CN102146416B

CN102146416B - 阳离子化杏鲍菇多糖纳米粒基因传递系统及其制法

Info

Publication number: CN102146416B
Application number: CN 201010613483
Authority: CN
Inventors: 徐希明; 邓纹纹; 余江南; 王淼; 曹霞
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2010-12-30
Filing date: 2010-12-30
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2030-12-30
Also published as: CN102146416A

Abstract

一种阳离子化杏鲍菇多糖纳米粒基因传递系统，它是一种用胺类化合物修饰的杏鲍菇多糖结合DNA质粒的基因传递系统，杏鲍菇多糖的分子量分布为：500~550KD，其中按质量比计，阳离子化杏鲍菇多糖:DNA质粒=0.5-100:1，阳离子化杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米复合物的粒径为50-100nm。精胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖具有最佳的干细胞转染效果，而且，杏鲍菇多糖是具有良好的生物活性的天然多糖，阳离子化的杏鲍菇多糖在其天然的生物活性基础上，增加了新的生物学功能，成为一种生物可降解、高效低毒的新型非病毒基因载体材料。本发明公开了其制法。

Description

阳离子化杏鲍菇多糖纳米粒基因传递系统及其制法

技术领域

本发明涉及生物技术和食用菌功能性多糖领域，涉及基因传递系统，具体涉及一种阳离子化杏鲍菇多糖纳米粒基因传递系统。

背景技术

多糖是广泛存在于自然界的醛糖和（或）酮糖通过糖苷键连接在一起的高分子聚合物，是植物、菌类、海洋生物等的重要组成成分。多糖的分子结构中存在着大量的活性羟基，可以进行许多化学反应，从而增加多糖的生物学功能。

随着近代生物技术的发展与人类基因库的不断完善，基因治疗已经受到越来越广泛的关注。各种与人类疾病相关基因逐步被揭晓，使人类从分子水平上认识某些疾病根源已逐步成为可能，为基因治疗提供了理论基础。基因载体，即基因传递系统，属于特殊的靶向给药系统，它不同于一般的靶向药物作用于某些器官或组织，而是在细胞和分子水平上的靶向作用。目前，基因传递系统主要面临两个重大问题需要解决：一是安全性，即治疗基因（或称目的基因）进入受体细胞后，能否得到正常的表达，产生人们期望的治疗蛋白质，而不产生其他异常蛋白质；二是高效性，即目的基因能顺利通过细胞膜不受破坏，进入受体细胞核，经过转录，翻译成治疗蛋白质，并达到可接受的基因表达水平，即具有较高的基因转染效率。一般来说，基因载体有病毒和非病毒两种类型。虽然，病毒型基因载体的基因转染效率较高，但是存在着以下问题，如：能诱导宿主免疫反应、有潜在的致突变和致癌作用、装在基因的容量有限、制备病毒型基因载体的代价高等，特别是1999年出现首例因使用腺病毒载体而致病人死亡的事件发生后，美国许多科研机构已停止使用病毒类载体，重点转向非病毒类载体研究和应用。目前，人们越来越多地关注非病毒载体的设计和应用，特别是对阳离子聚合物应用于基因传递系统的研究。精胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖是一种新型的非病毒基因传递系统，因其具有生物相容性、生物可降解性、几乎无毒和较高的细胞转染效率等优势而广受人们关注。

阳离子化多糖结合DNA质粒的基本原理是基于阳离子化多糖的正电荷与DNA质粒的负电荷的静电作用而结合。除了壳聚糖之外，其它的天然植物多糖几乎都不带正电荷，无法直接作为基因的载体，必须先将天然多糖阳离子化进行修饰以提高其电位，才能成功结合DNA质粒。目前，研究得比较多的阳离子多糖聚合物，除壳聚糖及其衍生物[参考：Tae Hee Kim, Hu Lin Jiang, Dhananjay Jere et al. Chemical modification of chitosan as a gene carrier in vitro and in vivo. Progress in polymer science, 2007, 32(7):726-753.]之外的阳离子多糖基因载体主要是精胺-葡聚糖[参考：Hagit Eliyahua,b, Aviva Josepha,c, Tony Azzam et al. Dextran–spermine-based polyplexes-Evaluation of transgene expression and of local and systemic toxicity in mice. Biomaterials 27 (2006) 1636–1645.]、精胺-淀粉[参考：Yuichiro Kido, Jun-ichiro Jo, Yasuhiko Tabata. A gene transfection for rat mesenchymal stromal cells in biodegradable gelatin scaffolds containing cationized polysaccharides. Biomaterials 2010 ]、精胺-聚甘露糖[参考：Jo Jun-ichiro，Okazaki Arimichi, Nagane Kentaro et al. Preparation of Cationized Polysaccharides as Gene Transfection Carrier for Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Journal of Biomaterials Science, PolymerEdition, 2010,21(2):185-204. ]、PEI修饰的多糖聚合物[参考：Soma Patnaik, Anita Aggarwal, Surendra Nimesh et al. PEI-alginate nanocomposites as efficient in vitro gene transfection agents. Journal of Controlled Release 114 (2006) 398–409]以及其它以环糊精[参考：Forrest ML, Gabrielson N, Pack DW. Cyclodextrin-polyethylenimine conjugates for targeted in vitro gene delivery. Biothechnolgy Bioengineering, 2005, 89(4)：416- 423. ]、海藻酸[参考：Soma Patnaik, Anita Aggarwal^,, Surendra Nimesh. PEI-alginate nano- composites as efficent in vitro gene transfection agents. Journal of controlled release, 2006,114(3): 398-409.]等为骨架而进行氨基化修饰的聚合物。在目前阳离子化多糖基因载体的构建中，所使用的多糖基本上都是人工合成或是在天然多糖基础上进行加工处理过的成分结构比较均一的多糖。杏鲍菇多糖是杏鲍菇子实体中一类具有生物活性的重要组成成分，因具有抗癌、抗氧化、降血脂、降胆固醇等功效（参考：Yang Lihong, Shi Yali, Wang Xiaojie et al. Isolation and purification of polysaccharides of Pleurotus eryngii and its bio-active. Food science and technology, 2005, 6(4):18-20）而日益受到人们关注。本发明首次将杏鲍菇多糖作为一种天然活性高分子材料加以修饰，使其成为一种有效的基因传递系统。

发明内容

本发明从具有很好保健效果的杏鲍菇（拉丁学名：P.eryngi(DC.:Fr.) Qurl.）新鲜子实体中，采用水提醇沉、柱色谱纯化的方法得到杏鲍菇总多糖，继而对其进行胺化修饰。该阳离子化杏鲍菇多糖基因传递系统兼具胺类化合物的正电性和杏鲍菇多糖的生物活性的优点，制备工艺流程简单。本发明将三种阳离子化的杏鲍菇多糖对质粒DNA的结合、干细胞转染效果、细胞黏附性进行了对比，同时设置脂质体阳性对照，实验结果表明精胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖与质粒DNA 的结合作用好，干细胞转染效率明显高于乙二胺修饰的杏鲍菇的多糖和小分子量PEI修饰的杏鲍菇多糖，也高于阳性对照脂质体的干细胞转染效率，并且细胞黏附性试验表明其具有良好的细胞黏附性，细胞毒性试验表明其安全无毒。具体工艺流程如图1。

本发明采用化学修饰的方法，提供了一种基于阳离子化杏鲍菇多糖的高效无毒的基因传递系统。

本发明的技术方案如下：

一种阳离子化杏鲍菇多糖纳米粒基因传递系统，它是一种用胺类化合物修饰的杏鲍菇多糖结合DNA质粒的基因传递系统，杏鲍菇多糖的分子量分布为：500~550KD，其中按质量比计，阳离子化杏鲍菇多糖:DNA质粒 = 0.5-100:1，阳离子化杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米复合物的粒径为50-100nm，所述的胺类化合物为精胺、乙二胺或数均分子量为600Da-2000Da的聚乙烯亚胺。

一种制备上述阳离子化杏鲍菇多糖纳米粒基因传递系统的方法，它包括以下步骤：

步骤1. 氧化杏鲍菇多糖的制备：

称取0.2~1g杏鲍菇多糖，溶解于20ml~50ml双蒸水中，加入KIO₄，KIO₄与多糖中单糖单位的摩尔比为：0.5~5:1，迅速放到暗室，磁力搅拌，室温反应72h；反应液加入10~20ml 乙二醇终止反应，按前述条件继续反应30min；将反应液装入透析袋(截取分子量>3500Da)，在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到氧化杏鲍菇多糖0.2~0.8g；

步骤2. 阳离子化鲍菇多糖的制备：

A. 精胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖的制备：

称取0.1~0.5g 步骤1制得的氧化杏鲍菇多糖，溶解于10-50ml 双蒸水中；称取精胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液（pH=9），精胺与氧化多糖的醛基的摩尔比为0.5~5:1；将精胺的硼酸盐溶液用一次性注射器缓慢加入到氧化杏鲍菇多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24h；然后，向反应液中加入0.1~0.5g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48h；再向反应液中加入0.1~0.5g 硼氢化钠，加入硼氢化钠的总质量与氧化多糖的质量之比为：0.5~3:1，相同条件下继续反应24h；将反应液装入透析袋(截取分子量>3500Da)，在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到精胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖0.2~0.6g；

B. 乙二胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖的制备：

称取0.1~0.6g 步骤1制得的氧化杏鲍菇多糖，溶解于10~60ml 双蒸水中；取乙二胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液（pH=9），乙二胺与氧化多糖的醛基的摩尔比为0.5-5:1；将乙二胺的硼酸盐溶液用一次性注射器缓慢加入到杏鲍菇多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24h；然后，向反应液中加入0.1~0.5g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48h；再向反应液中加入0.1~0.5g 硼氢化钠，加入硼氢化钠的总质量与氧化多糖的质量之比为：0.5~3:1，相同条件下继续反应24h；将反应液装入透析袋(截取分子量>3500Da)，在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到乙二胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖0.2~0.6g；

C. PEI修饰的杏鲍菇多糖的制备：

称取0.2~1g精制的杏鲍菇多糖，溶于10~20ml磷酸盐缓冲液（pH=7）；将活化羟基的连接剂，如：N，N’-羰基二咪唑、苯并三唑碳酸酯、羰基咪唑、N,N’-二琥珀酰亚胺基硫酸酯中的任一种，溶解于5 ml二氯甲烷中，多糖与连接剂的质量比为：0.5~3:1，在氮气的保护下，首先在多糖液中加入催化剂三乙胺，再将羟基连接剂的二氯甲烷溶液缓慢加入多糖溶液中，边加边搅拌，在30~100min内加完，加完之后，室温反应90~150min，获得活化的多糖溶液；将数均分子量为600Da-2000Da的聚乙烯亚胺溶于10ml磷酸盐缓冲液中，多糖与聚乙烯亚胺的质量比为0.5~4:1，加入催化剂三乙胺，在避光、氮气保护、室温条件下缓慢加入到活化的多糖液中，边加边搅拌，在120~150min加完，加完之后避光、室温下反应10h，反应完成之后的溶液经透析(截取分子量>3500Da)、冻干之后，得到PEI 修饰的杏鲍菇多糖；

步骤3. 阳离子化杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统的制备：

分别称取10~50mg上述步骤2制得的三种阳离子化杏鲍菇多糖，各自溶解于0.5~2ml双蒸水，得到阳离子多糖储备液；取阳离子多糖储备液50 μl，稀释100倍后，得到阳离子多糖应用液；取10μl阳离子多糖应用液和10μl 含0.1~3μg DNA质粒溶液，分别在55℃加热30~60min；再将二者混合，涡旋30s，即得到三种阳离子化杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。

有益效果

三种阳离子化杏鲍菇多糖均有良好的DNA质粒结合作用，糖链结合的伯、仲、叔氨基所携带的正电荷能够很好的与带负电荷的DNA质粒通过静电作用而结合，保护DNA质粒免受细胞内外各种酶的降解。其中，精胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖具有最佳的干细胞转染效果，经电泳实验和干细胞转染实验说明其对DNA质粒有更好的结合和释放效果。而且，杏鲍菇多糖是具有良好的生物活性的天然多糖，与以往用来制备阳离子聚合物的多糖相比，具有更好的生物可降解性和生物相容性，制备工艺简单，价格低廉。阳离子化的杏鲍菇多糖在其天然的生物活性基础上，增加了新的生物学功能，成为一种生物可降解、高效低毒的新型非病毒基因载体材料。

附图说明

图1为杏鲍菇阳离子多糖制备工艺流程图。

图2为阳离子化杏鲍菇多糖~DNA质粒纳米复合物电泳图，其中：

孔道1：裸pTGFβ-1；

孔道2~8，阳离子化杏鲍菇多糖:pTGFβ-1质量比依次为：1:1；1:5；1:10；1:20；1:40；1:60；1:100。

图3为杏鲍菇阳离子多糖-DNA质粒纳米复合物的粒径分布图。

图4为杏鲍菇阳离子化多糖-DNA质粒纳米复合物的透射电镜图。

图5为杏鲍菇阳离子化多糖-DNA质粒纳米复合物基因转染效果图，图中：Lipfectimane代表阳性对照脂质体lifectamine^TM 2000,杏鲍菇-PEI代表杏鲍菇多糖与聚乙烯亚胺（PEI）的复合物，杏鲍菇-sp代表杏鲍菇多糖与精胺（sp）的复合物。

具体实施方式

以下实施例所采用的材料和仪器：

实验材料：杏鲍菇（鲜品，镇江市食用菌种植基地）；95%乙醇（山东广源医药有限公司）；无水乙醇、丙酮、乙醚、乙二醇、三氯乙酸（国药集团化学试剂有限公司）；DEAE-52纤维素树脂（Whatman公司，英国）；SephadexG-100 凝胶树脂（Shanghai RiChu Bioscience有限公司）；KIO₄（国药集团化学试剂有限公司）；精胺（Biosharp公司，美国），乙二胺（Sigma-Aldrich，USA）, PEI（Sigma-Aldrich，USA）,硼氢化钠（国药集团化学试剂有限公司）；无内毒素质粒大提试剂盒（康为世纪）；Rat TGF-β1 ELISA Kit（烟台赛尔斯生物技术有限公司）。

实验器材：磁力搅拌器（金坛大中仪器厂）；透析袋（Biosharp公司，美国）；超低温高速离心机（Heareus，德国）；CHRIST冷冻干燥干机（BMH公司，德国）；DY602S稳流稳压电泳仪（南京新校园生物技术研究所）； JEM-2100透射电子显微镜（日本电子）；旋转蒸发仪（Heidolph公司，德国）。

实施例1.精制的杏鲍菇多糖的制备

1. 称取新鲜杏鲍菇1000g，粉碎成浆状；按如下工艺进行提取：料液比：1：4，提取温度：80℃，提取时间2h/次，提取次数：2次；过滤，将两次的提取液合并，旋转蒸发浓缩至原提取液体积的八分之一；浓缩液用95%无水乙醇沉淀，乙醇终浓度70%，静置12h；收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤两次；真空干燥，得到杏鲍菇粗多糖。

2. 称取5g杏鲍菇粗多糖，完全溶解于50ml双蒸水中，向其中加入20%三氯乙酸溶液直至三氯乙酸终浓度为3%，边加边搅拌，加完之后，4℃静置4h，离心3000r/min, 10min, 除去沉淀，上清液用1%NaOH溶液中和，旋转蒸发浓缩，透析，冻干，得到除蛋白的杏鲍菇多糖。

3. 称取1g除蛋白之后的杏鲍菇多糖，完全溶解于10ml双蒸水中，3000r/min, 离心10min, 取上清液，上DEAE-52纤维素树脂柱，依次用双蒸水、0.05mol/L、0.1 mol/L、0.25 mol/L、0.5 mol/L的NaCl溶液作为洗脱液，流速6ml/min, 收集洗脱液，同时采用硫酸-苯酚法跟踪检测收集的多糖含量；将含多糖的收集液合并，旋转蒸发浓缩，得浓缩液，透析，冻干。

4. 称取步骤3得到的杏鲍菇多糖0.5g，溶解于双蒸水中，上SephadexG-100凝胶树脂柱，以0.1 mol/LNaCl溶液作为洗脱液，流速6ml/min, 收集洗脱液，同时采用硫酸-苯酚法跟踪检测收集的多糖含量，将含多糖的收集液合并，旋转蒸发浓缩，透析，冻干，得到纯化的杏鲍菇多糖。

实施例2. 氧化杏鲍菇多糖的制备

称0.5g精制的杏鲍菇多糖，溶解于30ml双蒸水中，加入0.75g KIO₄，迅速放到暗室，磁力搅拌，室温反应72h；反应液加入10ml 乙二醇终止反应，按前述条件继续反应30min；将反应液装入透析袋(截取分子量>3500Da)，在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到氧化杏鲍菇多糖。

实施例3. 精胺修饰的杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统的制备

A. 取0.15g 氧化杏鲍菇多糖，溶解于10ml 双蒸水中；称0.3g 精胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液（pH=9）；将精胺的硼酸盐溶液用一次性注射器缓慢加入到杏鲍菇多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24h；然后，向反应液中加入0.2g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48h；再向反应液中加入0.2g 硼氢化钠，相同条件下继续反应24h；将反应液装入透析袋(截取分子量>3500Da)，在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到精胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖。

称取30mg 精胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖溶解于0.5ml双蒸水，得到阳离子多糖储备液。取阳离子多糖储备液50 μl，稀释100倍后，得到阳离子多糖应用液；取10μl阳离子多糖应用液和10μl 含0.2μg DNA质粒pTGFβ-1溶液，分别在55℃加热60min；再将二者混合，涡旋30s，即得到阳离子化杏鲍菇多糖:pTGFβ-1质量比为30:1的精胺修饰的杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统，其粒径分布见图3，透射电镜见图4。

B. 称取30mg 精胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖溶解于1ml双蒸水，得到阳离子多糖储备液。取阳离子多糖储备液50 μl，稀释100倍后，得到阳离子多糖应用液；取10μl阳离子多糖应用液和10μl 含0.3μg DNA质粒pTGFβ-1溶液，分别在55℃加热60min；再将二者混合，涡旋30s，即得到阳离子化杏鲍菇多糖:pTGFβ-1质量比为10:1的精胺修饰的杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。

实施例4.乙二胺修饰的杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统的制备

取0.3g 氧化杏鲍菇多糖，溶解于30ml 双蒸水中；取0.1ml乙二胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液（pH=9）；将乙二胺的硼酸盐溶液用一次性注射器缓慢加入到杏鲍菇多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24h；然后，向反应液中加入0.4g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48h；再向反应液中加入0.4g 硼氢化钠，相同条件下继续反应24h；将反应液装入透析袋(截取分子量>3500Da)，在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到乙二胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖。

称取20mg 乙二胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖溶解于1ml双蒸水，得到阳离子多糖储备液。取阳离子多糖储备液50 μl，稀释100倍后，得到阳离子多糖应用液；取10μl阳离子多糖应用液和10μl 含0.5μg DNA质粒pTGFβ-1溶液，分别在55℃加热40min；再将二者混合，涡旋30s，即得到乙二胺修饰的杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。

实施例5. PEI修饰的杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统的制备

称0.1g精制的杏鲍菇多糖，溶解于20ml 磷酸盐缓冲液（Ph=7）中; 将活化羟基的连接剂N，N’-羰基二咪唑（Aldrich, 美国）0.2g溶解于5ml二氯甲烷中，在氮气的保护下，首先在多糖液中加入催化剂0.1ml，再将羟基连接剂的二氯甲烷溶液缓慢加入多糖溶液中，边加边搅拌，在30~100min内加完，加完之后，室温反应90~150min，获得活化的多糖溶液；将1.8g小分子量PEI（分子量Mw 1300, Aldrich, 美国）溶于10ml磷酸盐缓冲液中，加入催化剂三乙胺，在避光、氮气保护、室温条件下缓慢加入到上述的活化的多糖液中，边加边搅拌，在120-150min加完，加完之后避光、室温下反应10h，反应完成之后的溶液经透析冻干之后，得到PEI 修饰的杏鲍菇多糖。

称取30mg PEI修饰的阳离子化杏鲍菇多糖溶解于1.5ml双蒸水，得到阳离子多糖储备液。取阳离子多糖储备液50 μl，稀释100倍后，得到阳离子多糖应用液；取10μl阳离子多糖应用液和10μl 含0.2μg DNA质粒pTGFβ-1溶液，分别在55℃加热30min；再将二者混合，涡旋30s，即得到PEI修饰的杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。

以苯并三唑碳酸酯（Aldrich, 美国）、羰基咪唑（Aldrich, 美国）或N,N’-二琥珀酰亚胺基硫酸酯（Aldrich, 美国）替代N，N’-羰基二咪唑重复上述实验得到相同的结果。

实施例6.

琼脂糖凝胶电泳：

制备1%琼脂糖凝胶，加入0.5μg/ml 溴化乙啶，铺板，加样，在80V电泳1.5h后采用凝胶成像系统观察结果。如图2所示，阳离子化杏鲍菇多糖能够较好的结合质粒DNA。

琼脂糖DNA电泳的步骤如下：

步骤1. 制备1%琼脂糖凝胶:称取0.2g 琼脂糖置于锥形瓶中，加入20ml 0.5×TBE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即得到1.0%琼脂糖凝胶液。

步骤2. 胶板制备：将电泳槽内的有机玻璃内槽和制胶槽洗干净，晾干。将有机玻璃内槽放入制胶槽内，并在固定位置放好梳子。待琼脂糖凝胶溶液冷却到65℃左右，向琼脂糖凝胶液中加0.5μg/ml溴化乙锭，混匀，小心地倒入有机玻璃内槽，是凝胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下，水平静置直至凝胶完全凝固，垂直轻轻拔出梳子，将凝胶及内槽一起放入电泳槽中。

步骤3. 加样：在点样板上混合一系列阳离子化多糖与质粒DNA质量比的阳离子化多糖-质粒DNA复合物样品（阳离子化多糖与质粒DNA 的质量比从第2孔道到第8孔道依次为：5:1；10:1；20:1；40:1；60:1；80:1；100:1）和上样缓冲液，用10μl微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内。

步骤4. 电泳：加油后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100V，样品由正极（红色）向负极（黑色）方向移动。当溴酚蓝移动到距离胶板前沿约1cm处时，停止电泳。

步骤5. 电泳完毕后，取出凝胶。

步骤6. 观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出橙红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。可见阳离子化杏鲍菇多糖对DNA质粒具有明显的包裹作用，结果见图2 。图2中，孔道1中为裸露的质粒，会被凝胶中的溴化乙啶染色，在紫外灯下显现橘红色荧光，在电泳中朝正极迁移，而从孔道2到孔道8是与阳离子化杏鲍菇多糖结合的质粒（阳离子化多糖与质粒DNA 的质量比从第2孔道到第8孔道依次为：5:1；10:1；20:1；40:1；60:1；80:1；100:1），第2、3孔道由于多糖量不足以完全包裹质粒而使部分质粒裸露，显出橘红色荧光，随着多糖质量比重的增加，由于质粒完全被阳离子化多糖包裹而避免被溴化乙啶染色，从而显现不出荧光，同时阳离子化多糖的正电荷中和了质粒的负电荷，在电泳中不向正极迁移而滞留在原孔道中。

实施例7.

以pTGFβ-1质粒为报告基因，按照实施例一、二、三所述制备三种阳离子化杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米粒基因传递系统。96孔板中培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，细胞浓度达到2×10⁵/ml 完全培养基/孔，孵育24-48h后，用无血清培养基置换原培养基，分别加入三种阳离子化杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米复合物、脂质体Lipofectamine-DNA质粒复合物、游离质粒，使每孔质粒DNA量均为0.2μg，并以空白细胞为阴性对照，孵育4h后，将无血清培养基置换成新鲜的含血清培养基，继续孵育72h，Rat TGF-β1 ELISA Kit检测转染效果。结果如图5所示，乙二胺和小分子量PEI修饰的杏鲍菇多糖均有一定的转染效果，但是比不上脂质体-DNA质粒复合物的转染效率，精胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖-DNA质粒复合物的转染效率最高，且高于脂质体-DNA质粒复合物的转染效率。说明精胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖是这三种阳离子化多糖中作为基因转染载体的最佳选择。

细胞转染实验步骤：

步骤1. 干细胞分离及培养：将SD大鼠拉颈处死，体积分数为75%的乙醇浸泡3~5min, 无菌条件下取出胫骨和股骨；将其两端干骺端切除，露出骨髓腔，用无菌注射器吸取适量PBS彻底冲洗骨髓腔；反复吹打冲出骨髓；使骨髓细胞充分分散；所获得的骨髓单细胞悬液沿管壁缓慢滴加于预置的Percoll分离液（相对体积质量1.073）的离心管中，骨髓单细胞悬液与分离液的体积比为1：1；2000rpm，离心20min，吸取中间云雾状细胞层，用PBS洗涤3次；重新悬起细胞，加入完全培养基（含体积分数为10%胎牛血清的DMEM），置于培养瓶中，37℃体积分数为5%的CO₂培养箱中培养。

步骤2. 细胞转染

阳离子化杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米复合物的转染：

分别取精胺、乙二胺和小分子量PEI修饰的阳离子化杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米复合物（20μg/ml）加至96孔板中（2.5×10⁵/孔），并轻轻摇晃使其均匀混合；放置37℃ CO2培养箱孵育24-48h，以脂质体-DNA质粒复合物的转染效率作为对照。

Claims

1.一种阳离子化杏鲍菇多糖纳米粒基因传递系统，其特征是：它是一种用胺类化合物修饰的杏鲍菇多糖结合DNA质粒的基因传递系统，杏鲍菇多糖的分子量分布为：500~550KD，其中按质量比计，阳离子化杏鲍菇多糖:DNA质粒 = 0.5-100:1，阳离子化杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米复合物的粒径50-100nm，所述的胺类化合物为精胺、乙二胺或数均分子量为600Da-2000Da的聚乙烯亚胺。

2.一种制备权利要求1所述阳离子化杏鲍菇多糖纳米粒基因传递系统的方法，其特征是它包括以下步骤：

步骤1. 氧化杏鲍菇多糖的制备：

称0.2~1g杏鲍菇多糖，溶解于20ml~50ml双蒸水中，加入KIO₄，KIO₄与多糖中单糖单位的摩尔比为：0.5~5:1，迅速放到暗室，磁力搅拌，室温反应72h；反应液加入10~20ml 乙二醇按前述条件继续反应30min终止反应；将反应液装入截取分子量>3500Da的透析袋，在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到氧化杏鲍菇多糖0.2~0.8g；

步骤2. 阳离子化鲍菇多糖的制备：

A. 精胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖的制备：

取0.1~0.5g 步骤1制得的氧化杏鲍菇多糖，溶解于10-50ml 双蒸水中；称取精胺溶解于5ml的pH=9的硼酸盐缓冲液，精胺与氧化多糖的醛基的摩尔比为0.5~5:1；将精胺的硼酸盐溶液用一次性注射器缓慢加入到氧化杏鲍菇多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24h；然后，向反应液中加入0.1~0.5g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48h；再向反应液中加入0.1~0.5g 硼氢化钠，加入硼氢化钠的总质量与氧化多糖的质量之比为：0.5~3:1，相同条件下继续反应24h；将反应液装入透析袋，在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到精胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖0.2~0.6g；

B. 乙二胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖的制备：

称取0.1~0.6g 步骤1制得的氧化杏鲍菇多糖，溶解于10~60ml 双蒸水中；取乙二胺溶解于5ml的pH=9的硼酸盐缓冲液，乙二胺与氧化多糖的醛基的摩尔比为0.5-5:1；将乙二胺的硼酸盐溶液用一次性注射器缓慢加入到氧化杏鲍菇多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24h；然后，向反应液中加入0.1~0.5g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48h；再向反应液中加入0.1~0.5g 硼氢化钠，加入硼氢化钠的总质量与氧化多糖的质量之比为：0.5~3:1，相同条件下继续反应24h；将反应液装入透析袋，在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到乙二胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖0.2~0.6g；

分别称取10~50mg二种阳离子化杏鲍菇多糖，各自溶解于0.5~2ml双蒸水，得到阳离子多糖储备液；取阳离子多糖储备液50 μl，稀释100倍后，得到阳离子多糖应用液；取10μl阳离子多糖应用液和10μl 含0.1~3μg DNA质粒溶液，分别在55℃加热30~60min；再将二者混合，涡旋30s，即得到阳离子化杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。

3.一种制备权利要求1所述阳离子化杏鲍菇多糖纳米粒基因传递系统的方法，其特征是它包括以下步骤：

步骤1. 数均分子量为600Da-2000Da的聚乙烯亚胺（PEI）修饰的杏鲍菇多糖的制备：

称取0.2~1g杏鲍菇多糖，溶于10~20ml的pH=7的磷酸盐缓冲液；将活化羟基的连接剂溶解于5 ml二氯甲烷中，多糖与连接剂的质量比为：0.5~3:1，所述的连接剂为N，N’-羰基咪唑，在氮气的保护下，首先在多糖液中加入催化剂三乙胺，再将活化羟基的连接剂的二氯甲烷溶液缓慢加入多糖溶液中，边加边搅拌，在30~100min内加完，加完之后，室温反应90~150min，获得活化的多糖溶液；将数均分子量为600Da-2000Da的聚乙烯亚胺溶于10ml磷酸盐缓冲液中，多糖与PEI 的质量比为0.5~4:1，加入催化剂三乙胺，在避光、氮气保护、室温条件下缓慢加入到活化的多糖液中，边加边搅拌，在120~150min加完，加完之后避光、室温下反应10h，反应完成之后的溶液经透析、冻干之后，得到PEI 修饰的杏鲍菇多糖；

步骤2. 阳离子化杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统的制备：

称取10~50mg步骤1得到的阳离子化杏鲍菇多糖，溶解于0.5~2ml双蒸水，得到阳离子多糖储备液；取阳离子多糖储备液50 μl，稀释100倍后，得到阳离子多糖应用液；取10μl阳离子多糖应用液和10μl 含0.1~3μg DNA质粒溶液，在55℃加热30~60min；再将二者混合，涡旋30s，即得到阳离子化杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。