CN101302532A - 一种含靶向遮蔽体系的基因载体系统及制法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含靶向遮蔽体系的基因载体系统及制法和应用。该基因载体系统由带靶向配体的遮蔽体系、阳离子高分子材料和质粒DNA组成；阳离子高分子材料和质粒DNA复合形成复合物颗粒，带靶向配体的遮蔽体系通过静电作用遮蔽到复合物表面。该含靶向遮蔽体系的基因载体系统可以将负载的基因物质转移到细胞内，实现基因物质的表达，完成转染过程，并且可以提高基因转染的靶向性。优点是将靶向配体接枝到遮蔽体系上，这种靶向策略一方面不会影响阳离子聚合物对DNA的复合能力，另一方面又能保证靶向配体伸展到基因载体体系的外围，提高靶向配体与细胞表面受体的结合效率。其对HeLa细胞的转染效率最高为73％。细胞毒性小。

Description

一种含靶向遮蔽体系的基因载体系统及制法和应用
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一种含靶向遮蔽体系的基因载体系统及制法和应用
背景技术
随着人类基因组计划的完成和细胞生物学技术的进步，基因治疗将在人类攻克肿瘤这一顽症的过程中占据重要地位，并将逐步成为一种常见手段[1]。基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。
将基因物质导入细胞进行表达是实现基因治疗的必须步骤，成功的基因治疗依赖于有效的基因载体。利用病毒载体介导基因转移是基因治疗中应用最广泛的方法，其中包括逆转录病毒、腺病毒(AV)、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、痘苗病毒(VV)等载体。但是病毒类载体在临床应用中存在着很大的安全隐患，在基因治疗历史上首例患者死亡事件以及著名的法国“气泡婴儿”事件，在很大程度上都是由病毒类基因载体的不安全性造成的。非病毒类载体因其安全、有效、无免疫原性等优点，已成为病毒类载体最有希望的替代者。而且非病毒类载体相对而言便宜易得，在价格上有优势[2，3]。
阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)是非病毒类载体中受到关注最多的一个，它已经在体外和体内的转染实验中得到应用，但是PEI仍然存在着毒性高、转染效率低、没有靶向性的缺点。为了提高PEI基因载体的性能，研究人员尝试了不同的方法，但是在提高转染效率和靶向性传递方面仍然不尽如人意[4]′。近来，随着对PEI基因载体转染过程的逐渐认识，人们对PEI的改性，多集中在改进细胞对复合物的内吞效果这一方面。
改进细胞对PEI/DNA复合物的内吞效果，分为降低非特异性内吞和提高特异性内吞两个方面。由于正常体液环境中，细胞表面带负电荷。细胞内吞阳离子复合物颗粒的重要机理就是首先通过静电作用吸附复合物颗粒，然后复合物颗粒进入细胞。从这个角度考虑，不管是目标组织或者非目标组织的细胞，它们内吞复合物颗粒的机会是均等的。开发体内应用的基因载体，就要增加基因载体体系进入目标组织细胞的效率，降低其被非目标组织细胞吞噬的几率。为了提高基因载体体系进入目标组织细胞的效率，常采用的方法是在载体上引入对目标细胞具有特异性结合能力的靶向配体，像精甘天短肽(RGD短肽)、叶酸等[5-9]。连接有靶向配体的基因载体对目标细胞也具有一定的靶向识别能力。用化学键合的方法直接将靶向配体连接到基因载体上，可以赋予载体一定的靶向性。但是直接连接靶向配体的基因载体与DNA复合后，仍然具有很高的正电荷密度，它被非目标组织细胞内吞的效率仍然很高。靶向配体通过亲水的聚乙二醇(PEG)连接到基因载体上，可以遮蔽过多的正电荷，同时赋予基因载体一定的靶向性。但是PEG分子对正电荷的遮蔽也会降低目标组织细胞对复合物颗粒的吞噬，从而降低转染效率[5]，PEG分子的接枝量需要精心控制才会得到较好的效果，我们前期的工作也证实了上述结果。另外，利用双异端PEG连接靶向配体的方法，原料不容易获取，反应也较为繁琐。本发明开发一种更简便易得的遮蔽体系，利用静电复合的方法将携带靶向配体的遮蔽体系引入基因载体体系，调节遮蔽比例，控制过分遮蔽对转染效率的降低，同时利用靶向配体提高基因载体对目标组织的特异性识别和传递是行业亟需的解决的技术问题。
发明内容
本发明目的是针对现有靶向基因载体存在的不足，提供一种含靶向遮蔽体系的基因载体系统及制法和应用
本发明提供的一种含靶向遮蔽体系的基因载体系统，其特征在于，其由带靶向配体的遮蔽体系、阳离子高分子材料和质粒DNA组成；
所述的带靶向配体的遮蔽体系由含精甘天短肽的靶向配体和分子量为5,000-2,000,000的透明质酸分子连接组成；
所述的阳离子高分子材料为聚乙烯亚胺或聚乙烯亚胺-聚谷氨酸苄酯；
所述的质粒DNA采用在真核细胞表达的质粒DNA；
所述的带靶向配体的遮蔽体系与阳离子高分子材料的质量比例为0.5∶1～50∶1，阳离子高分子材料与质粒DNA的质量比例为0.5∶1～50∶1。
所述的含靶向遮蔽体系的基因载体系统，其组成方式为阳离子高分子材料与质粒DNA通过静电作用复合在一起形成表面带正电的复合物颗粒，然后带负电的带靶向配体的遮蔽体系通过静电作用遮蔽到复合物颗粒表面。
本发明提供的含靶向遮蔽体系的基因载体系统的制备方法，通过以下方案实现：
1)带靶向配体的遮蔽体系的制备：将透明质酸溶于水中，加入1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和含胺基的精甘天短肽，透明质酸和含胺基的精甘天短肽的质量比在1∶10～10∶1之间，用盐酸将上述反应溶液的pH调节到4.75，室温反应4小时，反应结束后将反应产物用截留量为3,500的透析带透析48小时，冻干，得到带靶向配体的遮蔽体系；
2)含靶向遮蔽体系的基因载体系统的制备：
将质粒DNA溶于水中，获得溶液A；将阳离子聚合物基因载体溶于水中，得到溶液B；将带靶向配体的遮蔽体系溶于水中，得到溶液C；A和B复合得到基因载体和质粒DNA的复合物颗粒溶液，在室温下放置10分钟后，加入溶液C，得到一种含靶向遮蔽体系的基因载体系统。
本发明提供的含靶向遮蔽体系的基因载体系统在体外转染中的应用。其通过以下方案实现：
(1)HeLa细胞的培养
取人宫颈癌的HeLa细胞，在含有10％(质量/体积百分数)的小牛血清的培养液中，在含5％(体积百分数)CO2、温度为37℃的孵箱中培养24小时；
(2)体外转染
转染前24小时内，取对数生长期HeLa细胞，胰酶消化后用DMEM稀释，按每孔4×105细胞的密度接种于6孔培养板，置于含5％(体积百分数)的CO2、温度为37℃的孵箱中继续培养至80～90％融合，转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次后，基因组转染的复合物颗粒以及无血清或者在含有10％(质量/体积百分数)的小牛血清的DMEM培养基至终体积2ml，继续培养48小时；
(3)体外转染效率的测定
取出培养板，用PBS清洗细胞两次，然后加入胰酶消化，离心除去上清，然后加入PBS重悬，用流式细胞仪测定细胞转染效率；或者取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，然后加入荧光素底物，用光度计测定转染效率。
有益效果：本发明利用含靶向配体的遮蔽体系提高基因载体的性能，其对HeLa细胞的转染效率最高为73％。转染的特点是：转染效率高，细胞毒性小。
传统的基因载体靶向策略是将靶向配体直接连接到核心的阳离子聚合物上，或者通过聚乙二醇(PEG)连接到阳离子聚合物上。这种策略导致靶向配体在与DNA复合过程中被掩埋，或者会降低阳离子聚合物的电荷密度，减弱阳离子聚合物对DNA的复合能力，导致转染效率降低。
本发明的优点是将靶向配体接枝到遮蔽体系上，这种靶向策略一方面不会影响阳离子聚合物对DNA的复合能力，另一方面又能保证靶向配体伸展到基因载体体系的外围，提高靶向配体与细胞表面受体的结合效率。
附图说明
图1是透明质酸/聚乙烯亚胺-聚谷氨酸苄酯/质粒DNA(HA/PEI-PBLG/DNA)的凝胶电泳实验图。图中，Lane 1为：pDNA；Lane 2为：PEI-PBLG/DNA复合物颗粒，质量比10/1；Lane 3-7为：HA/PEI-PBLG/DNA复合物颗粒；其质量比分别为5/10/1，10/10/1，20/10/1，30/10/1，40/10/1。
图2是编号为HR2-PP-G-2.5的基因载体系统(编号含义见下文表2)介导绿色荧光蛋白质粒对HeLa细胞转染后的荧光照片；其中，Bar＝50m。
图3编号为利用HR2-PP-G-2.5的基因载体系统(编号含义见下文表2)介导绿色荧光蛋白质粒对HeLa细胞转染24小时和48小时后的细胞存活率。
具体实施方式
实施例1：带靶向配体的遮蔽体系的制备
按照表1所述的投料比例将分子量为1.3M的透明质酸10mg、1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和RGD的水溶液混合，用盐酸溶液将反应液的pH调节到4.75。反应在室温下进行5小时。反应结束后，产物对3升的蒸馏水透析3天后冻干得到白色絮状产物。用核磁计算产物中RGD的含量，结果见表1。
表1带RGD短肽的透明质酸遮蔽体系的制备表
  产物编号  HA∶EDC·HCl∶RGD投料比   RGD含量(每多少HA重
  复单元含有一个RGD)
  HA-RDG2   10∶5∶10   1.9
  HA-RGD5   10∶2∶10   4.7
  HA-RGD10   10∶1∶10   9.6
实施例2：含靶向遮蔽体系的基因载体系统的制备
取HA-RGD，加二次水溶解，配置浓度为0.02～2mg/mL的水溶液，用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤除菌、待用。取阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)和聚乙烯亚胺-聚谷氨酸苄酯(PEI-PBLG)，加二次水溶解，配置浓度为0.02～2mg/mL的水溶液，用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤除菌、待用。取质粒，用二次水溶解配置成浓度为0.02mg/mL的水溶液。
将不同浓度的阳离子聚合物水溶液和质粒水溶液等体积混合，保证阳离子聚合物和质粒的质量比为1∶1。混合后的复合物颗粒水溶液在室温下孵育10分钟后，加入不同浓度的HA-RGD，得到HA-RGD/阳离子聚合物/DNA三元复合物，复合物颗粒水溶液在室温下孵育10分钟后，再进行下一步的转染实验。按照上述方法制备的复合物颗粒的组成及性能如表2所示。
表2HA-RGD/PEI/DNA复合物的组成和性能
  序号   复合物编号   HA-RGD种类   阳离子聚合物种类   质粒种类   HA-RGD∶阳离子聚合物∶DNA的质量比   复合物颗粒大小(nm)   复合物颗粒表面电位(mV)
  1   HR2-PP-G-2.5   HA-RGD2   PEI-PBLG   pEGFP-N1   2.5∶10∶1   123   +33
  2   HR5-PP-G-2.5   HA-RGD5   PEI-PBLG   pEGFP-N1   2.5∶10∶1   119   +31
  3   HR10-PP-G-25   HA-RGD10   PEI-PBLG   pEGFP-N1   2.5∶10∶1   141   +29
  4   HR2-PP-L-2.5   HA-RGD2   PEI-PBLG   pGL3-CMV   2.5∶10∶1   131   +37
  5   HR2-PP-G-1   HA-RGD2   PEI-PBLG   pEGFP-N1   1∶10∶1   109   +39
  6   HR2-PP-G-5   HA-RGD2   PEI-PBLG   pEGFP-N1   5∶10∶1   153   +29
  7   HR2-P-G-1   HA-RGD2   PEI   pEGFP-N1   1∶1∶1   128   +23
  8   HR2-P-L-1   HA-RGD2   PEI   pGL3-CMV   1∶1∶1   130   +21
  9   H-PP-G-2.5   HA不含RGD   PEI-PBLG   pEGFP-N1   0∶10∶1   119   +40
  10   H-PP-L-2.5   HA不含RGD   PEI-PBLG   pGL3-CMV   0∶10∶1   123   +42
实施例3：利用凝胶电泳鉴定复合物颗粒的稳定性
取4μL 0.1μg/μL的DNA水溶液与4μL 1μg/μL的聚乙烯亚胺-聚谷氨酸苄酯水溶液复合，在室温下放置10分钟，然后加入4μL不同浓度的HA水溶液，检测复合物颗粒在遮蔽体系加入后的稳定性。图1的电泳结果表明，加入DNA 40倍的透明质酸遮蔽体系也不会破坏阳离子聚合物与DNA形成的复合物。
实施例4：利用带靶向遮蔽的基因载体系统体介导绿色荧光蛋白质粒的对HeLa细胞的体外转染
1、HeLa细胞的培养
取人宫颈癌细胞(HeLa细胞)，在含有10％小牛血清的培养液中连续培养(5％CO2、37℃孵箱)。
2、体外转染
转染前24小时内，取对数生长期HeLa细胞，胰酶消化后用DMEM稀释，按每孔4×105细胞的密度接种于6孔培养板，置于5％CO2、37℃孵箱中继续培养至80～90％融合。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次后，加入表2中所列的部分含有绿色荧光蛋白质粒DNA的复合物颗粒以及含有10％FBS的DMEM培养基至终体积2ml，继续培养48小时。
3、体外转染效率的测定
取出培养板，用PBS清洗细胞两次，然后加入胰酶消化，离心除去上清，然后加入PBS重悬，用流式细胞仪测定细胞转染效率。
表3给出了表2所列的部分复合物颗粒对HeLa细胞的转染效率，图2给出了HR2-PP-G-2.5介导绿色荧光蛋白质粒对HeLa细胞转染后的荧光照片。
由表3的数据可见，带靶向遮蔽体系的复合物HR2-PP-G-2.5比不带靶向遮蔽体系的复合物H-PP-G-2.5的转染效率高出10％以上。这是由于RGD和HeLa细胞上的RGD受体的特异性作用造成的。
表3带靶向遮蔽的基因载体系统介导绿色荧光蛋白质粒的体外转染效率表
  序号   复合物编号   转染效率，％
  1   HR2-PP-G-2.5   73
  2   HR5-PP-G-2.5   60
  3   HR10-PP-G-2.5   55
  4   HR2-PP-G-1   52
  5   HR2-PP-G-5   45
  6   HR2-P-G-1   53
  7   H-PP-G-2.5   61
实施例5：利用带靶向遮蔽的基因载体系统介导荧光素酶质粒的对HeLa细胞的体外转染实验
1.细胞培养
同实施例3的方法。
2.体外转染
转染前24小时内，将HeLa细胞按1×104/孔种于96孔培养板中，置于5％CO2、37℃孵箱中继续培养至80～90％融合。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次后，加入表2中所列的部分含有荧光素酶DNA的复合物颗粒以及含有10％FBS的DMEM培养基至终体200μL，继续培养48小时。
3、体外转染效率的测定
取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，然后加入荧光素底物，用光度计测定转染效率。
表4给出了表2所列的部分包含荧光素酶质粒的复合物的转染效率。
表4带靶向遮蔽的基因载体系统体介导荧光素酶质粒的体外转染效率表
  序号   复合物编号   转染效率，RLU/mg Protein
  1   HR2-PP-L-2.5   7.3×108
  2   H-PP-L-2.5   7.5×107
由表4的数据可见，带靶向遮蔽体系的复合物HR2-PP-L-2.5比不带靶向遮蔽体系的复合物H-PP-L-2.5的转染效率高出近10倍。这是由于RGD和HeLa细胞上的RGD受体的特异性作用造成的。
实施例6：利用带靶向遮蔽的基因载体系统介导绿色荧光蛋白质粒对CHO细胞的体外转染实验
CHO细胞的培养同实施例3中HeLa细胞的培养方法。按照实施例3中的转染方法和测试方法，采用表2中的HR2-PP-G-2.5和H-PP-G-2.5复合物颗粒，对CHO细胞进行体外转染，其转染效率如表5所示。
表5带靶向遮蔽的基因载体系统体介导绿色荧光蛋白质粒对CHO细胞的体外转染实验表
  序号   复合物编号   转染效率，％
  1   HR2-PP-G-2.5   37
  2   H-PP-G-2.5   26
由表5可见，由于CHO细胞膜上含有RGD受体，因此采用带靶向遮蔽体系的复合物HR2-PP-G-2.5比不带靶向遮蔽体系的复合物H-PP-G-2.5的转染效率要高。
实施例7：利用带靶向遮蔽的基因载体系统介导荧光素酶质粒对CHO细胞的体外转染实验
CHO细胞的培养同实施例3中HeLa细胞的培养方法。按照实施例5中的转染方法和测试方法，采用表2中的HR2-PP-G-2.5和H-PP-G-2.5复合物颗粒，对CHO细胞进行体外转染，其转染效率如表6所示。表6带靶向遮蔽的基因载体系统体介导荧光素酶质粒对CHO细胞的体外转染实验表
  序号   复合物编号   转染效率，RLU/mg Protein
  1   HR2-PP-L-2.5   9.2×107
  2   H-PP-L-2.5   8.6×106
由表6可见，由于CHO细胞，其细胞膜上含有RGD受体，因此采用带靶向遮蔽体系的复合物HR2-PP-L-2.5比不带靶向遮蔽体系的复合物H-PP-L-2.5的转染效率要高。
实施例8：利用带靶向遮蔽的基因载体系统介导绿色荧光蛋白质粒对293T细胞的体外转染实验
293T细胞的培养同实施例3中HeLa细胞的培养方法。按照实施例3中的转染方法和测试方法，采用表2中的HR2-PP-G-2.5和H-PP-G-2.5复合物颗粒，对293T细胞进行体外转染，其转染效率如表7所示
表7带靶向遮蔽的基因载体系统体介导绿色荧光蛋白质粒对293T细胞的体外转染实验表
  序号   复合物编号   转染效率，％
  1   HR2-PP-L-2.5   56
  2   H-PP-L-2.5   51
由表7可见，对于细胞膜上不含RGD受体的293T细胞，采用带靶向遮蔽体系的复合物HR2-PP-L-2.5比不带靶向遮蔽体系的复合物H-PP-L-2.5的转染效率差别不大。
实施例9：利用带靶向遮蔽体系的基因载体系统转染后的细胞存活率
按照实施例5的方法进行转染实验，转染后细胞的存活率利用MTT方法评价。转染24小时和48小时后，加入20μL MTT溶液[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，5mg/ml in PBS]。混合物在37℃继续作用4h，加入200μL DMSO溶解MTT甲臢(formazan)结晶10min。然后用ELISAmicroplate reader(Bio-Rad)酶标仪测试每孔的吸收，测试波长选用492nm。细胞存活率按下公式计算：
细胞存活率(％)＝(Asample/Acontrol)×100
Asample是转染后的细胞样品孔的吸收，Acontrol是不与复合物溶液作用的细胞样品孔的吸收，每组实验重复三次。图3是利用HR2-PP-L-2.5对HeLa细胞转染24小时和48小时后的细胞存活率。
由图3可见，利用HR2-PP-L-2.5对HeLa细胞转染24小时和48小时后的细胞存活率大于70％，可见本发明的转染系统具有较低的细胞毒性。
本发明涉及的参考文献：
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Claims (3)

1.一种含靶向遮蔽体系的基因载体系统，其特征在于，其由带靶向配体的遮蔽体系、阳离子高分子材料和质粒DNA组成；
所述的带靶向配体的遮蔽体系由含精甘天短肽的靶向配体和分子量为5,000-2,000,000的透明质酸分子连接组成；
所述的阳离子高分子材料为聚乙烯亚胺或聚乙烯亚胺-聚谷氨酸苄酯；
所述的质粒DNA采用在真核细胞表达的质粒DNA；
所述的带靶向配体的遮蔽体系与阳离子高分子材料的质量比例为0.5∶1～50∶1，阳离子高分子材料与质粒DNA的质量比例为0.5∶1～50∶1。
2.如权利要求1所述的一种带靶向遮蔽体系的基因载体系统的制法，其特征在于，步骤和条件如下：
1)带靶向配体的遮蔽体系的制备：将透明质酸溶于水中，加入1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和含胺基的精甘天短肽，透明质酸和含胺基的精甘天短肽的质量比在1∶10～10∶1之间，用盐酸将上述反应溶液的pH调节到4.75，室温反应4小时，反应结束后将反应产物用截留量为3,500的透析带透析48小时，冻干，得到带靶向配体的遮蔽体系；
2)含靶向遮蔽体系的基因载体系统的制备：
将质粒DNA溶于水中，获得溶液A；将阳离子聚合物基因载体溶于水中，得到溶液B；将带靶向配体的遮蔽体系溶于水中，得到溶液C；A和B复合得到基因载体和质粒DNA的复合物颗粒溶液，在室温下放置10分钟后，加入溶液C，得到一种含靶向遮蔽体系的基因载体系统。
3.如权利要求1所述的含靶向遮蔽体系的基因载体系统的应用，其特征在于，其用于体外基因转染。
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