CN106478947A - 一种改性超支化聚乙烯亚胺、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种改性超支化聚乙烯亚胺、其制备方法及应用，该改性超支化聚乙烯亚胺由超支化聚乙烯亚胺接枝式(I)所示的化合物得到；其中，所述‑R1为‑OH或R3‑NH‑；所述‑R3为氨基酸失去端氨基形成的基团；所述‑R2为甲基或对甲苯基。与现有技术相比，本发明将甲磺酰基或对甲苯磺酰基引入至超支化聚乙烯亚胺上，可在不减少整体电荷量的情况下有效地降低电荷密度，使改性超支化聚乙烯亚胺具有支化结构且电荷密度集中，克服了聚乙烯亚胺均聚物高毒性以及线型聚合物接枝聚乙烯亚胺电荷密度不够集中的缺点；同时改性超支化聚乙烯亚胺对基因物质负载能力强，能够自由调节电荷密度，是具有优良生物相容性的高效基因传递载体。

Description

一种改性超支化聚乙烯亚胺、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种改性超支化聚乙烯亚胺、及制备方法及应用。
背景技术
随着生物科学技术的不断进步，基因治疗将在人类攻克癌症及遗传疾病等顽症的过程中占据重要地位，并将逐步成为一种常见的有效手段(参见Jeong JH,Kim SW,ParkTG.Park.Molecular design of functional polymers for genetherapy.Prog.Polym.Sci.2007；32(11):1239-1274.)。
基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。成功的基因治疗依赖于有效的基因载体，常见的载体分为病毒类载体和非病毒载体。病毒类载体包括逆转录病毒、腺病毒(AV)、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、痘苗病毒(VV)等。但是病毒类载体在临床应用中存在着很大的安全隐患，在基因治疗历史上首例患者死亡事件以及著名的法国“气泡婴儿”事件，在很大程度上都是由病毒类基因载体的不安全性造成的。非病毒载体多为高分子阳离子聚合物，因其安全、有效、无免疫原性等优点，已成为病毒类载体最有希望的替代者(参见Godbey WT,Wu KK,Mikos AG.Poly(ethylenimine)and itsrole in gene delivery.J.Control Release.1999Aug 5；60(2-3):149-160.Remy JS,Abdallah B,Zanta MA,Boussif O,Behr JP,Demeneix B.Gene transfer withlipospermines and polyethylenimines.Adv.Drug Deliver.Rev 1998Mar 2；30(1-3):85-95.)。
阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)是非病毒类载体中受到关注最多的一个，它已经在体外和体内的转染实验中得到应用，聚乙烯亚胺(PEI)由于其具有独特的“质子海绵效应”能够实现高效的基因传递而倍受关注(参见Boussif O,Zanta M.A,Behr J.P.et al.AVersatile Vector for Gene and Oligonucleotide Transfer into Cells in Cultureand in Vivo–Polyethylenimine.PNAS,1995；92:7297-7301)。PEI的优点在于电荷密度集中，对基因物质有强的复合能力，在低质量(m/m)比即能获得最佳转染效率。但由于其毒性高、转染效率低、在体内运输过程的非特异性吸附以及没有靶向性的缺点，阻碍了它的进一步发展(参见Lungwitz U,Breunig M,Blunk T,Gopferich A.Polyethylenimine-basednon-viral gene delivery systems.Eur.J.Pharm.Biopharm 2005；60(2):247-266.)。
近来，研究者们围绕降低毒性和提高转染效率展开了一系列对PEI的改性工作。例如，人们将疏水链段胆固醇、聚己内酯、聚乳酸等接入PEI上得到两亲性的聚合物(参见LiuZH,Zhang ZY,Zhou CG,Jiao YP.Hydrophobic modifications of cationic polymersfor gene delivery.Prog Polym Sci2010；35:1144-1162.)。这些改性在一定程度上降低了细胞毒性和转染效率，但这类聚合物制备相对比较麻烦，并且转染效率也没有太大提高。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种具有良好的生物相容性的改性超支化聚乙烯亚胺、其制备方法及应用。
本发明提供了一种改性超支化聚乙烯亚胺，由超支化聚乙烯亚胺接枝式(I)所示的化合物得到；
其中，所述-R1为-OH或R3-NH-；
所述-R3为氨基酸失去端氨基形成的基团；
所述-R2为甲基或对甲苯基。
优选的，所述超支化聚乙烯亚胺的分子量为1800～25000。
优选的，所述超支化聚乙烯亚胺与式(I)所示的化合物的摩尔比为1：(5～200)。
优选的，所述氨基酸为碱性氨基酸。
本发明还提供了一种改性超支化聚乙烯亚胺的制备方法，包括：
当-R1为-OH或R3-NH-，且R3不包含氨基时，将超支化聚乙烯亚胺与式(I)所示的化合物溶解在有机溶剂中，在缩合剂与活化剂存在及无水无氧的条件下反应，得到改性超支化聚乙烯亚胺；
或当-R1为R3-NH-，且R3包含氨基时，将式(I)所示的化合物中除端氨基之外的氨基用氨基保护基团进行保护，得到氨基保护的式(I)所示的化合物；
将所述氨基保护的式(I)所示的化合物与超支化聚乙烯亚胺溶解在有机溶剂中，在缩合剂与活化剂存在及无水无氧的条件下反应，得到中间产物；
将所述中间产物脱除氨基保护基团，得到改性超支化聚乙烯亚胺；
其中，所述-R1为-OH或R3-NH-；
所述-R3为氨基酸失去端氨基形成的基团；
所述-R2为甲基或对甲苯基。
本发明还提供了一种改性超支化聚乙烯亚胺作为质粒DNA载体的应用。
优选的，所述改性超支化聚乙烯亚胺与质粒DNA的质量比为(10～1)：1。
本发明还提供了一种改性超支化聚乙烯亚胺作为质粒siRNA载体的应用。
本发明还提供了一种改性超支化聚乙烯亚胺在体内pDNA转染中作为基因传递载体的应用。
本发明还提供了一种改性超支化聚乙烯亚胺在体内siRNA转染中作为基因传递载体的应用。
本发明提供了一种改性超支化聚乙烯亚胺、其制备方法及应用，该改性超支化聚乙烯亚胺由超支化聚乙烯亚胺接枝式(I)所示的化合物得到；其中，所述-R1为-OH或R3-NH-；所述-R3为氨基酸失去端氨基形成的基团；所述-R2为甲基或对甲苯基。与现有技术相比，本发明将甲磺酰基或对甲苯磺酰基引入至超支化聚乙烯亚胺上，可在不减少整体电荷量的情况下有效地降低电荷密度，使改性超支化聚乙烯亚胺具有支化结构且电荷密度集中，克服了聚乙烯亚胺均聚物高毒性以及线型聚合物接枝聚乙烯亚胺电荷密度不够集中的缺点；同时改性超支化聚乙烯亚胺对基因物质负载能力强，能够自由调节电荷密度，是具有优良生物相容性的高效基因传递载体。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的改性超支化聚乙烯亚胺的核磁共振氢谱图；
图2为本发明实施例1制备的改性超支化聚乙烯亚胺细胞毒性实验结果曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种改性超支化聚乙烯亚胺，由超支化聚乙烯亚胺接枝式(I)所示的化合物得到；
其中，所述-R1为-OH或R3-NH-；
所述-R3为氨基酸失去端氨基形成的基团；
所述-R2为甲基或对甲苯基。
按照本发明，所述超支化聚乙烯亚胺的数均分子量优选为1800～25000；所述氨基酸为本领域技术人员熟知的氨基酸即可，并无特殊的限制，本发明中优选为碱性氨基酸，更优选为精氨酸或赖氨酸；所述超支化聚乙烯亚胺与式(I)所示的化合物的摩尔比优选为1：(5～200)，更优选为1：(5～180)。
本发明将甲磺酰基或对甲苯磺酰基引入至超支化聚乙烯亚胺上，可在不减少整体电荷量的情况下有效地降低电荷密度，使改性超支化聚乙烯亚胺具有支化结构且电荷密度集中，克服了聚乙烯亚胺均聚物高毒性以及线型聚合物接枝聚乙烯亚胺电荷密度不够集中的缺点；同时改性超支化聚乙烯亚胺对基因物质负载能力强，能够自由调节电荷密度，是具有优良生物相容性的高效基因传递载体。
本发明还提供了一种上述改性聚乙烯亚胺的制备方法，包括：
当-R1为-OH或R3-NH-，且R3不包含氨基时，将超支化聚乙烯亚胺与式(I)所示的化合物溶解在有机溶剂中，在缩合剂与活化剂存在及无水无氧的条件下反应，得到改性超支化聚乙烯亚胺。
其中，所述超支化聚乙烯亚胺与式(I)所示的化合物均同上所述，在此不再赘述。
将超支化聚乙烯亚胺与式(I)所示的化合物溶解在有机溶剂中，其中所述有机溶剂为本领域技术人员熟知的有机溶剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为DMF(N,N-二甲基甲酰胺)。
然后在缩合剂与活性剂存在及无水无氧的条件下反应，得到改性超支化聚乙烯亚胺；其中，所述缩合剂与活性剂为本领域技术人员熟知的缩合剂与活化剂即可，并无特殊的限制，本发明中所述缩合剂与活性剂优选为EDC与NHS组合或DCC与NHS组合；所述缩合剂与活性剂的摩尔量优选为式(I)所示的化合物摩尔数的1～3倍，更优选为1.5～2.5倍，再优选为1.5～2倍，最优选为1.5倍；所述反应的温度优选为20℃～30℃，更优选为25℃；所述反应的时间优选为15～30h，更优选为20～26h，再优选为24h。
当-R1为R3-NH-，且R3包含氨基时，将式(I)所示的化合物中除端氨基之外的氨基用氨基保护基团进行保护，得到氨基保护的式(I)所示的化合物；将所述氨基保护的式(I)所示的化合物与超支化聚乙烯亚胺溶解在有机溶剂中，在缩合剂与活化剂存在及无水无氧的条件下反应，得到中间产物；将所述中间产物脱除氨基保护基团，得到改性超支化聚乙烯亚胺。
其中，所述聚乙烯亚胺与式(I)所示的化合物均同上所述，在此不再赘述。
将式(I)所示的化合物中除端氨基之外的氨基用氨基保护基团进行保护，得到氨基保护的式(I)所示的化合物；所述氨基保护基团为本领域技术人员熟知的氨基保护基团即可，并无特殊的限制，本发明中优选为叔丁氧羰基保护基团(Boc)或N-芴甲氧羰基保护基团(Fmoc)。
将所述氨基保护的式(I)所示的化合物与超支化聚乙烯亚胺溶解在有机溶剂中，在缩合剂与活化剂存在及无水无氧的条件下反应，得到中间产物；其中，所述有机溶剂、缩合剂与活化剂及反应条件均同上所述，在此不再赘述。
将所述中间产物脱除氨基保护基团，得到改性超支化聚乙烯亚胺。所述脱除氨基保护基的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制。
本发明提供的改性超支化聚乙烯亚胺制备方法简单。
本发明还提供了一种上述改性超支化聚乙烯亚胺作为质粒DNA载体的应用。其中，所述改性超支化聚乙烯亚胺与质粒DNA的质量比优选为(10～1)：1，更优选为(5～1)：1，再优选为(3～2)：1，最优选为2.5:1；其作为质粒DNA载体可适用于目前各种细胞系，如HeLa，293T，293F，293S，BE(2)C，CHO，CHO-S，COS7，COS-7L，CV-1，HEK-293，HT-1080，MDCK，NIH-3T3，SKBR3，Vero等细胞系；所述作为载体时转染的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，本发明中优选按照以下步骤进行：
1)细胞培养；所述细胞培养的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制，本发明中优选将细胞置于胎牛血清的培养液中进行培养；所述培养液中胎牛血清的体积分数优选为10％；所述培养条件优选为37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中连续培养。
2)体外转染；转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80％～90％；转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，将改性聚乙烯亚胺与质粒DNA混合物以及含有体积分数为10％胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基(改性聚乙烯亚胺与质粒DNA混合物的体积应不超过培养液体积的1/10)至终体积200μL，继续培养24小时。
3)体外转染效率的测定：a)绿色荧光蛋白(GFP)表达：用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白信号。阳性细胞发出明亮的绿色荧光，而阴性细胞则无。用流式细胞仪检测阳性细胞的百分率。b)荧光素酶活性检测：取出培养板，吸去培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，加入细胞裂解液裂解，然后加入荧光素酶底物，用照度计测定转染效率。c)β-半乳糖苷酶染色：细胞用0.01mol/L的PBS洗涤，用0.4％多聚甲醛固定5min，PBS冲洗后加入5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)染色液(配方为0.04％X-gal,5mmol/L亚铁氰化钾，5mmol/L高铁氰化钾和2mmol/L MgCl2),放置37℃，5％CO2孵育3h。阳性细胞呈深蓝色，计算阳性细胞的百分率。
4)细胞毒性测试：采用噻唑蓝比色法比较评价基因载体材料的细胞毒性。
实验前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80％～90％。将不同浓度的材料与细胞共同培养24小时后，每孔分别加入20μl含质量分数为0.5％噻唑蓝的磷酸盐缓冲液。混合物在37℃继续作用4小时，加入200μl二甲基亚砜溶解噻唑蓝甲臢结晶10分钟。然后用酶标仪测试每孔的吸收，测试波长选用492nm。细胞存活率按下公式计算：
细胞存活率(％)＝(Asample/Acontrol)×100
Asample是转染后的细胞样品孔的吸收，Acontrol是不与改性聚乙烯亚胺与质粒DNA混合物作用的细胞样品孔的吸收，每组实验重复三次。
本发明还提供了一种上述改性超支化聚乙烯亚胺作为质粒siRNA载体的应用。其中，所述改性超支化聚乙烯亚胺与质粒siRNA的质量比优选为(10～1)：1，更优选为(5～1)：1，再优选为(3～2)：1，最优选为2.5:1；其作为质粒siRNA载体可适用于目前各种细胞系，如HeLa，293T，293F，293S，BE(2)C，CHO，CHO-S，COS7，COS-7L，CV-1，HEK-293，HT-1080，MDCK，NIH-3T3，SKBR3，Vero等细胞系；所述作为载体时转染的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，本发明中优选按照以下步骤进行：
1)用常规方法合成siRNA：所述的siRNA为本领域技术人员熟知的siRNA即可，并无特殊的限制，在本发明实施例中优选以沉默荧光素酶的Luc siRNA为例，其序列为5′-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3′。
2)细胞的培养：细胞置于含体积分数为10％胎牛血清的培养液中，在37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中连续培养。
3)体外转染
转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80％～90％。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，加入改性聚乙烯亚胺与siRNA混合物以及含有体积分数为10％胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基(改性聚乙烯亚胺与质粒siRNA混合物的体积应不超过培养液体积的1/10)至终体积200μL，继续培养24小时。
4)体外转染效率的测定
取出培养板，吸去培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，加入细胞裂解液裂解，然后加入荧光素酶底物，用照度计测定转染效率。
本发明还提供了一种上述改性聚乙烯亚胺在体内pDNA转染中作为基因传递载体的应用。其中，所述改性超支化聚乙烯亚胺与基因的质量比优选为(10～1)∶1，更优选为(5～1)：1，再优选为(3～2)：1，最优选为2.5:1；所述体内pDNA转染的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制，本发明中优选按照以下步骤进行：
1)CT26细胞的培养
取小鼠结肠癌CT26细胞，在含有10％(质量/体积百分数)的牛血清的培养液中，在含5％(体积百分数)CO2、温度为37℃的孵箱中培养。
2)肿瘤接种
购买重量在20g的Balb/C小鼠，肿瘤接种前，取对数生长期的CT26细胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×103离心5min，PBS洗涤三次后，用PBS重悬细胞，按每只小鼠2×106细胞的密度接种于腋下，10天后，瘤径长大至10mm时进行体内转染。
3)体内转染
基因组转染的复合物颗粒(改性聚乙烯亚胺与转染基因混合物)在含有5％(质量/体积百分数)的葡萄糖溶液(复合物颗粒的体积所占总体积的比例应低于10％)中至终体积0.5mL，尾静脉注射。
4)体内转染效率的测定
体内转染48h后，处死小鼠，取出肿瘤，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，匀浆，然后加入荧光素底物，测定转染效率。
本发明还提供了一种上述改性聚乙烯亚胺在体内siRNA转染中作为基因传递载体的应用。其中，所述改性超支化聚乙烯亚胺与基因的质量比优选为(10～1)∶1，更优选为(5～1)∶1，再优选为(3～2)∶1，最优选为2.5:1；所述体内siRNA转染的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制，本发明中优选按照以下步骤进行：
1)CT26细胞的培养
取小鼠结肠癌CT26细胞，在含有10％(质量/体积百分数)的牛血清的培养液中，在含5％(体积百分数)CO2、温度为37℃的孵箱中培养。
2)肿瘤接种
购买重量在20g的Balb/C小鼠，肿瘤接种前，取对数生长期的CT26细胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×103转/min离心5min，PBS洗涤三次后，用PBS重悬细胞，按每只小鼠2×106细胞的密度接种于腋下，8天后，瘤径长大至7mm时进行体内siRNA的转染。
3)体内转染
基因物质选用沉默血管内皮生长因子的VEGFsiRNA，通过抑制VEGF的表达实现抑制肿瘤生长的目的，基因组转染的复合物颗粒在含有5％(质量/体积百分数)的葡萄糖溶液中至终体积50μL，尾静脉注射给药。
4)体内肿瘤生长的测定
从第一次给药开始测量瘤径大小，实验共14天。
本发明提供的改性聚乙烯亚胺是一种新型高效的聚阳离子基因载体，转染效率高，其在同等条件下对HeLa细胞介导荧光素酶质粒的转染效率最高为商业化PEI25K的10～20倍，在最佳转染比例范围内，细胞存活率在80％以上；其基因沉默效率高，对恒定表达荧光素酶的Huh 7细胞的最高基因沉默效率为85％，该聚合物相对于商业转染试剂PEI25K有较高基因沉默效率和较小的细胞毒性，由此可见本发明提供的改性聚乙烯亚胺是一种新型高效的聚阳离子基因载体，对于DNA、siRNA都具有高的转染效率和低的细胞毒性。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种改性超支化聚乙烯亚胺、及制备方法及应用进行详细描述。
以下实施例中所用的试剂均为市售。
实施例1
将超支化聚乙烯亚胺、对甲苯磺酰基(Tos)和叔丁氧羰基(Boc)双保护的精氨酸((Boc)Arg(Tos)-OH)溶解在DMF中，在缩合剂、活化剂EDC、NHS(缩合剂与活化剂的摩尔数为(Boc)Arg(Tos)-OH摩尔数的1.5倍)的存在下，在无水无氧条件下25℃反应24h得到超支化聚乙烯亚胺接枝的(Boc)Arg(Tos)聚合物(PEI-(Boc)Arg(Tos))。然后用三氟乙酸脱去Boc基团得到终产物PEI-Arg(Tos)即改性超支化聚乙烯亚胺。
利用核磁共振对实施例1中得到的改性超支化聚乙烯亚胺进行分析，得到其核磁共振谱图(氢谱)，如图1所示。
实施例1中得到的对甲苯磺酰基保护的精氨酸(Arg(Tos))对于超支化聚乙烯亚胺(PEI)的接枝率列于表1。
表1实施例1中改性聚乙烯亚胺原料的摩尔比与产物分子量的对应关系
载体材料编号 PEI的分子量 PEI与Arg(Tos)的摩尔比
P1.8Arg(Tos)-1 1800 1:5
P1.8Arg(Tos)-2 1800 1:10
P1.8Arg(Tos)-3 1800 1:15
P25Arg(Tos)-4 25000 1:60
P25Arg(Tos)-5 25000 1:120
P25Arg(Tos)-6 25000 1:180
实施例2
利用PEI-Arg(Tos)介导pGL3(荧光素酶质粒)、pEGFPN1(绿色荧光蛋白质粒)、pCMV-lac Z(β-半乳糖苷酶质粒)对HeLa细胞的体外转染
1)HeLa细胞的培养
取人宫颈癌细胞(HeLa细胞)，在含有10％小牛血清的培养液中连续培养(5％CO2、37℃孵箱)。
2)体外转染
转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80％～90％。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，基因组转染的复合物颗粒(PEI-Arg(Tos)与质粒的水溶液，按照质量比2.5/1直接混合)以及含有体积分数为10％胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL，继续培养24小时。
3)体外转染效率的测定
取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，然后加入荧光素底物，用光度计测定转染效率。表2给出了荧光素酶质粒的复合物的转染效率，其中P1.8代表数均分子量为1800的超支化聚乙烯亚胺，P25代表数均分子量为25000的超支化聚乙烯亚胺。
绿色荧光蛋白(GFP)表达用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白信号。阳性细胞发出明亮的绿色荧光，而阴性细胞则无。用流式细胞仪检测阳性细胞的百分率。表3给出了绿色荧光蛋白质粒的复合物的转染效率。
β-半乳糖苷酶染色
细胞用0.01mol/L的PBS洗涤，用0.4％多聚甲醛固定5min，PBS冲洗后加入5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)染色液(配方为0.04％X-gal，5mmol/L亚铁氰化钾，5mmol/L高铁氰化钾和2mmol/L MgCl2),放置37℃，5％CO2孵育3h。阳性细胞呈深蓝色，计算阳性细胞的百分率。表4给出了β-半乳糖苷酶质粒的复合物的转染效率。
表2 PEI-Arg(Tos)介导荧光素酶质粒的体外转染效率
表3 PEI-Arg(Tos)介导绿色荧光蛋白质粒的体外转染效率
表4 PEI-Arg(Tos)介导β-半乳糖苷酶质粒的体外转染效率
实施例3
利用PEI-Arg(Tos)介导沉默荧光素酶的Luc siRNA在HeLa细胞系中的转染
1)HeLa细胞的培养
取HeLa细胞，在含有10％小牛血清的培养液中连续培养(5％CO2、37℃孵箱)。
2)体外转染
转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80％～90％。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，基因组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10％胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL，继续培养24小时。
3)体外转染效率的测定
取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，然后加入荧光素底物，用光度计测定转染效率。表5给出了荧光素酶沉默效率。
表5 PEI-Arg(Tos)介导沉默荧光素酶的Luc siRNA体外转染效率
实施例4
PEI-Arg(Tos)在体内pDNA转染中的应用
1)CT26细胞的培养
取小鼠结肠癌CT26细胞，在含有10％(质量/体积百分数)的牛血清的培养液中，在含5％(体积百分数)CO2、温度为37℃的孵箱中培养。
2)肿瘤接种
购买重量在20g的Balb/C小鼠，肿瘤接种前，取对数生长期的CT26细胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×103离心5min，PBS洗涤三次后，用PBS重悬细胞，按每只小鼠2×106细胞的密度接种于腋下，10天后，瘤径长大至10mm时进行体内转染。
3)体内转染
基因组转染的复合物颗粒在含有5％(质量/体积百分数)的葡萄糖溶液中至终体积0.5mL，尾静脉注射。
4)体内转染效率的测定
体内转染48h后，处死小鼠，取出肿瘤，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，匀浆，然后加入荧光素底物，测定转染效率。表6给出了体内实验荧光素酶质粒的复合物的转染效率。
表6 PEI-Arg(Tos)介导荧光素酶质粒体内转染效率
实施例5
PEI-Arg(Tos)在体内siRNA转染中的应用
1)CT26细胞的培养
取小鼠结肠癌CT26细胞，在含有10％(质量/体积百分数)的牛血清的培养液中，在含5％(体积百分数)CO2、温度为37℃的孵箱中培养。
2)肿瘤接种
购买重量在20g的Balb/C小鼠，肿瘤接种前，取对数生长期的CT26细胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×103转/min离心5min，PBS洗涤三次后，用PBS重悬细胞，按每只小鼠2×106细胞的密度接种于腋下，8天后，瘤径长大至7mm时进行体内siRNA的转染。
3)体内转染
基因物质选用沉默血管内皮生长因子的VEGFsiRNA，通过抑制VEGF的表达实现抑制肿瘤生长的目的，基因组转染的复合物颗粒在含有5％(质量/体积百分数)的葡萄糖溶液中至终体积50μL，尾静脉注射给药。
4)体内肿瘤生长的测定
从第一次给药开始测量瘤径大小，实验共14天。表7给出了体内实验VEGFsiRNA的复合物对肿瘤抑制14天后的瘤径。
表7 PEI-Arg(Tos)介导VEGFsiRNA体内转染实验的瘤径大小
由实施例2～实施例5可知本发明提供的改性超支化聚乙烯亚胺是一种新型高效的阳离子基因载体，转染效率高，其在同等条件下对HeLa和CHO细胞介导荧光素酶质粒的转染效率最高为商业化PEI25K的15倍和20倍，在最佳转染比例范围内，细胞存活率在80％以上；其基因沉默效率高，对恒定表达荧光素酶的Huh7以及CT26细胞的最高基因沉默效率均可达到80％以上，该聚合物相对于商业转染试剂PEI25K有较高基因沉默效率和较小的细胞毒性，有广泛的应用前景。
图2为本发明提供的改性超支化聚乙烯亚胺P1.8Arg(Tos)-2细胞毒性实验结果，在用MTT的方法检测细胞毒性实验时，与市售PEI25K和脂质体2000(Lip2K)相比，PEI-Arg(Tos)表现出较低的细胞毒性。

Claims (10)

1.一种改性超支化聚乙烯亚胺，其特征在于，由超支化聚乙烯亚胺接枝式(I)所示的化合物得到；
其中，所述-R1为-OH或R3-NH-；
所述-R3为氨基酸失去端氨基形成的基团；
所述-R2为甲基或对甲苯基。
2.根据权利要求1所述的改性超支化聚乙烯亚胺，其特征在于，所述超支化聚乙烯亚胺的分子量为1800～25000。
3.根据权利要求1所述的改性超支化聚乙烯亚胺，其特征在于，所述超支化聚乙烯亚胺与式(I)所示的化合物的摩尔比为1：(5～200)。
4.根据权利要求1所述的改性超支化聚乙烯亚胺，其特征在于，所述氨基酸为碱性氨基酸。
5.一种改性超支化聚乙烯亚胺的制备方法，其特征在于，包括：
当-R1为-OH或R3-NH-，且R3不包含氨基时，将超支化聚乙烯亚胺与式(I)所示的化合物溶解在有机溶剂中，在缩合剂与活化剂存在及无水无氧的条件下反应，得到改性超支化聚乙烯亚胺；
或当-R1为R3-NH-，且R3包含氨基时，将式(I)所示的化合物中除端氨基之外的氨基用氨基保护基团进行保护，得到氨基保护的式(I)所示的化合物；
将所述氨基保护的式(I)所示的化合物与超支化聚乙烯亚胺溶解在有机溶剂中，在缩合剂与活化剂存在及无水无氧的条件下反应，得到中间产物；
将所述中间产物脱除氨基保护基团，得到改性超支化聚乙烯亚胺；
其中，所述-R1为-OH或R3-NH-；
所述-R3为氨基酸失去端氨基形成的基团；
所述-R2为甲基或对甲苯基。
6.一种权利要求1～4任意一项所述的改性超支化聚乙烯亚胺或权利要求5所制备的改性超支化聚乙烯亚胺作为质粒DNA载体的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述改性超支化聚乙烯亚胺与质粒DNA的质量比为(10～1)：1。
8.一种权利要求1～4任意一项所述的改性超支化聚乙烯亚胺或权利要求5所制备的改性超支化聚乙烯亚胺作为质粒siRNA载体的应用。
9.一种权利要求1～4任意一项所述的改性超支化聚乙烯亚胺或权利要求5所制备的改性超支化聚乙烯亚胺在体内pDNA转染中作为基因传递载体的应用。
10.一种权利要求1～4任意一项所述的改性超支化聚乙烯亚胺或权利要求5所制备的改性超支化聚乙烯亚胺在体内siRNA转染中作为基因传递载体的应用。
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