CN108250431A - 一种超支化聚乙烯亚胺接枝的聚l-甘氨酸共聚物及其制备方法 - Google Patents

一种超支化聚乙烯亚胺接枝的聚l-甘氨酸共聚物及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108250431A
CN108250431A CN201810052703.7A CN201810052703A CN108250431A CN 108250431 A CN108250431 A CN 108250431A CN 201810052703 A CN201810052703 A CN 201810052703A CN 108250431 A CN108250431 A CN 108250431A
Authority
CN
China
Prior art keywords
glycine
poly
polyethyleneimine
transfection
copolymer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810052703.7A
Other languages
English (en)
Inventor
田华雨
郭兆培
陈学思
陈杰
林琳
孙平杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS
Original Assignee
Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS filed Critical Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS
Priority to CN201810052703.7A priority Critical patent/CN108250431A/zh
Publication of CN108250431A publication Critical patent/CN108250431A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
    • C08G69/02—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids
    • C08G69/04—Preparatory processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
    • C08G69/02—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids
    • C08G69/08—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids derived from amino-carboxylic acids
    • C08G69/10—Alpha-amino-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)

Abstract

本发明提供了一种式(I)结构的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L‑甘氨酸共聚物。本发明将超支化聚乙烯亚胺作为大分子引发剂溶解在有机溶剂中，在无水无氧条件下引发L‑甘氨酸N‑羧酸酐开环聚合得到超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L‑甘氨酸接枝共聚物。聚合物是一种聚阳离子基因载体，转染效率高，其在同等条件下对MCF7和CHO细胞介导荧光素酶质粒DNA的转染效率最高为商业化PEI25K的10倍和8倍，在转染比例范围内，细胞存活率在80％以上；用于siRNA转染时，其对恒定表达荧光素酶的Huh7以及CT26细胞的基因沉默效率最高可达到80％以上，该聚合物相对于商业转染试剂PEI25K具有较高基因沉默效率和较小的细胞毒性。

Description

一种超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共聚物及其制备 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种超支化聚乙烯亚胺接枝的聚 L-甘氨酸共聚物及其制备方法。
背景技术
基因治疗已经成为一种重要的用于对抗人类遗传疾病及癌症的治疗手段 [参见Olefsky JM.Diabetes–gene therapy for rats and mice.Nature.2000 408: 420-421.Chen YC,Huang L.Tumor-targeted delivery of siRNA by nonviral vector:safeand effective cancer therapy.Expert.Opin.Drug.Deliv.2008 5: 1301-1311.]。基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式 导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目 的。如何高效的将基因导入细胞而发挥作用，成为目前制约基因治疗发展的 重要因素。目前用于基因治疗的载体可分为病毒类和非病毒载体两大类。病 毒类载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒 等。虽然基因传输效率很高，但是病毒类载体在临床应用中存在着很大的安 全隐患。所以，非病毒类载体成为发展的热点。非病毒载体多为高分子阳离 子聚合物，因其安全、有效、无免疫原性等优点，已成为病毒类载体最有希 望的替代者[参见Yuba,E.et al.Effectof unsaturated alkyl chains on transfection activity of poly(amidoamine)dendron-bearing lipids.J.Control.Release.2012 160: 552-560.Kulkarni,A.,DeFrees,K.,Hyun,SH.& Thompson,DH.Pendant polymer:amino-beta-cyclodextrin:siRNA guest-host nanoparticles as efficient vectors for genesilencing.J.Am.Chem.Soc.2012 134:7596-7599.]。阳离子聚合 物聚乙烯亚胺(PEI)是非病毒类载体中受到关注最多的一个，它含有大量的胺， 具有高密度的正电荷，可以有效保护、压缩基因物质。在众多已经报道的聚 阳离子载体中，聚乙烯亚胺由于其具有独特的“质子海绵效应”能够实现高效的 基因传递而倍受关注[参见Boussif O,Zanta M.A,BehrJ.P.et al.A Versatile Vector for Gene and Oligonucleotide Transfer into Cellsin Culture and in Vivo– Polyethylenimine.PNAS,1995；92:7297-7301]。聚乙烯亚胺的优点在于电荷密 度集中，对基因物质有强的复合能力，在低质量(m/m)比即能获得最佳转染 效率。聚乙烯亚胺已经在体外和体内的转染实验中得到一定的应用。然而， 其高密度的正电荷虽然可以有效担载基因物质，但同时也造成较大的细胞毒 性。尤其在体内应用时的非特异性吸附直接导致很低的转染效率，阻碍了它 的进一步发展[参见Lungwitz U,Breunig M,Blunk T,Gopferich A. Polyethylenimine-based non-viral gene deliverysystems.Eur.J.Pharm.Biopharm 2005；60(2):247-266.]。
近来，研究者们围绕降低毒性和提高转染效率展开了一系列对聚乙烯亚 胺的改性工作。例如，人们将疏水链段胆固醇、聚己内酯、聚乳酸等接入聚 乙烯亚胺上得到两亲性的聚合物[参见Liu ZH,Zhang ZY,Zhou CG,Jiao YP. Hydrophobic modifications ofcationic polymers for gene delivery.Prog Polym Sci 2010；35:1144-1162.]。在一定程度上降低了细胞毒性。但这类聚合物制备相对 比较麻烦，并且转染效率也没有太大提高。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共聚 物，本发明提供的共聚物毒性低，转染效率高。
本发明提供了一种式(I)结构的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共 聚物，
其中，n1，n2，n3，x，y为聚合度，600≥x+y≥40；3≤n1+n2+n3≤180。
优选的，所述聚乙烯亚胺分子量为1800～25000。
优选的，所述550≥x+y≥50；10≤n1+n2+n3≤170；(x+y)：(n1+n2+n3)＝1:110。
本发明提供了一种式(I)结构的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共 聚物的制备方法，包括：
将L-甘氨酸N-羧酸酐与超支化聚乙烯亚胺在溶剂中反应，得到式(I)结 构的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共聚物；
其中，n1，n2，n3，x，y为聚合度，600≥x+y≥40；3≤n1+n2+n3≤180。
优选的，所述聚乙烯亚胺与L-甘氨酸N-羧酸酐的摩尔比为1:10～1:120。
优选的，所述反应温度为0～50℃；所述反应时间为12～36h。
优选的，所述聚乙烯亚胺分子量为1800～25000；所述溶剂选自无水氯仿、 无水二氯甲烷和无水N’N’-二甲基甲酰胺中的一种或几种。
优选的，所述L-甘氨酸N-羧酸酐的质量g与溶剂的体积mL的比为1： (10～100)。
本发明提供了一种上述技术方案任意一项所述的式(I)结构的超支化聚 乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共聚物或上述技术方案任意一项的制备方法制备 得到的式(I)结构的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共聚物作为制备细 胞转染传递载体中的应用。
优选的，所述细胞转染的细胞选自HeLa、293T、293F、293S、MCF7、 CHO、CHO-S、COS7、COS-7L、CV-1、HEK-293、HT-1080、MDCK、NIH-3T3、 SKBR3和Vero中的一种或几种；所述细胞转染的质粒DNA选自pEGFPN1、 pCMV-lac Z和pGL3中的一种或几种。
与现有技术相比，本发明要解决的技术问题在提供一种式(I)结构的超 支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共聚物，其中，n1，n2，n3，x，y为聚合 度，600≥x+y≥40；3≤n1+n2+n3≤180。本发明将超支化聚乙烯亚胺作为大分子 引发剂溶解在有机溶剂中，在无水无氧条件下引发L-甘氨酸N-羧酸酐 (Gly-NCA)开环聚合得到超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸接枝共聚物 (PEI-PGly)。所制备的聚合物是一种高效的聚阳离子基因载体，转染效率高， 其在同等条件下对MCF7和CHO细胞介导荧光素酶质粒DNA的转染效率最 高为商业化PEI25K的10倍和8倍，在最佳转染比例范围内，细胞存活率在 80％以上；用于siRNA转染时，其对恒定表达荧光素酶的Huh7以及CT26细 胞的基因沉默效率最高可达到80％以上，该聚合物相对于商业转染试剂 PEI25K具有较高基因沉默效率和较小的细胞毒性，有广泛的应用前景。
具体实施方式
本发明提供了一种超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共聚物及其制备 方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需 要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的， 它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进 行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方 法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种式(I)结构的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共 聚物，
其中，n1，n2，n3，x，y为聚合度，600≥x+y≥40；优选的，550≥x+y≥50； 更优选的，520≥x+y≥60；
3≤n1+n2+n3≤180；优选的10≤n1+n2+n3≤170；更优选的， 20≤n1+n2+n3≤150。
按照本发明，(x+y)：(n1+n2+n3)＝1:110。
其中，所述聚乙烯亚胺分子量优选为1800～25000；更优选为1900～24000；
所述产物式(I)结构的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共聚物的分 子量优选为2370～35260。
本发明要解决的技术问题在提供一种式(I)结构的超支化聚乙烯亚胺接 枝的聚L-甘氨酸共聚物，其中，n1，n2，n3，x，y为聚合度，600≥x+y≥40； 3≤n1+n2+n3≤180。本发明将超支化聚乙烯亚胺作为大分子引发剂溶解在有机 溶剂中，在无水无氧条件下引发L-甘氨酸N-羧酸酐(Gly-NCA)开环聚合得 到超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸接枝共聚物(PEI-PGly)。所制备的聚 合物是一种高效的聚阳离子基因载体，转染效率高，其在同等条件下对MCF7 和CHO细胞介导荧光素酶质粒DNA的转染效率最高为商业化PEI25K的10 倍和8倍，在最佳转染比例范围内，细胞存活率在80％以上；用于siRNA转 染时，其对恒定表达荧光素酶的Huh7以及CT26细胞的基因沉默效率最高可 达到80％以上，该聚合物相对于商业转染试剂PEI25K具有较高基因沉默效率 和较小的细胞毒性，有广泛的应用前景。
本发明提供了一种式(I)结构的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共 聚物的制备方法，包括：
将L-甘氨酸N-羧酸酐与超支化聚乙烯亚胺在溶剂中反应，得到式(I)结 构的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共聚物；
其中，n1，n2，n3，x，y为聚合度，600≥x+y≥40；优选的，550≥x+y≥50； 更优选的，520≥x+y≥60；
3≤n1+n2+n3≤180；优选的10≤n1+n2+n3≤170；更优选的， 20≤n1+n2+n3≤150。
其中，所述聚乙烯亚胺分子量优选为1800～25000；更优选为1900～24000；
所述产物式(I)结构的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共聚物的分 子量优选为2370～35260。
本发明首先在无水无氧条件下，将L-甘氨酸N-羧酸酐(Gly-NCA)单体 质量(g)，与溶剂投料到干燥的反应器中，充入氮气保护，搅拌溶解；
所述溶剂优选选自无水氯仿、无水二氯甲烷和无水N’N’-二甲基甲酰胺中 的一种或几种。
其中，所述L-甘氨酸N-羧酸酐(Gly-NCA)单体质量(g)与溶剂的体 积(mL)的比为1～100：1；或者为1～10：1。
本发明对于所述搅拌溶解的具体方式不进行限定，本领域技术人员熟知 的即可。
搅拌后，将支化聚乙烯亚胺作为多胺引发剂溶解在溶剂中，并加入反应 器内，其中聚乙烯亚胺质量，与溶剂体积(mL)的比为1～100：1；或者为1～ 10：1。
其中，所述聚乙烯亚胺与L-甘氨酸N-羧酸酐的摩尔比优选1:10～1:120； 还可以为1:10～1:180。
所述反应温度优选为0～50℃；更优选为10～45℃；所述反应时间优选 为12～36h；更优选为12～30h；最优选为12～24h。
反应完成后优选在乙醚、石油醚或正己烷中沉降，所述沉降优选为自然 沉降。
沉降后过滤得到，本发明对此不进行限定，本领域技术人员熟知的即可。
过滤后，得到滤饼，用水溶解后，用截流分子量为7000Da的透析袋透析 72小时，期间换水4-6次，冷冻干燥，得到聚乙烯亚胺聚L-甘氨酸共聚物。
本发明对于所述超支化聚乙烯亚胺的来源不进行限定，市售即可。
本发明通过氨基酸N-羧酸酐开环聚合的方式使得对氨基酸的应用更加方 便灵活。疏水性的聚氨基酸同样具有很好的生物相容性。作为疏水链段引入 到聚乙烯亚胺上，其制备过程更为简便。通过在聚乙烯亚胺上引入聚氨基酸， 可以在不减少整体电荷量的情况下有效地降低电荷密度，从而降低了细胞毒 性。本发明将超支化聚乙烯亚胺作为大分子引发剂引发L-甘氨酸N-羧酸酐开 环聚合得到超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸接枝共聚物。所制备的聚合 物是一种新型高效的聚阳离子基因载体，其制备过程简便，易于大量制备， 对于基因治疗的发展将起到一定的积极作用。
本发明提供了一种上述技术方案任意一项所述的式(I)结构的超支化聚 乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共聚物或上述技术方案任意一项的制备方法制备 得到的式(I)结构的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共聚物作为制备细 胞转染传递载体中的应用。
在本发明中，所述细胞转染的细胞优选选自HeLa、293T、293F、293S、 MCF7、CHO、CHO-S、COS7、COS-7L、CV-1、HEK-293、HT-1080、MDCK、 NIH-3T3、SKBR3和Vero中的一种或几种；
所述细胞转染的质粒DNA优选选自pEGFPN1(绿色荧光蛋白质粒)、 pCMV-lac Z(-半乳糖苷酶质粒)和pGL3(荧光素酶质粒)中的一种或几种。
所述细胞转染的siRNA选自HeLa、CT26、Huh7和CHO中的一种或几 种。
按照本发明，所述超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共聚物作为质粒 DNA的细胞转染传递载体的具体用法如下：
(1)细胞的培养
细胞置于含体积分数为10％胎牛血清的培养液中，在37℃含体积分数为 5％二氧化碳的孵箱中连续培养。
(2)体外转染
转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格 尔培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体 积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80～90％。转染时，吸 弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，基因 组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10％胎牛血清的达尔伯克改良伊格 尔培养基至终体积200μL，继续培养24小时。
(3)体外转染效率的测定
a)绿色荧光蛋白(GFP)表达
用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白信号。阳性细胞发出明亮的绿色荧光， 而阴性细胞则无。用流式细胞仪检测阳性细胞的百分率。
b)荧光素酶活性检测
取出培养板，吸去培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，加入细胞裂解液 裂解，然后加入荧光素酶底物，用光度计测定转染效率。
c)-半乳糖苷酶染色
细胞用0.01mol/L的PBS洗涤，用0.4％多聚甲醛固定5min,PBS冲洗后 加入5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)染色液(配方为0.04％X-gal, 5mmol/L亚铁氰化钾,5mmol/L高铁氰化钾和2mmol/LMgCl2),放置37℃， 5％CO2孵育3h。阳性细胞呈深蓝色，计算阳性细胞的百分率。
(4)细胞毒性测试
采用噻唑蓝比色法比较评价基因载体材料的细胞毒性。
实验前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格 尔培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积 分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80～90％。将不同浓度的材 料与细胞共同培养24小时后，每孔分别加入20μl含质量分数为0.5％噻唑蓝的磷 酸盐缓冲液。混合物在37℃继续作用4小时，加入200μl二甲基亚砜溶解噻唑 蓝甲臢结晶10分钟。然后用酶标仪测试每孔的吸收，测试波长选用492nm。细 胞存活率按下公式计算：
细胞存活率(％)＝(Asample/Acontrol)×100
Asample是转染后的细胞样品孔的吸收，Acontrol是不与复合物溶液作用的 细胞样品孔的吸收，每组实验重复三次。
按照本发明，所述超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共聚物作为 siRNA的细胞转染传递载体的具体用法如下：
(1)CT26细胞的培养
取小鼠结肠癌CT26细胞，在含有10％(质量/体积百分数)的牛血清的 培养液中，在含5％(体积百分数)CO2、温度为37℃的孵箱中培养；
(2)肿瘤接种
购买重量在20g的Balb/C小鼠，肿瘤接种前，取对数生长期的CT26细 胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×103转/min离心5min，PBS洗涤三次 后，用PBS重悬细胞，按每只小鼠2×106细胞的密度接种于腋下，8天后， 瘤径长大至7mm时进行体内siRNA的转染。
(3)体内转染
基因物质选用沉默血管内皮生长因子的VEGFsiRNA，通过抑制VEGF的 表达实现抑制肿瘤生长的目的，基因组转染的复合物颗粒在含有5％(质量/ 体积百分数)的葡萄糖溶液中至终体积50μL，尾静脉注射给药。
(4)体内肿瘤生长的测定
从第一次给药开始测量瘤径大小，实验共14天
本发明提供的聚乙烯亚胺-聚甘氨酸载体是一种新型高效的聚阳离子基因 载体，转染效率高，其在同等条件下对HeLa细胞介导荧光素酶质粒的转染效 率最高为商业化PEI25K的10-20倍，在最佳转染比例范围内，细胞存活率在 80％以上；其基因沉默效率高，对恒定表达荧光素酶的Huh7细胞的最高基因 沉默效率为82.5％，该聚合物相对于商业转染试剂PEI25K有较高基因沉默效 率和较小的细胞毒性。对于DNA、siRNA都具有高的转染效率和低的细胞毒 性。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种超支化聚 乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共聚物及其制备方法进行详细描述。
实施例1聚乙烯亚胺-聚甘氨酸的制备
(1)在无水无氧条件下，按照甘氨酸N-羧酸酐(Gly-NCA)单体质量g， 分别与无水氯仿、无水二氯甲烷或者无水N’N’-二甲基甲酰胺的体积mL的配 比为1～100，1～10，将两者投料到干燥的反应器中，充入氮气保护，搅拌溶 解；然后将支化聚乙烯亚胺作为多胺引发剂溶解在无水氯仿、无水二氯甲烷 或者无水N’N’-二甲基甲酰胺中，并加入反应器内，其中聚乙烯亚胺质量g， 与无水氯仿、无水二氯甲烷或者无水N’N’-二甲基甲酰胺体积mL，配比为1～ 100，1～10；其中聚乙烯亚胺与Gly-NCA的质量比为1:10-1:120；控温0～50℃ 搅拌反应至少12小时，反应完成后在乙醚或正己烷中沉降，过滤，干燥滤饼， 得到聚乙烯亚胺聚甘氨酸共聚物。
(2)将得到的聚乙烯亚胺聚甘氨酸共聚物用水溶解后，用透析袋透析72 小时，期间换水4-6次，冷冻干燥，得到聚乙烯亚胺-聚甘氨酸共聚物(PEI-PGly)。超支化聚乙烯亚胺(PEI)与甘氨酸N-羧酸酐(PEI-PGly)反 应所投原料的质量比与产物分子量的对应关系列于表1。
表1原料的摩尔比与产物分子量的对应关系
实施例2
利用聚乙烯亚胺-聚甘氨酸介导pGL3(荧光素酶质粒)、pEGFPN1(绿色荧 光蛋白质粒)、pCMV-lac Z(-半乳糖苷酶质粒)对HeLa细胞的体外转染
HeLa细胞的培养
(1)取人宫颈癌细胞(HeLa细胞)，在含有10％小牛血清的培养液中连 续培养(5％CO2、37℃孵箱)。
(2)体外转染
转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格 尔培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体 积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80～90％。转染时，吸 弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，基因 组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10％胎牛血清的达尔伯克改良伊格 尔培养基至终体积200μL，继续培养24小时。
(3)体外转染效率的测定
取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，然后加入 荧光素底物，用光度计测定转染效率。表2给出了荧光素酶质粒的复合物的 转染效率。
绿色荧光蛋白(GFP)表达用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白信号。阳性细 胞发出明亮的绿色荧光，而阴性细胞则无。用流式细胞仪检测阳性细胞的百 分率。表3给出了绿色荧光蛋白质粒的复合物的转染效率。半乳糖苷酶染色 细胞用0.01mol/L的PBS洗涤，用0.4％多聚甲醛固定5min,PBS冲洗后加入 5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)染色液(配方为0.04％X-gal,5mmol/L 亚铁氰化钾,5mmol/L高铁氰化钾和2mmol/LMgCl2),放置37℃，5％CO2孵 育3h。阳性细胞呈深蓝色，计算阳性细胞的百分率。表4给出了-半乳糖苷酶 质粒的复合物的转染效率。
表2聚乙烯亚胺-聚甘氨酸基因载体系统介导荧光素酶质粒的体外转染效率
表3聚乙烯亚胺-聚甘氨酸基因载体系统介导绿色荧光蛋白质粒的体外转染效率
表4聚乙烯亚胺-聚甘氨酸基因载体系统介导-半乳糖苷酶质粒的体外转染效率
实施例3
利用聚乙烯亚胺-聚甘氨酸基因载体介导沉默荧光素酶的Luc siRNA在 Huh7细胞系中的转染
Huh7细胞的培养
(1)取Huh7细胞，在含有10％小牛血清的培养液中连续培养(5％CO2、 37℃孵箱)。
(2)体外转染
转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格 尔培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体 积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80～90％。转染时，吸 弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，基因 组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10％胎牛血清的达尔伯克改良伊格 尔培养基至终体积200μL，继续培养24小时。
(3)体外转染效率的测定
取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，然后加入 荧光素底物，用光度计测定转染效率。表5给出了荧光素酶沉默效率。
表5聚乙烯亚胺-聚甘氨酸基因载体系统介导沉默荧光素酶的Luc siRNA，体外转染效率
实施例4聚乙烯亚胺-聚甘氨酸基因载体系统在体内pDNA转染中的应 用
(1)CT26细胞的培养
取小鼠结肠癌CT26细胞，在含有10％(质量/体积百分数)的牛血清的 培养液中，在含5％(体积百分数)CO2、温度为37℃的孵箱中培养；
(2)肿瘤接种
购买重量在20g的Balb/C小鼠，肿瘤接种前，取对数生长期的CT26细 胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×103离心5min，PBS洗涤三次后，用 PBS重悬细胞，按每只小鼠2×106细胞的密度接种于腋下，10天后，瘤径长 大至10mm时进行体内转染。
(3)体内转染
基因组转染的复合物颗粒在含有5％(质量/体积百分数)的葡萄糖溶液中 至终体积0.5mL，尾静脉注射。
(4)体内转染效率的测定
体内转染48h后，处死小鼠，取出肿瘤，PBS洗涤2次，加入裂解液裂 解，匀浆，然后加入荧光素底物，测定转染效率。表6给出了体内实验荧光 素酶质粒的复合物的转染效率。
表6聚乙烯亚胺-聚甘氨酸基因载体系统介导荧光素酶质粒体内转染效率
实施例5聚乙烯亚胺-聚甘氨酸基因载体系统在体内siRNA转染中的应 用
(1)CT26细胞的培养
取小鼠结肠癌CT26细胞，在含有10％(质量/体积百分数)的牛血清的 培养液中，在含5％(体积百分数)CO2、温度为37℃的孵箱中培养；
(2)肿瘤接种
购买重量在20g的Balb/C小鼠，肿瘤接种前，取对数生长期的CT26细 胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×103转/min离心5min，PBS洗涤三次 后，用PBS重悬细胞，按每只小鼠2×106细胞的密度接种于腋下，8天后，瘤 径长大至7mm时进行体内siRNA的转染。
(3)体内转染
基因物质选用沉默血管内皮生长因子的VEGFsiRNA，通过抑制VEGF的 表达实现抑制肿瘤生长的目的，基因组转染的复合物颗粒在含有5％(质量/ 体积百分数)的葡萄糖溶液中至终体积50μL，尾静脉注射给药。
(4)体内肿瘤生长的测定
从第一次给药开始测量瘤径大小，实验共14天。表7给出了体内实验 VEGFsiRNA的复合物对肿瘤抑制14天后的瘤径。
表7聚乙烯亚胺-聚甘氨酸基因载体系统介导VEGFsiRNA体内转染效率，瘤径大小
注：本发明选用不含载体的VEGF siRNA以及只含有5％Glucose的空白 体系做为对比。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种式(I)结构的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共聚物，
其中，n1，n2，n3，x，y为聚合度，600≥x+y≥40；3≤n1+n2+n3≤180。
2.根据权利要求1所述的共聚物，其特征在于，所述聚乙烯亚胺分子量为1800～25000。
3.根据权利要求1所述的共聚物，其特征在于，所述550≥x+y≥50；10≤n1+n2+n3≤170；(x+y)：(n1+n2+n3)＝1:110。
4.一种式(I)结构的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共聚物的制备方法，包括：
将L-甘氨酸N-羧酸酐与超支化聚乙烯亚胺在溶剂中反应，得到式(I)结构的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共聚物；
其中，n1，n2，n3，x，y为聚合度，600≥x+y≥40；3≤n1+n2+n3≤180。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺与L-甘氨酸N-羧酸酐的摩尔比为1:10～1:120。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述反应温度为0～50℃；所述反应时间为12～36h。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺分子量为1800～25000；所述溶剂选自无水氯仿、无水二氯甲烷和无水N’N’-二甲基甲酰胺中的一种或几种。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述L-甘氨酸N-羧酸酐的质量g与溶剂的体积mL的比为1：(10～100)。
9.一种权利要求1～3任意一项所述的式(I)结构的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共聚物或权利要求4～9任意一项的制备方法制备得到的式(I)结构的超支化聚乙烯亚胺接枝的聚L-甘氨酸共聚物作为制备细胞转染传递载体中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述细胞转染的细胞选自HeLa、293T、293F、293S、MCF7、CHO、CHO-S、COS7、COS-7L、CV-1、HEK-293、HT-1080、MDCK、NIH-3T3、SKBR3和Vero中的一种或几种；所述细胞转染的质粒DNA选自pEGFPN1、pCMV-lac Z和pGL3中的一种或几种；所述细胞转染的siRNA选自HeLa、CT26、Huh7和CHO中的一种或几种。
CN201810052703.7A 2018-01-19 2018-01-19 一种超支化聚乙烯亚胺接枝的聚l-甘氨酸共聚物及其制备方法 Pending CN108250431A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810052703.7A CN108250431A (zh) 2018-01-19 2018-01-19 一种超支化聚乙烯亚胺接枝的聚l-甘氨酸共聚物及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810052703.7A CN108250431A (zh) 2018-01-19 2018-01-19 一种超支化聚乙烯亚胺接枝的聚l-甘氨酸共聚物及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108250431A true CN108250431A (zh) 2018-07-06

Family

ID=62741873

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810052703.7A Pending CN108250431A (zh) 2018-01-19 2018-01-19 一种超支化聚乙烯亚胺接枝的聚l-甘氨酸共聚物及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108250431A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113101376A (zh) * 2021-04-12 2021-07-13 中国科学院长春应用化学研究所 一种可用于基因治疗的复合基因载体及其制备方法和应用
CN114044898A (zh) * 2021-12-27 2022-02-15 中国科学院长春应用化学研究所 一种赖氨酸接枝聚乙烯亚胺阳离子基因载体及其制备方法和应用
CN114558143A (zh) * 2022-02-28 2022-05-31 唐颐控股(深圳)有限公司 一种mRNA脂质纳米疫苗的制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103709400A (zh) * 2013-12-23 2014-04-09 中国科学院长春应用化学研究所 一种超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物及其制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103709400A (zh) * 2013-12-23 2014-04-09 中国科学院长春应用化学研究所 一种超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物及其制备方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113101376A (zh) * 2021-04-12 2021-07-13 中国科学院长春应用化学研究所 一种可用于基因治疗的复合基因载体及其制备方法和应用
CN114044898A (zh) * 2021-12-27 2022-02-15 中国科学院长春应用化学研究所 一种赖氨酸接枝聚乙烯亚胺阳离子基因载体及其制备方法和应用
CN114044898B (zh) * 2021-12-27 2022-07-12 中国科学院长春应用化学研究所 一种赖氨酸接枝聚乙烯亚胺阳离子基因载体及其制备方法和应用
CN114558143A (zh) * 2022-02-28 2022-05-31 唐颐控股(深圳)有限公司 一种mRNA脂质纳米疫苗的制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103709400B (zh) 一种超支化聚乙烯亚胺接枝的聚丙氨酸共聚物及其制备方法
CN107034237B (zh) 一种car-nk细胞及其制备方法与应用
CN103665384B (zh) 新型阳离子接枝共聚物及多重复合非病毒基因载体制备方法和应用
US20110306656A1 (en) Biologically tolerated low molecular weight polyethylenimines
CN105362251B (zh) DOTAP-mPEG-PLA纳米粒及其纳米粒溶液、载药复合物和制备方法和应用
CN106478947B (zh) 一种改性超支化聚乙烯亚胺、其制备方法及应用
CN108250431A (zh) 一种超支化聚乙烯亚胺接枝的聚l-甘氨酸共聚物及其制备方法
CN102775602B (zh) 一种聚乙烯亚胺-聚赖氨酸共聚物及其制备方法
CN102816795B (zh) 一种基因载体系统及其制备方法
CN101085356A (zh) 一种非病毒基因转染载体、其与质粒dna复合物颗粒及制备方法和用法
Hao et al. Covalent organic framework nanoparticles for anti-tumor gene therapy
CN101575416A (zh) 多臂聚氨基酸(酯)接枝聚乙烯亚胺共聚物与制法及在基因传递中的应用
CN112142972A (zh) 修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其合成方法和应用
CN108384810A (zh) 一种高转染效率低细胞毒性的阳离子基因载体及其制备方法
CN101704949A (zh) 丙烯酰胺类单体修饰的聚乙烯亚胺、制法和在基因传递中的应用
Jeong et al. Bioreducible cationic poly (amido amine) s for enhanced gene delivery and osteogenic differentiation of tonsil-derived mesenchymal stem Cells
WO2022262050A1 (zh) 一种非病毒载体及其制备方法与应用
CN103497961B (zh) 一种基因载体系统及其制备方法
CN112641952A (zh) 基因传递载体、含该基因传递载体的基因传递系统及其药物组合物
CN108424437A (zh) 一种递送分子及纳米颗粒、制备方法、用途
CN104758949A (zh) 一种肿瘤靶向腺病毒高分子给药系统及制备方法
CN114452266B (zh) 一种基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统及其制备方法和应用
CN106497084B (zh) 改性聚乙二醇/碳酸钙复合材料、其制备方法及应用
CN101812177B (zh) 类固醇激素修饰的阳离子聚合物及其基因复合物的制备
CN106086079A (zh) 多重靶向修饰的载基因复合物及制备方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180706