CN113087900B - 一种聚氨基酸衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种聚氨基酸衍生物及其制备方法和应用，聚氨基酸衍生物具有式Ⅰ结构。本发明将具有式Ⅰ结构的聚氨基酸衍生物作为添加剂可显著增强阳离子基因载体如PEI25k、PAMAM‑G3、PEI1.8k、PLL的转染效率。该聚氨基酸衍生物与PEI25k共同使用时，对B16F10、293T、HeLa、MCF‑7等正常细胞与癌细胞介导荧光素酶质粒DNA的转染效率是单独使用PEI25k的10～100倍。该聚氨基酸衍生物制备简便，将其与现有的阳离子基因载体混合即可取得增强的转染效果，具有广泛的应用前景。

Description

一种聚氨基酸衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医用新材料领域，尤其涉及一种聚氨基酸衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
基因治疗，是将特定的遗传物质导入细胞，从基因水平上有效治疗相关疾病的疗法。裸露的基因在体液中循环时，因易被核酸酶降解，难以在靶细胞附近聚集和内化，故无法实现基因治疗的目的。为了使基因能够克服种种障碍顺利到达目标位点，设计和构建安全和高效的基因载体显得至关重要。病毒类载体是人们最先关注到的基因载体，过去数十年中，全世界范围内共开展了2000多次有关基因治疗的临床试验。其中，约70％进入临床阶段的基因治疗均使用的是病毒类载体，如腺病毒、慢病毒、逆转录病毒等。尽管病毒载体能够高效地实现基因治疗，但是由于病毒载体存在潜在的致癌性、致免疫性、基因负载率不高、制备繁琐等缺点，仍具有重重使用限制。考虑到病毒载体的弊端，越来越多的研究人员致力于开发非病毒类基因载体。
目前，已报道的非病毒载体可分为聚合物类、脂质体类、无机纳米粒子类。其中，阳离子聚合物能够有效压缩和保护基因，又易于利用化学手段进行结构调整和功能化修饰，是备受关注的一类基因载体。迄今为止，研究和应用最广泛的阳离子聚合物基因载体包括聚赖氨酸、聚酰胺-胺型树枝状聚合物、聚乙烯亚胺、DEAE-葡聚糖等。但与病毒类载体相比，阳离子聚合物基因载体的转染效率仍不能令人满意。单一的多重功能化的适用于转染的阳离子聚合物难以制备，往往需要复杂的侧链修饰和大量筛选。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种聚氨基酸衍生物及其制备方法和应用，该聚氨基酸衍生物具有较高的转染效率。
本发明提供了一种聚氨基酸衍生物，具有式I结构：
Figure BDA0003012196750000021
其中，1≤n≤20。
本发明将具有式I结构的聚氨基酸衍生物作为添加剂可显著增强阳离子基因载体如PEI25k、PAMAM-G3、PEI1.8k、PLL的转染效率。该聚氨基酸衍生物与PEI25k共同使用时，对B16F10、293T、HeLa、MCF-7等正常细胞与癌细胞介导荧光素酶质粒DNA的转染效率是单独使用PEI25k的10～100倍。该聚氨基酸衍生物制备简便，将其与现有的阳离子基因载体混合即可取得增强的转染效果，具有广泛的应用前景。
本发明提供了一种上述技术方案所述聚氨基酸衍生物的制备方法，包括以下步骤：
在无氧条件下，将2-(Boc-氨基)乙硫醇、聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸酯)和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮混合，通入氮气，加入N,N-二甲基甲酰胺，365nm紫外光照射10～60min，室温下反应至少12h，得到的反应液透析，向透析产物中加入三氟乙酸，室温下反应2～6h，再次透析，得到具有式I结构的聚氨基酸衍生物。
该聚氨基酸衍生物制备简便，将其与现有的阳离子基因载体混合即可取得增强的转染效果，具有广泛的应用前景。
在本发明中，所述2-(Boc-氨基)乙硫醇和聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸酯)重复单元的摩尔比为1～5:1；所述聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸酯)所述聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸酯)重复单元和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的摩尔比为10～20:1和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的摩尔比为10～20:1。
在本发明中，所述N,N-二甲基甲酰胺加入的体积为(聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸酯)固体质量的5～10倍；室温下搅拌使固体溶解。本发明对得到的反应液用去离子水透析；所述透析的时间为23～25h；透析完成后，滤出透析袋中的固体，转移至反应器中，加入三氟乙酸；所述三氟乙酸加入的体积为固体质量的5～10倍。室温下反应2～6h，将得到的反应液转移至截留分子量2000或3500的透析袋中再次透析；采用去离子水透析；再次透析的时间为70～74h，期间换水4～6次。冷冻干燥，得到具有式I结构的聚氨基酸衍生物。
在本发明中，所述2-(Boc-氨基)乙硫醇和聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸酯)重复单元的摩尔比为1～5:1；所述聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸酯)重复单元和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的摩尔比为10～20:1。具体实施例中，所述2-(Boc-氨基)乙硫醇和聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸酯)重复单元的摩尔比为2:1；聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸酯)重复单元和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的摩尔比为10。
本发明提供了一种复合物颗粒，包括聚氨基酸衍生物、质粒DNA和阳离子聚合物；
所述聚氨基酸衍生物为上述技术方案所述具有式I结构的聚氨基酸衍生物或上述技术方案所述制备方法制备的具有式I结构的聚氨基酸衍生物；
所述聚氨基酸衍生物、质粒DNA和阳离子聚合物的质量比为1～2:1:1～5，优选为1～2:1～2～3，更优选为1～2:1:2.5。具体实施例中，所述聚氨基酸衍生物、质粒DNA和阳离子聚合物的质量比为1:1:2.5或1.25:1:2.5或1.5:1:2.5。
在本发明中，所述阳离子聚合物作为阳离子基因载体；所述阳离子聚合物优选选自支化型聚乙烯亚胺、线型聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚酰胺-胺树枝状聚合物中的一种或多种。所述阳离子聚合物选自PEI25k、PAMAM-G3、PEI1.8k和PLL中的一种或多种。
在本发明中，所述质粒DNA选自绿色荧光蛋白表达质粒pEGFPN1、荧光素酶表达质粒pGL3和红色荧光蛋白表达质粒pRFP中的一种或多种。
本发明提供的复合物颗粒中所述聚氨基酸衍生物作为添加剂可显著增强阳离子基因载体如PEI25k、PAMAM-G3、PEI1.8k、PLL的转染效率。
在本发明中，所述聚氨基酸衍生物与阳离子聚合物混合使用进行基因转染时，可促进纳米粒子的细胞内化及内涵体逃逸，相比于单一的阳离子聚合物，可大大提高转染效率。
本发明提供了一种上述技术方案所述聚氨基酸衍生物作为添加剂增强阳离子聚合物在多种细胞系中的体外质粒DNA转染或在体内质粒DNA转染的应用。
在本发明中，所述聚氨基酸衍生物与PEI25k共同使用时，对B16F10、293T、HeLa、MCF-7等正常细胞与癌细胞介导荧光素酶质粒DNA的转染效率是单独使用PEI25k的10～100倍。
在本发明中，所述细胞系包括HeLa、MCF7、293T、293F、293S、CHO、CHO-S、COS7、COS-7L、CV-1、HEK-293、HT-1080、MDCK、NIH-3T3、SKBR3和Vero中的一种或多种。
在本发明中，所述聚氨基酸衍生物作为添加剂增强阳离子聚合物在多种细胞系中的体外质粒DNA转染中的应用，具体步骤如下：
(1)细胞的培养
细胞置于含体积分数为10％胎牛血清的培养液中，在37℃含体积分数为5％二氧化碳的培养箱中连续培养。
(2)体外转染
转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的培养箱中继续培养至汇合度达到80～90％。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，加入基因组转染的掺入如上述技术方案所述聚氨基酸衍生物的复合物颗粒以及含有体积分数为10％胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL，继续培养24～48小时。
(3)体外转染效率的测定
a)绿色荧光蛋白(GFP)表达
用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白信号。阳性细胞发出明亮的绿色荧光，而阴性细胞则无。
b)荧光素酶活性检测
取出培养板，吸去培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，加入细胞裂解液裂解，然后加入荧光素酶底物，用微量光度计测定转染效率。
在本发明中，所述聚氨基酸衍生物作为添加剂增强阳离子聚合物在体内质粒DNA转染中的应用，(以CT26荷瘤小鼠为例进行说明)：
(1)CT26细胞的培养
取小鼠结肠癌CT26细胞，置于含体积分数为10％胎牛血清的培养液中，在37℃含体积分数为5％二氧化碳的培养箱中连续培养。
(2)肿瘤接种
购买重量约为20g的Balb/C小鼠，接种前，取对数生长期的CT26细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基中和胰酶，采用1×103转每分钟的转速离心5分钟，用磷酸盐缓冲溶液洗涤三次并重悬细胞，按每只小鼠2×106细胞的密度接种于大腿根部，待肿瘤体积长至约150mm3时进行体内转染实验。
(3)体内转染
配制0.2mL含有红色荧光蛋白基因组转染的掺入如上述技术方案所述的聚氨基酸衍生物的复合物颗粒的磷酸盐缓冲液，尾静脉注射至荷瘤小鼠体内。
(4)体内转染效率的测定
体内转染72小时后，解剖小鼠，取出肿瘤，磷酸盐缓冲液洗涤后，用荧光成像系统测定其荧光强度以评价体内转染效率。
本发明提供了一种聚氨基酸衍生物，具有式I结构。本发明将具有式I结构的聚氨基酸衍生物作为添加剂可显著增强阳离子基因载体如PEI25k、PAMAM-G3、PEI1.8k、PLL的转染效率。该聚氨基酸衍生物与PEI25k共同使用时，对B16F10、293T、HeLa、MCF-7等正常细胞与癌细胞介导荧光素酶质粒DNA的转染效率是单独使用PEI25k的10～100倍。该聚氨基酸衍生物制备简便，将其与现有的阳离子基因载体混合即可取得增强的转染效果，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的聚氨基酸衍生物的核磁共振氢谱图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种聚氨基酸衍生物及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1聚氨基酸衍生物的制备与表征
在无氧条件下，在反应容器中加入2-(Boc-氨基)乙硫醇、聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸酯)和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮，2-(Boc-氨基)乙硫醇和聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸酯)重复单元的摩尔比为2，聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸酯)重复单元和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的摩尔比为10。向反应容器中通入氮气，再加入N’N’-二甲基甲酰胺，体积为固体总质量的10倍，室温下搅拌使固体溶解。用365nm紫外光源照射反应容器60分钟后，室温继续反应12小时。反应完成后，将反应液转移至透析袋中，用去离子水透析24小时，其间多次换水。透析完成后，滤出透析袋中的固体，将固体转移至干净的反应容器中，加入三氟乙酸，体积为固体质量的10倍，室温反应4小时。反应完成后，将反应液转移至截留分子量3500的透析袋中，去离子水透析72小时，期间换水4～6次，冷冻干燥，得到最终产物聚氨基酸衍生物。
实施例2聚氨基酸衍生物提高阳离子聚合物PEI25k的体外转染能力
以聚氨基酸衍生物提高支化PEI25k在B16F10细胞系中的荧光素酶表达质粒转染为例进行说明。
(1)B16F10细胞的培养
细胞置于含体积分数为10％胎牛血清的培养液中，在37℃含体积分数为5％二氧化碳的培养箱中连续培养。
(2)体外转染
转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的培养箱中继续培养至汇合度达到80～90％。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，加入基因组转染的掺入本发明提供的聚氨基酸衍生物的复合物颗粒(按照聚氨基酸衍生物、质粒DNA和PEI25k的复合顺序以一定比例制得)以及含有体积分数为10％胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL，继续培养48小时。
(3)体外转染效率的测定
取出培养板，吸去培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，加入细胞裂解液裂解，然后加入荧光素酶底物，用微量光度计测定转染效率。
表1聚氨基酸衍生物增强PEI25k介导的荧光素酶质粒在B16F10中的转染效率
Figure BDA0003012196750000071
注：PEI25k与DNA的质量比为2.5:1。
实施例3聚氨基酸衍生物提高阳离子聚合物的体内转染能力
以聚氨基酸衍生物提高支化PEI25k在CT26荷瘤小鼠模型中的肿瘤部位红色荧光表达质粒转染为例进行说明。
(1)CT26细胞的培养
取小鼠结肠癌CT26细胞，置于含体积分数为10％胎牛血清的培养液中，在37℃含体积分数为5％二氧化碳的培养箱中连续培养。
(2)肿瘤接种
购买重量约为20g的Balb/C小鼠，接种前，取对数生长期的CT26细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基中和胰酶，采用1×103转每分钟的转速离心5分钟，用磷酸盐缓冲溶液洗涤三次并重悬细胞，按每只小鼠2×106细胞的密度接种于大腿根部，待肿瘤体积长至约150mm3时进行体内转染实验。
(3)体内转染
配制0.2mL含有红色荧光蛋白基因组转染的掺入所述的聚氨基酸衍生物的复合物颗粒的磷酸盐缓冲液，尾静脉注射至荷瘤小鼠体内。
(4)体内转染效率的测定
体内转染72小时后，解剖小鼠，取出肿瘤，磷酸盐缓冲液洗涤后，用荧光成像系统测定其荧光强度以评价体内转染效率。
表2聚氨基酸衍生物增强PEI25k介导的红色荧光蛋白质粒的体内转染
Figure BDA0003012196750000072
注：PEI25k与DNA的质量比为2.5:1，聚氨基酸衍生物与DNA的质量比为1.25:1。
实施例4聚氨基酸衍生物提高其他阳离子聚合物的体外转染能力
以聚氨基酸衍生物提高聚合度为120的聚赖氨酸(PLL120)和三代聚酰胺-胺树状物(PAMAM-G3)在B16F10细胞系中的荧光素酶表达质粒转染为例进行说明。
(1)B16F10细胞的培养
细胞置于含体积分数为10％胎牛血清的培养液中，在37℃含体积分数为5％二氧化碳的培养箱中连续培养。
(2)体外转染
转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的培养箱中继续培养至汇合度达到80～90％。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，加入基因组转染的掺入本发明提供的聚氨基酸衍生物的复合物颗粒(按照聚氨基酸衍生物、质粒DNA和聚赖氨酸或聚酰胺-胺树状物的复合顺序以一定比例制得)以及含有体积分数为10％胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μL，继续培养48小时。
(3)体外转染效率的测定
取出培养板，吸去培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，加入细胞裂解液裂解，然后加入荧光素酶底物，用微量光度计测定转染效率。
表3聚氨基酸衍生物增强聚赖氨酸(PLL120)介导的荧光素酶质粒在B16F10中的转染效率
Figure BDA0003012196750000081
注：PLL120与DNA的质量比为2.5:1。
表4聚氨基酸衍生物增强三代聚酰胺-胺树枝状聚合物(PAMAM-G3)介导的荧光素酶质粒在B16F10中的转染效率
Figure BDA0003012196750000082
Figure BDA0003012196750000091
注：PAMAM-G3与DNA的质量比为2.5:1。
由以上实施例可知，本发明提供了一种聚氨基酸衍生物，具有式I结构。本发明将具有式I结构的聚氨基酸衍生物作为添加剂可显著增强阳离子基因载体如PEI25k、PAMAM-G3、PEI1.8k、PLL的转染效率。该聚氨基酸衍生物与PEI25k共同使用时，对B16F10、293T、HeLa、MCF-7等正常细胞与癌细胞介导荧光素酶质粒DNA的转染效率是单独使用PEI25k的10～100倍。该聚氨基酸衍生物制备简便，将其与现有的阳离子基因载体混合即可取得增强的转染效果，具有广泛的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种聚氨基酸衍生物的制备方法，包括以下步骤：
在无氧条件下，将2-（Boc-氨基）乙硫醇、聚（γ-烯丙基-L-谷氨酸酯）和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮混合，通入氮气，加入N,N-二甲基甲酰胺，365nm紫外光照射10~60min，室温下反应至少12h，得到的反应液透析，向透析产物中加入三氟乙酸，室温下反应2~6h，再次透析，得到具有式Ⅰ结构的聚氨基酸衍生物；
Figure DEST_PATH_IMAGE002
式Ⅰ；
其中，1≤n≤20。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述再次透析采用截留分子量2000~3500的透析袋。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述2-（Boc-氨基）乙硫醇和聚（γ-烯丙基-L-谷氨酸酯）重复单元的摩尔比为1~5:1；
所述聚（γ-烯丙基-L-谷氨酸酯）重复单元和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的摩尔比为10~20:1。
4.一种复合物颗粒，包括聚氨基酸衍生物、质粒DNA和阳离子聚合物；
所述聚氨基酸衍生物为权利要求1~3任一项所述制备方法制备的具有式Ⅰ结构的聚氨基酸衍生物；
所述聚氨基酸衍生物、质粒DNA和阳离子聚合物的质量比为1~2:1:1~5。
5.根据权利要求4所述的复合物颗粒，其特征在于，所述阳离子聚合物选自支化型聚乙烯亚胺、线型聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚酰胺-胺树枝状聚合物中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的复合物颗粒，其特征在于，所述阳离子聚合物选自PEI25k、PAMAM-G3和PEI1.8k中的一种或多种。
7.根据权利要求4所述的复合物颗粒，其特征在于，所述质粒DNA选自绿色荧光蛋白表达质粒pEGFPN1、荧光素酶表达质粒pGL3和红色荧光蛋白表达质粒pRFP中的一种或多种。
8.一种权利要求1所述制备方法制备的聚氨基酸衍生物增强阳离子聚合物在制备多种细胞系中的体外质粒DNA转染的添加剂或在体内质粒DNA转染的添加剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述细胞系包括HeLa、MCF7、293T、293F、293S、CHO、CHO-S、COS7、COS-7L、CV-1、HEK-293、HT-1080、MDCK、NIH-3T3、SKBR3和Vero中的一种或多种。
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