CN114558143A - 一种mRNA脂质纳米疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种mRNA脂质纳米疫苗的制备方法，具体步骤如下：S1、将酸酐加入到PEI溶液中，二者反应合成聚羧酸；S2、将步骤S1得到的PEI‑脂质纳米颗粒与DPPC、DPPG、DPPE‑PEG‑COOH、胆固醇溶解在氯仿中，将cGAMP溶解在水后加入到上述氯仿溶液中，真空超声后，真空蒸发去除氯仿；S3、加入PBS进行水化，超声获得脂质体；S4、在得到的脂质体溶液中加入EDC/NHS，反应15分钟，加入mRNA，搅拌后获得仿生病毒纳米疫苗。本发明采用上述的一种mRNA脂质纳米疫苗的制备方法，通过以可变长度和疏水尾取代比的短支PEI为基础合成的脂类PEI衍生物库，短分枝PEI形成稳定的复合物，使其将mRNA疫苗、质粒DNA递送到干细胞中，提高干细胞转染的有效性和安全性。

Description

一种mRNA脂质纳米疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及纳米颗粒技术领域，具体涉及脂质纳米颗粒并且能够由该脂质纳米颗粒用于递送mRNA疫苗的多功能核酸传递系统，尤其是涉及一种用于mRNA脂质纳米疫苗的制备方法。
背景技术
由于以mRNA为基础的疫苗具有作用高效快速、安全性高以及制备成本较低等特点，因此与基于蛋白短肽和质粒DNA的疫苗相比具有更大的发展潜力与优势。目前，在许多基础研究和临床试验中，mRNA疫苗的细胞内递送已显示出可诱导编码抗原蛋白质合成和加工递呈并激活T细胞，从而发挥高效率的抗肿瘤免疫反应的作用。
无修饰及递送载体的裸露mRNA注射具有快速且成本低的特点，但由于 mRNA自身带高负电荷、易降解、稳定性差等特点，mRNA的体内递送仍面临若干潜在挑战。将mRNA、质粒DNA递送到人体体内递送工具对有效性和安全性的要求很高。在目前可用的运输工具中，长线性聚乙烯亚胺已成功用于体外和体内的细胞转染。然而，短支化聚乙烯亚胺与长线型聚乙烯亚胺相比没有效率。由于长环质粒体积大，短分枝PEI不能形成稳定的复合物。除了聚合物递送工具外，脂质纳米颗粒已被开发用于体内高效肝细胞转染，并已在临床试验中得到验证。然而，基于DLin-MC3-DMA的脂质纳米颗粒需要经过覆盖基团和过度纯化的多步骤合成，这严重限制了脂质纳米颗粒用于干细胞转染的快速结构优化的可能性。
发明内容
本发明的目的是提供一种mRNA脂质纳米疫苗的制备方法，通过以可变长度和疏水尾取代比的短支PEI为基础合成的脂类PEI衍生物库，短分枝PEI 形成稳定的复合物，将质粒DNA递送到干细胞中，提高干细胞转染的有效性和安全性。
为实现上述目的，本发明提供了一种的mRNA脂质纳米疫苗的制备方法，具体步骤如下：
S1、将酸酐加入到PEI溶液中，二者反应合成聚羧酸；
S2、将步骤S1得到的PEI-脂质纳米颗粒与DPPC、DPPG、 DPPE-PEG-COOH、胆固醇溶解在氯仿中，将cGAMP溶解在无菌水后加入到上述氯仿溶液中，真空超声30min后，真空蒸发去除氯仿；
S3、加入PBS进行水化，超声20分钟获得脂质体；
S4、在得到的脂质体溶液中加入EDC/NHS，反应15分钟，加入mRNA 蛋白，室温搅拌1小时后获得仿生病毒纳米疫苗。
优选的，具体步骤如下：
S1、将酸酐加入到PEI溶液中，二者反应合成聚羧酸；
S2、将步骤S1得到的PEI-脂质纳米颗粒与13μg DPPC、2μg DPPG、2 μg DPPE-PEG-COOH、1μg胆固醇一同溶解在3mL氯仿中，将cGAMP溶解在1mL无酶无菌水中后加入到上述氯仿溶液中，真空超声30min后，真空蒸发去除氯仿；
S3、加入2mL PBS进行水化，然后超声处理20分钟以获得脂质体；
S4、得到的脂质体溶液中加入EDC(10mg/mL)/NHS(10mg/mL)，反应15分钟，加入mRNA蛋白，mRNA：脂质体的体积比为2：1，室温搅拌1 小时后获得仿生病毒纳米疫苗。
优选的，步骤S1中，酸酐为C8-C18的烷基酸酐。
优选的，步骤S1中，PEI-脂质/DOPE的质量比为1:0.5，PEI脂质与质粒的质量比为1:1。
优选的，酸酐为C12的烷基酸酐。
优选的，步骤S4中，mRNA的合成过程如下：
(1)将脂质体溶解于氯仿中，将mRNA水溶液加入上述混合液后，超声 15分钟，真空蒸发；
(2)加入PBS水化，获得mRNA疫苗。
优选的，步骤(1)中，脂质体由50％可电离阳离子脂质Dlin-MC3-DMA、 10％DSPC、35％胆固醇和5％DPPE-PEG组成。
优选的，PEI-脂质纳米颗粒在递送mRNA纳米疫苗和干细胞(如HESC) 转染中的应用。
因此，本发明采用上述一种mRNA脂质纳米疫苗的制备方法，充分利用了PEI-脂质纳米颗粒可以结合聚合物和脂质的特性，提供了一种简便的方法来生成一个电荷中和聚乙烯亚胺脂质纳米粒子库，用于递送mRNA疫苗和干细胞转染。
本发明的脂质纳米颗粒基于小支化聚乙烯亚胺(PEI)和脂质酸酐。超过 15％的脂质纳米颗粒在不同细胞类型中表现出高转染效率，疏水烷基取代的长度和比例是高效传递基因的关键参数。更重要的是，改进的PEI转染效率高于原阳离子PEI。改进的PEI显示出高效的质粒DNA递送可以有效地将两个质粒DNA共转移到难以转染的人类胚胎干细胞(HESC)。合成了20多个脂质PEIs，并在不同的细胞类型中测试了递送mRNA疫苗，包括人类胚胎干细胞(hESC)。
本发明的具体技术效果如下：
(1)本发明的脂质纳米颗粒可以用于递送mRNA疫苗和转染干细胞，它能提高递送mRNA疫苗和干细胞转染效率和安全性。
(2)本发明的简单的模块化和可扩展的方法，用于PEI与酸酐之间的亲核反应，以可变长度和疏水尾取代比的短支PEI为基础，平行合成脂类PEI 衍生物库，合成的PEI脂类部分电荷中和，可以潜在地降低PEI中多氨基的毒性。
(3)本发明的PEI-脂质纳米颗粒，制作方法简单，操作方便，可模块化，可扩展，不需要很高的技术要求，且易能够翻译递送mRNA和转染干细胞，安全性强，适宜推广。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1是构建PEI-脂质纳米颗粒的流程图；
图2是构建PEI-脂质纳米颗粒的酸酐实施例的化学式；
图3是构建PEI-脂质纳米颗粒成功递送mRNA纳米疫苗的荧光成像图。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的主旨或基本特征的情况下，能够以其它的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其它实施方式。这些其它实施方式也涵盖在本发明的保护范围内。
还应当理解，以上所述的具体实施例仅用于解释本发明，本发明的保护范围并不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明/发明的保护范围之内。
本发明中使用的“包括”或者“包含”等类似的词语意指在该词前的要素涵盖在该词后列举的要素，并不排除也涵盖其它要素的可能。术语“内”、“外”、“上”、“下”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制，当被描述对象的绝对位置改变后，则该相对位置关系也可能相应地改变。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“附着”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。本发明中使用的术语“约”具有本领域技术人员公知的含义，优选指该术语所修饰的数值在其±50％，±40％，±30％，±20％，±10％，±5％或±1％范围内。
本公开使用的所有术语(包括技术术语或者科学术语)与本公开所属领域的普通技术人员理解的含义相同，除非另外特别定义。还应当理解，在诸如通用词典中定义的术语应当被理解为具有与它们在相关技术的上下文中的含义相一致的含义，而不应用理想化或极度形式化的意义来解释，除非本文有明确地这样定义。
对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作为详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为说明书的一部分。
本发明说明书中引用的现有技术文献所公开的内容整体均通过引用并入本发明中，并且因此是本发明公开内容的一部分。
实施例
(一)材料和仪器
支化聚乙烯亚胺(PEI，平均Mw～800，平均Mn～600)：购自香港 SigmaAldrich有限公司；八乙基琥珀酸酐(S1、顺式反式混合物，GC>95.0％)， (2-壬-1-基)丁二酸酐(S2，支链异构体混合物，>90％)，四丙烯基琥珀酸酐(S3，支链异构体混合物，>85％)，2-十二烷基琥珀酸酐(S4，顺式和反式混合物，>95％)，十四烯基琥珀酸酐(S5，>85％GC)：购自上海TCI发展有限公司；溶剂：购自中国美耶尔(上海)化工科技有限公司。试剂未经进一步纯化使用，除非另有说明。溶剂购自中国美耶尔(上海)化工科技有限公司。
(二)PEI-脂类文库的初步合成。
每个脂质纳米颗粒都来源于由PEI溶液和酸酐溶液反应生成的结构不同的PEI-脂质纳米颗粒文库。
为了制备电荷中和的PEI-脂类库，用六种不同的酸酐S1-S6(烷基链长度从C8到C18，其化学式如图2)在不同浓度(从10％到40％)下进行了支化 PEI(平均Mw～800)的平行合成。PEI衍生物的合成是基于酸酐S1-S6与PEI (二者比例从10％到40％)反应，根据亲核反应生成24种酰胺PS11-PS64(如表1)。反应高效，简单，只在一天内完成。用于快速模块化合成结构不同的 PEI-脂质纳米颗粒文库，用于基因传递。
表1PEI-脂质纳米颗粒实施例的对照表
Figure RE-GDA0003559940680000061
Figure RE-GDA0003559940680000071
通过一步法进行递送mRNA纳米疫苗效率筛选，将Hela细胞接种在96 孔板中12小时后，将PEI-脂质纳米颗粒转移到培养孔中。培养2天后，细胞核Hoechst染色，荧光显微镜成像分析。
以商业化的lipo2000作为阳性对照。结果显示，文库中80％以上的脂类显示绿色荧光蛋白(GFP)阳性，超过15％的脂类显示明显高于lipo2000的转染效率。通过联合化学方法可以高效合成许多转染效率高的基因传递试剂。
(三)以如下通用制备过程制备PS00至PS64的PEI-脂质纳米颗粒，其步骤如下：
基于PEI的库合成包括PEI溶液、酸酐溶液的制备。然后，将酸酐S1-S6 加入到PEI溶液中，混合物在50℃下反应24小时，合成反应产物用于基因递送筛选。
表2对照样品和制备实施例PS00至PS64的制备
实施例 酸酐 PEI与酸酐的比例 实施例 酸酐 PEI与酸酐的比例
PS00 无 无 - - -
PS11 S1 10％ PS12 S1 20％
PS21 S2 10％ PS22 S2 20％
PS31 S3 10％ PS32 S3 20％
PS41 S4 10％ PS42 S4 20％
PS51 S5 10％ PS52 S5 20％
PS61 S6 10％ PS62 S6 20％
PS13 S1 30％ PS14 S1 40％
PS23 S2 30％ PS24 S2 40％
PS33 S3 30％ PS34 S3 40％
PS43 S4 30％ PS44 S4 40％
PS53 S5 30％ PS54 S5 40％
PS63 S6 30％ PS64 S6 40％
由不同比例的不同酸酐与PEI制备了PEI-脂质纳米颗粒，如表2。将这些不同的PEI-脂质纳米颗粒进行递送mRNA疫苗使干细胞表达绿色荧光蛋白 (GFP)，通过计算不同PEI脂质递送mRNA疫苗后荧光与总细胞的比例来确定表达效率，测量结果如表3所示。
表3对照样品和制备实施例的mRNA疫苗递送效率
实施例 mRNA疫苗递送效率 实施例 mRNA疫苗递送效率
PS00 0 Lipo2000 1.1
PS11 0.25 PS12 0.02
PS21 0.1 PS22 0.45
PS31 1.7 PS32 2.1
PS41 0.22 PS42 0.3
PS51 0.06 PS52 0.7
PS61 0.04 PS62 0.2
PS13 0.4 PS14 0.75
PS23 0.55 PS24 1.2
PS33 1.35 PS34 0.9
PS43 0.18 PS44 0.5
PS53 0.14 PS54 0.35
PS63 0.16 PS64 0.08
由表3中的数据可见，mRNA疫苗递送效率最高的PEI-脂质纳米颗粒的最优的酸酐取代类型是S3-C12烷基链。使用S3时，PEI氨基的最佳替代率为 20％。
因此，本发明采用上述一种mRNA脂质纳米疫苗的制备方法，通过以可变长度和疏水尾取代比的短支PEI为基础合成的脂类PEI衍生物库，短分枝 PEI形成稳定的复合物，将质粒DNA递送到干细胞中，提高干细胞转染的有效性和安全性。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.一种mRNA脂质纳米疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
S1、将酸酐加入到PEI溶液中，二者反应合成聚羧酸；
S2、将步骤S1得到的PEI-脂质纳米颗粒与DPPC、DPPG、DPPE-PEG-COOH、胆固醇溶解在氯仿中，将cGAMP溶解在无菌水后加入到上述氯仿溶液中，真空超声30min后，真空蒸发去除氯仿；
S3、加入PBS进行水化，超声20分钟获得脂质体；
S4、在得到的脂质体溶液中加入EDC/NHS，反应15分钟，加入mRNA，室温搅拌1小时后获得仿生病毒纳米疫苗。
2.根据权利要求1所述的一种mRNA脂质纳米疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
S1、将酸酐加入到PEI溶液中，二者反应合成聚羧酸；
S2、将步骤S1得到的PEI-脂质纳米颗粒与13μg DPPC、2μg DPPG、2μg DPPE-PEG-COOH、1μg胆固醇一同溶解在3mL氯仿中，将cGAMP溶解在1mL无酶无菌水中后加入到上述氯仿溶液中，真空超声30min后，真空蒸发去除氯仿；
S3、加入2mL PBS进行水化，然后超声处理20分钟以获得脂质体；
S4、得到的脂质体溶液中加入EDC(10mg/mL)/NHS(10mg/mL)，反应15分钟，加入mRNA，mRNA：脂质体的体积比为2：1，室温搅拌1小时后获得仿生病毒纳米疫苗。
3.根据权利要求1所述的一种mRNA脂质纳米疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S1中，酸酐为C8-C18的烷基酸酐。
4.根据权利要求1所述的一种mRNA脂质纳米疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S1中，PEI-脂质/DOPE的质量比为1:0.5，PEI脂质与质粒的质量比为1:1。
5.根据权利要求1所述的一种mRNA脂质纳米疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S1中，酸酐为C12的烷基酸酐。
6.根据权利要求1所述的一种mRNA脂质纳米疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S4中，mRNA的合成过程如下：
(1)将脂质体溶解于氯仿中，将mRNA水溶液加入上述混合液后，超声15分钟，真空蒸发；
(2)加入PBS水化，获得mRNA疫苗。
7.根据权利要求6所述的一种mRNA脂质纳米疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，脂质体由50％可电离阳离子脂质Dlin-MC3-DMA、10％DSPC、35％胆固醇和5％DPPE-PEG组成。
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