗药物占整个医药市场的比例越来越大。生物大分子药物,特别是蛋白多肽类药物与新兴的基因药物DNA,mRNA、microRMA,siRNA以及shRNA具有广阔的应用前景。但是生物大分子药物不稳定,易受环境中多种因素的影响而失活,因而半衰期都很短,限制了该类药物的实际应用。常规的静脉注射给药方式,又存在生物利用度低等问题,且由于半衰期短所造成的反复给药,又给患者造成生理上的痛苦。根据不同的药物选择合适的运载系统与给药方法可以提高生物大分子药物的生物利用度,改善治疗效果。
鼻内给药途径是多种药物进行局部和系统给药的切实可行的给药途径。鼻粘膜表面积可以使药物迅速发挥治疗效果,还可以对中枢神经系统进行直接给药,不具有侵袭性,不需要进行无菌操作,给药方便简单,可以大大提高对患者进行给药的方便性、舒适性和顺应性。目前市场上有很多在售鼻喷药物,通常鼻部给药主要治疗上呼吸道的局部疾病,比如鼻塞,鼻部感染,鼻部过敏性疾病如过敏性鼻炎等。而在过去的几十年间,人们也在探索通过鼻腔给药进行小分子药物系统给药的方法。鼻粘膜具有高度血管化和高透过性,因此也可以通过该途径进行系统给药,使鼻部既成为治疗靶点又是药物入口。
经鼻到肺部给药途径是将药物直接运送至肺部进行治疗或输送的给药方式。由于肺部与外界环境直接接触,易于受到各种病原菌和有害物质的侵袭,理论上其同样也易于接受外界药物的治疗。肺部给药途径是很有应用前景的给药途径,在进行肺部疾病治疗时,可以将药物直接投送到患病部位,较易接触药物,且药物吸收快,使药物直接发挥作用,因而可以降低药物用量,同时也会降低刺激性药物对其他组织的系统副作用,和对其他正常器官的不良作用。肺部局部代谢活性低,无口服给药途径所产生的首过代谢效应,也较适于作为活性药物成分(API)如蛋白多肽和基因等易降解药物的给药部位。经肺部给药途径可以作为治疗哮喘和细菌感染,等肺部疾病的给药方式。
肺部给药的主要形式有吸入给药,鼻内给药和气管内给药。肺部给药的成功与否在很大程度上也取决于肺部给药设备的开发,只有开发出一种高效方便的肺部给药设备才可以将合适的载体运送至肺部产生作用。近年来,随着生物技术领域的发展促进了一系列治疗和预防多种疾病的生物大分子药物的出现。因此市场上将会出现越来越多的通过鼻和肺内途径给药的生物大分子药物。
脂质体是一种人工制备的球状囊泡,是由一种或多种磷脂双分子层或单分子层构成,通常为了改善脂质体的性质还加入胆固醇。由于脂质体生物相容性好,无毒可降解,可以装载亲水和疏水药物,并有一定的靶向性,脂质体非常适合作为多种生物活性药物的运送载体如蛋白多肽,核酸等,目前已有多种脂质体类药物上市如阿霉素和两性霉素脂质体药物。脂质体具有多种分类,按照其磷脂双分子层的不同可以分为单室脂质体和多室脂质体,粒径分布在25nm到10μm之间,但是药物运送的理想脂质体粒径分布则在50–200nm之间,根据所带电荷性质的不同又可分为中性,阳离子型和阴离子型脂质体。作为药物载体,脂质体可以将亲水性的生物大分子药物装载入其水溶液核心中,保护生物大分子的结构不被破坏,除了传统的脂质体以外,现在又出现了许多功能型的脂质体载体类型如隐形脂质体,长循环脂质体,配体靶向型脂质体,缓释脂质体以及多功能的脂质体。另外还有新型的脂质载体如固态脂质纳米颗粒和纳米结构脂质载体。
许多基因药物或疫苗(mRNA、iRNA和microRNA)通过鼻喷的治疗效果必须有合适的载体才能达到,所以本发明针对基因治疗药物或基因疫苗,选择合适的脂质体作为载体,以期可以通过选择与鼻黏膜和肺部表面较为接近的活性剂组成类似的磷脂材料,来制备脂质体,一方面提高载体的安全性,另一方面促进药物能够顺利克服鼻和肺部粘膜的阻碍,使药物作用于疫苗传递或肺部本身疾病,如肺癌细胞,以提高基因药物的实验效果。
发明内容
本发明的第一个目的在于,提供一种可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法,经鼻递送给药方式,经鼻和肺粘膜进入体内,以提高RNA类生物大分子的稳定性和生物利用度,改善疫苗预防或药物的治疗效果。
本发明的第二个目的在于,提供一种由上述方法制备获得的可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒。
本发明的第三个目的在于,提供可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒的应用。
为了实现上述目的,本发明提供了一种可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法,包括如下步骤:
(1)利用成膜水化法制备脂质纳米颗粒,基础合成材料为摩尔比8:1~1:1的磷脂和胆固醇,所述磷脂为DPPC或者PC-98T;
(2)制备Mal-PEG2000-DSPE脂质体胶束,利用LHRH肽修饰所述胶束,利用LHRH肽与Mal-PEG2000-DSPE交联后的胶束修饰脂质体。
作为一个优选方案,基础合成材料还包括和胆固醇相同摩尔比的DODAP。脂质体只要通过疏水相互作用和静电相互作用与所载物质结合,DODAP作为脂质体中的脂质分子,携带含一个正电荷的基团,为脂质体提供正电,使得制备的LNP系统可有效包封负电荷的核酸及表面电荷低,从而克服了直接混合所得复合体的许多问题。
作为一个优选方案,DPPC或者PC-98T与胆固醇的摩尔比优选为3:1。
作为一个优选方案,步骤(1)中将基础合成材料溶于三氯甲烷中,40℃旋蒸2h制备脂质膜,加入水,磁力搅拌水化处理,制备初级的脂质体悬浮液,高压匀浆,利用200nm聚碳酸脂膜过滤以除去大颗粒杂质,或者用200nm聚碳酸脂膜过滤10遍,并过450nm PVDF膜进行除菌,脂质体悬液置于4℃保存。
作为一个优选方案,制备Mal-PEG2000-DSPE脂质体胶束包括:
(1)取1μmol/mL的mal-PEG2000-DSPE储备液2mL,回复至室温后,置于圆底烧瓶中,补加3mL氯仿,充分混匀;
(2)利用真空旋转蒸发仪对上述Mal-PEG2000-DSPE溶液进行旋蒸成膜,水浴温度37℃,旋蒸1h,充分除去有机溶剂;
(3)成膜后,先进行超声处理5min,以使脂膜充分脱落,便于水化,利用HEPES缓冲液进行水化,水化温度60℃,持续水化2h以充分水化;
(4)水化后,利用超声清洗机进行超声处理10min,温度60℃;
(5)200nm聚碳酸脂膜过滤,除去较大颗粒,转入无菌离心管,4℃保存备用。
为了实现上述第二个目的,本发明提供了利用所述可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法制备获得的脂质纳米颗粒。
为了实现上述第三个目的,本发明提供了脂质纳米颗粒在制备RNA类基因药物和疫苗分子经鼻递送给药方式药物载体中的应用。
PC-98T:蛋黄卵磷脂——第一代天然磷脂,与普通的蛋黄卵磷脂不同的是,PC-98T的制取过程摒弃了乙醇胺磷脂(PE)、甘油磷脂(PG)、丝氨酸磷脂(PS)等所有其他类型的磷脂,仅保留了胆碱磷脂(PC),产品中PC含量高达98%以上。较高的纯度也使得PC-98T成为一种新型的蛋黄卵磷脂,并且应用面从脂肪乳扩大到了脂质体领域。
DPPC:二棕榈酰磷脂酰胆碱——基本载体材料,不论是在肺部慢性损伤还是在急性肺损伤中都起到了至关重要的作用,而且对这两种肺损伤类型都有一定的治疗作用。
Chol:胆固醇——辅助脂质,对细胞膜磷脂分子流动性的调节作用随温度的不同而改变。在相变温度以上,它能使磷脂的脂肪酸链的运动性减弱,从而降低细胞膜磷脂分子的流动性。而在相变温度以下时,胆固醇可通过阻止磷脂脂肪酸链的相互作用,缓解低温所引起的细胞膜磷脂分子流动性剧烈下降。
DODAP:二油酰二甲铵基丙烷,作为脂质体中的脂质分子,携带含一个正电荷的基团,为脂质体提供正电。
LHRH:促黄体素释放激素,是十肽化合物,其氨基酸的序列是谷-组-色-丝-酪-甘-亮-精-脯-甘,因为肺癌细胞表面高效表达LHRH肽的受体,可以使用它来促进肺细胞对脂质体的吸收效率。其他可选的如穿膜肽TATm,可以促进纳米颗粒被细胞摄取;小分子六肽cNGQGEQc,通过识别A549细胞表面整合素a3而与细胞发生结合。
Mal-PEG2000-DSPE是优选的含有马来酰亚胺基团的脂质的一种,做脂质体可以用其它的DSPE-PEG化的磷脂。如DSPE-mPEG5000、Mal-PEG1000-DSPE、Mal-PEG3000-DSPE、Mal-PEG5000-DSPE等,区别在于PEG的分子量不同。
本发明主要利用与鼻黏膜和肺部表面活性剂相似的磷脂成分二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和蛋黄卵磷脂(PC-98T)制备用以运载RNA的脂质体载体,总体设计和制备流程如图1。通过高压匀浆法制备的脂质体粒径分布在117.2nm和211.2nm,PDI为0.236和0.268,zeta点位为-19.1mV和+26.9mV。将脂质体进行冷冻干燥处理,水化后,脂质体能够很好的水化且体粒径有些许增大,zeta电位降低,为-13.6mV和+8.8mV。
脂质体在液体条件下具有很好的物理稳定性,放置一段时间后透光度基本不变。通过冻干再水化的过程将siRNA装载进脂质体中,通过琼脂糖凝胶阻滞实验可知,核酸被成功装载进了脂质体中。通过胶束后插入法对脂质体进行靶向修饰,选择黄体激素释放激素类似物(LHRH)小肽作为靶向配体,肺癌等多种人体内肿瘤细胞均会过量表达该类似物肽的受体。利用Mal-PEG2000-DSPE功能化磷脂制备胶束,然后将含有半胱氨酸的小肽与胶束中的马来酰亚胺基团进行反应,通过非还原性SDS-PAGE蛋白电泳验证,小肽与胶束成功连接,之后利用PEG化磷脂胶束可以与脂质体发生快速融合的性质,将修饰有小肽的胶束按照0.3%-1%的比例插入脂质体中。由实验可知空载的脂质体载体在高浓度下对肿瘤细胞的生长不会产生抑制作用。将分别载有针对编码Survivin,MTH1和HKDC1蛋白基因的siRNA的靶向与非靶向脂质体作用于非小细胞肺癌A549细胞,发现PC-98T:Chol脂质体对A549细胞的增殖抑制效果更明显,抑制率可以达到50%,靶向修饰的脂质体载体,对肿瘤细胞的抑制率高于非靶向修饰的脂质体。
本发明的优点在于,本发明制备的脂质纳米颗粒载体提高了RNA类生物大分子的稳定性和生物利用度,改善治疗效果。通过设计适于经鼻递送一直到肺部给药的基因药物和疫苗分子载体,使其能够以温和方便的给药方式,顺利克服肺部的各种生理障碍直接作用于效应细胞,以促进生物大分子类药物的实际应用效率,提高疾病的治疗或预防效果。
附图说明
图1.脂质体制备修饰过程与冻干与RNA装载示意图,A为LHRH肽与Mal-PEG2000-DSPE交联的示意图;B连接LHRH肽的胶束修饰脂质体。
图2.磷脂标准液的全波长扫描曲线,A:卵磷脂PC-98T全波长扫描图;B:DPPC全波长扫描图。
图3.卵磷脂PC-98T标准曲线。
图4.DPPC磷脂标准曲线。
图5.纳米脂质颗粒的悬液。
图6.透射电镜观察脂质体形态与粒径。
图7.PC-98T:Chol与DPPC:DODAP:Chol脂质体动态光散射表征脂质体粒径分布。
图8.脂质体悬液的表观稳定性。
图9透射电镜观察脂质体凝集现象。
图10.脂质体冻干前后的比较,A脂质体冻干前后的表观比较:A1冻干前液体样品,A2冻干后固体样品,A3冻干样品水化后;B脂质体冻干前后的粒径变化:B1冻干前液体样品粒径分布,B2冻干后脂质体粒径分布;C脂质体冻干前后的Zeta电位变化:C1冻干前脂质体Zeta电位,C2冻干后脂质体Zeta电位。
图11.LHRH肽与胶束反应产物的非还原性SDS-PAGE电泳。
图12.冻干脂质体装载核酸。
图13.卵磷脂脂质体细胞毒性分析结果。
图14.DPPC脂质体的细胞毒性分析结果。
图15.PC-98T:Chol脂质体装载不同siRNA对细胞活力的影响。
图16.DPPC:DODAP:Chol脂质体装载不同siRNA对细胞活力的影响。
图18.无转染试剂时survivin siRNA对细胞活力的影响。
图19.PC-98T:Chol脂质体对细胞形态的影响。
图20.DPPC:DODAP:Chol脂质体对细胞形态的影响。
图21.半定量PCR琼脂糖电泳结果。S1为单独装载survivin的靶向脂质体组,S2为三种siRNA同时给药组,S3位对照组Survivin,C1,C2,C3分别为以上各组相应的内参基因β-2-微管蛋白基因(beta-2-microglobulin),H代表HKDC1siRNA作用组;M为MTH1siRNA作用组。
图22.PC-98T:Chol脂质体装载不同siRNA对相应基因转录水平的影响。
图23.DPPC:DODAP:Chol脂质体装载不同siRNA对相应基因转录水平的影响。
具体实施方式
以下,结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是,以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明,而非对本发明的限制。
实施例1:可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备
一、制备鼻与肺粘膜亲和性单室纳米脂质颗粒
将DPPC/PC-98T:DODAP:Chol和PC-98T:Chol分别以3:1:1和3:1的摩尔比,溶于三氯甲烷中,置于圆底烧瓶中,40℃旋转蒸发仪旋蒸2h制备脂质膜,然后加入10mL水,磁力搅拌水化处理,制备初级的脂质体悬浮液,高压匀浆3-5遍,之后利用200nm聚碳酸脂膜过滤以除去大颗粒杂质,或者50℃用200nm聚碳酸脂膜过滤10遍,并过450nm PVDF膜进行除菌,脂质体悬液置于4℃保存。
脂质体制备方法采用成膜水化法,形成多层脂质囊泡后分别用挤出法和高压均质法进行均化处理,以产生单室脂质体,具体制备实验步骤如下:
1.取10μmol/mL的磷脂储备液和胆固醇储备液,静置20min使其恢复至室温,轻轻摇动使储备液混匀,将磷脂与胆固醇按照3:1的摩尔比混匀,吸取磷脂储备液600μL,胆固醇储备液200μL置于100mL,然后补加氯仿至5mL,充分混匀;
2.利用旋转蒸发仪除去氯仿,真空度大于0.8MPa,37℃旋蒸1h,80rpm,使均匀成膜;
3.将脂膜进行水化,水化温度37℃,水化1h-2h,使脂膜完全脱落,充分水化,形成多室脂质囊泡;
4.水化后,对多室脂质囊泡悬液进行均化处理以降低粒径产生单室脂质体。
方法一:将水化液进行水浴超声处理5min,然后用装有200nm聚碳酸脂膜的可换膜滤器过滤多室脂质囊泡悬液,过滤20遍,保持温度为37℃。
方法二:利用高压匀浆机进行处理,选择1000bar分别进行1,2,3,4,5,6,7次循环匀浆处理。
5.将均质处理的脂质体溶液置于50℃水浴中孵育30min,以修复由于高压均质所造成的脂质体破损;
6.将制备好的脂质体溶液置于4℃保存,备用。
7.凝胶阻滞实验
(1)制备脂质体核酸复合物溶液与上样缓冲液混合均匀,用1%SDS溶液处理脂质体核酸复合物作为对照组;
(2)利用1%的琼脂糖凝胶进行电泳,电压调整为70v;
(3)电泳30min左右,观察电泳结果;
(4)电泳后利用凝胶成像系统,记录电泳结果。
利用Stewart法测定脂质体中磷脂的含量,由全波长扫描结果如图3所示,本实验所选用的磷脂在466nm处有最大吸收波长,因此选为后续测定的波长。
脂质体的定量是基于Stewart法,使磷脂酰胆碱可以和硫氰酸铁铵形成复合物,显红色,根据颜色变化,通过测定其在466nm处的吸光度值进行定量分析,分别由卵磷脂PC-98T和DPPC来绘制标准曲线(图4),根据脂质体定量分析标准曲线,可以进行计算出所制备脂质体样品的含量,进而便于进行核酸装载的定量以及细胞毒性试验脂质体用量的定量。由此计算出所制备两种脂质体的质量浓度和收率分别如下表1所示:
表1.脂质体质量浓度与收率
8.脂质体制备与表征
图5为本实验所制备的脂质体悬液,由图中可以看出脂质体悬液呈淡蓝色乳光悬液,澄清透明,分散性良好。在制备过程中利用薄膜水化法制备初始脂质体悬液,成膜后,使其与水相具有足够长时间的接触,同时进行磁力搅拌,使脂质膜能够很好地脱落,进入水相,形成球形脂质体,这时形成的脂质体为大多室脂质体,单个脂质体有多层磷脂双层,粒径较大,为了得到粒径均一,且粒径在纳米级范围内的脂质体,需要施加额外的作用力,使其形成单层脂质体。
本实验中使用水浴超声法进行均化处理,5min之后再利用200nm孔径的多聚碳酸酯膜进行挤出处理,进一步使粒径分布均一,脂质体悬液也从混浊转为澄清透明,具有较好的表观形态。另外在脂质体充分水化后,利用高压匀浆法进行处理也可以有效降低脂质体的粒径,制备粒径分布较均一的单室脂质体。然后对脂质体进行了进一步的表征分析。
图6为脂质体的透射电镜图,从图中可以看出脂质体粒径主要分布在100-200nm之间,具有较好的均一性,为圆形。为进一步验证脂质体的粒径分布,又利用动态光散射分析脂质体的粒径分布情况,其结果与透射电镜结果具有较好的一致性,且由图可知粒径分布较均一。
二、Mal-PEG2000-DSPE脂质体胶束的制备及LHRH肽的修饰
1.DSPE-PEG2000-Mal的制备方法,具体过程如下:
(1)取1μmol/mL的mal-PEG2000-DSPE储备液2mL,回复至室温后,置于100mL圆底烧瓶中,补加3mL氯仿,充分混匀;
(2)利用真空旋转蒸发仪对上述Mal-PEG2000-DSPE溶液进行旋蒸成膜,水浴温度37℃,旋蒸1h,充分除去有机溶剂;
(3)成膜后,先进行超声处理5min,以使脂膜充分脱落,便于水化,利用HEPES缓冲液(pH 7.0)进行水化,水化温度60℃,持续水化2h以充分水化;
(4)水化后,利用超声清洗机进行超声处理10min,温度60℃;
(5)200nm聚碳酸脂膜过滤,除去较大颗粒,转入无菌离心管,4℃保存备用。
2.LHRH肽修饰胶束与脂质体修饰
脂质体的修饰采用后插入法,即将修饰有多肽的胶束与已经制备好的脂质体进行融合,使多肽仅修饰在脂质体表面,具体步骤如下:
(1)将胶束溶液1mL与500μL含有与胶束等摩尔量的LHRH肽链置于HEPES缓冲液(pH7.0)中反应;
(2)氮气除去反应体系中的氧气,置于磁力搅拌器上,低速室温避光反应过夜,非还原性SDS-PAGE蛋白电泳验证反应效果;
(3)取装载有siRNA的脂质体悬液,加入20-50μL连接有LHRH肽的胶束溶液,使胶束摩尔含量占总脂质含量的0.3%-1%;
(4)混匀后,50℃孵育1h,取出备用。
3.非还原性SDS-PAGE验证LHRH连接效果
按下表2配制SDS-PAGE浓缩胶与分离胶:
表2.非还原性SDS-PAGE浓缩胶和分离胶配方
在电泳样品处理时,胶束与多肽反应的样品用Native loading buffer进行处理,不煮沸;多肽样品用还原性loading buffer处理作为对照,以消除含半胱氨酸多肽之间的自交联产生的误差,煮沸5-10min。
图7为脂质体悬液的表观稳定性分析结果,通过测定脂质体悬液在750nm处的透光率变化,来表征脂质体悬液的物理稳定性,同时也在一定水平上说明了脂质体悬液的化学稳定性。在图8中,稳定脂质体悬液基本没有透光率变化,而不稳定脂质体,由于出现絮凝沉淀,起初时较浑浊,透光率较低,随着脂质体的沉淀,溶液逐渐澄清,透光率逐渐增大,当不再出现沉淀时,悬液已较澄清,透光率也不再继续增大,而维持稳定。图9为不稳定的脂质体在悬液中逐渐凝集的现象,由有透射电镜图可看出发生凝集的相互凝集融合,脂质体粒径增大,达到2μm以上。
三、纳米脂质体冻干与装载RNA核酸制备
1.脂质体冻干实验
为了使所制备的脂质体保持长期的稳定性,选择将脂质体进行冷冻干燥机处理。向所得的脂质体悬液中加入冻干保护剂蔗糖,使蔗糖终浓度为9%(w/v),-20℃冷冻2h,之后置于-80℃冷冻2h,冷冻干燥机中冷冻干燥48h,干燥机真空度维持在<0.1bar,将冻干后的脂质体于-20℃进行无菌保存。
1.用DEPC水配制36%(w/v)蔗糖溶液,0.22μm PVDF滤膜过滤除菌,备用;
2.取0.9mL经过滤除菌的脂质体悬液,加入0.3mL 36%(w/v)蔗糖溶液,充分混合均匀;
3.脂质体,蔗糖混合液置于4℃放置1h,-20℃放置2h进行预冻,之后置于-80℃冷冻2h以上;
4.将上述预冻好的脂质体置于预热好的冷冻干燥机中,干燥机真空度维持在<0.1bar,进行真空干燥48h,取出后置于-20℃冰箱保存备用。
5.冻干脂质体水化
利用上述制备的脂质体冻干粉,通过冻干水化法用siRNA水溶液水化脂质体冻干样品以装载siRNA,分别装载单独的siRNA基因以及同时装载多种siRNA基因siRNA。过程如下:
(1)将5mM的siRNA溶液预热至37℃;
(2)取冷冻干燥后的固体脂质体粉饼,用预先加热到37℃的siRNA溶液100μL水化脂质体,孵育30min;
(3)孵育过后,用DEPC水稀释脂质体悬液至2.5mL;
(4)通过凝胶阻滞实验验证核酸的装载效果。
A脂质体冻干前后的表观比较:A1冻干前液体样品,A2冻干后固体样品,A3冻干样品水化后;B脂质体冻干前后的粒径变化:B1冻干前液体样品粒径分布,B2冻干后脂质体粒径分布;C脂质体冻干前后的Zeta电位变化:C1冻干前脂质体Zeta电位,C2冻干后脂质体Zeta电位。
制备连接有多肽的胶束时可以选择先将多肽与Mal-PEG-DSPE分子连接,然后制备胶束,也可以选择先制备胶束,再与多肽连接,由于试验中Mal-PEG-DSPE不易溶于缓冲溶液,故选择后一种连接方法。本实验所选用的多肽为LHRH肽,其氨基酸序列为Gln-His-Trp-Ser-Tyr-(D-Cys)-Leu-Arg-Pro,由于含有半胱氨酸,可利用半胱氨酸的巯基与Mal-PEG-DSPE中的马来酰亚胺基团可在中性pH条件下特异地共价结合形成稳定的硫醚键,从而实现多肽与胶束的连接,进而修饰脂质体。通过非还原性SDS-PAGE电泳验证多肽与Mal-PEG-DSPE胶束的连接反应是否发生。由图11可知,与胶束反应的蛋白电泳条带,由于分子量变大,位置偏上,由此判断带有巯基的LHRH肽与胶束表面的马来酰亚胺基团发生了交联反应。
脂质体装载核酸时,在成膜水化过程中加入核酸存在包埋率低,易引起脂质体沉淀,以及siRNA降解问题,所以为了提高装载率,保持siRNA核酸分子的稳定性,选择冻干水化法进行核酸的装载,过程温和,装载率较高。图12即是转载有核酸的脂质体进行琼脂糖凝胶电泳,核酸由于被包埋在脂质体中,所以不会随着电泳而泳动,停留在加样孔处,而不被转载的核酸则则会随着电泳泳动,利用1%的SDS溶液破坏脂质体,释放出核酸后加样孔处则没有核酸条带。A、B分别为引物双链与质粒装载核酸凝胶阻滞实验。
实施例2:纳米脂质体的表征与细胞毒性试验
对所制备的脂质体进行表征,包括平均粒径分布,zeta电位,透射电镜观察脂质体形貌。
1.动态光散射仪测量粒径分布
分别利用动态光散射仪测量脂质体的粒径分布情况。将合适浓度的脂质体800μL置于清洗干净的测量皿中进行粒径测定。
2.Zeta电位测量
分别将脂质体样品注入检测池U形管中,测定各组的zeta电位分布情况。
原子力显微镜观察脂质体表面形貌
利用原子力显微镜观察所制备的空载和载基因脂质体以及雾化后脂质体的形貌。根据原子力显微镜的样品规范制备原子力显微镜观测样品,将50μL脂质体悬液滴于云母片上,自然晾干,然后将脂质体置于原子力显微镜下进行观察,得到脂质体的表面形貌信息和大小。
3.透射电镜(TEM)观察
将合适浓度的脂质体(20μL)悬液滴加在TEM无碳膜铜网上,室温自然风干后用2.5%磷钨酸负染,室温自然风干,然后利用透射电镜进行观察。
MTT法分析所制备的空载脂质体和siRNA对的细胞毒性。另外,还需要对未修饰过的脂质体进行细胞毒性分析,作为对照。设置脂质体用量梯度,在培养细胞时加入,然后利用所培养的细胞进行细胞毒性分析。
MTT法实验步骤
(1)胰酶消化细胞,离心收集,制成细胞悬液,调整细胞浓度至5-10×104个/mL;
(2)将细胞悬液制备好后,轻轻混匀,接种至96孔板,每孔加入200μL,边缘孔加无菌PBS;
(3)37℃培养24h后,弃去培养基,每孔加入100μL完全培养基,再加入100μL由无血清培养基稀释的不同浓度梯度的脂质体悬液;
(4)5%CO2,37℃孵育24-48h后,于倒置显微镜下观察细胞形态;
(5)每孔加入20μL MTT溶液,37℃继续培养4h;
(6)吸出培养基,每孔加入150μL二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10-15
min,使甲瓒结晶充分溶解,利用酶标仪测定OD490nm处的吸光值,并以OD630nm作为参比波长。
4.脂质体的细胞毒性分析结果:
图13和14为所制备的脂质体载体对肺癌细胞A549的细胞毒性试验,选择浓度从低到高的脂质体浓度进行实验,以PBS缓冲液作为对照组,发现当脂质体浓度高达312μg/mL时,对A549细胞的生长仍没有明显影响,而DPPC脂质体浓度增加至1000μg/mL才开始对A549细胞的生长产生影响,由此说明所制备的脂质体具有很好的安全性,两种脂质体对细胞均无毒性作用。
实施例3:装载RNA脂质体对细胞增殖的影响
分别将单独载有基因,共同运载基因的靶向脂质体与非靶向脂质体作用于肺癌细胞,对各组脂质体运载药物的抑癌作用进行测定分析与比较。按照MTT检测的步骤,分析装载不同siRNA的靶向与非靶向脂质体对细胞增殖的影响。
1.RT-PCR验证基因沉默效率
RNA的提取:培养细胞RNA的提取根据EZ-10DNAaway RNAMini-Preps Kit试剂盒(上海生工生物)中的操作步骤进行提取,具体步骤如下:
(1)吸尽六孔板中的培养基,2mL PBS冲洗2遍后,每个孔加入0.5mL胰酶,37℃消化2min,用移液器上下吹打细胞,使细胞全部脱落,然后将细胞吸至1.5mL EP管离心收集,并用PBS洗涤一次;
(2)向上述收集的细胞团块中加入350μL细胞裂解液Buffer Lysis-DR混匀;
(3)将裂解液加入gDNAEliminator Column,室温静置1min,然后12000rpm离心1min;
(4)将流穿液移入新的RNase Free管中,加入250μL无水乙醇,充分混匀;
(5)将上述混合液加入RZ-10RNAColumn柱,12000rpm离心1min,弃去流穿液;
(6)向纯化柱中加入500μL GT Solution,室温静置1min,然后室温12000rpm离心1min,弃去流穿液;
(7)向纯化柱中加入500μL NT Solution,室温静置1min,然后室温12000rpm离心1min,弃去流穿液;
(8)将纯化柱置于收集管中,室温12000rpm离心2min,静置3-5min出去乙醇;
(9)将纯化柱移入新的RNase Free管中,加入30-50μL无RNase水,室温静置2min,然后室温12000rpm离心2min,弃去收集含RNA流穿液;
(10)将提取的RNA进行反转录或者放在-80℃保存备用。
提取完成的RNA要进行完整性检查,一个是OD260/OD280在1.9-2.1之间。
(1)将试剂盒中的4×DNAMaster Mix与gDNAromover按照88μL:1.8μL的比例混合均匀;
(2)按照表3各成分配制DNaseⅠ反应溶液:
表3.DNaseⅠ反应溶液组分
(3)上述反应体系于37℃反应5min;
(4)向上述DNaseⅠ反应溶液中加入2μL5×RT Master MixⅡ溶液,置于PCR仪中按照表4程序进行逆转录反应:
表4.逆转录合成cDNA反应过程
3.半定量PCR初步检测mRNA转录水平
按照表设计的引物进行半定量PCR检测个基因cDNA是否成功逆转录出来同时初步检测个基因的相对量。分别测定三种基因单独使用和共同使用时的基因量。
表5.引物设计
M是MTH1基因,S为Survivin基因,H为HKDC1基因,B2M为内参基因β-2-微管蛋白基因(beta-2-microglobulin)
利用上述引物按照下述反应体系和程序进行PCR反应:
表6.半定量PCR反应体系
表7.半定量PCR反应条件
对PCR产物进行琼脂糖电泳分析,凝胶成像系统进行扩增条带观察与记录。
4.Real-time PCR检测各mRNA的转录水平
按照表设计的引物进行定量PCR检测各个基因的转录水平。按照下述反应体系和程序进行荧光定量PCR反应,由荧光定量PCR反应得出各组目的基因与管家基因的Ct值,通过相对定量法来确定目的基因的表达水平。按照如下公式计算目的基因与管家基因的相对量。
ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组(2-1)
计算各组目的基因的2-ΔΔCt值,即得出各基因的相对表达量。
表格8.定量PCR反应体系
表9.定量PCR反应条件
5.脂质体装载siRNA对细胞增殖的影响
分别利用靶向与非靶向脂质体装载三种siRNA,使三种siRNA分别独立作用于细胞和同事作用于细胞,MTT实验结果如下图15和图16所示。
图15是PC-98T:Chol脂质体装载不同siRNA对细胞活力的影响,由图可看出三种siRNA单独作用于同时作用时,对细胞的增殖均有明显的抑制作用,其中非靶向脂质体所装载的siRNA对细胞的抑制率分别为survivin siRNA40.4%,MTH1siRNA40.8%,HKDC1siRNA44%,MIX siRNA43.8%,靶向修饰的脂质体装载单一siRNA后对细胞的抑制率均增大,但是同时使用时对细胞的抑制率反而有所降低。其原因是因为同时利用三种siRNA转染细胞时,当siRNA进入细胞后,三种siRNA竞争性地形成RISC(RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex)),从而造成基因沉默效率降低的情况,另外,三种siRNA同时使用时,所用的浓度相对较低,每种siRNA浓度均为33.33nM,低于单独使用时的100nM。
由图16可知PC-98T:Chol脂质体所装载的单一以及三种siRNA对细胞增殖的抑制率要大于DPPC:DODAP:Chol脂质体相对应的抑制率,说明在细胞水平前者在细胞水平具有更高的转染效率。后一种脂质体载体装载siRNA对细胞的抑制作用并不明显,三种siRNA对细胞的抑制率分别为(survivin siRNA)12%,(MTH1siRNA)14%和(siRNA)17%对这是由于DPPC作为主要材料制备的脂质体,脂质体双层膜结构流动性差,脂质体硬度大,在与细胞膜进行相互作用时不容易进入细胞释放内容siRNA。
利用商品化转染不同浓度的survivin siRNA以观察其与本实验所制备的脂质体载体在siRNA转染方面的差别,由图17和18可知siRNA同为100nM时,2000转染试剂转染的siRNA对细胞的增殖抑制率低于本实验所制备的脂质体载体。另外,当无转染试剂时,发现不同浓度的siRNA对A549细胞没有明显的毒性作用。
实施例4:脂质体装载siRNA对细胞生长形态与基因转录水平的影响
1.对细胞形态的影响进行观察结果,下图19和20是两种靶向脂质体载体装载siRNA作用于A549细胞时对细胞形态的影响进行观察,发现分别单独装载三种siRNA的脂质体均能使细胞形态发生明显变化,皱缩,贴壁不牢,甚至悬浮的现象,相比于对照组和同时装载三种siRNA的载体,细胞密度较小。相比DPPC:DODAP:Chol脂质体载体而言,PC-98T:Chol脂质体载体装载siRNA对细胞形态影响更明显。
2.基因沉默效率检测结果
用靶向PC-98T:Chol脂质体分别单独装载三种siRNA和同时装载三种siRNA作用于细胞后,提取细胞中的总RNA,反转录得到cDNA,然后以cDNA作为模板进行目的基因的扩增,通过电泳验证cDNA是否合成,同时可以初步观察不同组基因的表达水平。由图21可知三种siRNA所对应的基因cDNA均成功合成,内参基因β-2-微管蛋白基因所对应的cDNA也成功合成,由电泳结果并不能准确定量反映出各个siRNA对相应基因转录水平的影响。需通过荧光定量PCR进一步确定。
S1为单独装载survivin的靶向脂质体组,S2为三种siRNA同时给药组,S3位对照组Survivin,C1,C2,C3分别为以上各组相应的内参基因β-2-微管蛋白基因(beta-2-microglobulin),H代表HKDC1siRNA作用组;M为MTH1siRNA作用组。
图22和23为两种靶向脂质体装载三种siRNA作用于细胞后,通过荧光定量PCR来确定各基因的沉默效率。图为靶向PC-98T:Chol脂质体装载不同siRNA对细胞内相应基因转录水平的影响,由图可知该载体可以明显抑制个基因的转录水平,转录水平相对于内参基因仅为16.7%(Survivin),19.88%(Mix survivin),43.22%(MTH1),23.61%(Mix MTH1),34.39%(HKDC1),22.53%(Mix HKDC1);而靶向DPPC:DODAP:Chol脂质体装载不同siRNA对相应基因转录水平的抑制效果不如前述载体明显,各基因转录水平相对于内参基因为48.3%(Survivin),116.5%(Mix survivin),50.35%(MTH1),137.6%(Mix MTH1),72.2%(HKDC1),109.4%(Mix HKDC1),将三中siRNA混合共同给药时,siRNA对目的基因的抑制效率大大下降。这与相关文献中所报道的现象不同,文献中同时装载两种siRNA并辅助化疗药物治疗时,对肿瘤的抑制效果优于单独使用时的效果。
通过半定量PCR与荧光定量PCR发现,装载三种siRNA的靶向PC-98T:Chol脂质体对相应基因具有很好的沉默效率,而DPPC:DODAP:Chol脂质体载体装载的siRNA对相应基因的沉默效率低于PC-98T:Chol脂质体,且同时装载三种siRNA时,靶向DPPC:DODAP:Chol脂质体对相应的基因未发生有效的基因沉默现象。将本实验制备的脂质体与商用2000,以及无载体介导的裸siRNA相比较,发现在控制siRNA浓度为100nmol/L时,本实验所制备的脂质体装载siRNA对肿瘤细胞的增殖抑制率优于2000,而无载体介导的siRNA对细胞生长无明显抑制作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏中慧元通生物科技有限公司
<120> 一种可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggctctata ccctggtgct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctttgccccc aaagccattc 20
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<211> 20
<212> DNA
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<210> 4
<211> 20
<212> DNA
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<400> 4
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<400> 5
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<212> DNA
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<400> 6
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<210> 7
<211> 20
<212> DNA
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<400> 7
acccccactg aaaaagatga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atcttcaaac ctccatgatg 20
Claims (7)
1.一种可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)利用成膜水化法制备脂质纳米颗粒,基础合成材料为摩尔比8:1~1:1的磷脂和胆固醇,所述磷脂为DPPC或者PC-98T;
(2)制备Mal-PEG2000-DSPE脂质体胶束,利用LHRH肽修饰所述胶束,利用LHRH肽与Mal-PEG2000-DSPE交联后的胶束修饰脂质体。
2.根据权利要求1所述的一种可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法,其特征在于,基础合成材料还包括和胆固醇相同摩尔比的DODAP。
3.根据权利要求1或2所述的一种可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法,其特征在于,DPPC或者PC-98T与胆固醇的摩尔比为3:1。
4.根据权利要求1或2所述的一种可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法,其特征在于,步骤(1)中将基础合成材料溶于三氯甲烷中,40℃旋蒸2h制备脂质膜,加入水,磁力搅拌水化处理,制备初级的脂质体悬浮液,高压匀浆,利用200nm聚碳酸脂膜过滤以除去大颗粒杂质,或者用200nm聚碳酸脂膜过滤10遍,并过450nm PVDF膜进行除菌,脂质体悬液置于4℃保存。
5.根据权利要求1或2所述的一种可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法,其特征在于,制备Mal-PEG2000-DSPE脂质体胶束包括:
(1)取1μmol/mL的mal-PEG2000-DSPE储备液2mL,回复至室温后,置于圆底烧瓶中,补加3mL氯仿,充分混匀;
(2)利用真空旋转蒸发仪对上述Mal-PEG2000-DSPE溶液进行旋蒸成膜,水浴温度37℃,旋蒸1h,充分除去有机溶剂;
(3)成膜后,先进行超声处理5min,以使脂膜充分脱落,便于水化,利用HEPES缓冲液进行水化,水化温度60℃,持续水化2h以充分水化;
(4)水化后,利用超声清洗机进行超声处理10min,温度60℃;
(5)200nm聚碳酸脂膜过滤,除去较大颗粒,转入无菌离心管,4℃保存备用。
6.权利要求1或2所述可鼻喷的稳定递载RNA分子的脂质纳米颗粒制备方法制备获得的脂质纳米颗粒。
7.权利要求6所述的脂质纳米颗粒在制备RNA类基因药物和疫苗分子经鼻递送给药方式药物载体中的应用。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113637708A (zh) * | 2021-08-09 | 2021-11-12 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体及其制备方法和应用 |
CN114129718A (zh) * | 2021-10-19 | 2022-03-04 | 华东师范大学 | 一种用于体内自组装car-t的纳米递送系统及其制备方法和应用 |
CN114558143A (zh) * | 2022-02-28 | 2022-05-31 | 唐颐控股(深圳)有限公司 | 一种mRNA脂质纳米疫苗的制备方法 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1455664A (zh) * | 2000-10-04 | 2003-11-12 | 协和发酵工业株式会社 | 由脂质膜被覆微粒的方法 |
WO2011142515A1 (ko) * | 2010-05-14 | 2011-11-17 | 한국생명공학연구원 | 핵산 및 친수성 음이온 화합물의 고효율 포획을 위한 비대칭 리포솜 및 이의 제조방법 |
CN102516395A (zh) * | 2011-12-22 | 2012-06-27 | 中国医学科学院生物医学工程研究所 | 提高药物/基因的靶向性和转染效率的多肽载体及用途 |
CN102516361A (zh) * | 2011-12-23 | 2012-06-27 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | Nrp-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物、其介导的主动靶向脂质体递药系统及其制备方法 |
CN102824647A (zh) * | 2011-06-13 | 2012-12-19 | 香港中文大学 | 基于小核酸药物成骨治疗的骨靶向递送系统及其制备方法 |
CN103830739A (zh) * | 2013-11-11 | 2014-06-04 | 上海交通大学 | 配体多肽ph1形成的药物输送系统及其用途 |
WO2017008076A1 (en) * | 2015-07-09 | 2017-01-12 | Insmed Incorporated | Compositions and methods for treating lung diseases and lung injury |
-
2021
- 2021-04-01 CN CN202110355364.1A patent/CN113058042B/zh active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1455664A (zh) * | 2000-10-04 | 2003-11-12 | 协和发酵工业株式会社 | 由脂质膜被覆微粒的方法 |
WO2011142515A1 (ko) * | 2010-05-14 | 2011-11-17 | 한국생명공학연구원 | 핵산 및 친수성 음이온 화합물의 고효율 포획을 위한 비대칭 리포솜 및 이의 제조방법 |
CN102824647A (zh) * | 2011-06-13 | 2012-12-19 | 香港中文大学 | 基于小核酸药物成骨治疗的骨靶向递送系统及其制备方法 |
CN102516395A (zh) * | 2011-12-22 | 2012-06-27 | 中国医学科学院生物医学工程研究所 | 提高药物/基因的靶向性和转染效率的多肽载体及用途 |
CN102516361A (zh) * | 2011-12-23 | 2012-06-27 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | Nrp-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物、其介导的主动靶向脂质体递药系统及其制备方法 |
CN103830739A (zh) * | 2013-11-11 | 2014-06-04 | 上海交通大学 | 配体多肽ph1形成的药物输送系统及其用途 |
WO2017008076A1 (en) * | 2015-07-09 | 2017-01-12 | Insmed Incorporated | Compositions and methods for treating lung diseases and lung injury |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MOHAMMAD RAMEZANI 等: "The influence of size, lipid composition and bilayer fluidity of cationic liposomes on the transfection efficiency of nanolipoplexes", 《COLLOIDS SURF B BIOINTERFACES》 * |
郑品劲 等: "单因素和正交设计法优化苦参素空间稳定脂质体处方", 《北方药学》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113637708A (zh) * | 2021-08-09 | 2021-11-12 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体及其制备方法和应用 |
CN114129718A (zh) * | 2021-10-19 | 2022-03-04 | 华东师范大学 | 一种用于体内自组装car-t的纳米递送系统及其制备方法和应用 |
CN114129718B (zh) * | 2021-10-19 | 2024-05-03 | 华东师范大学 | 一种用于体内自组装car-t的纳米递送系统及其制备方法和应用 |
CN114558143A (zh) * | 2022-02-28 | 2022-05-31 | 唐颐控股(深圳)有限公司 | 一种mRNA脂质纳米疫苗的制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113058042B (zh) | 2023-06-30 |
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