CN112094409A - 一种氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

一种氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物，它是由苯丙氨酸和酪氨酸取代聚乙烯亚胺中伯胺基的伯胺氢而得；所述聚乙烯亚胺的分子量小于10000。本发明制备的氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物作为基因载体具有良好的负载质粒DNA的能力，同时其细胞毒性很低，基因转染效率很高，在有无血清的条件下转染效率均高于现有产品，显著提高了低分子量聚乙烯亚胺的转染效率。本发明氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物可作为优良的基因载体。

Description

一种氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于化学医药领域，具体涉及一种氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物及其制备方法和用途。
背景技术
基因治疗是指将治疗基因通过载体运送到靶器官或组织以修复受损或缺失基因，发挥治疗效果的一种新型疗法。目前基因治疗主要策略包括导入抑癌基因、自杀基因、siRNA、耐药基因、免疫基因、CRISPR-Cas9系统等外源性基因。但是外源性基因无法主动被靶细胞纳入，需要依靠基因载体运载进入细胞。因此，低毒性高效率的载体是基因治疗的关键。
目前广泛使用的基因载体主要分为病毒类载体和非病毒类载体。病毒类载体包括反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等，其基因转染效率高，但存在免疫原性和基因插入突变两个严重的安全性问题。近年来随着药剂学、材料学等多学科的迅速发展，大量合成材料及天然材料涌现，非病毒载体备受关注，包括阳离子脂质体或脂类复合物和阳离子高分子聚合物，它们作为载体的优点是，能够递送大尺寸的核酸；有明确的化学机构，易于商品化等。
聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)是一种最常见的阳离子聚合物非病毒基因载体。它可以将带负电的质粒、RNA等包裹住，并形成纳米复合物，此复合物能够通过细胞内吞方式进入肿瘤细胞经过溶酶体逃逸展现出较好的转染效率。然而，PEI的分子量大小影响着它转染效率与毒性之间的平衡。高分子量的PEI(>25000)具有一定的转染效率，但是毒性较大；低分子量的PEI(<10000)毒性很低，但没有转染效率，这导致了PEI的应用受到一定的限制。
因此，研究一种高效低毒的聚乙烯亚胺基因载体对于促进基因治疗的发展有重要意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物及其制备方法和用途。
本发明提供了一种氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物，它是由苯丙氨酸和酪氨酸取代聚乙烯亚胺中伯胺基的伯胺氢而得；所述聚乙烯亚胺的分子量小于10000。
进一步地，所述聚乙烯亚胺中伯胺氢的摩尔取代比例为5～45％；优选为8～35％；更优选为19～37％。
进一步地，所述聚乙烯亚胺中伯胺氢的摩尔取代比例为24～28％；优选为28％。
进一步地，所述苯丙氨酸和酪氨酸的摩尔比为1:1。
进一步地，所述聚乙烯亚胺的分子量为1800。
本发明还提供了一种前述的氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物的制备方法，它包括如下步骤：
(1)苯丙氨酸和酪氨酸溶于溶剂中，加入催化剂进行催化反应；
(2)将聚乙烯亚胺与催化后的苯丙氨酸和酪氨酸溶于溶剂中，并加入催化剂反应，得反应液；
(3)将反应液进行提纯，提纯后冷冻干燥，即得。
进一步地，所述苯丙氨酸、酪氨酸和聚乙烯亚胺中伯胺基的摩尔比为0.05～0.3:0.05～0.3:1；优选地，所述苯丙氨酸、酪氨酸和聚乙烯亚胺中伯胺基的摩尔比为0.1～0.2:0.1～0.2:1；更优选地，所述苯丙氨酸、酪氨酸和聚乙烯亚胺中伯胺基的摩尔比为0.15:0.15:1。
进一步地，步骤(1)中，所述苯丙氨酸和酪氨酸的总摩尔量与溶剂体积的比为1:10～80(mol/mL)；所述苯丙氨酸和酪氨酸的总摩尔量与催化剂质量的比1:1～5(mol/mg)；
优选地，步骤(1)中，所述苯丙氨酸和酪氨酸的总摩尔量与溶剂体积的比为1:50(mol/mL)；所述苯丙氨酸和酪氨酸的总摩尔量与催化剂质量的比1:2(mol/mg)。
进一步地，步骤(2)中，所述苯丙氨酸和酪氨酸的总摩尔量与溶剂体积的比为1:10～80(mol/mL)；所述苯丙氨酸和酪氨酸的总摩尔量与催化剂体积的比0.4～1.6:1(mol/mL)；
优选地，步骤(2)中，所述苯丙氨酸和酪氨酸的总摩尔量与溶剂体积的比为1:40(mol/mL)；所述苯丙氨酸和酪氨酸的总摩尔量与催化剂质量的比0.6:1(mol/mL)。
进一步地，步骤(1)中，所述溶剂为MES缓冲液，所述催化剂由EDCI和NHS组成，其中EDCI和NHS的质量比为1:1.5～2；
和/或，步骤(2)中，所述溶剂为N-N二甲基甲酰胺，所述催化剂为三乙胺；
优选地，EDCI和NHS的质量比为1:2。
进一步地，步骤(1)中，所述催化反应为在25℃反应6h；和/或，步骤(2)中，所述反应为在25℃搅拌48小时。
进一步地，步骤(3)中，所述提纯为将反应液转移入透析袋中，透析，过滤，即可。
进一步地，所述透析袋的截留分子量为1000；和/或，所述透析为在双蒸水中透析3天；和/或，所述过滤为采用0.45μm的滤膜进行过滤。
本发明还提供了前述的氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物在制备基因载体中的用途。
本发明中1mol分子量为1800的聚乙烯亚胺中含16mol伯胺基。
本发明制备的氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物作为基因载体具有良好的负载质粒DNA的能力，同时其细胞毒性很低，基因转染效率很高，在有无血清的条件下转染效率均高于现有产品，显著提高了低分子量聚乙烯亚胺的转染效率。本发明氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物可作为优良的基因载体。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物的核磁图谱。
图2为本发明氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物与质粒复合后形成的PPT质粒复合物的水合粒径分布图。
图3为本发明氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物与质粒复合后形成的PPT质粒复合物的TEM图片。
图4为琼脂糖凝胶检测本发明氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物对质粒的负载能力。
图5为本发明氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物的细胞毒性。
图6为无血清条件下不同材料对Hela细胞的转染效率。
图7为有血清条件下本发明PPT与Lipo3000对Hela细胞转染效率的对比。
图8为无血清条件下不同材料对黑色素瘤细胞的转染效率。
图9为有血清条件下本发明PPT与Lipo3000对黑色素瘤细胞的转染对比。
具体实施方式
实施例1、本发明氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物的制备
苯丙氨酸、酪氨酸与分子量为1800的聚乙烯亚胺按照苯丙氨酸、酪氨酸与聚乙烯亚胺中伯胺基的摩尔比为0.15:0.15:1准备。首先称取0.15mol苯丙氨酸和0.15mol酪氨酸，溶解在15mLMES缓冲液中，加入0.6mg EDCI/NHS做催化剂，25℃催化6h，其中EDCI和NHS的质量比为1:2；随后将0.0625mol分子量为1800的聚乙烯亚胺(1mol分子量为1800的聚乙烯亚胺中含16mol伯胺基)与催化后的苯丙氨酸和酪氨酸一起溶于12mLN-N二甲基甲酰胺中得到混合溶液，并向混合溶液中加入0.5mL三乙胺作为催化剂，然后将上述反应体系置于25℃，搅拌48h进行取代反应。反应结束后将反应体系转移入截留分子量为1000的透析袋中，并在双蒸水中进行3天透析，透析后的溶液采用0.45μm的滤膜进行过滤，采用冷冻干燥机对过滤后的溶液进行冷冻干燥，得到白色粉末状产物，即为本发明氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物(PPT)，该氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物中伯胺氢的摩尔取代比例为28％。
实施例2、本发明氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物的制备
苯丙氨酸、酪氨酸与分子量为1800的聚乙烯亚胺按照苯丙氨酸、酪氨酸与聚乙烯亚胺中伯胺基的摩尔比为0.1:0.1:1准备。首先称取0.1mol苯丙氨酸和0.1mol酪氨酸，溶解在15mLMES缓冲液中，加入0.6mg EDCI/NHS做催化剂，25℃催化6h，其中EDCI和NHS的质量比为1:2；随后将0.0625mol分子量为1800的聚乙烯亚胺(1mol分子量为1800的聚乙烯亚胺中含16mol伯胺基)与催化后的苯丙氨酸和酪氨酸一起溶于12mLN-N二甲基甲酰胺中得到混合溶液，并向混合溶液中加入0.5mL三乙胺作为催化剂，然后将上述反应体系置于25℃，搅拌48h进行取代反应。反应结束后将反应体系转移入截留分子量为1000的透析袋中，并在双蒸水中进行3天透析，透析后的溶液采用0.45μm的滤膜进行过滤，采用冷冻干燥机对过滤后的溶液进行冷冻干燥，得到白色粉末状产物，即为本发明氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物(PPT)，该氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物中伯胺氢的摩尔取代比例为26％。
实施例3、本发明氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物的制备
苯丙氨酸、酪氨酸与分子量为1800的聚乙烯亚胺按照苯丙氨酸、酪氨酸与聚乙烯亚胺中伯胺基的摩尔比为0.2:0.2:1准备。首先称取0.2mol苯丙氨酸和0.2mol酪氨酸，溶解在15mLMES缓冲液中，加入1.2mg EDCI/NHS做催化剂，25℃催化6h，其中EDCI和NHS的质量比为1:2；随后将0.0625mol分子量为1800的聚乙烯亚胺(1mol分子量为1800的聚乙烯亚胺中含16mol伯胺基)与催化后的苯丙氨酸和酪氨酸一起溶于12mLN-N二甲基甲酰胺中得到混合溶液，并向混合溶液中加入0.5mL三乙胺作为催化剂，然后将上述反应体系置于25℃，搅拌48h进行取代反应。反应结束后将反应体系转移入截留分子量为1000的透析袋中，并在双蒸水中进行3天透析，透析后的溶液采用0.45μm的滤膜进行过滤，采用冷冻干燥机对过滤后的溶液进行冷冻干燥，得到白色粉末状产物，即为本发明氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物(PPT)，该氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物中伯胺氢的摩尔取代比例为24％。图1中，编号为4的线是摩尔取代比例为24％的PPT的核磁共振谱图，编号为3的线是苯丙氨酸的核磁共振谱图，编号为2的线是酪氨酸的核磁共振谱图，编号为1的线是分子量为1800的聚乙烯亚胺的核磁共振谱图，图1结果证明取代比例24％修饰的聚乙烯亚胺成功合成。
以下通过具体的试验例证明本发明的有益效果。
试验例1、本发明氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物负载质粒能力的研究
对实施例2制备的氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物(PPT)进行体外负载质粒的能力的检测。
1、试验方法
绿色荧光蛋白质粒(GFP)溶液的配制：利用DMEM无血清培养基溶解绿色荧光蛋白质粒，得到浓度为80μg/mL的GFP溶液。
PPT溶液的配制：利用DMEM无血清培养基溶解实施例2制备的PPT，得到浓度为800μg/mL的PPT溶液。
将上述50μLGFP溶液与50μLPPT溶液混合，静置20分钟，待PPT与质粒复合后，得到PPT质粒复合物(该PPT质粒复合物中PPT与质粒的质量比为10:1)，对其进行粒径检测、透射电镜观察。
调整GFP溶液和PPT溶液的浓度，将不同浓度的GFP溶液和PPT溶液混合，静置20分钟，待PPT与质粒复合后，得到不同质量比的PPT质粒复合物(所得PPT质粒复合物中PPT与质粒的质量比分别为0.5:1、1:1、2:1、5:1、8:1、10:1、15:1和20:1)，进行凝胶阻滞实验。
2、试验结果
PPT与质粒复合后，使用激光散射粒度仪检测PPT质粒复合物的水合粒径，结果如图2所示，由图2可知PPT与质粒复合后的水合粒径为108±3纳米。使用透射电镜观察PPT与质粒复合后的形状，如图3所示，PPT与质粒复合后的形状为球形，形态良好。
凝胶阻滞实验结果如图4所示，第一泳道为DNAmarker，第二泳道是单独质粒，第三至第八泳道分别为PPT与质粒的质量比为0.5:1、1:1、2:1、5:1、8:1、10:1、15:1和20:1的PPT质粒复合物，根据结果显示在PPT与质粒的质量比为15:1及以上时，相应的泳道中并没有条带显现，说明PPT可以完全压缩质粒DNA，使质粒DNA快速通过凝胶的孔隙。说明本发明PPT可以很好的负载质粒DNA。
试验例2、本发明氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物细胞毒性研究
1、试验方法
用MTT实验检测分子量为25000的聚乙烯亚胺(PEI 25K)、分子量为1800的聚乙烯亚胺(PEI 1.8K)和本发明PPT(实施例1)的细胞毒性。
将处于对数期的人正常细胞系293T和HELA细胞分别铺于96孔板中(细胞密度5000个/孔)，培养过夜使细胞完全贴壁。分别用不同浓度(5,10,20,40,60,80和120ug/mL)的PEI25K、PEI 1.8K和PPT处理293T和HELA细胞48小时。PEI 25K、PEI 1.8K和PPT均匀用DMEM双无培养基配制。然后用每孔加入20μL的MTT(5mg/m L)，继续培养4小时。最后弃去培养基，每孔加入150μL DMSO溶解甲瓒沉淀，在570nm出测定吸光度。每个实验做3个复孔。然后计算出不同浓度PEI 25K、PEI 1.8K和PPT处理后293T和HELA的细胞活性。
2、试验结果
不同浓度PEI 25K、PEI 1.8K和PPT处理后293T和HELA的细胞活性结果如图5所示。从图5可以看出，PPT的毒性很低，明显低于PEI 25K。
试验例3、本发明氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物在宫颈癌细胞株中的转染效率
研究本发明氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物(取实施例1制备的PPT)在无血清和有血清条件下在宫颈癌细胞株HELA中的转染效率。
1、试验方法
在六孔板中分别加入含有2×105个HELA细胞的2mL DMEM培养基(含10％胎牛血清)培养过夜。第二天进行换液，分别加入DMEM无血清培养基和DMEM有血清培养基(10％～30％胎牛血清)，然后每个孔分别加入100μL的PPT质粒复合物(含质粒2μg，PPT20μg；此比例为PPT的最佳转染比例)，PEI 1.8K质粒复合物(含质粒2μg，PEI 1.8K40μg；此比例为PEI1.8K的最佳转染比例)，PEI 25K质粒复合物(含质粒2μg，PEI 25K4μg；此比例为PEI 25K的最佳转染比例)，Lipofectamine 3000质粒复合物(含质粒2μg，Lipofectamine 3000原液7.5μL；此比例为Lipofectamine 3000的最佳转染比例)，培养5-6小时后进行换液，更换成新的DMEM培养基(含10％胎牛血清)，24小时后用流式细胞仪进行分析。
2、试验结果
无血清转染条件下，本发明PPT质粒复合物的转染效率为78％，PEI 1.8K质粒复合物的转染效率为5％，PEI 25K质粒复合物的转染效率为43％，Lipofectamine 3000质粒复合物的转染效率为64％。本发明PPT质粒复合物、Lipofectamine 3000(Lipo 3000)和PEI25K在无血清转染条件下的转染效率如图6所示。试验结果表明：在无血清转染条件下，PEI1.8K质粒复合物基本没有转染效率，而本发明经过氨基酸修饰后的PEI 1.8K(PPT)转染效率明显提高，转染效率显著高于PEI 25K和Lipofectamine 3000。
在含有10％～30％血清的转染条件下，本发明PPT质粒复合物的转染效率为72％(10％FBS)、65％(20％FBS)和56％(30％FBS)，PEI 1.8K质粒复合物的转染效率为5％(10％FBS)、0％(20％FBS)和0％(30％FBS)，Lipofectamine 3000质粒复合物的转染效率为62％(10％FBS)、54％(20％FBS)和45％(30％FBS)。本发明PPT质粒复合物和Lipofectamine3000(Lipo 3000)在含有10％～30％血清的转染条件下的转染效率如图7所示。试验结果表明：在有血清条件下，本发明PPT的转染效率仍然显著高于商用转染试剂Lipofectamine3000。
由此可见本发明PPT不论转染过程中有无血清，PPT在宫颈癌细胞株中转染效率都显著提高，显著高于市售其他材料的转染效率。
试验例4、本发明氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物在黑色素瘤细胞株中的转染效率
研究本发明氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物(取实施例1制备的材料)在无血清和有血清条件下在黑色素瘤细胞株B16F10中的转染效率。
1、试验方法
在六孔板中分别加入含有2×105个B16F10细胞的2mL DMEM培养基(含10％胎牛血清)培养过夜。第二天进行换液，分别加入DMEM无血清培养基和DMEM有血清培养基(10％～30％胎牛血清)，然后每个孔分别加入100μL的PPT质粒复合物(含质粒2μg，PPT20μg；此比例为PPT的最佳转染比例)，PEI 1.8K质粒复合物(含质粒2μg，PEI 1.8K40μg；此比例为PEI1.8K的最佳转染比例)，PEI 25K质粒复合物(含质粒2μg，PEI 25K4μg；此比例为PEI 25K的最佳转染比例)，Lipofectamine 3000质粒复合物(含质粒2μg，Lipofectamine 3000原液7.5μL；此比例为Lipofectamine 3000的最佳转染比例)，培养5-6小时后进行换液，更换成新的DMEM培养基(含10％胎牛血清)，24小时后用流式细胞仪进行分析。
2、试验效果
无血清转染条件下，本发明PPT质粒复合物的转染效率为84％，PEI 1.8K质粒复合物的转染效率为5％，PEI 25K质粒复合物的转染效率为48％，Lipofectamine 3000质粒复合物的转染效率为72％。本发明PPT质粒复合物、Lipofectamine 3000(Lipo 3000)和PEI25K在无血清转染条件下的转染效率如图8所示。试验结果表明：在无血清转染条件下，PEI1.8K质粒复合物基本没有转染效率，而本发明经过氨基酸修饰后的PEI 1.8K(PPT)转染效率明显提高，转染效率显著高于PEI 25K和Lipofectamine 3000。
在含有10％～30％血清的转染条件下，本发明PPT质粒复合物的转染效率为82％(10％FBS)、77％(20％FBS)和72％(30％FBS)，PEI 1.8K质粒复合物的转染效率为5％(10％FBS)、0％(20％FBS)和0％(30％FBS)，Lipofectamine 3000质粒复合物的转染效率为66％(10％FBS)、58％(20％FBS)和50％(30％FBS)。本发明PPT质粒复合物和Lipofectamine3000(Lipo 3000)在含有10％～30％血清的转染条件下的转染效率如图9所示。试验结果表明：在有血清条件下，本发明PPT的转染效率仍然显著高于商用转染试剂Lipofectamine3000组。
由此可见本发明PPT不论转染过程中有无血清，PPT在黑色素瘤细胞株中转染效率都显著提高，显著高于市售其他材料的转染效率。
综上，本发明制备的氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物作为基因载体具有良好的负载质粒DNA的能力，同时其细胞毒性很低，基因转染效率很高，在有无血清的条件下转染效率均高于现有产品，显著提高了低分子量聚乙烯亚胺的转染效率。本发明氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物可作为优良的基因载体。

Claims (14)

1.一种氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物，其特征在于：它是由苯丙氨酸和酪氨酸取代聚乙烯亚胺中伯胺基的伯胺氢而得；所述聚乙烯亚胺的分子量小于10000。
2.根据权利要求1所述的氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物，其特征在于：所述聚乙烯亚胺中伯胺氢的摩尔取代比例为5～45％；优选为8～35％；更优选为19～37％。
3.根据权利要求2所述的氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物，其特征在于：所述聚乙烯亚胺中伯胺氢的摩尔取代比例为24～28％；优选为28％。
4.根据权利要求1所述的氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物，其特征在于：所述苯丙氨酸和酪氨酸的摩尔比为1:1。
5.根据权利要求1所述的氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物，其特征在于：所述聚乙烯亚胺的分子量为1800。
6.一种权利要求1～5任一项所述的氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)苯丙氨酸和酪氨酸溶于溶剂中，加入催化剂进行催化反应；
(2)将聚乙烯亚胺与催化后的苯丙氨酸和酪氨酸溶于溶剂中，并加入催化剂反应，得反应液；
(3)将反应液进行提纯，提纯后冷冻干燥，即得。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述苯丙氨酸、酪氨酸和聚乙烯亚胺中伯胺基的摩尔比为0.05～0.3:0.05～0.3:1；优选地，所述苯丙氨酸、酪氨酸和聚乙烯亚胺中伯胺基的摩尔比为0.1～0.2:0.1～0.2:1；更优选地，所述苯丙氨酸、酪氨酸和聚乙烯亚胺中伯胺基的摩尔比为0.15:0.15:1。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述苯丙氨酸和酪氨酸的总摩尔量与溶剂体积的比为1:10～80(mol/mL)；所述苯丙氨酸和酪氨酸的总摩尔量与催化剂质量的比1:1～5(mol/mg)；
优选地，步骤(1)中，所述苯丙氨酸和酪氨酸的总摩尔量与溶剂体积的比为1:50(mol/mL)；所述苯丙氨酸和酪氨酸的总摩尔量与催化剂质量的比1:2(mol/mg)。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述苯丙氨酸和酪氨酸的总摩尔量与溶剂体积的比为1:10～80(mol/mL)；所述苯丙氨酸和酪氨酸的总摩尔量与催化剂体积的比0.4～1.6:1(mol/mL)；
优选地，步骤(2)中，所述苯丙氨酸和酪氨酸的总摩尔量与溶剂体积的比为1:40(mol/mL)；所述苯丙氨酸和酪氨酸的总摩尔量与催化剂质量的比0.6:1(mol/mL)。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述溶剂为MES缓冲液，所述催化剂由EDCI和NHS组成，其中EDCI和NHS的质量比为1:1.5～2；
和/或，步骤(2)中，所述溶剂为N-N二甲基甲酰胺，所述催化剂为三乙胺；
优选地，EDCI和NHS的质量比为1:2。
11.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述催化反应为在25℃反应6h；和/或，步骤(2)中，所述反应为在25℃搅拌48小时。
12.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述提纯为将反应液转移入透析袋中，透析，过滤，即可。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于：所述透析袋的截留分子量为1000；和/或，所述透析为在双蒸水中透析3天；和/或，所述过滤为采用0.45μm的滤膜进行过滤。
14.权利要求1～5任一项所述的氨基酸修饰的聚乙烯亚胺化合物在制备基因载体中的用途。
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