CN105906800A - 一种基因传递系统及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基因传递系统及其制备方法。本发明属于生物技术领域，涉及一种pH敏感可断裂的遮蔽材料、含有pH敏感可断裂的遮蔽材料的基因传递系统及其制备方法。本发明所述pH敏感可断裂的遮蔽材料为单醛基化聚乙二醇或双醛基化聚乙二醇，在正常组织中可与阳离子聚合物基因载体通过希夫碱反应连接在一起，实现对基因传递体系的遮蔽。本发明所述基因传递系统包括pH敏感可断裂的遮蔽材料、阳离子聚合物材料以及基因物质。在正常组织中，所述基因传递系统由于含有遮蔽层减少了正常细胞对体系的摄取可在体内进行长循环；而当到达微酸的肿瘤组织时，遮蔽材料与阳离子聚合物之间的化学键发生断裂，遮蔽层脱落，肿瘤细胞对正电性基因载体具有较高的内吞效率，实现基因物质的高效传递。

Description

一种基因传递系统及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种基因传递系统及其制备方法，尤其是一种pH敏感可断裂的遮蔽材料、含有所述pH敏感可断裂的遮蔽材料的基因传递系统及其制备方法。
背景技术
基因治疗(Gene therapy)是一种生物治疗手段，主要是通过将正常基因或野生型基因转入人体细胞中来修复或替换致病基因而实现对疾病的治疗。基因治疗离不开基因载体，因为单独的基因若直接注入体内会被体液中的物质和酶类快速的降解和破坏，且负电性的大分子DNA自身很难靠近并穿过负电性的细胞膜，因此，必须借助基因载体来担载目的基因，将基因运输到靶细胞中。
基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体。常用的病毒载体主要有腺病毒(AV)、逆转录病毒(RV)和慢病毒(LV)等，病毒载体具有较高的转染效率，但其制备比较困难、容量小、特异性差，且存在较高的安全隐患、免疫反应较强等缺陷。非病毒载体具有容量大、毒性低、免疫反应低等优点。常用的非病毒载体主要有磷酸钙粒子、脂质体和阳离子聚合物，其中阳离子聚合物因其种类多样、结构设计自由、便于功能化等优点已经成为基因载体设计合成的热点领域。
在众多阳离子载体中，研究最多、最具代表性的就是聚乙烯亚胺(PEI)。PEI具有大量的氨基，呈正电性，因此能够作为载体携带负电性的基因物质，且转染效果非常出色。PEI作为载体不仅可以保护基因在体内传递过程中免遭降解和酶解，而且其正电荷易与负电性的细胞膜发生吸附，进而实现高效的细胞内吞，进入细胞后，其优良的-质子海绵功能有利于体系从溶酶体内涵体中逃逸出来；另一方面，PEI大量的氨基有利于对其进行各种改性和修饰，以达到不同的使用目的。目前，关于PEI作为非病毒载体的相关研究非常多且效果良好，PEI是极具潜力和倍有价值的载体材料，类似的聚合物还有聚酰胺-胺(PAMAM)、聚赖氨酸(PLL)和聚(β-氨酯)(PAE)等等。
尽管如此，阳离子载体在实际应用过程中仍受到很多因素的阻碍。首先体系在循环过程中，血液中含有大量负电性的蛋白类物质，易与带正电的载体体系吸附，使之凝聚形成大颗粒或沉淀，易被很快清除；其次，由于正常细胞表面带负电，带正电的载体体系很容易与正常细胞接触而被其内吞掉。这些非特异性吸附最终将影响体系对靶细胞的有效作用。因此，要开发出适于体内应用的基因载体，就必须降低其被非目标组织吸附的几率，以提高基因载体体系进入目标组织的效率。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于针对现有基因传递体系存在的不足，提供一种pH敏感可断裂遮蔽材料、基因传递系统及其制备方法，本发明提供的pH敏感可断裂遮蔽材料可以有效降低阳离子载体体系被非目标组织所吸附，能够延长体系的循环时间，有利于载体体系蓄积到目标组织。本发明所述基因传递系统对肿瘤细胞转染效率高。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。
一种pH敏感可断裂的遮蔽材料，其为单醛基化聚乙二醇或双醛基化聚乙二醇。
在一些实施方案中，所述单醛基化聚乙二醇的制备方法为单羟基聚乙二醇与对羧基苯甲醛、邻羧基苯甲醛或间羧基苯甲醛反应。
在一些实施方案中，所述双醛基化聚乙二醇的制备方法为双羟基聚乙二醇与对羧基苯甲醛、邻羧基苯甲醛或间羧基苯甲醛反应。
优选的，所述单羟基聚乙二醇或双羟基聚乙二醇分子量为600～10,000。
优选的，所述单羟基聚乙二醇与对羧基苯甲醛、邻羧基苯甲醛或间羧基苯甲醛的摩尔比为1:1；
优选的，所述双羟基聚乙二醇与对羧基苯甲醛、邻羧基苯甲醛或间羧基苯甲醛的摩尔比为1:2。
在一些实施方案中，所述反应具体方法为反应物和EDC、DMAP溶于二氯甲烷，25℃反应48小时。所述反应物为单羟基聚乙二醇与对羧基苯甲醛、邻羧基苯甲醛或间羧基苯甲醛，或者双羟基聚乙二醇与对羧基苯甲醛、邻羧基苯甲醛或间羧基苯甲醛。
本发明还提供了一种基因传递系统，包括所述的pH敏感可断裂的遮蔽材料、阳离子聚合物材料和基因物质。
其中，所述阳离子聚合物材料为聚乙烯亚胺、树枝状聚酰胺胺或者聚赖氨酸；所述基因物质为质粒DNA或siRNA。
优选的，所述基因传递系统中所述的pH敏感可断裂的遮蔽材料与所述阳离子聚合物材料的质量比为1:1～100:1。
优选的，所述阳离子聚合物材料与质粒DNA或siRNA的质量比为0.5:1～50:1。
本发明还提供了所述基因传递系统的制备方法，包括以下步骤：
(A)将基因物质水溶液与阳离子聚合物材料水溶液混合均匀后孵育，得到二元复合物；
(B)将所述二元复合物与所述的pH敏感可断裂的遮蔽材料水溶液混合均匀后孵育。
优选的，所述步骤(A)和(B)中，所述孵育时间为10～30分钟。
与现有技术相比，本发明提供的pH敏感可断裂的遮蔽材料在pH 7.4的条件下，可与阳离子聚合物基因载体通过快速高效的希夫碱反应连接在一起，实现对基因传递体系的遮蔽。本发明所述基因传递系统包括所述pH敏感可断裂的遮蔽材料、阳离子聚合物材料以及基因物质(DNA或siRNA)。所述pH敏感可断裂的遮蔽材料在pH为7.4的条件下，可与阳离子聚合物基因载体通过快速高效的希夫碱反应连接在一起，并遮蔽在所述基因传递体系的最外层。在正常组织中(pH值为7.4左右)，所述基因传递系统由于含有有效遮蔽层，减少了正常细胞对体系的摄取，因此可在体内进行长循环；而当体系到达微酸的肿瘤组织时，在微酸性pH环境的作用下，遮蔽材料与阳离子聚合物之间的化学键发生快速的断裂，遮蔽层发生脱落，暴露出正电性的阳离子聚合物基因载体，由于正电性的基因载体和负电性的细胞膜之间具有静电吸引作用，使得肿瘤细胞对正电性基因载体具有较高的内吞效率，最终实现基因物质的高效传递。实验结果表明，本发明提供的基因传递系统对肿瘤细胞转染效率高，对HeLa细胞的体外转染效率可达5.6×106～9.7×108RLU/mg Protein，对CT26细胞的体内转染效率可达4.4×104～1.2×105RLU/mg Protein。表明本发明提供的基因传递系统对肿瘤具有良好的抑制作用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。
一种pH敏感可断裂的遮蔽材料，其为单醛基化聚乙二醇或双醛基化聚乙二醇。
本发明提供的pH敏感可断裂的遮蔽材料在pH 7.4的条件下，可与阳离子聚合物基因载体通过快速高效的希夫碱反应连接在一起，实现对基因传递体系的遮蔽。
按照本发明，在一些实施方案中，所述pH敏感可断裂的遮蔽材料为单醛基化聚乙二醇，其制备方法为单羟基聚乙二醇与对羧基苯甲醛、邻羧基苯甲醛或间羧基苯甲醛反应。
所述单羟基聚乙二醇分子量为600～10,000。所述对羧基苯甲醛(或邻羧基苯甲醛、间羧基苯甲醛)分子量为150.13。
按照本发明，所述单羟基聚乙二醇与对羧基苯甲醛、邻羧基苯甲醛或间羧基苯甲醛的摩尔比为1:1。
优选的，所述单醛基化聚乙二醇按照以下方法制备：
将单羟基聚乙二醇(PEG-OH)，对羧基苯甲醛(或邻羧基苯甲醛、间羧基苯甲醛，CHO)，EDC和DMAP溶于二氯甲烷，搅拌条件下，25℃反应48小时。
进一步的，所述反应还包括依次用饱和氯化钠和5％的氯化钠溶液洗涤的步骤。
进一步经无水硫酸镁干燥后，用乙醚沉降，过滤后抽干得到pH敏感可断裂的遮蔽材料单醛基化聚乙二醇(PEG-CHO)。
按照本发明，在一些实施方案中，所述pH敏感可断裂的遮蔽材料为双醛基化聚乙二醇，其制备方法为双羟基聚乙二醇与对羧基苯甲醛、邻羧基苯甲醛或间羧基苯甲醛反应。
所述双羟基聚乙二醇分子量为600～10,000。所述对羧基苯甲醛(或邻羧基苯甲醛、间羧基苯甲醛)分子量为150.13。
按照本发明，所述双羟基聚乙二醇与对羧基苯甲醛、邻羧基苯甲醛或间羧基苯甲醛的摩尔比为1:2。
本发明对所述pH敏感可断裂遮蔽材料的来源没有特殊限制。
优选的，所述双醛基化聚乙二醇按照以下方法制备：
将双羟基聚乙二醇(HO-PEG-OH)，对羧基苯甲醛(或邻羧基苯甲醛、间羧基苯甲醛，CHO)，EDC和DMAP溶于二氯甲烷，搅拌条件下，25℃反应48小时。
进一步的，所述反应还包括依次用饱和氯化钠和5％的氯化钠溶液洗涤的步骤。
进一步经无水硫酸镁干燥后，用乙醚沉降，过滤后抽干得到pH敏感可断裂的遮蔽材料双醛基化聚乙二醇(OHC-PEG-CHO)。
本领域技术人员可以理解，本发明对所述pH敏感可断裂的遮蔽材料的制备原料的来源没有特殊限制，只要能够制备得到所述pH敏感可断裂的遮蔽材料即可。
本发明还提供了一种基因传递系统，包括：本发明所述的pH敏感可断裂的遮蔽材料、阳离子聚合物材料和基因物质。
本发明所述基因传递系统中遮蔽材料在pH 7.4的条件下，可与阳离子聚合物基因载体通过快速高效的希夫碱反应连接在一起，实现对基因传递体系的遮蔽。在正常组织中(pH值为7.4左右)，所述基因传递体系由于含有有效遮蔽层，减少了正常细胞对体系的摄取，因此可在体内进行长循环；而当体系到达微酸的肿瘤组织时(pH值小于6.8)，在微酸性pH环境的作用下，pH敏感可断裂遮蔽材料与阳离子聚合物之间的化学键发生快速的断裂，遮蔽层发生脱落，暴露出正电性的阳离子聚合物基因载体，由于正电性的基因载体和负电性的细胞膜之间具有较强的静电吸引作用，使得肿瘤细胞对正电性基因载体体系具有较高的内吞效率，最终实现基因物质的高效传递。
按照本发明，所述基因传递系统中所述的阳离子聚合物材料的作用为担载基因物质，优选为聚乙烯亚胺、树枝状聚酰胺胺或者聚赖氨酸。本发明对所述阳离子聚合物材料的来源没有特殊限制，可以由市场购买。
按照本发明，所述基因传递系统中所述的基因物质为质粒DNA或siRNA。
所述质粒DNA优选为荧光素酶质粒DNA pGL-3。
所述siRNA优选为有治疗作用的VEGF siRNA。
按照本发明，所述基因传递系统中，pH敏感可断裂的遮蔽材料与阳离子聚合物材料的质量比优选为1:1～100:1，更优选为10:1～80:1。
按照本发明，所述基因传递系统中，所述阳离子聚合物材料与基因物质的质量比优选为0.5:1～50:1，更优选为2:1～40:1。
本发明还提供了一种基因传递系统的制备方法，包括以下步骤：
(A)将基因物质水溶液与阳离子聚合物材料水溶液混合均匀后孵育，得到二元复合物；
(B)将所述二元复合物与本发明所述的pH敏感可断裂的遮蔽材料水溶液混合均匀后孵育。
按照本发明，首先将基因物质水溶液与阳离子聚合物材料水溶液混合均匀后孵育。
所述阳离子聚合物材料的作用为担载基因物质，优选为聚乙烯亚胺、树枝状聚酰胺胺或聚赖氨酸。所述质粒DNA优选为荧光素酶质粒DNA pGL-3；所述siRNA优选为有治疗作用的VEGF siRNA。
本发明对所述阳离子聚合物材料的来源没有特殊限制，可以由市场购买。所述基因物质为质粒DNA或siRNA。
所述阳离子聚合物材料与基因物质的质量比优选为0.5:1～50:1，更优选为2:1～40:1。
所述混合均匀后孵育的溶剂优选为水，为了孵育的效果更好，优选将基因物质与阳离子聚合物材料分别溶于水，形成水溶液后再将两者的水溶液进行混合孵育。所述基因物质水溶液的浓度优选为0.01～4mg/mL；所述阳离子聚合物材料水溶液的浓度优选为0.01～4mg/mL。所述混合孵育的时间优选为10～30分钟。
基因物质与阳离子聚合物材料混合孵育后，得到二元复合物。然后，将所述二元复合物与所述pH敏感可断裂的遮蔽材料混合。
pH敏感可断裂的遮蔽材料与阳离子聚合物材料的质量比优选为1:1～100:1，更优选为10:1～80:1。
所述混合时所用的溶剂优选为水。为了保证混合均匀，优选将pH敏感可断裂的遮蔽材料溶于水，形成水溶液后再与二元复合物进行混合。所述pH敏感可断裂遮蔽材料水溶液的浓度优选为0.01～4mg/mL，其pH值优选为7.4。所述混合孵育的时间优选为10～30分钟。
与现有技术相比，本发明提供的pH敏感可断裂的遮蔽材料在pH 7.4的条件下，可与阳离子聚合物基因载体通过快速高效的希夫碱反应连接在一起，实现对基因传递体系的遮蔽。本发明所述基因传递系统包括所述pH敏感可断裂的遮蔽材料、阳离子聚合物材料以及基因物质(DNA或siRNA)。所述pH敏感可断裂的遮蔽材料在pH为7.4的条件下，可与阳离子聚合物基因载体通过快速高效的希夫碱反应连接在一起，并遮蔽在所述基因传递体系的最外层。在正常组织中(pH值为7.4左右)，所述基因传递系统由于含有有效遮蔽层，减少了正常细胞对体系的摄取，因此可在体内进行长循环；而当体系到达微酸的肿瘤组织时，在微酸性pH环境的作用下，遮蔽材料与阳离子聚合物之间的化学键发生快速的断裂，遮蔽层发生脱落，暴露出正电性的阳离子聚合物基因载体，由于正电性的基因载体和负电性的细胞膜之间具有静电吸引作用，使得肿瘤细胞对正电性基因载体具有较高的内吞效率，最终实现基因物质的高效传递。实验结果表明，本发明提供的基因传递系统对肿瘤细胞转染效率高，对HeLa细胞的体外转染效率可达5.6×106～9.7×108RLU/mg Protein，对CT26细胞的体内转染效率可达4.4×104～1.2×105RLU/mg Protein。表明本发明提供的基因传递系统对肿瘤具有良好的抑制作用。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的基因传递系统及其制备方法进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1～10：pH敏感可断裂遮蔽材料单醛基化聚乙二醇的制备
按照表1所示的原料以及材料摩尔比，按照以下方法制备单醛基化聚乙二醇：
将PEG-OH、CHO、EDC和DMAP溶于二氯甲烷，搅拌条件下，25℃反应48小时。反应液分别用饱和氯化钠以及5％的氯化钠溶液洗涤，进一步经无水硫酸镁干燥后，用乙醚沉降，过滤后抽干得到pH敏感可断裂遮蔽材料单醛基化聚乙二醇PEG-CHO。
使用不同分子量的PEG-OH，如分子量为600，800，1000，1500，2000，3000，4000，6000，8000，10000的PEG-OH，可以得到不同分子量的PEG-CHO。反应所投原料的分子量与产物分子量的对应关系列于表1。
表1原料的分子量与产物分子量的对应关系
实施例11～20：pH敏感可断裂遮蔽材料双醛基化聚乙二醇的制备
按照表2所示的原料以及材料摩尔比，按照以下方法制备双醛基化聚乙二醇：
将HO-PEG-OH、CHO、EDC和DMAP溶于二氯甲烷，搅拌条件下，25℃反应48小时。反应液分别用饱和氯化钠以及5％的氯化钠溶液洗涤，进一步经无水硫酸镁干燥后，用乙醚沉降，过滤后抽干得到pH敏感可断裂遮蔽材料双醛基化聚乙二醇OHC-PEG-CHO。
使用不同分子量的HO-PEG-OH，如分子量为600，800，1000，1500，2000，3000，4000，6000，8000，10000的HO-PEG-OH，可以得到不同分子量的OHC-PEG-CHO。反应所投原料的分子量与产物分子量的对应关系列于表2。
表2原料的分子量与产物分子量的对应关系
实施例21～28：单醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统的制备
取pH敏感可断裂遮蔽材料单醛基化聚乙二醇PEG-CHO，加一定量的二次水，配置浓度为0.01～4mg/mL的水溶液，调节pH值至7.4，用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤除菌、待用。
取阳离子聚合物材料(以聚乙烯亚胺PEI为例)，加二次水溶解，配置浓度为0.01～4mg/mL的水溶液，用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤除菌、待用。取质粒DNA，用二次水溶解，配置成浓度为0.01mg/mL的水溶液。
将PEI水溶液和质粒DNA水溶液混合，室温下孵育20分钟，之后加入不同浓度的PEG-CHO，得到PEG-CHO/PEI/DNA三元复合物，按照上述方法制备的复合物颗粒的组成及性能如表3所示(其中，选用制备的部分pH敏感可断裂遮蔽材料单醛基化聚乙二醇做以下表征；阳离子聚合物材料选用PEI，质粒DNA选用pGL-3)。
表3PEG-CHO/PEI/DNA复合物的组成和性能
由表3可知，本发明提供的pH敏感可断裂遮蔽材料单醛基化聚乙二醇能有效对阳离子聚合物材料的正电荷进行遮蔽，使基因传递体系在pH值为7.4的情况下正电性减弱，有利于体系的稳定和长循环；在pH值为6.8的条件下，pH敏感可断裂遮蔽材料发生去遮蔽，使体系恢复较高的正电性，有利于基因传递体系被细胞高效内吞。
实施例29～36：双醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统的制备
取pH敏感可断裂遮蔽材料双醛基化聚乙二醇OHC-PEG-CHO，加一定量的二次水，配置浓度为0.01～4mg/mL的水溶液，调节pH值至7.4，用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤除菌、待用。
取阳离子聚合物材料(以聚乙烯亚胺PEI为例)，加二次水溶解，配置浓度为0.01～4mg/mL的水溶液，用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤除菌、待用。取质粒DNA，用二次水溶解，配置成浓度为0.01mg/mL的水溶液。
将PEI水溶液和质粒DNA水溶液混合，室温下孵育20分钟，之后加入不同浓度的OHC-PEG-CHO，得到OHC-PEG-CHO/PEI/DNA三元复合物，按照上述方法制备的复合物颗粒的组成及性能如表4所示(其中，选用制备的部分pH敏感可断裂遮蔽材料双醛基化聚乙二醇做以下表征；阳离子聚合物材料选用PEI，质粒DNA选用pGL-3)。
表4OHC-PEG-CHO/PEI/DNA复合物的组成和性能
由表4可知，本发明提供的pH敏感可断裂遮蔽材料双醛基化聚乙二醇能有效对阳离子聚合物材料的正电荷进行遮蔽，使基因传递体系在pH值为7.4的情况下正电性减弱，有利于体系的稳定和长循环；在pH值为6.8的条件下，pH敏感可断裂遮蔽材料发生去遮蔽，使体系恢复较高的正电性，有利于基因传递体系被细胞高效内吞。
比较例1
取阳离子聚合物聚乙烯亚胺PEI，加二次水溶解，配置浓度为0.01～4mg/mL的水溶液，用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤除菌、待用。取质粒DNA，用二次水溶解配置成浓度为0.01mg/mL的水溶液。将PEI水溶液和质粒DNA水溶液混合，室温下孵育20分钟，得到PEI/DNA复合物(其中，质粒DNA选用pGL-3)。
实施例37～44：单醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统介导荧光素酶质粒DNA对HeLa细胞的体外转染
取人宫颈癌细胞(HeLa细胞)，在含有10％小牛血清的培养液中连续培养(5％CO2、37℃培养箱)；
转染前24小时内，将HeLa细胞按1×104/孔接种于96孔培养板中，置于5％CO2、37℃培养箱中继续培养至80～90％融合。转染时，吸出前一天加注的细胞培养液，用PBS洗涤两次后，加入200μL不同pH值的(pH 6.8或7.4)含有10％FBS的细胞培养液，之后将表3中所列的PEG-CHO/PEI/pGL-3复合物颗粒以及比较例1的PEI/pGL-3复合物颗粒加入各孔中，置于5％CO2、37℃培养箱中培养2h，之后吸出孔中全部液体，加入200μL含有10％FBS的细胞培养液，继续培养48小时；
转染完成后，取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，然后加入荧光素底物，用光度计测定转染效率。表5给出了本发明中实施例21～28提供的单醛基化单羟基聚乙二醇遮蔽的基因传递系统以及比较例1提供的基因传递系统的体外转染效率。
表5单醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统介导荧光素酶质粒DNA对HeLa细胞的体外转染
由表5的数据可见，对于单醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统，其在正常组织环境中pH 7.4条件下的转染效率较低，而其在微酸性的肿瘤环境中(pH 6.8)转染效率大大提高，说明本发明中的pH敏感可断裂遮蔽体系基因传递系统对正常细胞的转染低，毒副作用小，而体系在微酸性肿瘤环境中转染能力高。
实施例45～52：双醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统介导荧光素酶质粒DNA对HeLa细胞的体外转染
取人宫颈癌细胞(HeLa细胞)，在含有10％小牛血清的培养液中连续培养(5％CO2、37℃培养箱)；
转染前24小时内，将HeLa细胞按1×104/孔接种于96孔培养板中，置于5％CO2、37℃培养箱中继续培养至80～90％融合。转染时，吸出前一天加注的细胞培养液，用PBS洗涤两次后，加入200μL不同pH值的(pH 6.8或7.4)含有10％FBS的细胞培养液，之后将表4中所列的OHC-PEG-CHO/PEI/pGL-3复合物颗粒以及比较例1的PEI/pGL-3复合物颗粒加入各孔中，置于5％CO2、37℃培养箱中培养2h，之后吸出孔中全部液体，加入200μL含有10％FBS的细胞培养液，继续培养48小时；
转染完成后，取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，然后加入荧光素底物，用光度计测定转染效率。表6给出了本发明中实施例29～36提供的双醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统以及比较例1提供的基因传递系统的体外转染效率。
表6双醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统介导荧光素酶质粒DNA对HeLa细胞的体外转染
由表6的数据可见，对于双醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统，其在正常组织环境中pH 7.4条件下的转染效率较低，而其在微酸性的肿瘤环境中(pH 6.8)转染效率大大提高，说明本发明中的pH敏感可断裂遮蔽体系基因传递系统对正常细胞的转染低，毒副作用小，而体系在微酸性肿瘤环境中转染能力高。
实施例53～60：单醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统在体内的转染
取小鼠结肠癌CT26细胞，在含有10％小牛血清的培养液中连续培养(5％CO2、37℃培养箱)；
购买体重在20g左右的Balb/C小鼠，饲养备用。取对数生长期的CT26细胞，胰酶消化后离心(1000g，5min)，之后用PBS洗涤三次，并用PBS重悬细胞，按每只小鼠2×106个细胞的密度接种于腋下。10天后，瘤径长大至10mm时进行体内转染。
将实施例21～28提供的单醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统以及比较例1制备的基因传递系统溶解于含有5％(质量体积百分数)的葡萄糖溶液中至终体积为0.1mL，对小鼠尾静脉注射进行体内转染；
体内转染48h后，处死小鼠，取出肿瘤，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，匀浆，然后加入荧光素底物，测定转染效率。
表7给出了单醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统介导的体内转染效率。
表7单醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统介导的体内转染
由表7的数据可见，单醛基化聚乙二醇遮蔽的pH敏感可断裂遮蔽体系在体内肿瘤模型中能展示出良好的转染效率。
实施例61～68：双醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统在体内的转染
取小鼠结肠癌CT26细胞，在含有10％小牛血清的培养液中连续培养(5％CO2、37℃培养箱)；
购买体重在20g左右的Balb/C小鼠，饲养备用。取对数生长期的CT26细胞，胰酶消化后离心(1000g，5min)，之后用PBS洗涤三次，并用PBS重悬细胞，按每只小鼠2×106个细胞的密度接种于腋下。10天后，瘤径长大至10mm时进行体内转染。
将实施例29～36提供的双醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统以及比较例1制备的基因传递系统溶解于含有5％(质量体积百分数)的葡萄糖溶液中至终体积为0.1mL，对小鼠尾静脉注射进行体内转染；
体内转染48h后，处死小鼠，取出肿瘤，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，匀浆，然后加入荧光素底物，测定转染效率。
表8给出了双醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统介导的体内转染效率。
表8双醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统介导的体内转染
由表8的数据可见，单醛基化聚乙二醇遮蔽的pH敏感可断裂遮蔽体系在体内肿瘤模型中能展示出良好的转染效率。
实施例69～76：单醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统的制备
按照实施例21～28的方法、步骤制备单醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统，区别在于，采用沉默血管内皮生长因子的VEGF siRNA代替质粒pGL-3。
比较例2
按照比较例1提供的方法、步骤制备基因传输系统，区别在于，采用沉默血管内皮生长因子的VEGF siRNA代替质粒pGL-3。
实施例77～84：单醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统的体内VEGF siRNA转染
取小鼠结肠癌CT26细胞，在含有10％小牛血清的培养液中连续培养(5％CO2、37℃培养箱)；
购买体重在20g左右的Balb/C小鼠，饲养备用。取对数生长期的CT26细胞，胰酶消化后离心(1000g，5min)，之后用PBS洗涤三次，并用PBS重悬细胞，按每只小鼠2×106个细胞的密度接种于腋下。8天后，瘤径长大至7mm时进行体内VEGF siRNA的转染。
基因物质选用沉默血管内皮生长因子的VEGF siRNA，通过抑制VEGF的表达实现抑制肿瘤生长的目的。
将实施例69～76提供的单醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统以及比较例2制备的基因传递系统溶解于含有5％(质量体积百分数)的葡萄糖溶液中至终体积为0.1mL，对小鼠尾静脉注射进行体内转染；
从第一次给药开始测量瘤径大小，实验共14天；
表9给出了单醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递体系介导VEGF siRNA体内转染后的瘤径大小。
表9单醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递体系介导VEGF siRNA体内转染后的瘤径大小
(注：选用VEGF siRNA以及只含有5％Glucose的空白体系做为对比。)
由表9可知，与VEGF siRNA以及只含有5％Glucose的空白体系相比，本发明提供的基因传递系统可以将治疗性的基因物质VEGF siRNA有效的传递到体内肿瘤细胞中，体系对肿瘤具有良好的抑制效果。
实施例85～92：双醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统的制备
按照实施例29～36的方法、步骤制备双醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统，区别在于，采用沉默血管内皮生长因子的VEGF siRNA代替质粒pGL-3。
实施例93～100：双醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统的体内VEGF siRNA转染
取小鼠结肠癌CT26细胞，在含有10％小牛血清的培养液中连续培养(5％CO2、37℃培养箱)；
购买体重在20g左右的Balb/C小鼠，饲养备用。取对数生长期的CT26细胞，胰酶消化后离心(1000g，5min)，之后用PBS洗涤三次，并用PBS重悬细胞，按每只小鼠2×106个细胞的密度接种于腋下。8天后，瘤径长大至7mm时进行体内VEGF siRNA的转染。
基因物质选用沉默血管内皮生长因子的VEGF siRNA，通过抑制VEGF的表达实现抑制肿瘤生长的目的。
将实施例85～92提供的双醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递系统以及比较例2制备的基因传递系统溶解于含有5％(质量体积百分数)的葡萄糖溶液中至终体积为0.1mL，对小鼠尾静脉注射进行体内转染；
从第一次给药开始测量瘤径大小，实验共14天；
表10给出了双醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递体系介导VEGF siRNA体内转染后的瘤径大小。
表10双醛基化聚乙二醇遮蔽的基因传递体系介导VEGF siRNA体内转染后的瘤径大小
(注：选用VEGF siRNA以及只含有5％Glucose的空白体系做为对比。)
由表10可知，与VEGF siRNA以及只含有5％Glucose的空白体系相比，本发明提供的基因传递系统可以将治疗性的基因物质VEGF siRNA有效的传递到体内肿瘤细胞中，体系对肿瘤具有良好的抑制效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种pH敏感可断裂的遮蔽材料，其特征在于，其为单醛基化聚乙二醇或双醛基化聚乙二醇。
2.根据权利要求1所述的遮蔽材料，其特征在于，所述单醛基化聚乙二醇的制备方法为单羟基聚乙二醇与对羧基苯甲醛、邻羧基苯甲醛或间羧基苯甲醛反应；所述双醛基化聚乙二醇的制备方法为双羟基聚乙二醇与对羧基苯甲醛、邻羧基苯甲醛或间羧基苯甲醛反应。
3.根据权利要求2所述的遮蔽材料，其特征在于，所述单羟基聚乙二醇或双羟基聚乙二醇分子量为600～10,000。
4.根据权利要求2或3所述的遮蔽材料，其特征在于，所述单羟基聚乙二醇与对羧基苯甲醛、邻羧基苯甲醛或间羧基苯甲醛的摩尔比为1:1；所述双羟基聚乙二醇与对羧基苯甲醛、邻羧基苯甲醛或间羧基苯甲醛的摩尔比为1:2。
5.根据权利要求2-4任意一项所述的遮蔽材料，其特征在于，所述反应具体方法为反应物和EDC、DMAP溶于二氯甲烷，25℃反应48小时。
6.一种基因传递系统，其特征在于，包括权利要求1-5任意一项所述的pH敏感可断裂的遮蔽材料、阳离子聚合物材料和基因物质。
7.根据权利要求6所述的基因传递系统，其特征在于，
所述阳离子聚合物材料为聚乙烯亚胺、树枝状聚酰胺胺或者聚赖氨酸；
所述基因物质为质粒DNA或siRNA。
8.根据权利要求6或7所述的基因传递系统，其特征在于，所述基因传递系统中权利要求1-5任意一项所述的pH敏感可断裂的遮蔽材料与所述阳离子聚合物材料的质量比为1:1～100:1；所述阳离子聚合物材料与质粒DNA或siRNA的质量比为0.5:1～50:1。
9.权利要求6-8所述基因传递系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(A)将基因物质水溶液与阳离子聚合物材料水溶液混合均匀后孵育，得到二元复合物；
(B)将所述二元复合物与权利要求1-5任意一项所述的pH敏感可断裂的遮蔽材料水溶液混合均匀后孵育。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(A)和(B)中，所述孵育时间为10～30分钟。
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