CN113388122B - 一种正电性表面外泌体及其制备方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种正电性表面外泌体及其制备方法与用途。由ε‑聚赖氨酸(ε‑PLL)和聚乙二醇修饰磷脂(PEG‑lipid)制备得到了阳离子两亲性聚合物；再用阳离子两亲性聚合物与外泌体在生物相容性溶液中混合得到混合悬液，混合悬液中阳离子两亲性聚合物与外泌体反应；随后，利用生物相容性溶液稀释混合液，提纯获取表面正电性外泌体，还公开了正电性表面外泌体在制备药物或药物载体中的应用。与现有技术相比，本发明制备的表面正电性外泌体可有效跨越生物屏障，在治疗与药物递送过程中，表现出更有效的生物利用度。

Description

一种正电性表面外泌体及其制备方法与用途
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种正电性表面外泌体及其制备方法与用途。
背景技术
外泌体是由细胞分泌的直径30–150nm的天然膜性囊泡，主要负责细胞间的物质通讯。外泌体包含来源于母体细胞的RNA、蛋白质、DNA片段和磷脂等物质，并可将这些物质传递给受体细胞，调控受体细胞状态，在生理和病理机制中发挥重要功能。近年来，外泌体在生物医药领域得到了广泛的关注与研究，主要包括两方面应用：一是特定细胞分泌的外泌体可治疗某些疾病，二是外泌体作为天然药物载体可实现药物分子的高效递送。目前，广泛研究证实间充质干细胞来源的外泌体具有促进细胞增殖、促血管再生及调控炎症等功能，可有效修复组织损伤，具有替代干细胞治疗的潜力(HarrelC.R.et al.,Pharmaceutics,2020,12,474)；另有报道显示多能干细胞来源外泌体可缓解或逆转细胞衰老，对一些衰老相关疾病具有治疗功能(Ullah M.et al.,Ageing Research Reviews，2020，01，57)。另外，相比于人工合成药物载体，外泌体具有生物安全性高、免疫原性低及细胞靶向性强等优势，极具临床应用潜力(Vader P.,et al.,Advanced Drug Delivery Reviews,2016,106,148-156)。
外泌体及其介导的药物递送治疗的关键是实现外泌体向目标处细胞有效传递自身携带的功能性分子。外泌体膜由磷脂双分子层构成，表面呈显著负电性。然而，负电性表面不利于外泌体在细胞外基质中的渗透及其与细胞膜的高效结合，降低其生物利用率。例如，间充质干细胞外泌体具有调控软骨组织稳态的功能；然而，相关研究中均采用大剂量频繁的关节腔注射才可实现间充质干细胞外泌体对关节炎症状的干预(Zhu Y.,Stem CellResearch&Therapy,2017,8,64)。
中国专利CN109395096B公开了一种标记外泌体的方法和AIE荧光分子标记的外泌体及其应用，该方法包括：将含有AIE荧光分子的标记溶液与外泌体混合后进行荧光标记。利用特定的聚集诱导发光荧光分子稳定高效地对外泌体进行标记，不改变外泌体的结构和组成成分，不影响其生物功能，所得到的标记后的外泌体可用于制备示踪药物，有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。该专利给出了可以使用AIE荧光分子标记外泌体的技术启示，不过该专利主要解决的技术问题是标记示踪问题，没有涉及外泌体生物利用度的问题。
中国专利CN105849554B公开了利用低分子量有机两性离子的外泌体回收方法，该专利中指出：外泌体外膜的脂质组分被认为是强疏水性的，该专利认为将外泌体与两性离子组合均可改进纯化期间的外泌体回收率。不过该专利主要解决的技术问题是外泌体回收问题，没有涉及外泌体生物利用度的问题。
发明内容
在本申请的发明创造过程中，发明人研究发现，之所以间充质干细胞外泌体需要大剂量注射的原因在于：软骨基质中存在大量负电性成分(硫酸软骨素、透明质酸等)阻碍了表面呈显著负电性的外泌体向软骨组织的渗透，造成较低的生物利用度。
基于以上研究发现，为克服外泌体的负电性表面特性对其在疾病治疗或药物递送中存在的生物利用度低的负面影响，本发明提供一种正电性表面外泌体及其制备方法与应用。
具体而言，本发明提供一种阳离子两亲性聚合物、阳离子两亲性聚合物的制备方法、基于阳离子两亲性聚合物构建正电性表面外泌体的方法、基于阳离子两亲性聚合物构建的正电性表面外泌体，以及正电性表面外泌体的用途。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明首先提供一种阳离子两亲性聚合物，其结构如式I所示：
Figure BDA0003138759320000021
在本发明的一个实施方式中，式I中，n为10～50间的正整数，优选为23～40；
在本发明的一个实施方式中，式I中，不同位置处的R独立的选取，可以相同也可以不同。
在本发明的一个实施方式中，式I中，R选自H或如式II所示结构。
Figure BDA0003138759320000031
式II所示为一类PEG-磷脂，其以铵盐或钠盐的形式存在。
在本发明的一个实施方式中，式II中，m为10～1000间的正整数，优选为20～100；
在本发明的一个实施方式中，式II中，p为8～25间的正整数，优选为10～20；
式II中最左端的弯曲线是表示该位置是连接到式I主链的位置。
本发明还提供阳离子两亲性聚合物的制备方法，所述阳离子两亲性聚合物由ε-聚赖氨酸(ε-PLL)和琥珀酰亚胺修饰的聚乙二醇修饰磷脂(PEG-lipid)制备得到。
ε-聚赖氨酸的结构式为：
Figure BDA0003138759320000032
式中n为正整数，优选为10～50间的正整数，更优选为23～40间的正整数；
琥珀酰亚胺修饰的PEG-lipid盐的结构式为：
Figure BDA0003138759320000033
m为10～1000间的正整数，优选为20～100；p为8～25间的正整数，优选为10～20。
在本发明的一个实施方式中，所述阳离子两亲性聚合物的制备方法如下：
准确称取一定质量的ε-PLL，充分溶解于水和有机溶剂的混合溶剂中；另外，准确称取一定质量的琥珀酰亚胺修饰的PEG-lipid(NHS-PEG-lipid)溶解于有机溶剂中，其中溶解NHS-PEG-lipid的有机溶剂选择与溶解ε-PLL相同的有机溶剂；将溶解有ε-PLL的溶液的pH值调至8.5～9.0。随后，将NHS-PEG-lipid的溶液在搅拌状态下滴加到ε-PLL的溶液中进行反应；反应结束后，用水稀释反应溶液，并将稀释后的溶液进行透析、超滤或切向流超滤，去除未反应的原料；最后，对反应液进行冷冻干燥，得到所述阳离子两亲性聚合物粉末。
在本发明的一个实施方式中，上述制备过程中，所述有机溶剂选自N’N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)或二甲基亚砜(DMSO)中的一种，优选为DMSO。
在本发明的一个实施方式中，上述制备过程中，水和有机溶剂的混合溶剂中，有机溶剂与水的体积比例为0.5～2，优选为1。
在本发明的一个实施方式中，上述制备过程中，称取ε-PLL以及NHS-PEG-lipid的量需要满足：NHS-PEG-lipid与ε-PLL中所含氨基的摩尔数比为1:50～1:1，优选为1:40～1:10。
在本发明的一个实施方式中，上述制备过程中，反应温度为20～40℃，优选为25℃，反应时间为1～50小时，优选为24小时。
在本发明的一个实施方式中，调节溶液的pH值采用的溶剂是1M的NaOH水溶液。
本发明提供的阳离子两亲性聚合物具有自发结合外泌体双层磷脂膜的能力。结构中，ε-PLL是一种多聚赖氨酸，其结构中的氨基在溶液中可发生质子化，进而通过静电吸附作用可以结合外泌体膜表面，并反转外泌体表面负电性；PEG-lipid链段可通过亲-疏水自组装作用嵌入外泌体的磷脂双层膜结构中，起到增强该聚合物修饰外泌体膜的稳定性。
本发明进一步提供了基于上述阳离子两亲性聚合物构建正电性表面外泌体的方法，制备方法如下：利用阳离子两亲性聚合物与外泌体在生物相容性溶液中混合，反应；随后，利用生物相容性溶液稀释混合液，提纯获取表面正电性外泌体。
在本发明的一个实施方式中，本发明进一步提供了基于上述阳离子两亲性聚合物构建正电性表面外泌体的方法，具体制备过程如下：
将所述阳离子两亲性聚合物按照一定质量浓度溶解于生物相容性介质中，并将该溶液与一定颗粒浓度的外泌体悬液混合，得到混合悬液；一定温度下，利用一定方法处理上述混合悬液，使混合悬液中阳离子两亲性聚合物与外泌体充分反应一定时间，随后，利用生物相容性介质对上述混合悬液进行一定比例的稀释后，利用外泌体分离与提取方法收集所制备得到的正电性表面外泌体。
在本发明的一个实施方式中，上述制备过程中，所述外泌体为细胞外泌体，优选为人多能干细胞外泌体。
在本发明的一个实施方式中，上述制备过程中，所述生物相容性介质选自生理盐水、生理缓冲液或细胞培养基，优选为生理缓冲液；
在本发明的一个实施方式中，上述制备过程中，所述阳离子两亲性聚合物的溶液与外泌体悬液混合后所得的混合悬液中，阳离子两亲性聚合物的终浓度为0.001g/L～2g/L，优选为0.01g/L～0.4g/L；混合悬液中，外泌体的颗粒浓度为1×107～1×1012个/mL，优选为1×1010～1×1011个/mL。
在本发明的一个实施方式中，上述制备过程中，处理混合悬液的方法为静置、摇床震荡或超声震荡。
在本发明的一个实施方式中，上述制备过程中，阳离子两亲性聚合物与外泌体反应的温度为4～45℃，优选为20～40℃。
在本发明的一个实施方式中，上述制备过程中，阳离子两亲性聚合物与外泌体反应的时间为0.1～240小时，优选为1～10小时。
在本发明的一个实施方式中，上述制备过程中，反应结束后，混合悬液的稀释体积比为10～100000倍，优选为50～1000倍。
在本发明的一个实施方式中，上述制备过程中，稀释后正电性表面外泌体的收集方法为超速离心法，超滤法、沉淀法或切向流超滤法。
其中，超速离心法，超滤法、沉淀法或切向流超滤法采用本领域的常规操作手段即可。
本发明还提供基于阳离子两亲性聚合物构建的正电性表面外泌体。
本发明还提供正电性表面外泌体的用途，所述正电性表面外泌体在制备药物或药物载体中的应用。
所述正电性表面外泌体可以直接用于制备疾病治疗相关的药物，也可以用于制备药物载体。
即，本发明中，所述正电性表面外泌体在疾病治疗、药物递送等领域都有广泛的应用。
本发明首次针对外泌体表面负电性对其在治疗与药物递送过程中造成的生物利用度低的问题提出的优化技术方案。
与现有技术相比，本发明技术方案具有以下优势：
1、本发明技术方案中涉及的阳离子两亲性聚合物可由一些已知的物质通过简单的合成方法制备得到，成本低廉；
2、本发明技术方案中涉及的阳离子两亲性聚合物具有优异的生物相容性，且不会对外泌体的主要理化性能造成不利影响；
3、本发明技术方案中，仅通过阳离子两亲性聚合物与外泌体的简单混合，便可实现表面正电性外泌体的制备，操作简单、技术复杂程度低；
4、采用本发明技术方案制备的表面正电性外泌体可有效跨越生物屏障，在治疗与药物递送过程中，表现出更有效的生物利用度。
附图说明
图1：实施例1所得阳离子两亲性聚合物的核磁共振氢谱。
图2：实施例制备的阳离子两亲性聚合物的细胞毒性评价。
图3：实施例2所得正电性表面间充质干细胞外泌体Zeta电位分析结果。
图4：实施例3中PPD-iMSC-Exos与负电性基质成分作用前后的Zeta电位分析结果。
图5：实施例4中iMSC-Exos粒径分布结果。
图6：实施例4中PPD-iMSC-Exos粒径分布结果。
图7：实施例4中iMSC、iMSC-Exos、PPD-iMSC-Exos免疫印迹分析结果。
图8：实施例4中iMSC-Exos、PPD-iMSC-Exos荧光阳性率分析结果。
图9：实施例4中iMSC-Exos、PPD-iMSC-Exos荧光强度分析结果。
图10：实施例5中iMSC-Exos、PPD-iMSC-Exos在软骨片中的渗透深度结果。
图11：实施例6中未手术组(Sham)、阳性对照组(ACLT+PBS)、iMSC–Exos干预组、PPD-iMSC-Exos干预组对应的关节软骨形态。
图12：实施例6中未手术组(Sham)、阳性对照组(ACLT+PBS)、iMSC–Exos干预组、PPD-iMSC-Exos干预组对应的关节软骨退变情况OARSI评分结果。
图13：实施例7中未手术组(Sham)、造模组(IVDD)、iMSC–Exos干预组、PPD-iMSC-Exos干预组大鼠椎间盘退变情况的Pfirrmann评分结果。
图14：实施例7中未手术组(Sham)、造模组(IVDD)、iMSC–Exos干预组、PPD-iMSC-Exos干预组大鼠椎间盘退变情况的组织学评分结果。
具体实施方式
本发明首先提供一种阳离子两亲性聚合物，其结构如式I所示：
Figure BDA0003138759320000071
式I中，n为10～50间的正整数，优选为23～40；式I中，不同位置处的R独立的选取，可以相同也可以不同。
式I中，R选自H或如式II所示结构。
Figure BDA0003138759320000072
式II中，m为10～1000间的正整数，优选为20～100；式II中，p为8～25间的正整数，优选为10～20；式II中最左端的弯曲线表示该位置是连接到式I中的位置。
本发明还提供阳离子两亲性聚合物的制备方法，所述阳离子两亲性聚合物由ε-聚赖氨酸(ε-PLL)和聚乙二醇修饰磷脂(PEG-lipid)制备得到。
ε-聚赖氨酸的结构式为：
Figure BDA0003138759320000073
式中n为正整数，优选为10～50间的正整数，更优选为23～40间的正整数；
琥珀酰亚胺修饰的PEG-lipid的结构式为：
Figure BDA0003138759320000074
m为10～1000间的正整数，优选为20～100；p为8～25间的正整数，优选为10～20，琥珀酰亚胺修饰的PEG-lipid是以电离盐的形式存在的，其中，Na+、NH4 +表示阳离子。
阳离子两亲性聚合物的制备方法如下：
准确称取一定质量的ε-PLL，充分溶解于水和有机溶剂的混合溶剂中；另外，准确称取一定质量的琥珀酰亚胺修饰的PEG-lipid(NHS-PEG-lipid)溶解于上述有机溶剂中；将溶解有ε-PLL的溶液的pH值调至8.5～9.0。随后，将NHS-PEG-lipid的溶液在搅拌状态下滴加到ε-PLL的溶液中进行反应；反应结束后，用水稀释反应溶液，并将稀释后的溶液进行透析、超滤或切向流超滤，去除未反应的原料；最后，对反应液进行冷冻干燥，得到所述阳离子两亲性聚合物粉末。
上述制备过程中，所述有机溶剂选自N’N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)或二甲基亚砜(DMSO)中的一种，优选为DMSO。上述制备过程中，水和有机溶剂的混合溶剂中，有机溶剂与水的体积比为0.5～2，优选为1。上述制备过程中，称取ε-PLL以及NHS-PEG-lipid的量需要满足：NHS-PEG-lipid与ε-PLL中所含氨基的摩尔数比为1:50～1:1，优选为1:40～1:10。上述制备过程中，反应温度为20～40℃，优选为25℃，反应时间为1～50小时，优选为24小时。上述制备过程中，调节溶液的pH值采用的溶剂是1M的NaOH水溶液。
本发明一个实施方式中进一步提供了基于上述阳离子两亲性聚合物构建正电性表面外泌体的方法，具体制备过程如下：
将所述阳离子两亲性聚合物按照一定质量浓度溶解于生物相容性介质中，并将该溶液与一定颗粒浓度的外泌体悬液混合，得到混合悬液；一定温度下，利用一定方法处理上述混合悬液，使混合悬液中阳离子两亲性聚合物与外泌体充分反应一定时间，随后，利用生物相容性介质对上述混合悬液进行一定比例的稀释后，利用外泌体分离与提取方法收集所制备得到的正电性表面外泌体。
上述制备过程中，所述生物相容性介质选自生理盐水、生理缓冲液或细胞培养基，优选为生理缓冲液；上述制备过程中，所述阳离子两亲性聚合物的溶液与外泌体悬液混合后所得的混合悬液中，阳离子两亲性聚合物的终浓度为0.001g/L～2g/L，优选为0.01g/L～0.4g/L；混合悬液中，外泌体的颗粒浓度为1×107～1×1012个/mL，优选为1×1010～1×1011个/mL。上述制备过程中，处理混合悬液的方法为静置、摇床震荡或超声震荡。上述制备过程中，阳离子两亲性聚合物与外泌体反应的温度为4～45℃，优选为20～40℃。上述制备过程中，阳离子两亲性聚合物与外泌体反应的时间为0.1～240小时，优选为1～10小时。上述制备过程中，反应结束后，混合悬液的稀释体积比为10～100000倍，优选为50～1000倍。上述制备过程中，稀释后正电性表面外泌体的收集方法为超速离心法，超滤法、沉淀法或切向流超滤法。
其中，超速离心法，超滤法、沉淀法或切向流超滤法采用本领域的常规操作手段即可。
本发明还提供基于阳离子两亲性聚合物构建的正电性表面外泌体。所述正电性表面外泌体可以直接用于制备疾病治疗相关的药物，也可以用于制备药物载体。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
25≤n≤35,m＝40,p＝18的阳离子两亲性聚合物的合成与细胞毒性评价
商品化途径获ε-聚赖氨酸(狮王生物科技有限公司，食品级，ε-PLL，25≤n≤35)和琥珀酰亚胺修饰的聚乙二醇-磷脂(西安瑞禧生物科技有限公司，药用级，NHS-PEG-DSPE，m＝4，p＝18，铵盐)。
准确称取200mgε-PLL(1.56mmol氨基)溶解于5mL去离子水中，并加入3mLDMSO。利用1M的NaOH溶液将上述ε-PLL的溶液pH调节至8.5～9.0。准确称取100mg(0.062mmol)的NHS-PEG-DSPE溶解于2mL DMSO中，并滴加到ε-PLL的水/DMSO溶液中，得到反应溶液。反应溶液于25℃下搅拌12小时。随后，用去离子水将反应溶液稀释至50mL，并装入截留分子量为10KDa的透析袋中，用去离子水透析4天，每天更换两次透析液。最后，将透析液体进行冷冻干燥，得到阳离子两亲性聚合物(PPD-1)200mg。核磁共振氢谱表征结果(附图1)显示ε-PLL中4％的氨基接枝有PEG-NHS。此外，通过利用软骨细胞，评估了上述合成的聚合物的细胞毒性。实验结果显示，100μg/mL的PPD-1对细胞没有任何毒副作用(附图2)。
实施例2
正电性表面间充质干细胞外泌体的制备
利用无血清培养基对诱导多能干细胞分化的间充质干细胞(iMSCs)进行培养。当细胞达到60％～70％密度时，更换无血清培养基直至细胞长满培养皿。随后收集细胞培养基，300g离心10分钟去除细胞；2000g离心20分钟去除细胞碎片；过220nm滤膜去除大囊泡；100000g离心70分钟后收取沉淀并用PBS(0.01M，pH 7.4)重悬。随后，再进行一次100000g离心70分钟，1mLPBS重悬获得iMSCs来源的外泌体(iMSC-Exos)悬液。
PBS稀释iMSC-Exos悬液至最终颗粒浓度为2×1010个/mL。另配置0.2g/L实施例1中制备的阳离子两亲性聚合物PPD-1的PBS溶液。将0.5mLiMSC-Exos悬液与0.5mLPPD-1溶液混合，至于2mL圆底离心管中，37℃下摇床震荡1小时。随后，用无菌PBS将反应溶液稀释至100倍，100000g条件下离心70分钟。用PBS重悬离心管底部的表面正电性外泌体(PPD-iMSC-Exos)沉淀。Zeta电位分析结果(附图3)显示修饰后iMSC-Exos的表面电位由-17mV转变为+8.2mV，该结果证实本发明的方法可高效的反转外泌体的表面负电性。
实施例3
PPD-1修饰iMSC-Exos稳定性能评估
实施例2中利用阳离子两亲性聚合物修饰外泌体膜已获得表面正电性的外泌体。然而，细胞外基质和血液中有大量负电性生物大分子的存在，例如透明质酸(HA)、硫酸软骨素和血清蛋白等，这些物质可通过静电作用竞争性的结合实施例1中涉及的修饰聚合物(阳离子两亲性聚合物)，对修饰产生不利影响。
因此，采用本发明方法修饰外泌体后，正电两亲性聚合物结合的稳定性至关重要。
因此，该实施例向实施例2中制备的PPD-iMSC-Exos悬液中加入HA(7.4KDa)或CS(5KDa)，使它们的终浓度维持在10mg/mL，37℃条件下摇床震荡2小时。随后，利用超滤(截留分子量100KDa)方法重新提纯液体中的PPD-iMSC-Exos，测定其Zeta电位并与新鲜制备的PPD-iMSC-Exos进行比对。结果(附图4)显示，PPD-iMSC-Exos与负电性基质成分作用后并无显著变化，证实本发明方法制备的正电性外泌体的表面电位的稳定性。
实施例4
实施例2中制备的PPD-iMSC-Exos理化性能及细胞摄取功能进行表征
对实施例2中制备的PPD-iMSC-Exos的粒径分布和表面特异性蛋白进行表征，并对其软骨细胞摄取能力进行评价，同时将上述评估结果与未修饰的iMSC-Exos进行对比。
利用纳米流式分析仪对PPD-iMSC-Exos的粒径进行分析，结果(附图5、附图6)显示PPD-iMSC-Exos粒径分布情况基本与iMSC-Exos一致，平均粒径稍有增加。免疫印迹分析结果(附图7)显示PPD-iMSC-Exos表面特异性蛋白的表达情况与iMSC-Exos基本一致。上述结果证实本发明涉及的外泌体修饰方法对外泌体的主要理化性能没有影响。
同时，将1×108个/mL荧光染料(DiO)标记的PPD-iMSC-Exos或iMSC-Exos加入到软骨细胞的培养液中，培养12h后，消化细胞，进行流式细胞仪进行荧光阳性率和荧光强度分析。实验结果显示(附图8、附图9)PPD-iMSC-Exos的软骨细胞摄取能力显著优于iMSC-Exos，证实正电性表面外泌体具有更好的细胞摄取效率。
基于上述结果，认为正电性表面外泌体的细胞摄取效率的提高由正电性表面增加了外泌体与细胞接触概率引起，并有利于提高治疗过程中外泌体的生物利用率。
实施例5
表面正电性外泌体的细胞外基质渗透性能评估
本实施例中对实施例2中制备的PPD-iMSC-Exos的细胞外基质渗透性能进行了详细评估。从迷你猪的关节组织样本处获取直径5mm、厚度2mm的新鲜软骨组织片浸泡于PBS中1小时；随后将软骨片至于单向渗透模具中，渗透模具上室加入含1×1010个/mL荧光软料(DiI)标记的PPD-iMSC-Exos或iMSC-Exos，下室加入PBS。上述模具中，上下室由软骨片联通，外泌体只能通过软骨片由上室扩散至下室。渗透48小时后，将软骨片取出，垂直于软骨片表面进行冷冻切片，激光共聚焦显微镜观察外泌体在软骨片中的渗透深度。实验结果(附图10)显示，PPD-iMSC-Exos的软骨渗透深度显著优于iMSC-Exos，证实本发明方法制备的正电性表面外泌体具有更好的细胞外基质渗透能力。
实施例6
表面正电性外泌体干预小鼠骨关节炎效果评估
本实施例中，利用实施例2中制备的PPD-iMSC-Exos，评估其对小鼠骨关节炎软骨退变的治疗效果。首先，通过小鼠膝关节前交叉韧带切除手术(ACLT)进行创伤型骨关节炎造模。造模后一周，通过小鼠膝关节腔注射10μL 1×1010个/mL的PPD-iMSC-Exos或iMSC-Exos进行干预治疗，阳性对照组小鼠膝关节腔注射10μL PBS，每两周注射一次，四周后对所有小鼠实施过量麻醉处死，取各组小鼠膝关节进行番红-固绿染色(S-O staining)，再通过染色结果对关节软骨退变情况进行OARSI评分，综合评价软骨退变程度。实验结果(附图11、附图12)显示，较未手术组(Sham)而言，阳性对照组(ACLT+PBS)中关节软骨缺损明显，软骨厚度明显变薄。在PPD-iMSC-Exos干预后，关节软骨形态较完整，未见明显大段缺损，软骨厚度尚可；而iMSC-Exos干预后，仍存在明显软骨缺损，且软骨厚度明显变薄。结果证实本发明制备的正电荷修饰的iMSC-Exos具有更好的软骨保护及修复作用。
实施例7
表面正电性外泌体干预大鼠椎间盘退变效果评估
本实施例中，利用实施例2中制备的PPD-iMSC-Exos，评估其对大鼠椎间盘退变的治疗效果。首先，通过针刺损伤法进行大鼠椎间盘(Co5/6)退变造模，造模后一周进行椎间隙注射2μL 1×1010个/mL的PPD-iMSC-Exos或iMSC-Exos干预治疗，每两周一次。干预八周后，通过Pfirrmann评分体系及组织学评分对各组大鼠椎间盘退变情况进行综合评估。实验结果(附图13、附图14)显示，较未手术组(Sham)而言，造模组(IVDD)的Pfirrmann评分及组织学评分均显著增高，椎间盘明显退变。应用PPD-iMSC-Exos干预治疗后，Pfirrmann评分及组织学评分均有所降低，表明椎间盘退变情况明显改善；而iMSC-Exos干预组大鼠的椎间盘退变评分较造模组而言，未见显著差异。
上述结果证实本发明制备的正电荷修饰的iMSC-Exos具有更好的椎间盘保护及修复作用。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种基于阳离子两亲性聚合物构建正电性表面外泌体的方法，其特征在于，利用阳离子两亲性聚合物与外泌体在生物相容性溶液中混合得到混合悬液，混合悬液中阳离子两亲性聚合物与外泌体反应；随后，利用生物相容性溶液稀释混合液，提纯获取表面正电性外泌体；
所述阳离子两亲性聚合物的溶液与外泌体悬液混合后所得的混合悬液中，阳离子两亲性聚合物的终浓度为0.001g/L～2g/L，混合悬液中，外泌体的颗粒浓度为1×107～1×1012个/mL；
其中，阳离子两亲性聚合物的结构如式I所示：
Figure FDA0003721023000000011
式I中，n为10～50间的正整数；
式I中，不同位置处的R独立的选取，可以相同也可以不同；
式I中，R选自H或式II所示结构：
Figure FDA0003721023000000012
式II中，m为10～1000间的正整数；
式II中，p为8～25间的正整数；
式II中最左端的弯曲线表示该位置是连接到式I中的位置；
阳离子两亲性聚合物具有自发结合外泌体双层磷脂膜的能力，其结构中的氨基在溶液中能够发生质子化，进而通过静电吸附作用结合外泌体膜表面，并反转外泌体表面负电性；其结构中的PEG-lipid链段通过亲-疏水自组装作用嵌入外泌体的磷脂双层膜结构中，起到增强该聚合物修饰外泌体膜的稳定性。
2.根据权利要求1所述一种基于阳离子两亲性聚合物构建正电性表面外泌体的方法，其特征在于，式I中，n为23～40间的正整数；
式II中，m为20～100间的正整数，式II中，p为10～20间的正整数。
3.根据权利要求1所述一种基于阳离子两亲性聚合物构建正电性表面外泌体的方法，其特征在于，所述阳离子两亲性聚合物的制备方法包括以下步骤：
称取ε-聚赖氨酸，充分溶解于水和有机溶剂的混合溶剂中；
称取琥珀酰亚胺修饰的聚乙二醇-磷脂的钠盐或铵盐(PEG-lipid)溶解于有机溶剂中；
将溶解有ε-聚赖氨酸的溶液的pH值调至8.5～9.0；
将琥珀酰亚胺修饰的PEG-lipid的溶液在搅拌状态下滴加到溶解有ε-聚赖氨酸的溶液中进行反应；
反应结束后，用水稀释反应溶液，去除未反应的原料；
对反应液进行冷冻干燥，得到阳离子两亲性聚合物粉末。
4.根据权利要求3所述一种基于阳离子两亲性聚合物构建正电性表面外泌体的方法，其特征在于，ε-聚赖氨酸的结构式为：
Figure FDA0003721023000000021
式中n为10～50间的正整数；
琥珀酰亚胺修饰的PEG-lipid的结构式为：
Figure FDA0003721023000000022
m为10～1000间的正整数；p为8～25间的正整数。
5.根据权利要求4所述一种基于阳离子两亲性聚合物构建正电性表面外泌体的方法，其特征在于，n为23～40间的正整数；m为20～100间的正整数，p为10～20间的正整数。
6.根据权利要求3所述一种基于阳离子两亲性聚合物构建正电性表面外泌体的方法，其特征在于，所述有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或二甲基亚砜中的一种；
称取ε-聚赖氨酸以及琥珀酰亚胺修饰的PEG-lipid的量需要满足：琥珀酰亚胺修饰的PEG-lipid与ε-聚赖氨酸中所含氨基的摩尔数比为1:50～1:1；
制备过程中，反应温度为20～40℃，反应时间为1～50小时。
7.根据权利要求1所述一种基于阳离子两亲性聚合物构建正电性表面外泌体的方法，其特征在于，所述生物相容性介质选自生理盐水、生理缓冲液或细胞培养基。
8.根据权利要求1所述一种基于阳离子两亲性聚合物构建正电性表面外泌体的方法，其特征在于，阳离子两亲性聚合物与外泌体反应的温度为4～45℃，阳离子两亲性聚合物与外泌体反应的时间为0.1～240小时。
9.根据权利要求1所述一种基于阳离子两亲性聚合物构建正电性表面外泌体的方法，其特征在于，反应结束后，混合悬液的稀释体积比为10～100000倍；
稀释后正电性表面外泌体的收集方法为超速离心法、超滤法、沉淀法或切向流超滤法。
10.一种基于阳离子两亲性聚合物构建的正电性表面外泌体，其特征在于，采用权利要求1的方法制备得到。
11.一种正电性表面外泌体的用途，其特征在于，所述正电性表面外泌体在制备药物或药物载体中的应用；
所述正电性表面外泌体为如权利要求10所述基于阳离子两亲性聚合物构建的正电性表面外泌体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114323863B (zh) * 2021-12-31 2023-12-22 吉林大学 一种外泌体阵列捕获探针的制备方法与应用
CN114702621B (zh) * 2022-04-12 2024-01-30 大连医科大学 一种pH响应无规共聚物及其制备方法、一种外泌体均相分离纯化方法
CN118021941A (zh) * 2022-11-02 2024-05-14 中国科学院生物物理研究所 一种改造的外泌体制剂、其制备方法及应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011231220A (ja) * 2010-04-28 2011-11-17 Univ Of Tokyo エンドソーム脱出機能を有するチャージコンバージョンポリマー含有リン酸カルシウム粒子を含む水性分散組成物、及びその核酸デリバリーへの応用
CN101974152B (zh) * 2010-09-28 2012-07-11 山东大学 一种类脂-阳离子聚合物及其制备方法
CN102634043B (zh) * 2012-04-27 2013-06-26 广州吉家庄生物科技有限公司 一种超分子水凝胶及其制备方法和应用
CN103755965A (zh) * 2013-12-25 2014-04-30 南京工业大学 一种ε-聚赖氨酸水凝胶及其制备方法和应用
US20220287967A1 (en) * 2019-04-18 2022-09-15 The Regents Of The University Of California Exosome mimicking nanovesicles making and biological use
CN112353815B (zh) * 2020-10-27 2024-02-13 华南理工大学 一种具有细胞外囊泡缓释功能的微纳米纤维膜及其制备方法与应用
CN112266483A (zh) * 2020-12-22 2021-01-26 天津力博生物科技有限公司 一种侧链修饰的聚氨基酸及其制备方法和用途

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