CN102558569A - 一种脂多糖胺阳离子聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脂多糖胺阳离子聚合物，通过以亲水的多醛基海藻酸钠为主链、疏水胆固醇封端的低分子量聚乙烯亚胺为侧链合成，并对其物理化学结构、缓冲能力、转染效率和细胞毒性进行了表征，探讨其用作基因载体的可行性及在提高基因转染效率降低细胞毒性方面的作用发现，该聚合物具有生物相容性好、可控的降解性能、在MSCs中无论有无血清对GFP的转染效率均高于95％、细胞毒性低、安全实用、成本低等优点，并可作为基因载体以及其它药物载体如抗癌药物、RNA等载体的应用，本发明还公开了该聚合物的制备方法和应用。

Description

一种脂多糖胺阳离子聚合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种脂多糖胺阳离子聚合物及其制备方法和应用。

背景技术

基因疗法将为一切与基因有关的疾病的治疗提供无限可能性，因此近二十年来成为研究热点。基因治疗应用于临床的瓶颈是其安全性和有效性问题。由于病毒载体存在诸多无法预期和解决的诸如免疫原性、毒性、致癌性、宿主DNA插入整合等安全隐患，因此非病毒载体成为实现基因疗法临床应用的希望。过去十年来，人们开始致力于设计各种新的非病毒载体，研究提高其转染效率、同时降低细胞毒性的途径，并取得了极大进展，但与病毒载体的转染效率仍存在一定差距。因此提高非病毒载体的基因转染效率仍是基因治疗中一个需要解决的重要问题。

在非病毒载体中，聚乙烯亚胺PEI因为在DNA保护、细胞粘附和摄取、内含体逃逸方面性能优异而被认为是最有效的阳离子基因载体之一。但它不可降解，且转染效率和细胞毒性具有分子量依赖性，即它们均随分子量的增加而增加。因此，研究者采用各种策略对PEI进行改性，以进一步提高其基因转染效率同时降低细胞毒性。比如在大分子量的PEI上引入靶向配体、核定位信号因子等提高细胞摄取及入核能力等。或取基本无转染效率、无细胞毒性、但具有内含体突破能力(质子海绵作用)、细胞粘附、并可通过新陈代谢排出体外的小分子量的PEI(LMW PEI，PEI分子量＜2k Dalton)，用可降解的交联键连接起来，或将LMW PEI作为侧链连接在可降解的大分子主链上等，形成含LMW PEI的大分子作为基因载体，以降低聚合物的电荷密度及使聚合物进入细胞后能降解，并使DNA的释放更容易，进而降低细胞毒性，提高基因转染效率。此外，也有研究者将胆固醇(动物细胞膜的成分之一)和LMW PEI连接起来形成接枝共聚物。基因转染实验表明该载体能在一定程度上提高基因转染效率(与PEI 25k相比)。他们认为这种提高是通过胆固醇实现的。胆固醇的引入一方面促进了细胞对聚合物载体/基因复合物的摄取，而这种促进作用是通过细胞的胆固醇摄取路径来实现的；另一方面可能因为胆固醇对PEI的疏水改性提高了聚合物对质粒DNA的包封、促进了聚合物/DNA复合物在细胞膜表面的吸附、促进复合物的胞内运输及DNA从复合物中的释放等。但是，这种载体的基因转染效率仍远低于病毒的转染水平。如利用这种载体对鼠Jurkat细胞进行体外无血清转染时，其绿色荧光蛋白(GFP)的基因转染效率最高仅能达到约18％；而在有血清转染时，其转染效率更低于1％。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脂多糖胺阳离子聚合物，该聚合物具有生物相容性好、可控的降解性能、有血清及无血清基因转染效率高、细胞毒性低、安全实用、成本低等优点。

本发明的目的还在于提供上述脂多糖胺阳离子聚合物的制备方法，该方法工艺简单、易于控制。

本发明的目的还在于提供上述脂多糖胺阳离子聚合物作为基因载体以及药物载体的用途。

本发明通过制备以亲水的多醛基海藻酸钠为主链、疏水胆固醇封端的低分子量聚乙烯亚胺为侧链的脂多糖胺刷状聚合物(brush polymer)，并对其物理化学结构、缓冲能力、转染效率和细胞毒性进行表征，探讨其用做基因载体的可行性及在提高基因转染效率降低细胞毒性方面的作用。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种脂多糖胺阳离子聚合物，通过以下步骤制备获得：

(1)以聚乙烯亚胺PEI和胆固醇氯甲酸酯为原料，合成胆固醇Cho封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho；

(2)将胆固醇Cho封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho接枝于多醛基海藻酸钠MASA，合成胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI-Cho，即脂多糖胺阳离子聚合物。

其中将脂多糖胺阳离子聚合物经过还原处理时获得还原了的胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物rMASA-PEI-Cho，即还原了的脂多糖胺阳离子聚合物。

具体为将步骤(2)中的胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI-Cho即脂多糖胺阳离子聚合物经硼氢化钠NaBH₄还原处理，获得还原了的胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物rMASA-PEI-Cho，即还原了的脂多糖胺阳离子聚合物。

其中还原了的脂多糖胺阳离子聚合物和未还原的脂多糖胺阳离子聚合物均可用作基因载体，只是还原了的脂多糖胺阳离子聚合物与未还原的脂多糖胺阳离子聚合物相比更加稳定，而未还原的脂多糖胺阳离子聚合物由于亚胺键会水解所以降解更彻底，但转染效率和细胞毒性二者基本相同，二者的转染效率均接近100％。

本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的：上述脂多糖胺阳离子聚合物的制备方法，含以下步骤：

(1)以聚乙烯亚胺PEI和胆固醇氯甲酸酯为原料，合成胆固醇Cho封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho；

(2)将胆固醇Cho封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho接枝于多醛基海藻酸钠MASA，合成胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI-Cho，即脂多糖胺阳离子聚合物。

作为本发明的一种改进：还可以对步骤(2)中获得的脂多糖胺阳离子聚合物进行还原处理，具体过程是：采用硼氢化钠NaBH₄还原胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI-Cho，获得还原了的胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物rMASA-PEI-Cho，即还原了的脂多糖胺阳离子聚合物。

其中：

步骤(1)中所述聚乙烯亚胺PEI的分子量小于2k，其与胆固醇氯甲酸酯的摩尔比为1∶0.5～3。

步骤(1)中以聚乙烯亚胺PEI和胆固醇氯甲酸酯为原料合成胆固醇封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho的具体过程为：取聚乙烯亚胺PEI、二氯甲烷和三乙胺混匀得溶液A，取胆固醇氯甲酸酯溶于二氯甲烷中得溶液B，将溶液B滴加至溶液A中进行搅拌反应后，除去有机溶剂，得到粘稠状半固体，将该粘稠状半固体溶于盐酸水溶液中后过滤，将滤液用二氯甲烷萃取以除去未反应完的胆固醇氯甲酸酯后，取水相过滤，滤液经干燥即获得胆固醇封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho。

步骤(2)中多醛基海藻酸钠MASA中醛基与胆固醇Cho封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho的摩尔比小于1∶2，所述多醛基海藻酸钠的氧化程度为0.20-0.80。

步骤(2)中将胆固醇封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho接枝于多醛基海藻酸钠MASA合成胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI-Cho的具体过程为：将多醛基海藻酸钠溶于水中得溶液1，将胆固醇封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho溶于水中得溶液2，将溶液1滴入剧烈搅拌的溶液2中，滴完后室温下搅拌反应，反应产物经透析后滤去不溶物，冻干得胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI-Cho。

本发明的最后一个目的是通过如下技术方案来实现的：上述脂多糖胺阳离子聚合物作为基因载体以及其它药物载体如抗癌药物、RNA等载体的用途。

所述脂多糖胺阳离子聚合物包括还原了的脂多糖胺阳离子聚合物和未还原的脂多糖胺阳离子聚合物。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明提供的脂多糖胺阳离子聚合物不仅结合了MASA、PEI、胆固醇三者的优点，即同时具有MASA的可降解性、优良的生物相容性，低分子量PEI的质子海绵特性、低毒性、强的细胞膜粘附及保护DNA不受酶解的特性，胆固醇的细胞摄取及脂质特性；而且赋予了脂多糖胺阳离子聚合物新的特性：本发明脂多糖胺阳离子聚合物是两亲接枝共聚两性电解质，即共聚物同时具有亲疏水性(两亲)及酸碱性(两性)，可形成类似细胞膜双分子层的脂质体囊泡；上述优点能促进基因转染过程中的DNA压缩装载、聚合物/基因复合物在细胞表面的粘附摄取、复合物对细胞内体/溶酶体的突破、DNA从复合物的解离释放等过程，最终达到提高基因转染效率及降低细胞毒性的目的；

(2)本发明提供的脂多糖胺阳离子聚合物MASA-PEI-Cho可形成疏水层为胆固醇(动物细胞膜脂之一)、亲水层为天然多糖及PEI的类似细胞膜双分子层的脂质体囊泡。因囊泡有着很大的比表面积，且其表面正电荷更多，因此可压缩装载更多的DNA(带负电荷的DNA可增溶进入囊腔中、也可和囊泡内外表面带正电荷的PEI发生中和作用后沉积于囊泡内外表面)，更好地保护DNA不被酶解，并可能因为胆固醇及PEI的共同作用使复合物更易粘附在细胞膜表面，能更好地与细胞膜表面发生相互作用，促进细胞对其摄取，同时对细胞的即刻毒性减小；

(3)MASA中大量的羧基阴离子在酸性的内体/溶酶体中的质子化增强了共聚物的质子缓冲能力，提高了其突破内体/溶酶体的能力；

(4)胆固醇的疏水改性及MASA的可降解性促进了DNA从聚合物/基因复合物中的解离释放。由于本体系中形成聚合物/DNA纳米复合物的驱动力来源于两方面：疏水相互作用和静电相互作用，因此胆固醇的疏水改性减弱了DNA和PEI之间的静电相互作用，可能促进共聚物/DNA复合物的解离，使DNA的释放更容易。再加上MASA的可降解性，降解后聚合物携带的正电荷数减少，聚合物和DNA之间的静电相互作用继续减弱，进一步促进了DNA的解离释放，同时也减轻了细胞毒性；

(5)MASA的阴离子特性，可能抑制了血清蛋白对其转染效率的抑制，因此在有血清转染时也能获得高达98％的基因转染效率。

附图说明

图1是本发明MASA-PEI-Cho的合成示意图；

图2是具体实施方式中的PEI-Cho的¹H NMR谱图(CDCl₃为溶剂)；

图3是具体实施方式中制备获得的脂多糖胺阳离子聚合物溶液的缓冲能力滴定曲线；

图4是具体实施方式中不同N/P下，脂多糖胺阳离子聚合物/pEGFP(pEGFP是质粒DNA中的一种，即增强的绿色荧光蛋白质粒。如无特殊说明，说明书附图和实施例中的DNA均指pEGFP)复合物的凝胶电泳结果；

图5是rMASA-PEI-Cho在水溶液中自组装形成纳米囊泡的透射电镜照片(磷钨酸负染)，其中A是还原了的脂多糖胺阳离子聚合物rMASA-PEI-Cho的透射电镜照片，B是具体实施方式中N/P为60时，水溶液中还原了的脂多糖胺阳离子聚合物rMASA-PEI-Cho/DNA复合物的透射电镜照片；

图6a是具体实施方式中rMASA-PEI-Cho最佳N/P比为60/1时荧光显微镜下的骨髓间质干细胞MSCs细胞转染情况(无血清)；

图6b是具体实施方式中PEI 25k在最佳N/P比为10/1时荧光显微镜下的骨髓间质干细胞MSCs细胞转染情况(无血清)；

图7是不同的N/P下，rMASA-PEI-Cho/DNA复合物对MSCs细胞的无血清转染效率(流式细胞仪测定)(A)及细胞毒性(转染后MSCs的存活率)(B)。(PEI 25k和MASA-PEI均是文献报道的最佳N/P下的转染效率)；

图8是荧光显微镜下，以rMASA-PEI-Cho为载体时，MSCs对绿色荧光蛋白GFP的细胞转染情况(有血清，N/P＝100)。

具体实施方式

以下实施例中使用的材料如下：

平均分子量为1800和25000的聚乙烯亚胺(PEI)均由Aldrich公司购得。海藻酸钠，粘度300cps(Lot M3H5540，Nacalai tespue INC.，Kyoto，Japan)。携带报告基因增强的绿色荧光蛋白质粒pEGFP-C1(华西医科大学馈赠)，通过大肠杆菌Escherichia coli DH5-α增殖、用内毒素去除试剂盒(Qiagen，CA，USA)提纯。DNA浓度由生物分光光度计(Eppendorf5840R，Germany)测定260nm的紫外吸光度确定。骨髓间质干细胞(MSCs)按照常规方法从大鼠股骨分离提取并常规培养。二氯甲烷、三乙胺等为分析纯试剂。二氯甲烷和PEI经脱水处理，其它试剂直接用。

实施例1

1还原了的脂多糖胺阳离子聚合物rMASA-PEI-Cho的合成

1.1胆固醇封端的聚乙烯亚胺(PEI-Cho)的合成

首先对二氯甲烷和分子量小于2k的PEI进行脱水处理，然后取3g PEI(1.67×10^-3mol)、10mL二氯甲烷、100μL三乙胺(7.17×10^-3mol)于冰上充分搅拌混合30min得澄清透明溶液A；取0.75g胆固醇氯甲酸酯(1.67×10^-3mol，此处PEI与胆固醇氯甲酸酯的摩尔投料比为1∶1。)溶于5mL冰冷的无水二氯甲烷中得透明澄清溶液B。搅拌下将溶液2于30min内慢慢滴加至溶液A中，然后使反应混合物于冰上继续搅拌反应12h，旋蒸除去溶剂，得到白色极粘稠的半固体。将半固体溶于50mL 0.1mol/L HCl中，过滤，滤液用100mL二氯甲烷萃取3次以除掉未反应的胆固醇氯甲酸酯。然后过滤萃取后的水溶液，滤液经冷冻干燥即可得PEI-Cho固体(反应示意图见图1)。样品置于-20℃密闭干燥保存。同时以氘代氯仿CDCl₃为溶剂，用¹H NMR分析共聚物的化学结构(图2)。图2中，2.5-3.6ppm出现的信号峰为PEI单体单元NCH₂CH₂N中的亚甲基质子峰，其余为胆固醇中的各种质子峰，说明聚合物中同时存在PEI和胆固醇。另外，从1H NMR谱图中可积分算出PEI和胆固醇中所有氢的积分面积A，再按下式算出共聚物中两者的摩尔比(n_PEI∶n_胆固醇)。

(A_PEI/164)∶(A_胆固醇/45)＝n_PEI∶n_胆固醇

经计算得出n_PEI∶n_胆固醇＝1∶1，即1个PEI分子上接了1个胆固醇基。

1.2胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI-Cho的合成

按王琴梅专利方法合成多醛基海藻酸钠MASA(具体参阅专利如200910039769.3中所述的合成方法)。取多醛基海藻酸钠0.27g(含醛基7.94×10^-4mol，氧化程度为0.26(氧化程度在0.2-0.8之间均可，此处为列举，M_n＝33K)，溶于10mL水中，得溶液1。取5.27g PEI-Cho(2.38×10^-3mol，n_醛基/n_PEI＝1/3，n代表物质的量，单位为摩尔，此处为列举，n_醛基/n_PEI＜1/2均可)溶于30mL水中，得溶液2。搅拌下将溶液1于20min内缓慢滴入剧烈搅拌的溶液2中。滴完后，室温下搅拌反应24h。反应产物在蒸馏水中透析72h，滤去不溶物，冻干后得到胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI-Cho，即脂多糖胺阳离子聚合物(反应示意图见图1)。

1.3还原了的胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物rMASA-PEI-Cho的合成

先按上述步骤让PEI-Cho和MASA反应24h，不做后续的纯化，然后取0.3gNaBH₄(7.94×10^-4mol，n_{MASA中的醛基}∶n_NaBH4＝1∶1(此处二者的摩尔比并不仅限于1∶1，其它比例如1∶1～100也可以，只要NaBH₄保持过量即可)加入反应溶液中，继续搅拌反应24小时，以还原共聚物中的亚胺键(由PEI上的氨基和MASA中的醛基反应生成)及MASA上残余的醛基。产物在蒸馏水中透析72h，滤去不溶物，冻干后得到还原了的胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物rMASA-PEI-Cho，即还原了的脂多糖胺阳离子聚合物rMASA-PEI-Cho(反应示意图见图1)。

用元素分析法测定聚合物中的N含量，结果表明，MASA中N含量为0；PEI 1.8k中N含量为23.42mmol/g；rMASA-PEI-Cho中N含量为11.29mmol/g，据此可看出共聚物的N含量低于PEI 1.8k，说明引入MASA和Cho后成功降低了聚合物的电荷密度。同时联合元素分析及PEI-Cho的核磁积分结果计算出每8个MASA单体单元接一个PEI-Cho。因MASA的氧化程度为26％，即每4个MASA的单体单元中有一个单体单元被氧化，考虑到PEI为高度支化的分子，反应时存在立体位阻；此外MASA上的醛基还有可能和邻近的羟基生成半缩醛或缩醛而不能和PEI的氨基发生缩合反应，所以这个PEI-Cho在MASA上的接枝率是合理的。

实施例2

1脂多糖胺阳离子接枝共聚物MASA-PEI-Cho的合成

1.1胆固醇封端的聚乙烯亚胺(PEI-Cho)的合成

首先对二氯甲烷和PEI进行脱水处理，然后取3g PEI(1.67×10^-3mol)、10mL二氯甲烷、200μL三乙胺(1.43×10^-2mol)于冰上充分搅拌混合30min得澄清透明溶液A；取1.5g胆固醇氯甲酸酯(其与PEI的摩尔比为2∶1)溶于10mL冰冷的无水二氯甲烷中得透明澄清溶液B。搅拌下将溶液B于30min内慢慢滴加至溶液A中，然后使反应混合物于冰上继续搅拌反应12h，旋蒸除去溶剂，得到白色极粘稠的半固体。将半固体溶于50mL 0.5mol/L HCl中，过滤，滤液用100mL二氯甲烷萃取3次以除掉未反应的胆固醇氯甲酸酯。然后过滤萃取后的水溶液，滤液经冷冻干燥即可得PEI-Cho固体(反应示意图见图1)。样品置于-20℃密闭干燥保存。同时以氘代氯仿CDCl₃为溶剂，用¹H NMR分析共聚物的化学结构(图2)。图2中，2.5-3.6ppm出现的信号峰为PEI单体单元NCH₂CH₂N中的亚甲基质子峰，其余为胆固醇中的各种质子峰，说明聚合物中同时存在PEI和胆固醇。另外，从1H NMR谱图中可积分算出PEI和胆固醇中所有氢的积分面积A，再按下式算出共聚物中两者的摩尔比(n_PEI∶n_胆固醇)。

(A_PEI/164)∶(A_胆固醇/45)＝n_PEI∶n_胆固醇

经计算得出n_PEI∶n_胆固醇＝1∶1.8，即1个PEI分子上接了约2个胆固醇基。

1.2胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI-Cho的合成

按王琴梅专利方法合成多醛基海藻酸钠MASA，具体参阅专利如200910039769.3中所述的合成方法。取多醛基海藻酸钠0.27g(含醛基9.54×10^-4mol，氧化程度为0.35(氧化程度大于0.20均可，在0.2～0.8之间更好，此处为列举)，溶于10mL水中，得溶液1。取6.33g PEI-Cho(2.86×10^-3mol，n_醛基/n_PEI＝1/3，n代表物质的量，单位为摩尔，n_醛基/n_PEI＜1/2即可，此处为列举但并不限定)溶于30mL水中，得溶液2。搅拌下将溶液1于20min内缓慢滴入剧烈搅拌的溶液2中。滴完后，室温下搅拌反应18h。反应产物在蒸馏水中透析72h，滤去不溶物，冻干后得到胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI-Cho，即脂多糖胺阳离子聚合物(反应示意图见图1)。

以下实验采用的是实施例1中制备获得的还原了的胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物rMASA-PEI-Cho，即还原了的脂多糖胺阳离子聚合物进行效果试验，但未还原的脂多糖胺阳离子聚合物与还原了的脂多糖胺阳离子聚合物进相比，二者在试验结果上基本无区别。

1接枝共聚物缓冲能力的测定

室温下取50mg实施例1中制备获得的接枝共聚物(指还原了的脂多糖胺阳离子聚合物rMASA-PEI-Cho)溶于30mL 0.9％NaCl溶液中，用1M HCl或NaOH调节溶液pH至10，再用1M HCl进行滴定。记录加入的盐酸的总体积及此时溶液相应的pH，绘制盐酸体积-pH曲线(图3)，并据此计算聚合物的缓冲能力。以0.9％NaCl溶液、PEI 25k分别作为空白对照、阳性对照。聚合物的缓冲能力根据下式计算：

(ΔH⁺ _样品-ΔH⁺ _NaCl)/N×100％，

其中，ΔH⁺为滴定时，样品溶液从pH 7.0到4.0之间消耗的盐酸的摩尔数。N为样品中所含N的摩尔数。

结果，rMASA-PEI-Cho和PEI 25k的缓冲能力分别为30.7、21.3，说明共聚物具有强的质子缓冲能力，即具有优异的内含体/溶酶体逃逸能力。

2载体/DNA复合物的制备和表征

用去离子水调节实施例1中制备获得的共聚物溶液浓度，使其中的氨基基团和等体积pEGFP DNA溶液(40μg/mL)中磷酸基团的摩尔比(N/P)分别为0.3、0.9、1.5、3、4.5、6。各取50μL共聚物和DNA溶液，涡旋混合后室温共孵育30min，取15μL复合物溶液用凝胶电泳观察聚合物阻滞DNA的情况(图4)。图4显示，rMASA-PEI-Cho和PEI 25k均在N/P为1.5时即对DNA具有完全阻滞能力，说明此时聚合物能完全压缩包裹DNA形成表面带正电荷的复合物。

此外，发明人还用透射电镜和动态光散射仪(DLS)分析了N/P为60/1时，rMASA-PEI-Cho和DNA形成的复合物、及同样浓度下单纯rMASA-PEI-Cho水溶液的性质。图5为去离子水溶液中单纯共聚物(5A)及共聚物/DNA复合物(5B)的透射电镜照片(磷钨酸负染)。图5A可见，单纯共聚物在蒸馏水中能形成粒径约为110nm的囊泡，因为样品制备过程中囊泡里的水蒸发而导致其塌陷成瘪了的足球形状。图5B可见，共聚物能压缩DNA形成球状的复合物纳米囊泡。DLS测得共聚物的粒径约为110nm，ζ电位为39mV；共聚物/DNA复合物的平均粒径为112nm，ζ电位为35mV，这进一步证明rMASA-PEI-Cho自身能在水溶液中自组装形成稳定的表面带正电荷的纳米囊泡，也能压缩DNA形成稳定的、表面带正电荷的纳米囊泡。

3体外骨髓间质干细胞MSCs无血清转染实验

鼠骨髓间质干细胞MSCs由本实验室按标准方法分离提取后，在含10％(v/v)小牛血清FBS(fetal bovine serum)，1％青霉素-链霉素的DMEM 1640培养液中常规培养传代。

将实施例1中制备获得的聚合物载体与质粒DNA(pEGFP)按前述方法分别用去离子水配制成一定浓度的溶液后，按N/P为45、60、77、90等体积混合，涡旋后室温静置30min。将MSCs细胞接种到24孔板上，密度为1.0×10⁵个细胞/孔，培养20～24小时，当细胞融合度为70％～80％时，将有血清的培养液更换成不含血清的1640培养液(1ml/孔)，每孔再加入100μL载体/DNA复合物溶液(含2μg质粒)，37℃、5％CO₂下孵育4h。然后将培养介质更换成新鲜含血清的培养液继续培养44小时，用荧光显微镜观察细胞对GFP的表达情况，用流式细胞仪测定每10000个细胞中发荧光的细胞百分数，此即细胞转染效率。图6a和图6b为MASA-PEI-Cho和PEI 25k在最佳N/P比时荧光显微镜下的细胞转染情况。图6a和图6b中可见，与阳离子聚合物PEI 25k基因载体相比，以rMASA-PEI-Cho为基因载体时，细胞对GFP的表达多且强。图7A为用流式细胞仪测定的细胞转染效率。图7A中可见，PEI25k的最高细胞转染效率为10.2％(N/P＝10)，而接枝共聚物的最高细胞转染效率高达96.5％(N/P＝60、77、90)，接近病毒载体的细胞转染效率。

4rMASA-PEI-Cho的细胞毒性

按“3体外骨髓间质干细胞MSCs无血清转染实验”中的方法对MSCs进行无血清转染，转染后48h，再加入MTT溶液，用标准的MTT法研究不同N/P下的实施例1中制备的还原了的聚合物/DNA复合物对MSCs的毒性。实验以PEI25K为阴性对照，每个样品设4个复孔。细胞毒性实验结果见图7B。图中的纵坐标为细胞活力，细胞活力＝OD_样品/OD_control×100％，其中OD_样品为用复合物溶液处理的细胞组在490nm处的吸光度值，OD_control为只用培养液处理的细胞组在490nm处的吸光度值。图7B可见，在所研究的范围内，rMASA-PEI-Cho/DNA复合物的细胞存活率均大于PEI 25k/DNA复合物(最佳N/P比)。在最佳N/P比下，rMASA-PEI-Cho/DNA复合物的细胞存活率接近90％，其对MSCs的细胞毒性为I级(国标)，说明rMASA-PEI-Cho具有较低的细胞毒性，适合体内应用。因本实验中所用细胞为正常组织的干细胞，而非癌细胞，因此其细胞毒性对体内应用更有说服力。

基因载体的毒性主要来源于其上大量的阳离子，由于接枝共聚物的MASA嵌段上每个单体单元均带有一个羧基阴离子，减少了净阳离子的数量，另外元素分析法证明了MASA和Cho的引入降低了聚合物的电荷密度，因此接枝共聚物的毒性远小于PEI25k。而与带阴离子的DNA复合后，复合物的净阳离子浓度进一步降低，因此毒性进一步减小。此外，进入细胞后，rMASA-PEI-Cho可降解成PEI 1.8K、胆固醇和无毒的小分子多糖，此时其毒性进一步降低，因此可以认为接枝共聚物用作基因载体时有可忽略的细胞毒性。

5有血清转染

有血清转染方法同上，除了转染前不再将有血清的培养液更换成无血清的培养液，而是更换成加入了转染介质的含血清全培养基，培养24h后，再换全培养基培养24h。图8是rMASA-PEI-Cho在N/P＝100时的荧光显微镜照片，图8中可见，有血清且以共聚物为载体时，MSCs对GFP的表达同样多且强。流式细胞仪测定结果表明，当N/P为100、110、12、140时，MSCs的基因转染效率最高，为98.2％，远高于PEI 25K最大转染效率55.0％。说明阳离子聚合物不被血清清除，且转染效率受血清影响不大。无血清转染的最佳N/P(60)比有血清时的最佳N/P(如100)小，这是因为血清中有很多带负电荷的蛋白质，转染时部分阳离子聚合物被中和，因此达最高转染效率需更高浓度的阳离子聚合物。

综上，本发明设计的脂多糖-胺类接枝共聚物(MASA-PEI-Cho)以及其还原了的脂多糖-胺类接枝共聚物(rMASA-PEI-Cho)，合成容易、成本较低，具有低的细胞毒性、生物降解性能、接近病毒载体的高细胞转染效率、且转染效率不受血清影响，是一种适用范围较广，极有前景的阳离子聚合物基因载体。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种脂多糖胺阳离子聚合物，其特征是通过以下步骤制备获得：

(1)以聚乙烯亚胺PEI和胆固醇氯甲酸酯为原料，合成胆固醇Cho封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho；

(2)将胆固醇Cho封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho接枝于多醛基海藻酸钠MASA，合成胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI-Cho，即脂多糖胺阳离子聚合物。

2.根据权利要求1所述的脂多糖胺阳离子聚合物，其特征是：将步骤(2)中的胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI-Cho即脂多糖胺阳离子聚合物经硼氢化钠NaBH₄还原处理，获得还原了的胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物rMASA-PEI-Cho，即还原了的脂多糖胺阳离子聚合物。

3.权利要求1所述的脂多糖胺阳离子聚合物的制备方法，其特征是含以下步骤：

(1)以聚乙烯亚胺PEI和胆固醇氯甲酸酯为原料，合成胆固醇Cho封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho；

(2)将胆固醇Cho封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho接枝于多醛基海藻酸钠MASA，合成胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI-Cho，即脂多糖胺阳离子聚合物。

4.根据权利要求3所述的脂多糖胺阳离子聚合物的制备方法，其特征是步骤(2)中将胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI-Cho即脂多糖胺阳离子聚合物采用硼氢化钠NaBH₄还原处理，获得还原了的胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物rMASA-PEI-Cho，即还原了的脂多糖胺阳离子聚合物。

5.根据权利要求3所述的脂多糖胺阳离子聚合物的制备方法，其特征是：步骤(1)中所述聚乙烯亚胺PEI的分子量小于2k，其与胆固醇氯甲酸酯的摩尔比为1∶0.5～3。

6.根据权利要求3所述的脂多糖胺阳离子聚合物的制备方法，其特征是：步骤(1)中以聚乙烯亚胺PEI和胆固醇氯甲酸酯为原料合成胆固醇封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho的具体过程为：取聚乙烯亚胺PEI、二氯甲烷和三乙胺混匀得溶液A，取胆固醇氯甲酸酯溶于二氯甲烷中得溶液B，将溶液B滴加至溶液A中进行搅拌反应后，除去有机溶剂，得到粘稠状半固体，将该粘稠状半固体溶于盐酸水溶液中后过滤，将滤液用二氯甲烷萃取以除去未反应完的胆固醇氯甲酸酯后，取水相过滤，滤液经干燥即获得胆固醇封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho。

7.根据权利要求3所述的脂多糖胺阳离子聚合物的制备方法，其特征是：步骤(2)中多醛基海藻酸钠MASA中醛基与胆固醇Cho封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho的摩尔比小于1∶2，所述多醛基海藻酸钠的氧化程度为0.20-0.80。

8.根据权利要求3所述的脂多糖胺阳离子聚合物的制备方法，其特征是：步骤(2)中将胆固醇封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho接枝于多醛基海藻酸钠MASA合成胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI-Cho的具体过程为：将多醛基海藻酸钠溶于水中得溶液1，将胆固醇封端的聚乙烯亚胺PEI-Cho溶于水中得溶液2，将溶液1滴入剧烈搅拌的溶液2中，滴完后室温下搅拌反应，反应产物经透析后滤去不溶物，冻干得胆固醇封端的聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI-Cho。

9.权利要求1-2所述的脂多糖胺阳离子聚合物作为基因载体以及药物载体的用途。

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