CN108728496B - 一种聚阳离子基因载体、其制备方法及其应用 - Google Patents
一种聚阳离子基因载体、其制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种聚阳离子基因载体、其制备方法及其应用,聚阳离子基因载体包括接枝骨架和与所述接枝骨架接枝的对甲苯磺酰基保护的精氨酸;所述接枝骨架的原料选自树枝状聚酰胺‑胺、分子量为2000~100000g/mol的超支化聚赖氨酸或分子量2000~50000g/mol的线性ε‑聚赖氨酸;所述树枝状聚酰胺‑胺选自型号PAMAM‑G3、型号PAMAM‑G4和型号PAMAM‑G5中的一种或多种。本发明提供的聚阳离子基因载体在特定接枝骨架上接枝对甲苯磺酰基保护的精氨酸,能显著提高聚阳离子载体制备的复合物纳米颗粒的转染效率。另外,其能够有效降低纳米复合物颗粒的电荷密度,进而降低其细胞毒性。
Description
技术领域
本发明属于生物医用新材料技术领域,尤其涉及一种聚阳离子基因载体、其制备方法及其应用。
背景技术
基因治疗作为一种全新的治疗工具在治疗癌症以及遗传疾病上逐渐受到人们的关注。基因治疗是指将健康的外源基因导入受体细胞也就是靶细胞,以纠正或补偿因基因缺陷或者异常引起的疾病,从而达到治疗目的的新技术。
高效的基因载体在基因治疗中显得十分重要。其中,阳离子型基因载体日益受到人们的关注。在传统的阳离子基因载体中,PEI25k是作为阳离子基因载体的“黄金标准”。PEI25k虽然具有较高的转染效率,但是其存在较大的细胞毒性,限制了其在临床上的应用[参见Lungwitz U,Breunig M,Blunk T,Gopferich A.Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems.Eur.J.Pharm.Biopharm 2005;60,247-266.]。因此设计出高转染效率,低细胞毒性的阳离子基因载体逐渐成为研究的热点。
参见文献Tian,H.Y.;Chen,X.S.Ultrasensitive pH Triggered Charge/SizeDual-Rebound Gene Delivery System.Nano Lett.2016,16,6823-6831.Tian,H.Y;Tang,Z.H.;Zhuang,X.L.;Chen,X.S.;Jing,X.B.Biodegradable synthetic polymers:Preparation,functionalization and biomedicalapplication.Prog.Polym.Sci.2012,37,237-280.尽管上述文献报道的载体能够在一定程度上降低其细胞毒性,但是其制备方法复杂,可重复性差。因此,设计一种制备方法简单、可重复性强的阳离子基因载体显得十分重要。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种聚阳离子基因载体、其制备方法及其应用,该聚阳离子基因载体制备的复合物具有较高的转染效率。
本发明提供了一种聚阳离子基因载体,包括接枝骨架和与所述接枝骨架接枝的对甲苯磺酰基保护的精氨酸;
所述接枝骨架的原料选自树枝状聚酰胺-胺、分子量为2000~100000g/mol的超支化聚赖氨酸或分子量2000~50000g/mol的线性ε-聚赖氨酸;
所述树枝状聚酰胺-胺选自型号PAMAM-G3、型号PAMAM-G4和型号PAMAM-G5中的一种或多种。
优选地,所述树枝状聚酰胺-胺和对甲苯磺酰基保护的精氨酸的物质的量比为1:5~80;
所述分子量为2000~100000g/mol的超支化聚赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的物质的量比为1:5~400;
所述分子量2000~50000g/mol的线性ε-聚赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的物质的量比为1:5~200。
本发明提供了一种上述技术方案所述聚阳离子基因载体的制备方法,包括以下步骤:
a)将活化的对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液和接枝骨架原料溶液反应,透析,冻干,得到冻干产物;所述接枝骨架原料溶液中的接枝骨架原料选自树枝状聚酰胺-胺、分子量为2000~100000g/mol的超支化聚赖氨酸或分子量2000~50000g/mol的线性ε-聚赖氨酸;所述树枝状聚酰胺-胺选自型号PAMAM-G3、型号PAMAM-G4和型号PAMAM-G5中的一种或多种;
b)将所述冻干产物和三氟乙酸反应,沉降反应产物,得到聚阳离子基因载体。
优选地,所述步骤a)中活化的对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液按照以下方法制得:
将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑加入到对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液中,进行活化,得到活化的对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液。
优选地,所述对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸与所述接枝骨架原料的质量比为4.5~5.5:1;
所述对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液中对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的质量与溶剂的体积比为1g:(9~12)mL。
优选地,所述活化的温度为15~35℃;活化的时间为0.5~2h。
优选地,所述步骤a)中反应的温度为15~35℃;所述步骤a)中反应的时间为80~120h。
优选地,所述步骤b)中反应的温度为15~35℃;所述步骤b)中反应的时间为3~5h。
优选地,所述步骤a)中透析的时间为65~80h;冻干的温度为-60~-80℃。
本发明提供了一种纳米复合物颗粒,包括上述技术方案所述或上述技术方案所述制备方法制备的聚阳离子基因载体和负载在聚阳离子基因载体上的基因;
所述基因为DNA和/或RNA。
本发明提供了一种聚阳离子基因载体,包括接枝骨架和与所述接枝骨架接枝的对甲苯磺酰基保护的精氨酸;所述接枝骨架的原料选自树枝状聚酰胺-胺、分子量为2000~100000g/mol的超支化聚赖氨酸或分子量2000~50000g/mol的线性ε-聚赖氨酸;所述树枝状聚酰胺-胺选自型号PAMAM-G3、型号PAMAM-G4和型号PAMAM-G5中的一种或多种。本发明提供的聚阳离子基因载体在特定接枝骨架上接枝对甲苯磺酰基保护的精氨酸,能显著提高聚阳离子载体制备的复合物纳米颗粒的转染效率。另外,其能够有效降低纳米复合物颗粒的电荷密度,进而降低其细胞毒性。实验结果表明:PAMAM-Arg(Tos)担载的pGL3质粒在MCF-7细胞中的最佳转染效率比亲代PAMAM高出10多倍,在最佳转染效率的比例范围,细胞存活率达到90%以上;PAMAM-Arg(Tos)的基因沉默效率高,对恒定表达荧光素酶的HuH-7Luc细胞的基因沉默效率最高可达为67%;HBPLL-Arg(Tos)担载的pGL3质粒在MCF-7细胞中的最佳转染效率大约是亲代HBPLL的10倍,在最佳转染效率的比例范围,细胞存活率达到85%以上,HBPLL-Arg(Tos)的基因沉默效率高,对恒定表达荧光素酶的HuH-7Luc细胞的基因沉默效率最高可达为64%;ε-PLL-Arg(Tos)担载的pGL3质粒在MCF-7细胞中的最佳转染效率是亲代ε-PLL的100倍,在最佳转染效率的比例范围,细胞存活率达到90%以上,ε-PLL-Arg(Tos)的基因沉默效率高,对恒定表达荧光素酶的HuH-7Luc细胞的基因沉默效率最高可达为59%。
聚阳离子基因载体的制备过程简单,可重复性强,对于基因载体的构建以及通过基因治疗肿瘤起到重要的作用。
具体实施方式
本发明提供了一种聚阳离子基因载体,包括接枝骨架和与所述接枝骨架接枝的对甲苯磺酰基保护的精氨酸;
所述接枝骨架的原料选自树枝状聚酰胺-胺、分子量为2000~100000g/mol的超支化聚赖氨酸或分子量2000~50000g/mol的线性ε-聚赖氨酸;
所述树枝状聚酰胺-胺选自型号PAMAM-G3、型号PAMAM-G4和型号PAMAM-G5中的一种或多种。
本发明提供的聚阳离子基因载体在特定接枝骨架上接枝对甲苯磺酰基保护的精氨酸(Arg(Tos)),能显著提高聚阳离子载体制备的复合物纳米颗粒的转染效率。另外,其能够有效降低纳米复合物颗粒的电荷密度,进而降低其细胞毒性。
本发明提供的聚阳离子基因载体包括接枝骨架;所述接枝骨架的原料选自树枝状聚酰胺-胺(PAMAM)、分子量为2000~100000g/mol的超支化聚赖氨酸(HBPLL)或分子量2000~50000g/mol的线性ε-聚赖氨酸(ε-PLL)。
在本发明中,所述树枝状聚酰胺-胺选自型号PAMAM-G3、型号PAMAM-G4和型号PAMAM-G5中的一种或多种。所述PAMAM-G3中伯氨基团的个数为32个;PAMAM-G3所接枝的Arg(Tos)的数量为5~25。PAMAM-G4中伯氨基团的个数为64个;PAMAM-G4所接枝的Arg(Tos)的数量为5~40。PAMAM-G5中伯氨基团的个数为128个;PAMAM-G5所接枝的Arg(Tos)的数量为10~80。在本发明具体实施例中,所述PAMAM-G3的分子量为6909g/mol;PAMAM-G4的分子量为14215g/mol;PAMAM-G5的分子量为28826g/mol。所述树枝状聚酰胺-胺和对甲苯磺酰基保护的精氨酸的物质的量比优选为1:5~80;在本发明具体实施例中,所述树枝状聚酰胺-胺和对甲苯磺酰基保护的精氨酸的物质的量比为1:5;1:10;1:15;1:20;1:25;1:40和1:80。
在本发明具体实施例中,所述分子量为2000~100000g/mol的超支化聚赖氨酸(HBPLL)具体为分子量2000g/mol的HBPLL或分子量100000g/mol的HBPLL。所述分子量为2000~100000g/mol的超支化聚赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的物质的量比优选为1:5~400;在本发明具体实施例中,所述分子量为2000~100000g/mol的超支化聚赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的物质的量比为1:5;1:10;1:15;1:20;1:50;1:100;1:200和1:400。
在本发明具体实施例中,所述分子量2000~50000g/mol的线性ε-聚赖氨酸(ε-PLL)具体为分子量2000g/mol的ε-PLL和分子量50000g/mol的ε-PLL。所述分子量2000~50000g/mol的线性ε-聚赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的物质的量比优选为1:5~200;在具体实施例中,所述分子量2000~50000g/mol的线性ε-聚赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的物质的量比为1:5;1:10;1:15;1:20;1:25;1:100和1:200。
所述树枝状聚酰胺-胺接枝对甲苯磺酰基保护的精氨酸得到的聚阳离子基因载体记作PAMAM-Arg(Tos);所述分子量为2000~100000g/mol的超支化聚赖氨酸接枝对甲苯磺酰基保护的精氨酸得到的聚阳离子基因载体记作HBPLL-Arg(Tos);所述分子量2000~50000g/mol的线性ε-聚赖氨酸接枝对甲苯磺酰基保护的精氨酸得到的聚阳离子基因载体记作ε-PLL-Arg(Tos)。
本发明提供了一种上述技术方案所述聚阳离子基因载体的制备方法,包括以下步骤:
a)将活化的对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液和接枝骨架原料溶液反应,透析,冻干,得到冻干产物;所述接枝骨架原料溶液中的接枝骨架原料选自树枝状聚酰胺-胺、分子量为2000~100000g/mol的超支化聚赖氨酸或分子量2000~50000g/mol的线性ε-聚赖氨酸;所述树枝状聚酰胺-胺选自型号PAMAM-G3、型号PAMAM-G4和型号PAMAM-G5中的一种或多种;
b)将所述冻干产物和三氟乙酸反应,沉降反应产物,得到聚阳离子基因载体。
该制备过程简单,可重复性强,对于基因载体的构建以及通过基因治疗肿瘤起到重要的作用。
本发明将活化的对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液和接枝骨架原料溶液反应,透析,冻干,得到冻干产物。
在本发明中,所述活化的对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液优选按照以下方法制得:
将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、1-羟基苯并三唑(HOBT)加入到对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液中,进行活化,得到活化的对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液。
在本发明中,所述EDC·HCl的摩尔当量优选为Boc-Arg(Tos)-OH的2倍;所述HOBT的摩尔当量优选为Boc-Arg(Tos)-OH的2倍。所述对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液中的溶剂优选为醇类溶剂;更优选为甲醇和/或水;所述对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液中对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的质量与溶剂的体积比优选为1g:(9~12)mL;更优选为1g:10mL。
在本发明中,所述活化的温度优选为15~35℃,更优选为20~30℃;活化的时间优选为0.5~2h,更优选为1~1.5h。
所述接枝骨架原料溶液中的接枝骨架原料选自树枝状聚酰胺-胺、分子量为2000~100000g/mol的超支化聚赖氨酸或分子量2000~50000g/mol的线性ε-聚赖氨酸。所述树枝状聚酰胺-胺、分子量为2000~100000g/mol的超支化聚赖氨酸或分子量2000~50000g/mol的线性ε-聚赖氨酸的具体种类与上述技术方案所述树枝状聚酰胺-胺、分子量为2000~100000g/mol的超支化聚赖氨酸或分子量2000~50000g/mol的线性ε-聚赖氨酸种类一致,在此不再赘述。
在本发明中,所述对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸与所述接枝骨架原料的质量比优选为4.5~5.5:1;更优选为5:1。
所述活化的对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液和接枝骨架原料溶液反应的温度优选为15~35℃;更优选为20~30℃。所述活化的对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液和接枝骨架原料溶液反应的时间优选为80~120h,更优选为90~110h。
所述透析采用本领域技术人员熟知的透析袋进行透析。本发明根据具体接枝骨架不同,采用不同分子量的透析袋;具体的,分子量2000g/mol的HBPLL和分子量2000g/mol的ε-PLL均采用分子量1000的透析袋;PAPAM-G3、PAPAM-G4、PAPAM-G5、分子量100000g/mol的HBPLL和分子量50000g/mol的ε-PLL均采用分子量3500的透析袋。透析时优选每隔8h换一次透析水;透析的时间优选为65~80h;更优选为70~75h。
本发明优选采用冷冻干燥机进行冻干。所述冻干的温度优选为-60~-80℃;更优选为-68~-78℃。冻干的真空度为0.001Pa。
得到冻干产物后,本发明将所述冻干产物和三氟乙酸反应,沉降反应产物,得到聚阳离子基因载体。在本发明中,所述冻干产物和三氟乙酸反应的温度优选为15~35℃;所述反应的时间优选为3~5h,更优选为3.5~4.5h。
本发明优选在所述冻干产物和三氟乙酸反应结束后进行真空浓缩;本发明优选采用旋转蒸发仪进行真空浓缩;所述真空浓缩的真空度为-0.1~0MPa;本发明优选真空浓缩至80%的液体除去。
真空浓缩后进行沉降;本发明优选采用无水乙醚进行沉降。本发明优选将沉降产物依次进行真空抽干,透析和冻干,得到聚阳离子基因载体。本发明对真空抽干、透析和冻干的方法没有特殊的限制,采用本领域技术人员熟知的真空抽干、透析和冻干技术方案即可。
本发明提供了一种纳米复合物颗粒,包括上述技术方案所述或上述技术方案所述制备方法制备的聚阳离子基因载体和负载在聚阳离子基因载体上的基因;所述基因为DNA和/或RNA。
在本发明中,所述DNA优选选自pDNA;所述RNA优选选自siRNA。
所述纳米复合物颗粒可以在体内以及体外进行应用。
PAMAM-Arg(Tos)和pDNA的质量比为2.5~10:1;HBPLL-Arg(Tos)和pDNA的质量比为2.5~20:1;ε-PLL-Arg(Tos)与pDNA的质量比为2.5~20:1。
PAMAM-Arg(Tos)和siRNA的质量比为5~20:1;HBPLL-Arg(Tos)和siRNA的质量比为5~20:1;ε-PLL-Arg(Tos)与siRNA的质量比为5~20:1。
本发明将纳米复合物颗粒进行体外和体内的应用研究。纳米复合物颗粒可以用于多种细胞系,如MCF-7,HeLa,B16F10,293T,293F,293S,CT26,BE(2)C,CHO,CHO-S,COS7,COS-7L,CV-1,HEK-293,HT-1080,MDCK,NIH-3T3,SKBR3,Vero和HuH-7。转染中作为质粒DNA的载体;所述质粒DNA选自pEGFPN1(绿色荧光蛋白质粒)和pGL3(荧光素酶质粒)。在本发明具体实施例中,所述细胞选自MCF-7或HuH-7细胞系。
在转染中作为质粒DNA(pEGFPN1(绿色荧光蛋白质粒)和pGL3(荧光素酶质粒))载体的过程包括:
(1)细胞培养
将细胞于培养在含10%体积分数的胎牛血清培养液中,细胞在设定温度为37℃、体积分数为5%的二氧化碳的恒温培养箱中培养。
(2)细胞转染
在转染前24h,取对数生长期细胞,胰酶消化后用含体积分数10%的胎牛血清培养液稀释,按照1×104细胞/孔的密度铺板于96孔细胞培养板中,置于培养温度为37℃、含体积分数5%的CO2的恒温培养箱中培养直至细胞汇合度达80~90%。转染时,将载体/pDNA复合物复合20min后,按照0.2μg pDNA/孔加入到96孔细胞板中,继续培养48小时。
(3)细胞转染效率的测定
a)荧光素酶活性检测
从培养箱中取出细胞培养板,移除细胞培养液,用PBS洗涤2次,加入细胞裂解液放入-80℃中裂解20min,然后每孔加入一定量的荧光素酶底物,通过光度计定量测定细胞转染效率。
b)绿色荧光蛋白(GFP)的表达
在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白信号。能够转染的阳性细胞能够产生绿色荧光,而不能转染的细胞就不会产生绿色荧光。可以用流式细胞仪(Flowcytometry)检测转染阳性细胞的百分比。
(4)细胞毒性的检测(MTT)
采用四甲基偶氮唑盐(噻唑蓝)比色法进行阳离子载体/pDNA复合物的细胞毒性评价。
在转染前24h,取对数生长期细胞,胰酶消化后用含体积分数10%的胎牛血清培养液稀释,按照1×104细胞/孔的密度铺板于96孔细胞培养板中,置于培养温度为37℃、含体积分数5%的CO2的恒温培养箱中培养直至细胞汇合度达80~90%。将不同浓度的阳离子载体材料和细胞进行共培养24小时,然后在每孔中加入20μL噻唑蓝溶液(质量分数0.5%),在37℃下继续培养4小时,然后吸出培养液,往其中每孔加入200μLDMSO,通过酶标仪检测培养板每孔的吸收,检测的波长选为490nm。细胞的存活率按如下公式:
细胞存活率(%)=(Asample/Acontrol)×100
Asample是转染后的细胞样品孔的吸收,Acontrol是不加材料组样品孔的吸收,每组实验重复三次。
本发明将纳米复合物颗粒用于细胞体系中时包括:
(1)通过常规方法我们合成siRNA,该siRNA的序列为5’-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3’,能够沉默荧光素酶的Luc siRNA.
(2)细胞的培养
将细胞置于含体积分数10%的胎牛血清培养液中,在培养温度37℃下体积分数为5%的CO2的恒温箱中连续培养。
(3)细胞转染
在转染前24h,取对数生长期细胞,胰酶消化后用含体积分数10%的胎牛血清培养液稀释,按照1×104细胞/孔的密度铺板于96孔细胞培养板中,置于培养温度为37℃、含体积分数5%的CO2的恒温培养箱中培养直至细胞汇合度达80~90%。转染时,将载体/pDNA复合物复合20min后,按照0.2μg pDNA/孔加入到96孔细胞板中,继续培养48小时。
(4)细胞转染效率的测定
从培养箱中取出细胞培养板,移除细胞培养液,用PBS洗涤2次,加入细胞裂解液放入-80℃中裂解20min,然后每孔加入一定量的荧光素酶底物,通过光度计定量测定细胞转染效率。
本发明提供阳离子基因载体PAMAM-Arg(Tos)、HBPLL-Arg(Tos)以及ε-PLL-Arg(Tos)在体内转染的应用,通过以下方案实现:
(1)CT26细胞的培养
将CT26细胞置于含有10%的胎牛血清培养液中,在含体积分数为5%的CO2、温度为37℃的恒温箱中培养。
(2)肿瘤接种
购买周龄5-6周的体重20g左右的BALB/c小鼠,肿瘤接种前,取对数生长期的CT26细胞,用胰蛋白酶消化,然后用细胞培养液混合胰蛋白酶,1×103rpm离心5min,PBS洗涤三次,用PBS悬浮细胞。按每只小鼠3×106细胞接种于小鼠腋下。7天后,瘤径平均长大至7mm时进行siRNA体内的转染。
(3)体内转染
基因选用能够表达能够沉默肿瘤血管内皮生长因子的shRNA的pDNA(通过抑制VEGF蛋白的表达来抑制肿瘤生长,按照每只小鼠的pDNA用量20ug,载体/pDNA复合物的生理盐水溶液体积200μL尾静脉注射小鼠体内,每隔一天给一次药,给药14天。
(4)小鼠肿瘤生长的测定
在小鼠第一次给药开始,每天测量小鼠肿瘤大小以及体重的变化。
本发明提供的PAMAM-Arg(Tos)、HBPLL-Arg(Tos)以及ε-PLL-Arg(Tos)是三种高转染效率、低细胞毒性的阳离子基因载体。
为了进一步说明本发明,下面结合实施例对本发明提供的一种聚阳离子基因载体、其制备方法及其应用进行详细地描述,但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1:PAMAM-Arg(Tos)的制备
(1)G3代的PAMAM-Arg(Tos)的合成。
称量G3代的PAMAM(200mg,0.0289mmol)溶解于4mL无水甲醇中,根据设计的摩尔投料比(见表格1)将一定量的对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸(Boc-Arg(Tos)-OH)溶解在无水甲醇中(按照1gBoc-Arg(Tos)-OH/10mL甲醇溶解)中。将EDCI(摩尔当量是Boc-Arg(Tos)-OH的2倍)和HOBT(摩尔当量是Boc-Arg(Tos)-OH的2倍)加入到Boc-Arg(Tos)-OH溶液中活化反应1h,然后将PAMAM的甲醇溶液缓慢加入到上述混合液中,室温反应4天。将反应的混合物透析,冻干。然后将冻干产物在三氟乙酸的条件下反应4h,真空浓缩,加无水乙醚沉降,真空抽干,透析,冻干,得到固体产物G3PAMAM-Arg(Tos)。
(2)G4代的PAMAM-Arg(Tos)的合成。
称量G4代的PAMAM(200mg,0.0141mmol)溶解于4mL无水甲醇中,根据设计的摩尔投料比(见表格1)将一定量的对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸Boc-Arg(Tos)-OH)溶解于无水甲醇(按照1g Boc-Arg(Tos)-OH/10mL甲醇溶解)中。将EDCI(摩尔当量是Boc-Arg(Tos)-OH的2倍)和HOBT(摩尔当量是Boc-Arg(Tos)-OH的2倍)加入到Boc-Arg(Tos)-OH溶液中室温下活化反应1h,然后将PAMAM的甲醇溶液缓慢加入到上述混合液中,室温反应4天。将反应的混合物透析,冻干。然后将冻干产物在三氟乙酸的条件下反应4h,真空浓缩,加无水乙醚沉降,真空抽干,透析,冻干,得到固体产物G4PAMAM-Arg(Tos)。
(3)G5代的PAMAM-Arg(Tos)的合成。
称量G5代的PAMAM(200mg,0.0069mmol)溶解于4mL无水甲醇中,根据设计的摩尔投料比例(见表格1)将一定量的Boc-Arg(Tos)-OH溶解于无水甲醇(按照1g Boc-Arg(Tos)-OH/10mL甲醇溶解)中。将EDCI(摩尔当量是Boc-Arg(Tos)-OH的2倍)和HOBT(摩尔当量是Boc-Arg(Tos)-OH的2倍)加入到Boc-Arg(Tos)-OH溶液中室温下活化反应1h,然后将PAMAM的甲醇溶液缓慢加入到上述混合液中,室温反应4天。将反应的混合物透析,冻干。然后将冻干产物在三氟乙酸的条件下反应4h,真空浓缩,加无水乙醚沉降,真空抽干,透析,冻干,得到固体产物G5PAMAM-Arg(Tos)。
PAMAM接枝对甲苯磺酰基保护的精氨酸(Arg(Tos))的接枝率列于表1:
表1实施例1原料的摩尔比与产物分子量的对应关系
实施例2:HBPLL-Arg(Tos)的制备
(1)分子量2000的HBPLL组的HBPLL-Arg(Tos)的合成。将称量的HBPLL(200mg,0.1mmol)溶解于4mL无水甲醇中,根据设计的摩尔比例(见表格2)将一定量的Boc-Arg(Tos)-OH溶解于无水甲醇(按照1gBoc-Arg(Tos)-OH/10mL甲醇溶解)中。将EDCI(摩尔当量是Boc-Arg(Tos)-OH的2倍)和HOBT(摩尔当量是Boc-Arg(Tos)-OH的2倍)加入到Boc-Arg(Tos)-OH溶液中室温下活化反应1h,然后将PAMAM的甲醇溶液缓慢加入到上述混合液中,室温反应4天。将反应的混合物透析,冻干。然后将冻干产物在三氟乙酸的条件下反应4h,真空浓缩,加无水乙醚沉降,真空抽干,透析,冻干,得到固体产物HBPLL-Arg(Tos)。
(2)分子量100000的HBPLL组的HBPLL-Arg(Tos)的合成。将称量的HBPLL(200mg,0.002mmol)溶解于4mL无水甲醇中,根据设计的摩尔比例(见表格2)将一定量的Boc-Arg(Tos)-OH溶解于无水甲醇(按照1gBoc-Arg(Tos)-OH/10mL甲醇溶解)中。将EDCI(摩尔当量是Boc-Arg(Tos)-OH的2倍)和HOBT(摩尔当量是Boc-Arg(Tos)-OH的2倍)加入到Boc-Arg(Tos)-OH溶液中室温下活化反应1h,然后将HBPLL-Arg(Tos)的甲醇溶液缓慢加入到上述混合液中,室温反应4天。将反应的混合物透析,冻干。然后将冻干产物在三氟乙酸的条件下反应4h,真空浓缩,加无水乙醚沉降,真空抽干,透析,冻干,得到固体产物HBPLL-Arg(Tos)。
表2实施例2原料的摩尔比与产物分子量的对应关系
载体材料编号 | HBPLL的分子量 | HBPLL与Arg(Tos)的摩尔比 |
HBPLL<sub>2k</sub>-Arg(Tos)-1 | 2000 | 1:5 |
HBPLL<sub>2k</sub>Arg(Tos)-2 | 2000 | 1:10 |
HBPLL<sub>2k</sub>-Arg(Tos)-3 | 2000 | 1:15 |
HBPLL<sub>2k</sub>-Arg(Tos)-4 | 2000 | 1:20 |
HBPLL<sub>100k</sub>-Arg(Tos)-1 | 100000 | 1:20 |
HBPLL<sub>100k</sub>-Arg(Tos)-2 | 100000 | 1:50 |
HBPLL<sub>100k</sub>-Arg(Tos)-3 | 100000 | 1:100 |
HBPLL<sub>100k</sub>-Arg(Tos)-4 | 100000 | 1:200 |
HBPLL<sub>100k</sub>-Arg(Tos)-5 | 100000 | 1:400 |
实施例3:ε-PLL-Arg(Tos)的制备
(1)分子量2000的ε-PLL组的ε-PLL-Arg(Tos)的合成。将称量的ε-PLL(200mg,0.1mmol)溶解于4mL去离子水中,根据设计的摩尔比例(见表格3)将一定量的对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸(Boc-Arg(Tos)-OH)溶解于无水甲醇(按照1g Boc-Arg(Tos)-OH/10mL甲醇溶解)中。将EDCI(摩尔当量是Boc-Arg(Tos)-OH的2倍)和HOBT(摩尔当量是Boc-Arg(Tos)-OH的2倍)加入到Boc-Arg(Tos)-OH溶液中室温下活化反应1h,然后将ε-PLL的水溶液缓慢加入到上述混合液中,室温反应4天。将反应的混合物透析,冻干。然后将冻干产物在三氟乙酸的条件下反应4h,真空浓缩,加无水乙醚沉降,过滤,真空抽干,透析,冻干,得到固体产物ε-PLL-Arg(Tos)。
(2)分子量50000的ε-PLL组的ε-PLL-Arg(Tos)的合成。将称量的ε-PLL(200mg,0.02mmol)溶解于4mL去离子水中,根据设计的摩尔比例(见表格3)将一定量的Boc-Arg(Tos)-OH溶解于无水甲醇(按照1gBoc-Arg(Tos)-OH/10mL甲醇溶解)中。将EDC·HCl(摩尔当量是Boc-Arg(Tos)-OH的2倍)和HOBT(摩尔当量是Boc-Arg(Tos)-OH的2倍)加入到Boc-Arg(Tos)-OH溶液中室温下活化反应1h,然后ε-PLL的水溶液缓慢加入到上述混合液中,室温反应4天。将反应的混合物透析,冻干。然后将冻干产物在三氟乙酸的条件下反应4h,真空浓缩,加无水乙醚沉降,真空抽干,透析,冻干,得到固体产物ε-PLL-Arg(Tos)。
表3实施例3原料的摩尔比与产物分子量的对应关系
载体材料编号 | ε-PLL的分子量 | ε-PLL与Arg(Tos)的摩尔比 |
ε-PLL<sub>2k</sub>-Arg(Tos)-1 | 2000 | 1:5 |
ε-PLL<sub>2k</sub>Arg(Tos)-2 | 2000 | 1:10 |
ε-PLL<sub>2k</sub>-Arg(Tos)-3 | 2000 | 1:15 |
ε-PLL<sub>2k</sub>-Arg(Tos)-4 | 2000 | 1:20 |
ε-PLL<sub>50k</sub>-Arg(Tos)-1 | 50000 | 1:10 |
ε-PLL<sub>50k</sub>-Arg(Tos)-2 | 50000 | 1:25 |
ε-PLL<sub>50k</sub>-Arg(Tos)-3 | 50000 | 1:50 |
ε-PLL<sub>50k</sub>-Arg(Tos)-4 | 50000 | 1:100 |
ε-PLL<sub>50k</sub>-Arg(Tos)-5 | 50000 | 1:200 |
实施例4
(1)利用PAMAM-Arg(Tos),HBPLL-Arg(Tos)以及ε-PLL-Arg(Tos)载体介导pGL3(荧光素酶质粒)、pEGFPN1(绿色荧光蛋白质粒)对MCF-7细胞的体外转染
MCF-7细胞的培养
将MCF-7细胞培养在含10%体积分数的胎牛血清培养液中,细胞在设定温度为37℃、体积分数为5%的CO2的恒温培养箱中培养。
(2)细胞转染
在转染前24h,取对数生长期细胞,胰酶消化后用含体积分数10%的胎牛血清培养液稀释,按照1×104细胞/孔的密度铺板于96孔细胞培养板中,置于培养温度为37℃、含体积分数5%的CO2的恒温培养箱中培养直至细胞汇合度达80~90%。转染时,将载体/pDNA复合物复合20min后,按照0.2μg pDNA/孔的用量加入到96孔细胞板中,继续培养48小时。
(3)细胞转染效率的测定
a)荧光素酶活性检测
从培养箱中取出细胞培养板,移除细胞培养液,用PBS洗涤2次,每孔加入细胞裂解液50μL,放入-80℃中裂解20min,然后每孔取出20μL加入20μL荧光素酶底物,通过光度计定量测定细胞转染效率。表4,表5以及表6给出了荧光素酶质粒-载体的复合物的转染效率。
绿色荧光蛋白(GFP)的表达是通过荧光显微镜来观察绿色荧光蛋白信号。绿色荧光蛋白表达阳性的细胞发出明亮的绿色荧光,而阴性细胞则不会发出荧光。用流式细胞仪检测阳性细胞的百分比。表7,表8以及表9给出了绿色荧光蛋白质粒-载体的复合物的转染效率。
表4 PAMAM-Arg(Tos)介导荧光素酶质粒的体外转染效率
表5 HBPLL-Arg(Tos)介导荧光素酶质粒的体外转染效率
表6ε-PLL-Arg(Tos)介导荧光素酶质粒的体外转染效率
表7 PAMAM-Arg(Tos)介导绿色荧光蛋白质粒的体外转染效率
表8 HBPLL-Arg(Tos)介导绿色荧光蛋白质粒的体外转染效率
表9ε-PLL-Arg(Tos)介导绿色荧光蛋白质粒的体外转染效率
PAMAM-Arg(Tos)担载的pGL3质粒在MCF-7细胞中的最佳转染效率比亲代PAMAM高出10多倍,在最佳转染效率的比例范围,细胞存活率达到90%以上;PAMAM-Arg(Tos)的基因沉默效率高,对恒定表达荧光素酶的HuH-7Luc细胞的基因沉默效率最高可达为67%,该阳离子载体相比于PEI25k,具有较高基因沉默效率和较小的细胞毒性。HBPLL-Arg(Tos)担载的pGL3质粒在MCF-7细胞中的最佳转染效率大约是亲代HBPLL的10倍,在最佳转染效率的比例范围,细胞存活率达到85%以上,HBPLL-Arg(Tos)的基因沉默效率高,对恒定表达荧光素酶的HuH-7Luc细胞的基因沉默效率最高可达为64%,该阳离子载体相比于PEI25k,具有较高基因沉默效率和较小的细胞毒性。ε-PLL-Arg(Tos)担载的pGL3质粒在MCF-7细胞中的最佳转染效率是亲代ε-PLL的100倍,在最佳转染效率的比例范围,细胞存活率达到90%以上,ε-PLL-Arg(Tos)的基因沉默效率高,对恒定表达荧光素酶的HuH-7Luc细胞的基因沉默效率最高可达为59%,该阳离子载体相比于PEI25k,具有较高基因沉默效率和较小的细胞毒性。
实施例5
1)利用PAMAM-Arg(Tos),HBPLL-Arg(Tos)以及ε-PLL-Arg(Tos)载体介导沉默荧光素酶的Luc siRNA,在HuH-7细胞系中的转染
(1)HuH-7细胞的培养
将细胞置于含体积分数10%的胎牛血清培养液中,在培养温度37℃下体积分数为5%的CO2的恒温箱中连续培养。
(2)细胞转染
在转染前24h,取对数生长期细胞,胰酶消化后用含体积分数10%的胎牛血清培养液稀释,按照1×104细胞/孔的密度铺板于96孔细胞培养板中,置于培养温度为37℃、含体积分数5%的CO2的恒温培养箱中培养直至细胞汇合度达80~90%。转染时,将载体/siRNA复合物复合20min后,按照0.2μg siRNA/孔加入到96孔细胞板中,继续培养48小时。
(3)细胞转染效率的测定
从培养箱中取出细胞培养板,移除细胞培养液,用PBS洗涤2次,加入细胞裂解液放入-80℃中裂解20min,然后每孔加入一定量的荧光素酶底物,通过光度计定量测定细胞转染效率。表10给出了荧光素酶的沉默效率。
表10 PAMAM-Arg(Tos)介导沉默荧光素酶的Luc siRNA的体外转染效率
表11 HBPLL-Arg(Tos)介导沉默荧光素酶的Luc siRNA的体外转染效率
表12ε-PLL-Arg(Tos)介导沉默荧光素酶的Luc siRNA的体外转染效率
实施例6:PAMAM-Arg(Tos),HBPLL-Arg(Tos)以及ε-PLL-Arg(Tos)载体在体内pDNA转染中的应用
(1)细胞培养
将CT26细胞置于含有10%的胎牛血清培养液中,在含体积分数为5%(体积分数)CO2、温度为37℃的恒温箱中培养。
(2)肿瘤接种
购买周龄5-6周的体重20g左右的BALB/c小鼠,肿瘤接种前,取对数生长期的CT26细胞,用胰蛋白酶消化,然后用细胞培养液混合胰蛋白酶,1×103rpm离心5min,PBS洗涤三次,用PBS悬浮细胞。按每只小鼠3×106细胞接种于小鼠腋下,大约7后,小鼠平均瘤径长到7mm时进行体内转染。
(3)体内转染
将表达荧光素酶的质粒DNA作为转染基因,按照每只小鼠质粒pDNA用量20μg,将载体/pDNA复合物的生理盐水溶液200μL尾静脉注射小鼠体内。
(4)体内转染效率效率的测定
在进行48h的体内转染后,处死BALB/c鼠,取出各组肿瘤,用PBS洗涤2次,组织裂解液进行裂解,匀浆,然后加入荧光素底物,测定转染效率。表13~表15给出了体内实验荧光素酶质粒的复合物的转染效率。
表13 PAMAM-Arg(Tos)介导荧光素酶质粒体内转染效率
表14 HBPLL-Arg(Tos)介导荧光素酶质粒体内转染效率
表15ε-PLL-Arg(Tos)介导荧光素酶质粒体内转染效率
实施例7:PAMAM-Arg(Tos),HBPLL-Arg(Tos)以及ε-PLL-Arg(Tos)在体内siRNA转染中的应用
(1)CT26细胞的培养
将CT26细胞置于含有10%的胎牛血清培养液中,在含体积分数为5%的CO2、温度为37℃的恒温培养箱中培养。
(2)肿瘤接种
购买周龄5-6周的体重20g左右的BALB/c小鼠,肿瘤接种前,取对数生长期的CT26细胞,用胰蛋白酶消化,然后用细胞培养液混合胰蛋白酶,1×103rpm离心5min,PBS洗涤三次,用PBS悬浮细胞。按每只小鼠3×106细胞接种于小鼠腋下。7天后,瘤径平均长大至7mm时进行siRNA体内的转染。
(3)体内转染
基因选用能够表达能够沉默肿瘤血管内皮生长因子的shRNA的质粒DNA(通过抑制VEGF蛋白的表达来抑制肿瘤生长),按照每只小鼠的pDNA用量20μg,50μL,载体/pDNA复合物的生理盐水溶液体积200μL尾静脉注射小鼠体内,每隔一天给一次药,给药14天。
(4)小鼠肿瘤生长的测定
在小鼠第一次给药开始,每天测量小鼠肿瘤大小以及体重的变化。表16~表18给出了对肿瘤进行抑制14天后的瘤径大小。
表16 PAMAM-Arg(Tos)介导shVEGF的pDNA体内转染后的瘤径大小
表17 HBPLL-Arg(Tos)介导shVEGF的pDNA体内转染后的瘤径大小
表18ε-PLL-Arg(Tos)介导shVEGF的pDNA体内转染后的瘤径大小
由以上实施例可知,本发明提供了一种聚阳离子基因载体,包括接枝骨架和与所述接枝骨架接枝的对甲苯磺酰基保护的精氨酸;所述接枝骨架的原料选自树枝状聚酰胺-胺、分子量为2000~100000g/mol的超支化聚赖氨酸或分子量2000~50000g/mol的线性ε-聚赖氨酸;所述树枝状聚酰胺-胺选自型号PAMAM-G3、型号PAMAM-G4和型号PAMAM-G5中的一种或多种。本发明提供的聚阳离子基因载体在特定接枝骨架上接枝对甲苯磺酰基保护的精氨酸,能显著提高聚阳离子载体制备的复合物纳米颗粒的转染效率。另外,其能够有效降低纳米复合物颗粒的电荷密度,进而降低其细胞毒性。实验结果表明:PAMAM-Arg(Tos)担载的pGL3质粒在MCF-7细胞中的最佳转染效率比亲代PAMAM高出10多倍,在最佳转染效率的比例范围,细胞存活率达到90%以上;PAMAM-Arg(Tos)的基因沉默效率高,对恒定表达荧光素酶的HuH-7Luc细胞的基因沉默效率最高可达为67%;HBPLL-Arg(Tos)担载的pGL3质粒在MCF-7细胞中的最佳转染效率大约是亲代HBPLL的10倍,在最佳转染效率的比例范围,细胞存活率达到85%以上,HBPLL-Arg(Tos)的基因沉默效率高,对恒定表达荧光素酶的HuH-7Luc细胞的基因沉默效率最高可达为64%;ε-PLL-Arg(Tos)担载的pGL3质粒在MCF-7细胞中的最佳转染效率是亲代ε-PLL的100倍,在最佳转染效率的比例范围,细胞存活率达到90%以上,ε-PLL-Arg(Tos)的基因沉默效率高,对恒定表达荧光素酶的HuH-7Luc细胞的基因沉默效率最高可达为59%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种聚阳离子基因载体,由接枝骨架和与所述接枝骨架接枝的对甲苯磺酰基保护的精氨酸制得;
所述接枝骨架的原料选自树枝状聚酰胺-胺、分子量为2000~100000g/mol的超支化聚赖氨酸或分子量2000~50000g/mol的线性ε-聚赖氨酸;
所述树枝状聚酰胺-胺选自型号PAMAM-G3、型号PAMAM-G4和型号PAMAM-G5中的任意一种;
所述树枝状聚酰胺-胺和对甲苯磺酰基保护的精氨酸的物质的量比为1:5~80;
所述分子量为2000~100000g/mol的超支化聚赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的物质的量比为1:5~400;
所述分子量2000~50000g/mol的线性ε-聚赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的物质的量比为1:5~200。
2.一种权利要求1所述聚阳离子基因载体的制备方法,包括以下步骤:
a)将活化的对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液和接枝骨架原料溶液反应,透析,冻干,得到冻干产物;所述接枝骨架原料溶液中的接枝骨架原料选自树枝状聚酰胺-胺、分子量为2000~100000g/mol的超支化聚赖氨酸或分子量2000~50000g/mol的线性ε-聚赖氨酸;所述树枝状聚酰胺-胺选自型号PAMAM-G3、型号PAMAM-G4和型号PAMAM-G5中的任意一种;
b)将所述冻干产物和三氟乙酸反应,沉降反应产物,得到聚阳离子基因载体。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤a)中活化的对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液按照以下方法制得:
将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑加入到对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液中,进行活化,得到活化的对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸与所述接枝骨架原料的质量比为4.5~5.5:1;
所述对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液中对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的质量与溶剂的体积比为1g:(9~12)mL。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述活化的温度为15~35℃;活化的时间为0.5~2h。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤a)中反应的温度为15~35℃;所述步骤a)中反应的时间为80~120h。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤b)中反应的温度为15~35℃;所述步骤b)中反应的时间为3~5h。
8.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤a)中透析的时间为65~80h;冻干的温度为-60~-80℃。
9.一种纳米复合物颗粒,包括权利要求1或权利要求2~8任一项所述制备方法制备的聚阳离子基因载体和负载在聚阳离子基因载体上的基因;
所述基因为pDNA或siRNA。
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Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111393552B (zh) * | 2020-03-22 | 2022-07-15 | 福建医科大学 | 聚乙烯胺-精氨酸接枝衍生物作为基因载体的制备和应用 |
CN111394392B (zh) * | 2020-03-24 | 2022-03-29 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种脂肪细胞靶向阳离子基因载体、其制备方法及其应用 |
CN111693595B (zh) * | 2020-05-29 | 2022-10-25 | 江苏大学 | 一种基于电化学细胞传感器评价农药毒性的方法 |
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CN114044898B (zh) * | 2021-12-27 | 2022-07-12 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种赖氨酸接枝聚乙烯亚胺阳离子基因载体及其制备方法和应用 |
CN114984244B (zh) * | 2022-05-30 | 2023-09-29 | 浙江大学 | 一种含超支化聚赖氨酸水凝胶载体材料及其制备方法 |
CN115068680A (zh) * | 2022-05-30 | 2022-09-20 | 浙江大学 | 一种具有自适应性的促组织再生材料 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2185626A2 (en) * | 2007-08-23 | 2010-05-19 | Medivas, LLC | Cationic alpha-amino acid-containing biodegradable polymer gene transfer compositions |
CN102816795A (zh) * | 2012-08-28 | 2012-12-12 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种基因载体系统及其制备方法 |
CN104403107A (zh) * | 2014-10-30 | 2015-03-11 | 中山大学 | 一种改性阳离子聚氨基酸及其制备方法和应用 |
CN104592523A (zh) * | 2014-12-24 | 2015-05-06 | 天津大学 | 一种多肽修饰的聚阳离子基因载体及制备方法及应用 |
CN104650360A (zh) * | 2013-04-08 | 2015-05-27 | 韩冰 | 一种新型的树枝状聚合物基因载体的制备和用途 |
CN107459583A (zh) * | 2017-08-08 | 2017-12-12 | 中山大学 | 一种含树枝状聚酰胺‑胺基团的高度超支化阳离子多糖衍生物及其制备方法 |
-
2018
- 2018-06-05 CN CN201810569306.7A patent/CN108728496B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2185626A2 (en) * | 2007-08-23 | 2010-05-19 | Medivas, LLC | Cationic alpha-amino acid-containing biodegradable polymer gene transfer compositions |
CN102816795A (zh) * | 2012-08-28 | 2012-12-12 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种基因载体系统及其制备方法 |
CN104650360A (zh) * | 2013-04-08 | 2015-05-27 | 韩冰 | 一种新型的树枝状聚合物基因载体的制备和用途 |
CN104403107A (zh) * | 2014-10-30 | 2015-03-11 | 中山大学 | 一种改性阳离子聚氨基酸及其制备方法和应用 |
CN104592523A (zh) * | 2014-12-24 | 2015-05-06 | 天津大学 | 一种多肽修饰的聚阳离子基因载体及制备方法及应用 |
CN107459583A (zh) * | 2017-08-08 | 2017-12-12 | 中山大学 | 一种含树枝状聚酰胺‑胺基团的高度超支化阳离子多糖衍生物及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
生物还原响应型聚合物用于基因传递系统的研究进展;吴珊等;《中国医药工业杂志》;20141231;第45卷(第11期);第1078-1085页 * |
Also Published As
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CN108728496A (zh) | 2018-11-02 |
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