CN101085356A - 一种非病毒基因转染载体、其与质粒dna复合物颗粒及制备方法和用法 - Google Patents

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CN101085356A CNA2007100557918A CN200710055791A CN101085356A CN 101085356 A CN101085356 A CN 101085356A CN A2007100557918 A CNA2007100557918 A CN A2007100557918A CN 200710055791 A CN200710055791 A CN 200710055791A CN 101085356 A CN101085356 A CN 101085356A
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田华雨
陈磊
王宇
夏加亮
陈杰
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本发明属于非病毒基因转染载体的技术领域，涉及一种非病毒基因转染载体、其与质粒DNA复合物颗粒及制备方法和用法。所述的聚乙烯亚胺和含有苯环的疏水单元的质量比为1∶9～4∶6；所述的聚乙烯亚胺为平均分子量为1.8K～25K的超支化聚乙烯亚胺(PEI)；所述的含有苯环的疏水单元为：γ－卞酯－L－谷氨酸、ε－苄氧羰基赖氨酸、苯丙氨酸的任一种、两种以任意比例组合的产物或三种以任意比例组合的产物。该含有苯环的疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物与基因物质复合形成表面带正电荷，粒径在50～300nm的复合物颗粒。该复合物颗粒可以将负载的基因物质转移到细胞内，实现基因物质的表达，完成转染过程。本发明制备的非病毒基因转染载体具有毒性低、转染效率高的特点，可以作为体内和体外的转染试剂使用。

Description

一种非病毒基因转染载体、其与质粒DNA复合物颗粒及制备方法和用法
技术领域
本发明属于非病毒基因转染载体的技术领域，涉及非病毒基因转染载体、其与质粒DNA复合物颗粒及制备方法和用法。
背景技术
基因治疗是指运用DNA转移来治疗甚至预防人类疾患的一种治疗方法。近年来，基因治疗的发展使得医治遗传疾病或癌症成为可能。成功的基因治疗依赖于有效的基因载体。利用病毒载体介导基因转移是基因治疗中应用最广泛的方法，其中包括逆转录病毒、腺病毒(AV)、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、痘苗病毒(VV)等载体。但是病毒类载体在临床应用中存在着很大的安全隐患。非病毒类载体因其安全、有效、无免疫原性等优点，已成为病毒类载体最有希望的替代者，而且非病毒类载体相对而言便宜易得，在价格上有优势。
阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)是非病毒类载体受到关注最多的一个，它已经在体外和体内的转染实验中得到应用。PEI是通过静电作用与基因物质复合，形成尺寸合适的复合物颗粒，然后通过细胞对该复合物颗粒的吞噬达到基因转染的目的。由于PEI自身的“质子泵效应”，它与聚(L-赖氨酸)相比，既不需要裂解胞内体的试剂也不需要溶酶体类或是任何易于受体介导的试剂，因此PEI是阳离子聚合物类基因载体中综合性能最优异的一个。
但是，PEI作为基因载体仍然存在两个突出的问题。(1)和病毒类载体相比，其转染效率不高；(2)PEI胞毒性较大。这两个问题影响了PEI在临床治疗上的进一步应用，因此对PEI进行改性得到低毒高效的基因转染载体显得尤为迫切。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种非病毒基因转染载体、其与质粒DNA复合物颗粒及制备方法和用法。
本发明的一个目的是提供一种非病毒基因转染载体，所述的一种非病毒基因转染载体为含有苯环疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物；所述的聚乙烯亚胺和含有苯环的疏水单元的质量比为1∶9～4∶6；所述的聚乙烯亚胺为平均分子量为1.8K～25K的超支化聚乙烯亚胺；所述的含有苯环的疏水单元为：γ-卞酯-L-谷氨酸、ε-苄氧羰基赖氨酸、苯丙氨酸的任一种、两种以任意比例组合的产物或三种以任意比例组合的产物。
本发明的第二个目的是提供上述一种非病毒基因转染载体的制备方法。其步骤和条件如下：
按照聚乙烯亚胺：含有苯环的疏水性的氨基酸的N羧酸酐环状单体的质量比为1∶9～4∶6，将聚乙烯亚胺和含有苯环的疏水性的氨基酸的N羧酸酐环状单体分别溶于氯仿，搅拌充分溶解，再在搅拌条件下，3小时内将含有苯环的疏水性的氨基酸的N羧酸酐环状单体的氯仿溶液滴加到聚乙烯亚胺的氯仿溶液中，室温反应72小时，将反应液浓缩为为原体积的三分之一以下，然后用是浓缩体积的5～10倍的乙醚沉降，真空干燥得到产物，然后将产物溶于水中，置于透析袋中，用蒸馏水透析48小时，透析液冷冻干燥后，得到一种非病毒基因转染载体；
所述的聚乙烯亚胺为平均分子量为1.8K～25K的超支化聚乙烯亚胺；所述的含有苯环的疏水单元，选自γ-卞酯-L-谷氨酸、ε-苄氧羰基赖氨酸、苯丙氨酸的任一种、两种以任意比例组合的产物或三种以任意比例组合的产物，所述的一种非病毒基因转染载体为含有苯环疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物。
本发明的第三个目的是提供上述的一种非病毒基因转染载体/质粒DNA复合物颗粒的制备方法。
(1)一种非病毒基因转染载体/绿色荧光蛋白质粒DNA复合物颗粒的制备方法，步骤和条件如下：
取一种非病毒基因转染载体加水溶解，得到一种非病毒基因转染载体的水溶液，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌；用二次水配制质粒DNA水溶液，按照一种非病毒基因转染载体：绿色荧光蛋白质粒DNA的质量比为0.1∶1～100∶1，将一种非病毒基因转染载体的水溶液和质粒DNA水溶液混合，把该水溶液置室温30分钟，进一步促进一种非病毒基因转染载体与质粒DNA复合物颗粒的形成，得到一种非病毒基因转染载体/质粒DNA复合物颗粒；
所述的聚乙烯亚胺为平均分子量为1.8K～25K的超支化聚乙烯亚胺；所述的含有苯环的疏水单元，选自γ-卞酯-L-谷氨酸、ε-苄氧羰基赖氨酸、苯丙氨酸的任一种、两种以任意比例组合的产物或三种以任意比例组合的产物，所述的一种非病毒基因转染载体为含有苯环疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物，所述的一种非病毒基因转染载体为含有苯环疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物。
该复合物颗粒的直径在50～300nm，表面电位为+5mV～+40mV。
(2)一种非病毒基因转染载体/荧光素酶质粒DNA复合物颗粒的制备方法，步骤和条件如下：
一种非病毒基因转染载体：荧光素酶质粒DNA质量比为0.1∶1～100∶1，按照步骤(1)的条件，得到一种非病毒基因转染载体/荧光素酶质粒DNA复合物颗粒。其粒径为50-300nm，表面电荷为+5mV～+40mV。
本发明的第四个目的是提供一种非病毒基因转染载体在体外转染中的应用方法，所述的一种非病毒基因转染载体为含有苯环疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物，其步骤和条件如下：
(1)HeLa细胞的培养
取人宫颈癌细胞(HeLa细胞)，在含有10％小牛血清的培养液中，置于5％CO2、37℃孵箱中连续培养，取对数生长期细胞，胰酶消化后用DMEM稀释，按每孔4×105细胞的密度接种于6孔培养板，孵箱内预培养24小时。
(2)体外转染
转染前24小时内，将HeLa细胞按4×105/孔种于6孔培养板中，置于5％CO2、37℃孵箱中继续培养至80～90％融合，转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次，加入一种非病毒基因转染载体/质粒DNA复合物颗粒，以及无血清或者含有10％FBS的DMEM培养基至终体积0.5ml，继续培养48小时。
(3)体外转染效率的测定
取出培养板，用PBS清洗细胞两次，然后加入胰酶消化，离心除去上清，然后加入PBS重悬，用流式细胞仪测定细胞转染效率。
取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，然后加入荧光素底物，用光度计测定转染效率。
本发明的一种非病毒基因转染载体还可以对Vero细胞和293T细胞进行转染，其步骤和条件按照目的四中步骤(1)、(2)和(3)进行。
本发明的第五个目的是提供一种非病毒基因转染载体在体内转染中的应用的动物实验：
取13周体重为22～25克的BALB/c老鼠，取复合物溶液100μL在后腿肌肉分别注射，48小时后用精诺真活体成像仪观测体内转然效果。在进行活体成像观察之前，将小鼠麻醉。麻醉5分钟后，向小鼠体内注入200uL荧光素。10分钟后，用活体成像系统观察体内转染效果。
本发明的一种非病毒基因转染载体/绿色荧光蛋白质粒DNA复合物颗粒，其对在体外对HeLa细胞的转染效率最高为75％。转染的特点是：转染效率高，细胞毒性小。
本发明的一种非病毒基因转染载体/荧光素酶质粒DNA复合物颗粒，其在体外对HeLa细胞的转染效率最高为1.7×105RLU/mg。转染的特点是：转染效率高，细胞毒性小。
本发明的优点是：本发明将含苯环的疏水单元引入超支化聚乙烯亚胺，降低了聚乙烯亚胺的电荷密度，降低了细胞毒性。同时由于带苯环的疏水单元可以增加载体与细胞膜的融合作用，这可以增加细胞对载体的吞噬效率，有利于提高转染效率。
附图说明
图1是不同材料不同浓度条件下的细胞毒性与聚乙烯亚胺比较的结果。
图2是PP-1064介导绿色荧光蛋白质粒对HeLa细胞转染后的荧光照片(bar＝50μm)。
图3是体内转染实验效果图。由图3可见，聚乙烯亚胺-谷氨酸卞酯共聚物载体可以介导荧光素酶质粒在小鼠体内有适当的目的基因表达。
具体实施方式
实施例1：聚乙烯亚胺-γ-卞酯-L-谷氨酸共聚物的制备
取分子量分别为1.8K，5K，10K，25K的超支化聚乙烯亚胺1g，加100mL氯仿溶解。
γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐环状单体溶于氯仿中，配成1％wt浓度的氯仿溶液。磁力搅拌下，按照聚乙烯亚胺和γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐环状单体的质量比为1∶9～4∶6的比例，将γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐环状单体的氯仿溶液滴加到聚乙烯亚胺的氯仿溶液中，3小时内滴加完毕，反应在室温下进行72小时。反应完全后，用乙醚将反应物沉降出来，真空干燥。然后将产物溶于二次水，对该二次水溶液透析48小时，透析液冷冻干燥，得到聚乙烯亚胺-γ-卞酯-L-谷氨酸共聚物。产物低温干燥保存。产物的组成和分子量用核磁和元素分析的方法来确定，结果见表1。
表1聚乙烯亚胺-γ-卞酯-L-谷氨酸共聚物共聚物的合成
聚乙烯亚胺分子量(KD)  聚乙烯亚胺和γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐单体的投料质量比  共聚物中γ-卞酯-L-谷氨酸的含量(wt％)  共聚物的分子量(KD)
1.8  5∶5  42.4  3.1
5  5∶5  39.8  8.3
10  5∶5  40.3  16.8
10  6∶4  33.6  15.0
25  5∶5  41.5  42.7
25  6∶4  31.2  36.3
实施例2：聚乙烯亚胺-ε-苄氧羰基赖氨酸共聚物的制备
取分子量分别为1.8K，5K，10K，25K的超支化聚乙烯亚胺1g，加100mL氯仿溶解。
ε-苄氧羰基赖氨酸的N羧酸酐环状单体溶于氯仿中，配成1％wt浓度的氯仿溶液。磁力搅拌下，按照聚乙烯亚胺和ε-苄氧羰基赖氨酸的N羧酸酐环状单体的质量比为1∶9～4∶6，将ε-苄氧羰基赖氨酸的N羧酸酐环状单体的氯仿溶液滴加到聚乙烯亚胺的氯仿溶液中，3小时内滴加完毕，反应在室温下进行72小时。反应完全后，用乙醚将反应物沉降出来，真空干燥。然后将产物溶于二次水，对该二次水溶液透析48小时，透析液冷冻干燥，得到聚乙烯亚胺-ε-苄氧羰基赖氨酸共聚物。产物低温干燥保存。产物的组成和分子量用核磁和元素分析的方法来确定，结果见表2。
表2聚乙烯亚胺-ε-苄氧羰基赖氨酸共聚物的合成
 聚乙烯亚胺分子量(KD)  聚乙烯亚胺和ε-苄氧羰基赖氨酸的N羧酸酐单体的投料质量比  共聚物中ε-苄氧羰基赖氨酸的含量(wt％)  共聚物的分子量(KD)
 1.8  6∶4  33.2  2.7
 5  6∶4  34.5  7.6
 10  5∶5  43.1  17.6
 10  6∶4  35.8  15.6
 25  5∶5  42.6  43.6
 25  6∶4  32.9  37.3
实施例3：聚乙烯亚胺-苯丙氨酸共聚物的制备
取分子量分别为1.8K，5K，10K，25K的超支化聚乙烯亚胺1g，加100mL氯仿溶解。苯丙氨酸的N羧酸酐环状单体溶于氯仿中，配成1％wt浓度的氯仿溶液。磁力搅拌下，按照聚乙烯亚胺和γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐环状单体的质量比为1∶9～4∶6的比例，将γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐环状单体的氯仿溶液滴加到聚乙烯亚胺的氯仿溶液中，3小时内滴加完毕，反应在室温下进行72小时。反应完全后，用乙醚将反应物沉降出来，真空干燥。然后将产物溶于二次水，对该二次水溶液透析48小时，透析液冷冻干燥，得到聚乙烯亚胺-苯丙氨酸共聚物。产物低温干燥保存。产物的组成和分子量用核磁和元素分析的方法来确定，结果见表3。
表3聚乙烯亚胺-苯丙氨酸共聚物的合成
  聚乙烯亚胺分子量(KD)  聚乙烯亚胺和苯丙氨酸的N羧酸酐单体的投料质量比  共聚物中苯丙氨酸的含量(wt％)  共聚物的分子量(KD)
  1.8  6∶4  31.2  2.6
  5  6∶4  30.6  7.2
  10  5∶5  40.1  16.7
10 6∶4 32.7 14.9
  25  5∶5  39.8  41.5
  25  6∶4  29.8  35.6
实施例4：聚乙烯亚胺-(γ-卞酯-L-谷氨酸-ε-苄氧羰基赖氨酸-苯丙氨酸)共聚物的制备
取分子量分别为1.8K，5K，10K，25K的超支化聚乙烯亚胺1g，加100mL氯仿溶解。γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐环状单体、ε-苄氧羰基赖氨酸的N羧酸酐环状单体和苯丙氨酸苯丙氨酸的N羧酸酐环状单体按照任意比例溶于氯仿中，配成1％wt浓度的氯仿溶液。磁力搅拌下，按照聚乙烯亚胺和γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐环状单体、ε-苄氧羰基赖氨酸的N羧酸酐环状单体和苯丙氨酸苯丙氨酸的N羧酸酐环状单体混合物的质量比为1∶9～4∶6的比例，将混合的环状单体的氯仿溶液滴加到聚乙烯亚胺的氯仿溶液中，3小时内滴加完毕，反应在室温下进行72小时。反应完全后，用乙醚将反应物沉降出来，真空干燥。然后将产物溶于二次水，对该二次水溶液透析48小时，透析液冷冻干燥，得到聚乙烯亚胺-(γ-卞酯-L-谷氨酸-ε-苄氧羰基赖氨酸-苯丙氨酸)共聚物。产物低温干燥保存。产物的组成和分子量用核磁和元素分析的方法来确定，结果见表4
表4聚乙烯亚胺-(γ-卞酯-L-谷氨酸-ε-苄氧羰基赖氨酸-苯丙氨酸)共聚物的合成
聚乙烯亚胺分子量(KD)  聚乙烯亚胺和混合单体的投料比  共聚物中γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐环状单体的含量(wt％)  ε-苄氧羰基赖氨酸的N羧酸酐环状单体的含量(wt％) 苯丙氨酸的N羧酸酐环状单体的含量(wt％)  共聚物的分子量
1.8  6∶2∶1∶1  16.8  8.1 7.9  2.7
5  6∶2∶1∶1  15.9  8.9 7.6  7.4
10  6∶2∶1∶1  16.3  8.7 7.3  14.8
10  6∶1∶1∶2  8.3  8.8 15.6  14.9
25  6∶1∶2∶1  8.3  17.9 7.8  38.8
25  6∶2∶1∶1  17.1  8.6 7.5  38.2
实施例5：一种非病毒基因转染载体的细胞毒性评价
材料的细胞毒性采用MTT方法评价。在96孔细胞培养板的每孔中植入1.0×105的细胞，DMEM培养液中含10％FBS，100units/ml青霉素，100μg/mL链霉素，在37℃，5％CO2孵箱中培养24h。配制不同浓度的载体的PBS溶液。然后在每孔中加入100μL的载体聚合物溶液，在37℃，5％CO2孵箱中继续培养24h。然后加入20μL MTT溶液[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，5mg/ml in PBS]。混合物在37℃继续作用4h，加入200μL DMSO溶解MTT甲臢(formazan)结晶10min。然后用ELISAmicroplate reader(Bio-Rad)酶标仪测试每孔的吸收，测试波长选用492nm。细胞存活率按下公式计算：
细胞存活率(％)＝(Asample/Acontrol)×100
Asample是与聚合物溶液作用的细胞样品孔的吸收，Acontrol是不与聚合物溶液作用的细胞样品孔的吸收，每组实验重复三次。图1是不同材料不同浓度条件下的细胞毒性与聚乙烯亚胺比较的结果。由图1可见，浓度为0.5mg/mL的PEI和细胞作用24小时后，只有不超过25％的细胞存活，而浓度为5mg/mL的含有苯环疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物和细胞作用24小时，仍然有超过40％的细胞存活。由此可见，含有苯环疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物的细胞毒性和聚乙烯亚胺相比有了显著的下降。
实施例6：一种非病毒基因转染载体/质粒DNA复合物颗粒的制备
取一种非病毒基因转染载体，加二次水溶解，配置成浓度为0.02～2mg/mL的水溶液，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌、待用。取质粒，用二次水溶解配置成浓度为0.02mg/mL的水溶液。将不同浓度的含有苯环的疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物水溶液和质粒水溶液等体积混合，保证含有苯环的疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物和质粒的质量比在0.1∶1～100∶1之间。混合后的复合物颗粒水溶液在室温下孵育10分钟后，再进行下一步的转染实验。按照上述方法制备的复合物颗粒的组成及性能如表5所示。
表5一种非病毒基因转染载体与质粒DNA的复合
序号 编号 一种非病毒基因转染载体 质粒种类 一种非病毒基因转染载体与质粒DNA的质量比 复合物颗粒大小(nm) 复合物颗粒表面电位(mV)
PEI分子量(KD) PEI含量(％)  谷氨酸卞酯含量(％)  苄氧羰基赖氨酸含量(％)  苯丙氨酸含量(％)
 1  PP-185500  1.8  57.6  42.4  0  0  pEGFP-N1  10∶1  34 +36
 2  PP-186040  1.8  66.8  0  33.2  0  pEGFP-N1  10∶1  43 +29
 3  PP-186004  1.8  68.8  0  0  31.2  pGL3-CMV  10∶1  38 +34
 4  PP-186211  1.8  67.2  16.8  8.1  7.9  pGL3-CMV  10∶1  51 +25
 5  PP-185500  1.8  57.6  42.4  0  0  pEGFP-N1  1∶1  89 +6
 6  PP-186040  1.8  66.8  0  33.2  0  pEGFP-N1  100∶1  31 +43
 7  PP-055500  5  60.2  39.8  0  0  pEGFP-N1  10∶1  45 +35
 8  PP-056040  5  65.5  0  34.5  0  pEGFP-N1  10∶1  52 +39
 9  PP-056004  5  69.4  0  0  30.6  pGL3-CMV  10∶1  54 +36
 10  PP-056211  5  67.6  15.9  8.9  7.6  pGL3-CMV 10∶1 51 +41
 11  PP-055500  5  60.2  39.8  0  0  pEGFP-N1 20∶1 60 +34
 12  PP-056040  5  65.5  0  34.5  0  pEGFP-N1 50∶1 45 +43
 13  PP-105500  10  59.7  40.3  0  0  pEGFP-N1 10∶1 113 +42
  14   PP-106400   10   66.4   33.6   0   0   pEGFP-N1 10∶1 125 +44
  15   PP-105050   10   56.9   0   43.1   0   pEGFP-N1 10∶1 136 +38
  16   PP-106040   10   64.2   0   35.8   0   pGL3-CMV 10∶1 109 +37
  17   PP-105005   10   59.9   0   0   40.1   pGL3-CMV 10∶1 121 +39
  18   PP-106004   10   67.3   0   0   32.7   pGL3-CMV 10∶1 131 +36
  19   PP-106211   10   67.7   16.3   8.7   7.3   pEGFP-N1 10∶1 129 +35
  20   PP-106112   10   67.3   8.3   8.8   15.6   pEGFP-N1 10∶1 138 +40
  21   PP-105500   10   59.7   40.3   0   0   pEGFP-N1 0.5∶1 151 +6
  22   PP-106400   10   66.4   33.6   0   0   pEGFP-N1 50∶1 110 +41
  23   PP-255500   25   58.5   41.5   0   0   pEGFP-N1   10∶1   163   +45
  24   PP-256400   25   68.8   31.2   0   0   pEGFP-N1   10∶1   156   +44
  25   PP-255050   25   57.4   0   42.6   0   pEGFP-N1   10∶1   162   +46
  26   PP-256040   25   67.1   0   32.9   0   pGL3-CMV   10∶1   170   +49
  27   PP-255005   25   60.2   0   0   39.8   pGL3-CMV   10∶1   159   +49
  28   PP-256004   25   70.2   0   0   29.8   pGL3-CMV   10∶1   145   +41
  29   PP-256121   25   66.0   8.3   17.9   7.8   pGL3-CMV   10∶1   159   +48
  30   PP-256211   25   66.8   17.1   8.6   7.5   pGL3-CMV   10∶1   163   +39
  3   PP-255500   25   58.5   41.5   0   0   pEGFP-N1   0.25∶1   209   +3
    1
    32     PP-256400     25     68.8     31.2     0     0     pEGFP-N1     0.5∶1     189     +5
    33     PP-256400     25     68.8     31.2     0     0     pEGFP-N1     0.1∶1     223     +2
实施例7：一种非病毒基因转染载体/绿色荧光蛋白质粒DNA复合物颗粒的体
外转染实验
1、HeLa细胞的培养
取人宫颈癌细胞(HeLa细胞)，在含有10％小牛血清的培养液中连续培养(5％CO2、37℃孵箱)。取对数生长期细胞，胰酶消化后用DMEM稀释，按每孔4×105细胞的密度接种与6孔培养板，孵箱内预培养24小时。
2、体外转染
转染前24小时内，将HeLa细胞按4×105/孔种于6孔培养板中，置于5％CO2、37℃孵箱中继续培养至80～90％融合。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次后，加入含有苯环的疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物/绿色荧光蛋白质粒DNA复合物颗粒以及含有10％FBS的DMEM培养基至终体2ml，继续培养48小时。
3、体外转染效率的测定
取出培养板，用PBS清洗细胞两次，然后加入胰酶消化，离心除去上清，然后加入PBS重悬，用流式细胞仪测定细胞转染效率。
表6给出了表5所列的部分载体介导绿色荧光蛋白质粒对HeLa细胞的转染效率，图2给出了PP-1064介导绿色荧光蛋白质粒对HeLa细胞转染后的荧光照片。
表6一种非病毒基因转染载体介导绿色荧光蛋白质粒对HeLa细胞的转染效率
载体编号  转染效率
PP-1855  3.2％
PP-0555  33.2％
PP-1064  73.2％
PP-10622  55.6％
PP-2564  76.3％
PP-25631  68.2％
实施例8：一种非病毒基因转染载体/荧光素酶质粒DNA复合物颗粒的体外转染实验
细胞培养
同实施例7的方法。
2、体外转染
转染前24小时内，将HeLa细胞按1×104/孔种于96孔培养板中，置于5％CO2、37℃孵箱中继续培养至80～90％融合。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次后，加入含有苯环的疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物/荧光素酶质粒DNA复合物颗粒以及含有10％FBS的DMEM培养基至终体积200μL，继续培养48小时。
3、体外转染效率的测定
取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，然后加入荧光素底物，用光度计测定转染效率。
表7给出了表5所列的部分包含荧光素酶质粒的复合物的转染效率。
表7一种非病毒基因转染载体介导荧光素酶质粒对HeLa细胞的转染效率
载体编号   转染效率(RLU/mg Protein)
PP-1855   1,526
PP-0555   29,017
PP-1064   88,356
PP-10622   83,626
PP-2564   173,080
PP-25631   98,023
实施例9：一种非病毒基因转染载体/绿色荧光蛋白质粒DNA复合物颗粒对不同细胞的体外转染实验
Vero细胞和293T细胞的培养同实施例7中HeLa细胞的培养方法。按照实施例7中的转染方法和测试方法，采用表5中的PP-256400形成的复合物，对HeLa细胞、Vero细胞和293T细胞进行体外转染，其转染效率如表8所示。
表8 聚乙烯亚胺载体介导绿色荧光蛋白质粒对不同细胞的体外转染实验
细胞系 HeLa Vero  293T
转染效率 73.3％ 36.2％  53.6％
一种非病毒基因转染载体/绿色荧光蛋白质粒DNA复合物颗粒，对HeLa细胞的转染效率最高，对Vero和293T细胞的转染效率要低一些。
实施例10：一种非病毒基因转染载体在不含血清条件下的体外转染
1、HeLa细胞的培养
如实施例7。
2、体外转染
转染前24小时内，将HeLa细胞按4×105/孔种于6孔培养板中，置于5％CO2、37℃孵箱中继续培养至80～90％融合。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次后，加入复合物颗粒以及不含血清的DMEM培养基至终体2mL，继续培养6小时。然后吸去培养液，加入2mL的含有10％FBS的DMEM培养基，继续培养42小时。
3、体外转染效率的测定
如实施例7。
表9给出了一种非病毒基因转染载体在不含血清条件下的体外转染并且与含血清条件下的转染效率进行了对比。
表9一种非病毒基因转染载体在含血清和不含血清条件下的体外转染效率比较
 载体编号  含血清条件下的转染效率，％  不含血清条件下的转染效率，％
 PP-1864  2.8  2.1
 PP-0564  29.8  23.6
 PP-1064  73.2  65.3
 PP-2564  76.3  69.8
与一些商业化的阳离子基因转染载体不一样，本专利制备的一种非病毒基因转染载体在含血清条件下比不含血清条件下的转染效率更高一些，这对本发明制备的一种非病毒基因转染载体体内应用是非常有益的。
实施例11：一种非病毒基因转染载体的体内转染实验
取13周体重为22～25克的BALB/c老鼠，在后腿肌肉分别注射复合物取表5中的复合物溶液1#和2#100L，48小时后用精诺真活体成像仪观测体内转然效果。在进行活体成像观察之前，将小鼠麻醉。麻醉5分钟后，向小鼠体内注入200uL荧光素。10分钟后，用活体成像系统观察体内转染效果，结果如图3。
由图3可见，含有苯环疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物可以介导荧光素酶质粒在小鼠体内有适当的目的基因表达。

Claims (7)

1、一种非病毒基因转染载体，其特征是：其是含有苯环的疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物；所述的聚乙烯亚胺和含有苯环的疏水单元的质量比为1∶9～4∶6；所述的聚乙烯亚胺为平均分子量为1.8K～25K的超支化聚乙烯亚胺；所述的含有苯环的疏水单元为：γ-卞酯-L-谷氨酸、ε-苄氧羰基赖氨酸、苯丙氨酸的任一种、两种以任意比例组合的产物或三种以任意比例组合的产物。
2、根据权利要求1所述的非病毒基因转染载体的制备方法，其特征在于，其步骤和条件如下：
按照聚乙烯亚胺∶含有苯环的疏水性的氨基酸的N羧酸酐环状单体的质量比为1∶9～4∶6，将聚乙烯亚胺和含有苯环的疏水性的氨基酸的N羧酸酐环状单体分别溶于氯仿，搅拌充分溶解，再在搅拌条件下，3小时内将含有苯环的疏水性的氨基酸的N羧酸酐环状单体的氯仿溶液滴加到聚乙烯亚胺的氯仿溶液中，室温反应72小时，将反应液浓缩为原体积的三分之一以下，然后用是浓缩体积的5～10倍的乙醚沉降，真空干燥得到产物，然后将产物溶于水中，置于透析袋中，用蒸馏水透析48小时，透析液冷冻干燥后，得到一种非病毒基因转染载体；
所述的聚乙烯亚胺为平均分子量为1.8K～25K的超支化聚乙烯亚胺；所述的含有苯环的疏水单体，选自γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐、ε-苄氧羰基赖氨酸的N羧酸酐、苯丙氨酸的N羧酸酐的任一种以及γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐与ε-苄氧羰基赖氨酸的N羧酸酐两者以任意比例混合在一起、ε-苄氧羰基赖氨酸的N羧酸酐与苯丙氨酸的N羧酸酐混合在一起、γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐与苯丙氨酸的N羧酸酐两者混合在一起、γ-卞酯-L-谷氨酸的N羧酸酐和ε-苄氧羰基赖氨酸的N羧酸酐和苯丙氨酸的N羧酸酐三者以任意比例混合在一起，所述的一种非病毒基因转染载体为含有苯环疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物。
3、一种非病毒基因转染载体/质粒DNA复合物颗粒的制备方法，其特征在于，其步骤和条件如下：
取一种非病毒基因转染载体加水溶解，得到一种非病毒基因转染载体的水溶液，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌；用二次水配制质粒DNA水溶液，按照一种非病毒基因转染载体∶质粒DNA的质量比为0.1∶1～100∶1，将一种非病毒基因转染载体的水溶液和质粒DNA水溶液混合，把该水溶液置室温30分钟，进一步促进一种非病毒基因转染载体与质粒DNA复合物颗粒的形成，得到一种非病毒基因转染载体/质粒DNA复合物颗粒；
所述的非病毒基因转染载体是指含有苯环的疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物，所述的聚乙烯亚胺为平均分子量为1.8K～25K的超支化聚乙烯亚胺；所述的含有苯环的疏水单元，选自γ-卞酯-L-谷氨酸、ε-苄氧羰基赖氨酸、苯丙氨酸的任一种、两种以任意比例组合的产物或三种以任意比例组合的产物，所述的一种非病毒基因转染载体为含有苯环疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物，所述的一种非病毒基因转染载体为含有苯环疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物。
4、如权利要求3所述的非病毒基因转染载体/质粒DNA复合物颗粒的制备方法，其特征在于，所述的质粒DNA是绿色荧光蛋白质粒。
5、如权利要求3所述的一种非病毒基因转染载体，/质粒DNA复合物颗粒的制备方法，其特征在于，所述的质粒DNA是荧光素酶质粒。
6、如权利要求1所述的一种非病毒基因转染载体的应用，其特征在于，利用含有苯环疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物在体外基因转染中作为基因转染载体。
7、如权利要求1所述的非病毒基因转染载体的应用，其特征在于，利用含有苯环疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物在体内基因转染中作为基因转染载体。
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