JP2011231220A - エンドソーム脱出機能を有するチャージコンバージョンポリマー含有リン酸カルシウム粒子を含む水性分散組成物、及びその核酸デリバリーへの応用 - Google Patents

Abstract

【課題】りん酸カルシウム法の欠点を解消し、簡便かつ効率的な核酸デリバリーを達成する方法を提供する。
【解決手段】ポリエチレングリコール−ポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）ブロックコポリマーの酸性又は塩基性アミノ酸ブロックの側鎖カルボン酸又は１級アミンに、場合によりカチオン性セグメント（Ｓ¹）を介して酸性条件下で脱離するアニオン性セグメント（Ｔ¹）が結合していることを特徴とする、チャージコンバージョンポリマー；少なくとも１種の生物活性物質を担持するチャージコンバージョンポリマー含有リン酸カルシウム粒子を含む水性分散組成物；及びその調製方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規なチャージコンバージョンポリマー、少なくとも１種の生物活性物質を担持する、チャージコンバージョンポリマー含有リン酸カルシウム粒子を含む水性分散組成物、及びその調製方法に関する。また本発明は、細胞内に生物活性物質（特に、ｓｉＲＮＡなどに代表される核酸医薬）を導入するための方法における該水性分散組成物の使用にも関する。

ＲＮＡｉ（RNA interference：ＲＮＡ干渉）を利用した遺伝子機能解析法は、容易にターゲット遺伝子をノックダウンできる手法として注目され、幅広く活用されている。さらに近年では、ターゲット遺伝子と同じ配列を持つｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）などの人工ＲＮＡを生体内へ導入し、ターゲット遺伝子の発現を特異的に抑制することによる分子標的治療法としての応用が期待され、様々な研究がなされている。いずれの場合も、人工ＲＮＡの標的細胞への効率的なデリバリーが必要とされる。

細胞への遺伝子導入法として、リン酸カルシウム法が古くから知られ、核酸医薬デリバリーへの応用も検討されている。古典的なリン酸カルシウム法では、先ずリン酸溶液に核酸物質を含む塩化カルシウム溶液を撹拌しながら加え、核酸−リン酸カルシウムの微細な粒子を形成する。次いでこの溶液を培養細胞に加えることにより、核酸−リン酸カルシウム粒子が細胞内にエンドサイトーシスにより取り込まれる。その大部分はエンドソームを介してリソソームへと送られ代謝されることになるが、一部のフラクションはエンドソームから脱出し、核酸を細胞質、ときには核へと運ぶことが可能となる。しかしながら、リン酸カルシウム粒子は凝集しやすく、細胞や、況してや生体への適用可能な粒径（nmサイズ）を保つのが難しいという欠点がある。

このリン酸カルシウム法の欠点を解消すべく、種々の研究がなされている。例えば、Victoria V. Sokolovaらは、リン酸カルシウムのナノ粒子をコアとして、その表面にＤＮＡを吸着・被覆することにより形成する、多層シェル構造のＤＮＡ−リン酸カルシウム粒子について報告している（例えば、非特許文献１参照）。また、Jun Liらは、ｓｉＲＮＡ−リン酸カルシウムのナノ粒子を形成後、これをリポソームに封入した、脂質コーティングされたｓｉＲＮＡ−リン酸カルシウムのナノ粒子について報告している（例えば、非特許文献２参照）。

本発明者らの研究グループもまた、このリン酸カルシウム法の欠点を解消し、簡便且つ効率的な核酸デリバリーを達成すべく鋭意検討を重ねてきた。例えば、カルシウム／ＤＮＡ及びリン酸／ポリエチレングリコールとポリ（α，β−アスパラギン酸）のブロックコポリマー（以下、「ＰＥＧ−ｂ−ＰＡＡ」という）溶液を混合すると、自己組織化により、リン酸カルシウム、ＤＮＡ及びＰＥＧ−ｂ−ＰＡＡからなるナノ粒子が容易に得られること、ＰＥＧ−ｂ−ＰＡＡのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分がシェルのように働き、リン酸カルシウムの凝集を阻害することを報告している（例えば、非特許文献３、特許文献１参照）。また、別のアプローチとして、ジスルフィド結合が細胞内還元環境で切断されやすいことに着目し、ジスルフィド結合を介して予めＰＥＧ化したｓｉＲＮＡ（ＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ｓｉＲＮＡ）を用い、これとリン酸カルシウムからなるナノ粒子を調製したこと、同様にＰＥＧ部分がシェルのように働き、リン酸カルシウムの凝集を阻害すること、そして細胞内に取り込まれた後、ジスルフィド結合部分の切断により脱ＰＥＧ化されたｓｉＲＮＡが核内へ取り込まれることを報告している（例えば、非特許文献４、特許文献２参照）。

一方、細胞への遺伝子導入法として、非ウイルス性合成ベクターである、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）とカチオン性ポリマーとの複合体（ポリプレックス）を用いるポリフェクション法も知られている。ポリプレックスがエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれた後、エンドソームからの脱出にはそのカチオン性セグメントが重要な役割を果たしていると考えられている。しかしながら、カチオン性セグメントはその正に帯電する性質によって、負に帯電した血清成分と非特異的に相互作用を起こして毛細血管で血栓を形成したり、原形質膜の構造を乱し高い細胞毒性と過剰な免疫応答を誘導するリスクをもたらすという欠点を有することも知られている。そこで本発明者らの研究グループは、ポリプレックスを構成するカチオン性ポリマーに、中性条件下では安定であるが、弱酸性条件下では速やかに脱離するアニオン性構造を組み込んだチャージコンバージョンポリマーを開発し、カチオン性セグメントと共に三元系ポリプレックスを調製することで、高トランスフェクション活性と低毒性の両方の特性を発揮することを報告している（例えば、非特許文献５、特許文献３参照）。

国際公開第０３／０１８６９０号公報 国際公開第２００９／０５７８１２号公報 国際公開第２００９／１３３９６８号公報

Biomaterials 27 (2006) 3147-3153 Journal of Controlled Release 142 (2010) 416-421 Langmuir 18 (2002) 4539-4543 Adv. Mater. 21 (2009) 3520-3525 Angew. Chem. 120 (2008) 5241-5244

本発明は、新規なチャージコンバージョンポリマーを提供する。本発明はまた、少なくとも１種の生物活性物質を担持する、チャージコンバージョンポリマー含有リン酸カルシウム粒子を含む水性分散組成物及びその調製方法を提供する。さらに本発明は、該水性分散組成物を用いる、細胞内に生物活性物質（特に、核酸医薬）を導入するための方法も提供する。

本発明者らは、特定の構造を有するチャージコンバージョンポリマーを生物活性物質（特に、ｓｉＲＮＡなどの核酸医薬）−リン酸カルシウム粒子の形成に用いると、リン酸カルシウム粒子に組み込まれたチャージコンバージョンポリマーが、粒子の凝集を抑制すると同時に、細胞外ではアニオン性ポリマーとして低毒性であるが、細胞へ取り込まれた後のエンドソーム内の弱酸性環境において、カチオン性ポリマーとなることにより（すなわち、チャージコンバージョンにより）エンドソームから細胞質への速やかな移行に寄与することを見出し、本発明を完成させた。本発明は、以下のとおりである。

１．ポリエチレングリコール−ポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）ブロックコポリマーであって、ポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）ブロックの側鎖カルボン酸又は１級アミンに、場合によりカチオン性セグメント（Ｓ¹）を介して、酸性条件下で脱離するアニオン性セグメント（Ｔ¹）が結合していることを特徴とする、チャージコンバージョンポリマー。

２．ポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）ブロックが、ポリリシン、ポリオルニチン、ポリアスパラギン酸又はポリグルタミン酸から選択されるブロックである、上記１記載のポリマー。

３．下記式（Ｉ）：

〔式中、
Ｒ¹及びＲ²の一方は、下記式：

（式中、Ｒは、水素又はＣ_1〜6アルキルであり；Ｌは、ポリエチレングリコールブロックとポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）ブロックとをつなぐリンカーであり、ｏは、ポリエチレングリコールブロックの分子量が２，０００〜２０，０００になるような数である）の基であり、他方は、Ｒ¹の場合、ヒドロキシであるか、又はカルボキシルの保護基であり、Ｒ²の場合、水素であるか、又はアミノの保護基であり；
Ｘは、−ＮＨ−又は−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｓ¹は、カチオン性セグメントであるが、Ｘが−ＮＨ−の場合、単結合であってもよく；
Ｔ¹は、酸性条件下で脱離するアニオン性セグメントであり；そして
ｍは、１〜５であり、ｎは、１０〜２００であり、ｐ、ｑ及びｒは、独立して０又は１であるが、ｐ、ｑ及びｒが同時に０であることはなく、またｑ及びｒが同時に１であることもない〕で表される上記１に記載のポリマー。

４．Ｌが、下記式：

（式中、ｓは、１〜１０である）の２価基から選択される、上記３に記載のポリマー。

５．Ｔ¹が、脂肪族不飽和ジ−又はトリカルボン酸から誘導されるモノアシル基である、上記３に記載のポリマー。

６．式（Ｉａ）：

（式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｘ、Ｓ¹、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒは、上記のとおりであり；Ｒ′は、水素、Ｃ_1〜6アルキル又は−ＣＨ₂ＣＯＯＨである）で表される、上記５に記載のポリマー。

７．Ｘが−Ｃ（Ｏ）−であり；ｒが０である、上記３〜６のいずれかに記載のポリマー。

８．式（Ｉｂ）：

（式中、Ｒ、ｎ及びｏは、上記のとおりであり；Ｓ¹は、カチオン性セグメントであり；Ｒ²は、水素又はアミノ保護基であり；Ｒ′は、水素、Ｃ_1〜6アルキル又は−ＣＨ₂ＣＯＯＨである）で表される、上記７に記載のポリマー。

９．Ｓ¹が、−ＮＨ−（Ｃ_2〜20アルキレン）−ＮＨ−（ここで、前記アルキレン部分は、直鎖状又は分岐鎖状であってよく、１個以上の−ＮＨ−若しくは−Ｎ（Ｃ_1〜6アルキル）−で中断されていてもよい）である、上記７又は８に記載のポリマー。

１０．Ｓ¹が、−（ＮＨ−ＣＨ₂ＣＨ₂）_ｔ−ＮＨ−（ここで、ｔは、１〜５である）である、上記９に記載のポリマー

１１．少なくとも１種の生物活性物質を担持するチャージコンバージョンポリマー含有リン酸カルシウム粒子を含む水性分散組成物の調製方法であって、
（ｉ）カルシウムイオンを含む水性溶液を調製する工程、
（ii）生物活性物質、リン酸イオン、及び上記１〜１０のいずれかに記載のポリマーを含む水性溶液を調製する工程、及び
（iii）溶液（ｉ）を溶液（ii）に一定速度で加える工程
を含む方法。

１２．上記１１に記載の方法により得られる、少なくとも１種の生物活性物質を担持するチャージコンバージョンポリマー含有リン酸カルシウム粒子を含む水性分散組成物。

１３．少なくとも１種の生物活性物質、リン酸イオン、カルシウムイオン、及び上記１〜１０のいずれかに記載のポリマーから構成されるハイブリッド粒子を含む水性分散組成物。

１４．粒子の平均粒径が、１０〜５００nmの範囲である、上記１２又は１３に記載の水性分散組成物。

１５．生物活性物質が、核酸である、上記１２〜１４のいずれかに記載の水性分散組成物。

１６．in vitroで細胞内に生物活性物質を導入するための方法であって、
（ｉ）上記１２〜１５のいずれかに記載の水性分散組成物を標的細胞に添加する工程；
（ii）所与の条件で培養する工程
を含む方法。

１７．in vivoで細胞内に生物活性物質を導入するための方法であって、上記１２〜１５のいずれかに記載の水性分散組成物を、被験対象に投与する工程を含む方法。

１８．上記１２〜１５のいずれかに記載の水性分散組成物を有効成分として含むことを特徴とする、遺伝子研究用又は治療用医薬組成物。

本発明のチャージコンバージョンポリマーは、ポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）ブロックの側鎖カルボン酸又は１級アミンに、場合によりカチオン性セグメント（Ｓ¹）を介して、酸性条件下で脱離するアニオン性セグメント（Ｔ¹）が結合していることを特徴とする。この側鎖末端のアニオン性セグメント（Ｔ¹）により、本発明のチャージコンバージョンポリマーは、通常の生理環境下ではアニオン性ポリマーとして働くので、カチオン性ポリマーに懸念される生体物質との非特異的な相互作用や細胞毒性などのリスクを回避することができる。そして本発明のチャージコンバージョンポリマーは、一旦、エンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれると、酸性環境である後期エンドソーム（リソソーム）内で側鎖末端のアニオン性セグメントが脱離し、カチオン性ポリマーとなる。すなわち、チャージ（電荷）コンバージョンにより、アニオン性ポリマーがエンドソームからの速やかな脱出に有利なカチオン性ポリマーとなる。したがって、本発明のチャージコンバージョンポリマーを生物活性物質（特に、ｓｉＲＮＡ）−リン酸カルシウム粒子の形成に用いると、低毒性で高トランスフェクション活性を奏するハイブリッド粒子を得ることができる。また、ハイブリッド粒子は、水性溶液中で静電的相互作用による自己組織化により、容易にナノサイズで調製することができ、且つそのリン酸カルシウム粒子の凝集もチャージコンバージョンポリマーにより抑制することができる。

本発明に係る、ｓｉＲＮＡを担持するチャージコンバージョンポリマー含有リン酸カルシウム粒子の模式図である。 実施例１で得られたチャージコンバーションポリマー（ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ））の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。 実施例２で得られたチャージコンバーションポリマー（ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ａｃｏ））の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。 比較例１で得られたブロックコポリマー（ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ｃａｒ））の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。 （Ａ）は実施例３；（Ｂ）は実施例４；（Ｃ）は比較例３；そして（Ｄ）は比較例４で調製したｓｉＬｕｃ担持ＣａＰナノ粒子の動的光散乱法による粒径分布を示すヒストグラムである。 ｓｉＲＮＡ担持ＣａＰナノ粒子の調製時にポリマー濃度を変更したときの、流体力学直径（Ａ）及び多分散指数（Ｂ）の評価を示したグラフである。 ｓｉＲＮＡ担持ＣａＰナノ粒子の調製時に、ナノ粒子に封入されたｓｉＲＮＡの割合（パーセンテージ）を示す。 ＰａｎＣ−１細胞を用いたｓｉＶＥＧＦ担持ＣａＰナノ粒子のＣＣＫ−８細胞毒性アッセイの結果を示す。 ＰａｎＣ−１細胞における、Ｃｙ５−ラベルｓｉＧＬ３担持ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）含有ＣａＰナノ粒子を用いた、ｓｉＧＬ３の細胞内動態（エンドソーム脱出）の観察結果を示す。（Ａ）は３時間後、（Ｂ）は２４時間後の共焦点画像を示す。 ＰａｎＣ−１細胞における、Ｃｙ５−ラベルｓｉＧＬ３担持ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ａｃｏ）含有ＣａＰナノ粒子を用いた、ｓｉＧＬ３の細胞内動態（エンドソーム脱出）の観察結果を示す。（Ａ）は３時間後、（Ｂ）は２４時間後の共焦点画像を示す。 ＰａｎＣ−１細胞における、Ｃｙ５−ラベルｓｉＧＬ３担持ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ｃａｒ）含有ＣａＰナノ粒子を用いた、ｓｉＧＬ３の細胞内動態（エンドソーム脱出）の観察結果を示す。（Ａ）は３時間後、（Ｂ）は２４時間後の共焦点画像を示す。 ＰａｎＣ−１細胞における、Ｃｙ５−ラベルｓｉＧＬ３担持ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ含有ＣａＰナノ粒子を用いた、ｓｉＧＬ３の細胞内動態（エンドソーム脱出）の観察結果を示す。（Ａ）は３時間後、（Ｂ）は２４時間後の共焦点画像を示す。 各実施例及び比較例のナノ粒子に細胞を３時間曝し、２４時間後のＰａｎＣ−１細胞におけるＶＥＧＦ遺伝子のノックダウンを示す。

以下に本発明について詳細に説明する。但し、以下に示される本発明の具体的態様は、本発明を説明するために提示されるものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

１．チャージコンバージョンポリマー
本発明のチャージコンバージョンポリマーは、ポリエチレングリコール−ポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）ブロックコポリマーであって、ポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）ブロックの側鎖カルボン酸又は１級アミンに、場合によりカチオン性セグメント（Ｓ¹）を介して、酸性条件下で脱離するアニオン性セグメント（Ｔ¹）が結合していることを特徴とする。ポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）ブロックは、ポリアスパラギン酸ブロック又はポリグルタミン酸などの、側鎖にカルボン酸を有する酸性アミノ酸ブロック、あるいはポリリシン又はポリオルニチンなどの、側鎖に１級アミンを有する塩基性アミノ酸ブロックであるのが好ましく、特にはポリ−α及び／又はβ−アスパラギン酸ブロック、ポリ−γ−グルタミン酸ブロック、ポリ−α−オルニチンブロック、あるいはポリ−α及び／又はε−リシンブロックであるのが好ましい。なお、ポリ（塩基性アミノ酸）ブロックはそれ自体がカチオン性ポリマーの性質を有するため、アニオン性セグメント（Ｔ¹）の結合にカチオン性セグメント（Ｓ¹）を介さなくともよい。すなわち「場合によりカチオン性セグメント（Ｓ¹）を介して」とは、塩基性アミノ酸の場合に、アニオン性セグメント（Ｔ¹）の結合に、カチオン性セグメント（Ｓ¹）を介してもよいが、介さなくともよいことを意味する。ポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）ブロックの重合度（ｎ）は、特に限定されないが、好ましくは約１０〜２００、より好ましくは約２０〜１００である。

具体的に、そのようなポリマーとして、下記式（Ｉ）：

〔式中、
Ｒ¹及びＲ²の一方は、下記式：

（式中、Ｒは、水素又はＣ_1〜6アルキルであり；Ｌは、ポリエチレングリコールブロックとポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）ブロックとをつなぐリンカーであり、ｏは、ポリエチレングリコールブロックの分子量が２，０００〜２０，０００になるような数である）の基であり、他方は、Ｒ¹の場合、ヒドロキシであるか、又はカルボキシルの保護基であり、Ｒ²の場合、水素であるか、又はアミノの保護基であり；
Ｘは、−ＮＨ−又は−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｓ¹は、カチオン性セグメントであるが、Ｘが−ＮＨ−の場合、単結合であってもよく；
Ｔ¹は、酸性条件下で脱離するアニオン性セグメントであり；そして
ｍは、１〜５であり、ｎは、１０〜２００であり、ｐ、ｑ及びｒは、独立して０又は１であるが、ｐ、ｑ及びｒが同時に０であることはなく、またｑ及びｒが同時に１であることもない〕で表されるものが挙げられる。

本発明の式（Ｉ）で表されるポリマーにおいて、［］内に記載された構造式は、ポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）ブロックを構成する繰り返し単位を意味する。一般に酸性アミノ酸は分子内に２個のカルボン酸と１個の１級アミンを有し、塩基性アミノ酸は分子内に２個の１級アミンと１個のカルボン酸を有するため、その繰り返し単位は、単一の構造式からなるホモポリマーである場合（すなわち、ｐ、ｑ及びｒのいずれか一つが１であり、残りの二つが０である場合）と、ペプチド結合とイソペプチド結合が混在する不規則性コポリマーである場合（すなわち、ｐが１であり、ｑ及びｒの一方が０で、他方が１である場合）とがある。前者の例としては、ポリ−α−アスパラギン酸ブロック又はポリ−α−リシンブロック（ｐ＝１、ｑ及びｒ＝０）、ポリ−β−アスパラギン酸ブロック又はポリ−γ−グルタミン酸ブロック（ｑ＝１、ｐ及びｒ＝０）、あるいはポリ−ε−リシンブロック（ｒ＝１、ｐ及びｑ＝０）などが挙げられ、後者の例としては、ポリ−α，β−アスパラギン酸ブロック（ｐ及びｑ＝１、ｒ＝０）などが挙げられる。

なお、本明細書において、他に断りの無い限り、「Ｃ_1〜6アルキル」とは、炭素数１〜６の直鎖状のアルキル（メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ヘキシル等）、あるいは炭素数３〜６の分岐鎖状のアルキル（ｉ−プロピル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル等）又は環状のアルキル（シクロプロピル、シクロヘキシル等）を意味する。

また本明細書における「カルボキシルの保護基」及び「アミノの保護基」は、公知技術、例えばGreene’s Protective Groups in Organic Synthesis, 4^th edition, 2007 by John Wiley & Sons, Inc.に「カルボキシルの保護基」及び「アミノの保護基」として記載されたもの中から、当業者であれば適宜選択することができる。例えば、前者の代表的な例としては、メチル、エチル、ｔ−ブチル、ベンジルなどが挙げられ、後者の代表的な例としては、アセチル、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどが挙げられる。

本発明のチャージコンバージョンポリマーは、先ず、ポリエチレングリコール−ポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）ブロックコポリマーを調製し、次いで、そのポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）ブロックの側鎖カルボン酸又は１級アミンに、場合によりカチオン性セグメント（Ｓ¹）を導入し、続いて酸性条件下で脱離するアニオン性セグメント（Ｔ¹）を導入することにより合成することができる。

ポリエチレングリコール−ポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）ブロックコポリマーの調製は、公知の方法により行うことができる。例えば、市販のＰＥＧ化試薬と市販のポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）の末端官能基（Ｎ末端又はＣ末端）を適宜反応させることにより、調製してもよい。したがって、式（Ｉ）及び（Ｉａ）のポリマーにおいて、Ｒ¹及びＲ²の一方が、下記式：

（式中、Ｒ、Ｌ、及びｏは、上記のとおりである）の基であるとは、ポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）のＮ末端又はＣ末端のいずれか一方がＰＥＧ化されていることを意味し、リンカーＬは、ＰＥＧ化されるポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）の末端官能基（Ｎ末端又はＣ末端）に応じて適宜選択されるＰＥＧ化試薬の反応性基に由来するものであればよい。そのようなＰＥＧ化試薬は、例えば、日油株式会社からSUNBRIGHT（登録商標）の名称で市販されている。具体的にリンカーＬとしては、以下のようなものが挙げられる。

（式中、ｓは、１〜１０である）。エチレングリコール単位の数を表す「ｏ」は、ポリエチレングリコールブロックの分子量が２，０００〜２０，０００になるような数であるが、より好ましくは５，０００〜２０，０００になるような数であり、特に好ましくは、１２，０００〜２０，０００になるような数である。また、Ｒは、水素又はＣ_1〜6アルキルであるが、より好ましくは水素又はメチルである。

また、ポリエチレングリコール−ポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）ブロックコポリマーの調製は、ＰＥＧ化試薬を開始剤として、アミノ酸Ｎ−カルボン酸無水物を用いたアミノ酸ホモポリマーの重縮合により行ってもよい。例えば、下記式（１）：

のブロックコポリマー（以下、「ｍＰＥＧ−ｂ−ＰＢＬＡ」と称する）は、ＰＥＧ化試薬であるα−メトキシ−ω−アミノ−ポリ（エチレングリコール）（以下、「ｍＰＥＧ−ＮＨ₂」と称する）と、β−ベンジル−Ｎ−カルボキシ−Ｌ−アスパラギン酸無水物（以下、「ＢＬＡ−ＮＣＡ」と称する）を用い、公知の方法、例えば特開平８−３１０９７０号公報に記載の方法に従い調製することができる。

次いで、ポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）ブロックの側鎖カルボン酸又は１級アミンに、カチオン性セグメント（Ｓ¹）を導入し、カチオン性ポリマーを調製する。側鎖カルボン酸又は１級アミンが保護されている場合は、カチオン性セグメント（Ｓ¹）を導入するための試薬との反応前に、公知の方法に従い脱保護してもよい。例えば、式（１）のように、ポリ（酸性アミノ酸）ブロックの側鎖カルボン酸がベンジルエステルとして保護されている場合は、カチオン性セグメント（Ｓ¹）を導入するための試薬との反応前に、公知のアルカリ加水分解反応に付して脱保護してもよいが（例えば、特開平８−３１０９７０号参照）、かかる試薬の塩基性度によっては脱保護工程に付す必要はなく、カルボン酸エステルと直接反応させてもよい。

カチオン性セグメント（Ｓ¹）を導入するための試薬としては、２個以上の１級、２級、３級アミノ基、及び／又は４級アンモニウム基と、側鎖カルボン酸又は１級アミンと反応する官能基を含む脂肪族化合物であればよい。例えば、ポリ（酸性アミノ酸）ブロックの側鎖カルボン酸にカチオン性セグメント（Ｓ¹）を導入するための試薬として、好ましくは、Ｈ₂Ｎ−（Ｃ_2〜20アルキレン）−ＮＨ₂（ここで、前記アルキレン部分は、直鎖状又は分岐鎖状であってよく、１個以上の−ＮＨ−若しくは−Ｎ（Ｃ_1〜6アルキル）−で中断されていてもよい）、特には、Ｈ（ＨＮ−ＣＨ₂ＣＨ₂）_ｔ−ＮＨ₂（ここで、ｔは、１〜５である）が挙げられる。具体的には、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴ）、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミンを挙げることができる。

例えば、式（１）のポリエチレングリコール−ポリ（アスパラギン酸）ブロックコポリマーの側鎖カルボン酸又はそのエステルとカチオン性セグメント（Ｓ¹）を導入するための試薬との反応は、公知の方法、例えば特許文献３に記載の方法に従い実施することができる。反応は、過剰量の、例えば、側鎖カルボン酸又はそのエステルに対して１０〜２００当量のカチオン性セグメント（Ｓ¹）を導入するための試薬を使用し、例えば、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの非プロトン性極性溶媒中で実施することができる。

上記反応は、−２０〜１５０℃、好ましくは−１０〜４０℃、より好ましくは０〜２０℃の温度で、１分〜２４時間、好ましくは５分〜２０時間、より好ましくは１０分〜１６時間反応することによって行うことができる。反応は、例えば希酢酸（例えば、１０％酢酸）を反応系に滴下することにより、停止させることができる。

なお、本反応では、エステル基のアルカリ加水分解反応で、あるいはカチオン性セグメント（Ｓ¹）を導入するための試薬との反応により、ポリアスパラギン酸の一部がβ−アミド化することが知られている（例えば、特開平８−３１０９７０号参照）。したがって、上記式（１）のｍＰＥＧ−ｂ−ＰＢＬＡと、ＤＥＴとの反応により得られるカチオン性ポリマー（以下、「ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）」と称する）は、下記式（２ａ）：

で表されるように、α−位のアミノ基とα−位のカルボキシ基との反応により得られる一般的なペプチド構造単位に加えて、α−位のアミノ基とβ−位のカルボキシ基との反応により得られるイソペプチド様構造単位を不規則に含むものとなる。

続いて、酸性条件下で脱離するアニオン性セグメント（Ｔ¹）を、カチオン性ポリマーの側鎖末端に導入し、本発明のチャージコンバージョンポリマーを得る。なお上述のように、ポリ（塩基性アミノ酸）ブロックの場合、その側鎖１級アミンによりそれ自体がカチオン性ポリマーの性質を有するため、上述のカチオン性セグメント（Ｓ¹）を導入する工程を経ずに、直接、アニオン性セグメント（Ｔ¹）を導入し、本発明のチャージコンバージョンポリマーを得てもよい。アニオン性セグメント（Ｔ¹）を導入するための試薬としては、脂肪族不飽和ジ−又はトリカルボン酸であればよく、具体的には、マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸、cis−若しくはtrans−アコニット酸、又はそれらの無水物など、特には、マレイン酸、シトラコン酸、cis−アコニット酸又はそれらの無水物を挙げることができる。

具体的に、そのようなポリマーとして、下記式（Ｉａ）：

（式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｘ、Ｓ¹、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒは、上記のとおりであり；Ｒ′は、水素、Ｃ_1〜6アルキル又は−ＣＨ₂ＣＯＯＨである）で表されるものが挙げられる。

カチオン性ポリマーと、脂肪族不飽和ジ−又はトリカルボン酸の無水物又はその他の活性エステル体との反応は、ピリジンや炭酸水素ナトリウム溶液などの塩基性溶媒中で実施することができる。反応は、過剰量の、例えば、カチオン性ポリマーの１級アミノ基に対して２０〜２００当量のアニオン性セグメント（Ｔ¹）を導入するための試薬を使用し、−２０〜１５０℃、好ましくは−１０〜４０℃、より好ましくは０〜２０℃の温度で、１分〜２４時間、好ましくは５分〜２０時間、より好ましくは１０分〜１６時間反応することによって行うことができる。

例えば、式（Ｉｂ）：

（式中、Ｒ、ｎ及びｏは、上記のとおりであり；Ｓ¹は、カチオン性セグメントであり；Ｒ²は、水素又はアミノ保護基であり；Ｒ′は、水素、Ｃ_1〜6アルキル又は−ＣＨ₂ＣＯＯＨである）で表されるポリマーの具体的態様として、上記式（２ａ）のｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）と、cis−アコニット酸無水物との反応により、下記式（３ａ）：

で表されるチャージコンバージョンポリマー（以下、「ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）」と称する）が得られる。

２．チャージコンバージョンポリマー含有リン酸カルシウム粒子
本発明のチャージコンバージョンポリマーは、少なくとも１種の生物活性物質、リン酸イオン、及びカルシウムイオンと水溶液中で混合することにより、静電的相互作用による自己組織化により、水中に分散するナノサイズのハイブリッド粒子を調製することができる（図１参照）。すなわち、少なくとも１種の生物活性物質を担持するチャージコンバージョンポリマー含有リン酸カルシウム粒子を含む水性分散組成物は、
（ｉ）カルシウムイオンを含む水性溶液を調製する工程、
（ii）生物活性物質、リン酸イオン、及び本発明のチャージコンバージョンポリマー（以下、「ＣＣＰ」と略す）を含む水性溶液を調製する工程、及び
（iii）溶液（ｉ）を溶液（ii）に一定速度で加える工程
を含む方法により調製することができる。

工程（ｉ）のカルシウムイオンを含む水性溶液の調製は、市販の塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂）又はその水溶液を、水、あるいはＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ又はＢＥＳなどの緩衝液により、適宜、所望の濃度（例えば、約０．０１〜０．５Ｍ）及びｐＨ（例えば、約７．５〜１０）となるよう希釈すればよく、特に限定はない。

工程（ii）の生物活性物質、リン酸イオン、及びＣＣＰを含む水性溶液の調製は、所望の濃度の生物活性物質、ＣＣＰ、及びリン酸一水素二ナトリウム（Ｎａ₂ＨＰＯ₄）、リン酸ナトリウム（Ｎａ₃ＰＯ₄）などのリン酸イオン（ＰＯ₄ ^3-）の供給源を、水、あるいはＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ又はＢＥＳなどの緩衝液により、適宜、所望の濃度及びｐＨ（例えば、約７．５〜１０）となるよう希釈すればよく、特に限定はない。工程（ii）の水性溶液中、生物活性物質、ＣＣＰ、及びＰＯ₄ ^3-の所望の濃度は、工程（ｉ）の水性溶液中のカルシウムイオン（Ｃａ^2-）の濃度に応じて、適宜調製すればよいが、生物活性物質の濃度としては約０．１〜２０μＭ、ＣＣＰの濃度としては約１０〜３０００μg／mL、及びＰＯ₄ ^3-の濃度としては約０．０１〜５ｍＭを挙げることができる。

カルシウムイオンとリン酸イオンの含有割合は、両者が反応してリン酸カルシウム〔Ｃａ₃（ＰＯ₄）₂、但し、本明細書における「リン酸カルシウム」は、ヒドロキシアパタイトＣａ₁₀（ＯＨ）₂（ＰＯ₄）₆を含んでいてもよい〕を生成するのに必要な当量より、カルシウムイオンが過剰量で存在することが好ましい。具体的には、Ｃａ^2-対ＰＯ₄ ^3-は、モル濃度で、１〜１０００対１、好ましくは５０〜５００対１、より好ましくは２００〜４００対１であることが好ましい。このような割合でカルシウムイオンとリン酸イオンが存在すると、これらとＣＣＰとが都合よく相互作用しうる。

また、ＣＣＰの含有割合は、特に限定されるものでないが、具体的には、Ｃａ^2-（１mol）に対し、ＣＣＰ０．１〜１０g、好ましくは０．５〜５gであることが好ましい。生物活性物質の含有割合もまた、特に限定されるものでないが、具体的には、Ｃａ^2-（１mol）に対し、生物活性物質０．１〜１０００μmol、好ましくは１〜３００μmolであることが好ましい。しかし、上述の濃度及び割合を超える範囲で各成分を用いても、本発明の目的に沿う水性分散組成物を提供できる。

本発明の水性分散組成物は、溶液（ｉ）を溶液（ii）に一定速度で加えることにより調製することができる。このような簡便な方法により、水性溶液中で静電的相互作用による自己組織化が起こり、平均粒径が１〜１０００nm、好ましくは１０〜５００nm、より好ましくは２０〜２００nmの範囲にある、少なくとも１種の生物活性物質、リン酸イオン、カルシウムイオン、及び請求項１〜８のいずれかに記載のポリマーから構成されるハイブリッド粒子を含む水性分散組成物が得られる。なお、ここでいう平均粒径とは、動的光散乱法により得られる流体力学直径を意味する。

本発明により得られるハイブリッド粒子は、少なくとも１種の生物活性物質を担持する。ここで、生物活性物質としては、好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸（医薬）；タンパク質；抗がん剤、造影剤などの低分子化合物が挙げられる。本発明のチャージコンバージョンポリマー含有リン酸カルシウム粒子は、特にｓｉＲＮＡのような重合度の低いオリゴヌクレオチドを担持するのに好適である。

本発明の水性分散組成は、in vivo又はin vitroで被験対象に投与することにより、細胞に効率よく取り込まれる。そのようにして取り込まれたハイブリッド粒子は、通常、カルシウムイオン濃度の低い細胞内で徐々に崩壊すると共に、チャージコンバージョンポリマーがエンドソーム内の弱酸性環境において、カチオン性ポリマーとなることにより（すなわち、チャージコンバージョンにより）エンドソームから細胞質への速やかに脱出し、細胞質で放出された生物活性物質が核内へ移行することにより、所望のトランスフェクションが達成される。したがって、本発明の水性分散組成物は、遺伝子研究用の組成物として、あるいは治療用の医薬組成物として有用である。この際、本発明の水性分散組成物は、例えば、凍結乾燥法により乾燥形態にすることもできる。このような乾燥形態の組成物は水性媒体で、再度、安定な水分散体に構成することもできる。また、乾燥形態のまま、必要により他の結合剤等を用いて、他の形態の製剤に調製してもよい。

以下で使用いたＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）及びcis−アコニット酸無水物はSigma社から；β−ベンジル−Ｎ−カルボキシ−Ｌ−アスパラギン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）は日油株式会社から；エチレンジアミン（１，２−ジアミノメタン）及びジエチレントリアミン（ビス（２−アミノエチル）アミン）は東京化成工業株式会社；そして酢酸及び塩酸は和光純薬工業株式会社から購入した。

［合成例１］
ポリ（エチレングリコール）−ポリ（２−［（２−アミノエチル）アミノ］エチルアスパルトアミド）：ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）（２ａ）の合成：

特開平８−３１０９７０号公報に開示された方法に従い、α−メトキシ−ω−アミノ−ポリ（エチレングリコール）（ｍＰＥＧ−ＮＨ₂、ＭＷ：１２，０００）を開始剤として、β−ベンジル−Ｎ−カルボキシ−Ｌ−アスパラギン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）を開環重合させ、上記式（１）で表されるポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（ｍＰＥＧ−ｂ−ＰＢＬＡ）を得た。ｍＰＥＧ−ｂ−ＰＢＬＡ中の「ＰＢＬＡ」単位の重合度は、¹Ｈ−ＮＭＲ測定によると９６であった。
次いで、ChemMedChem 1 (2006) 439-444に記載の方法に従い、ｍＰＥＧ−ｂ−ＰＢＬＡをＮＭＰに氷浴中で溶解し、同容量のＮＭＰで希釈したジエチレントリアミン（ＤＥＴ、ＰＢＬＡセグメントのベンジル基に対して１００当量）を加え、０℃（氷浴）で４時間撹拌しながら反応させた。反応を、冷１０％酢酸を少しずつ加えて停止させた（溶液の容量の２倍）。中和溶液を０．０１Ｍ塩酸溶液（×３）及び蒸留水（×３）に対して４℃で透析した。凍結乾燥後、透析した溶液から白色粉末を得た。得られたｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）は、単峰型分子量分布かつＰＢＬＡからｐＡｓｐ（ＤＥＴ）へほぼ１００％変換したことが、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）及び¹Ｈ−ＮＭＲ測定によりそれぞれ確認された。

［合成例２］
ポリ（エチレングリコール）−ポリ［（２−アミノエチル）アスパルトアミド］：ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＥＤＡ）（２ｂ）の合成：

ChemMedChem 1 (2006) 439-444に記載の方法に従い、合成例１で得られたｍＰＥＧ−ｂ−ＰＢＬＡをＮＭＰに氷浴中で溶解し、同容量のＮＭＰで希釈したエチレンジアミン（ＥＤＡ、ＰＢＬＡセグメントのベンジル基に対して５０当量）を加え、０℃（氷浴）で２時間撹拌しながら反応させた。反応を、冷１０％酢酸を少しずつ加えて停止させた（溶液の容量の２倍）。中和溶液を０．０１Ｍ塩酸溶液（×３）及び蒸留水（×３）に対して４℃で透析した。凍結乾燥後、透析した溶液から白色粉末を得た。得られたｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＥＤＡ）は、単峰型分子量分布かつＰＢＬＡからｐＡｓｐ（ＥＤＡ）へほぼ１００％変換したことが、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）及び¹Ｈ−ＮＭＲ測定によりそれぞれ確認された。

［実施例１］
ポリ（エチレングリコール）−ポリ（２−［（［Ｎ’−cis−アコニチル］−２−アミノエチル）アミノエチル］アスパルトアミド）：ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）（３ａ）の合成：

（式中、ａ〜ｉは、図２の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル中に付された符号に対応する。）

ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）（１級アミノの０．５３８mmol）をピリジン（２ml）に溶解した。cis−アコニット酸無水物（Ａｃｏ：２．６９２mmol）を溶液にゆっくり加え、０℃で２時間撹拌した。反応混合物をアミコンウルトラ（ＭＷＣＯ＝１０，０００；ミリポア社製）（０．５Ｍ ＮａＨＣＯ₃（ｐＨ９．１）で×３、蒸留水で×３）で精製した。凍結乾燥後、最終生成物を白色粉末として得た。¹Ｈ−ＮＭＲから計算した変換収率は、９９％超であった。¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２に示す。

［実施例２］
ポリ（エチレングリコール）−ポリ［（［Ｎ’−cis−アコニチル］−２−アミノエチル）アスパルトアミド］：ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ａｃｏ）（３ｂ）の合成：

（式中、ａ〜ｇは、図３の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル中に付された符号に対応する。）

ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＥＤＡ）（１級アミノの０．１１mmol）を０．５Ｍ ＮａＨＣＯ₃（ｐＨ９．１）（５０ml）に溶解した。cis−アコニット酸無水物（Ａｃｏ：５．５mmol）を溶液にゆっくり加え、０℃で２時間撹拌した。反応混合物をアミコンウルトラ（ＭＷＣＯ＝１０，０００；ミリポア社製）（冷蒸留水で×３）で精製した。凍結乾燥後、最終生成物を白色粉末として得た。¹Ｈ−ＮＭＲから計算した変換収率は、９９％超であった。¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３に示す。

［比較例１］
ポリ（エチレングリコール）−ポリ（２−［（［Ｎ’−カルバリリル］−２−アミノエチル）アミノエチル］アスパルトアミド）：ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ｃａｒ）（３ｃ）の合成：

（式中、ａ〜ｊは、図４の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル中に付された符号に対応する。）

ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）（１級アミノの０．５３８mmol）を０．５Ｍ ＮａＨＣＯ₃（ｐＨ９．１）（５０ml）に溶解した。カルバリル酸無水物（Ｃａｒ：２．７mmol）を溶液にゆっくり加え、０℃で２時間撹拌した。反応混合物をアミコンウルトラ（ＭＷＣＯ＝１０，０００；ミリポア社製）（冷蒸留水で×３）で精製した。凍結乾燥後、最終生成物を白色粉末として得た。¹Ｈ−ＮＭＲから計算した変換収率は、９９％超であった。
¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図４に示す。

［比較例２］
ポリ（エチレングリコール）−ポリ［アスパラギン酸］：ｍＰＥＧ−ＰＡＡの合成

合成例１で得られたｍＰＥＧ−ｂ−ＰＢＬＡ（０．０６mmol）をアセトニトリル（１．５ml）に溶解した。０．５Ｎ 水酸化ナトリウム（ＰＢＬＡセグメントのベンジル基に対して５０当量）を加え、室温で１時間撹拌しながら反応させた。溶液を蒸留水（×３）に対して透析した。透析した溶液の凍結乾燥後、白色粉末を得た。得られたｍＰＥＧ−ＰＡＡは、単峰型の分子量分布かつＰＢＬＡからＰＡＡへ９９％超で変換したことが、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）及び¹Ｈ−ＮＭＲ測定によりそれぞれ確認された。

［実施例３〜６／比較例３〜６］
ｓｉＲＮＡ担持リン酸カルシウム（ＣａＰ）ナノ粒子の調製（ＰＥＧ−ＣＣＰ／リン酸カルシウム粒子の調製とｓｉＲＮＡの封入）
２．５Ｍ ＣａＣｌ_２溶液１μLを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）１１．５μLで希釈した（第１溶液、１２．５μL）。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．７）で希釈した、実施例１又は２で得られたチャージコンバージョンポリマー（ＣＣＰ）あるいは比較例１又は２で得られたアニオンブロックコポリマー（１０００μg／mL〜１６８０μg／mL）を含む溶液を、１５μＭ ｓｉＲＮＡ溶液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．２）中）および、１．５ｍＭ Ｎａ_３ＰＯ_４および１４０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．５）と混合した（第２溶液、１２．５μL〜１３μL）。第１溶液を一定速度で約２０秒かけてピペットで第２溶液と混合し、ｓｉＲＮＡ担持ＣａＰナノ粒子の溶液を調製した。第１溶液及び第２溶液において、各々の使用したブロックコポリマー及びｓｉＲＮＡの種類と具体的な使用量を下記の表１に示す。

ｓｉＲＮＡは以下の配列のＧＬ３ルシフェラーゼまたはヒトＶＥＧＦに対するｓｉＲＮＡを用いた。核酸については全て北海道システムサイエンス社製（ＨＰＬＣ精製グレード）に委託合成して入手した。

ｓｉＧＬ３（またはｓｉＬｕｃと表記）の配列（ＧＬ３に対するｓｉＲＮＡを意味する）
ＧＬ３センス鎖(配列番号１)：5’-CUUACGCUGAGUACUUCGATT-3’
ＧＬ３アンチセンス鎖(配列番号２)：5’-UCGAAGUACUCAGCGUAAGTT-3’

ｓｉＶＥＧＦの配列（ＶＥＧＦに対するｓｉＲＮＡを意味する）
ヒトＶＥＧＦセンス鎖（配列番号３）：5’-GGAGUACCCUGAUGAGAUCTT-3’
ヒトＶＥＧＦアンチセンス鎖（配列番号４）：5’-GAUCUCAUCAGGGUACUCCTT-3’

［試験例１］
ｓｉＲＮＡ担持ＣａＰナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）による粒径測定
上記実施例３、４及び比較例３、４で得られたｓｉＬｕｃ担持ＣａＰナノ粒子の流体力学直径および多分散指数（ＰｄＩ）の決定のために、動的光散乱（ＤＬＳ）測定を２５℃でZetasizer Nano ZS（Malvern Instruments, UK）を用いて、１７３°の検出角度で行った。Ｈｅ-Ｎｅイオンレーザー（６３３nm）を入射ビームとして使用した。得られた散乱光の光子相関関数の減衰速度に対するキュムラント解析により、ミセルの拡散係数および多分散指数（μ₂/Γ²)を得た。さらに、ナノ粒子を球体と仮定してストークス・アインシュタインの式を用いることにより、得られた拡散係数を流体力学直径へと変換した。一方、得られたデータのヒストグラム解析を行うことで、粒子径の散乱光強度分布を得た。

〔結果〕
図５（Ａ）〜（Ｄ）に示す通り、実施例３、４及び比較例３、４で得られた、４種類のポリアニオンブロックコポリマーを用いて調製したｓｉＬｕｃ担持ＣａＰナノ粒子は、全て単峰性のピークを示した。平均粒子径は多少ブロックコポリマーの種類によって異なったが、チャージコンバージョンポリマーを用いた場合は約６０ｎｍとなることが確認された。また、多分散指数においては約０．１となり、非常に均一であることも確認された（図５（Ａ）及び（Ｂ））。

［試験例２］
ｓｉＲＮＡ担持ＣａＰナノ粒子の調製におけるポリマー濃度の影響
上記実施例３、４及び比較例３におけるｓｉＬｕｃ担持ＣａＰナノ粒子の調製を、ポリマー濃度を６００μg/mL〜３０００μg/mLと変化させた以外は同様に行い、得られたナノ粒子を試験例１と同様に測定し、ポリマー濃度がナノ粒子の流体力学直径および多分散指数（ＰｄＩ）に与える影響を調べた。

〔結果〕
図６（Ａ）及び（Ｂ）に示すとおり、低濃度でポリマーを添加した場合はマイクロメートルオーダーの粒子径かつ多分散指数の大きい不均一な粒子形成が見られた。一方、ポリマー濃度８００μg/mL以上ではそれぞれのブロックコポリマーに対してナノメートルオーダーの粒子径かつ多分散指数の小さい均一な粒子形成が確認された。

［試験例３］
ｓｉＲＮＡ担持ＣａＰナノ粒子におけるｓｉＲＮＡ封入率の算出
上記実施例３、４及び比較例３におけるｓｉＬｕｃ担持ＣａＰナノ粒子の調製を、ポリマー濃度を６００μg/mL〜３０００μg/mLと変化させた以外は同様に行い、得られたｓｉＬｕｃ担持ＣａＰナノ粒子溶液を１５，０００ｘｇ、３０分間遠心し、ナノ粒子を沈殿させた。上清を注意深く取り、上清の２６０nmの吸収を分光光度計で測定することにより上清中のｓｉＬｕｃの濃度を決定した。ナノ粒子に取り込まれたｓｉＬｕｃのパーセンテージを、ナノ粒子の調製時に添加したｓｉＲＮＡの濃度、すなわち遠心前の濃度と遠心後の上清中のｓｉＲＮＡの濃度の比から算出した。

〔結果〕
図７に示すとおり、ポリマー濃度が６００〜１５００μg/mLの範囲では、使用したｓｉＬｕｃのうち約８０％がナノ粒子と複合体を形成した。一方、高濃度のポリマーを添加した範囲（３０００μg/mL）では、ｓｉＬｕｃの封入率が少し低下し、約７０％となった。

［試験例４］
細胞毒性試験
細胞毒性試験のために、ＰａｎＣ−１（すい臓がん細胞、ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ：ＣＲＬ−１４６９）を９６ウェルプレートに５×１０^３細胞／ウェルで播き、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地中で２日間培養した。その後、最終濃度が１０ｎＭ〜１５００ｎＭ となるように、実施例５、６及び比較例５で得られたｓｉＶＥＧＦ含有ＰＥＧ−ＣＣＰ／ＣａＰナノ粒子の溶液１０μLを１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地９０μLと共に加え、４８時間後の生細胞数をCell Counting Kit-8（Dojindo, Kumamoto, Japan）を用いることで計数した。キット溶液を１０μL／ウェルとなるように添加し、３７℃で２時間静置後、各ウェルをマイクロプレートリーダー（BioRad Model 680, Bio-Rad Laboratories, United Kingdom）で４５０nmの吸収を読み取ることによって測定した。結果を、培養培地のみで培養したコントロール細胞の生細胞数を１００としてパーセンテージ（％）で表した。

〔結果〕
図８に示すとおり、１５００ｎＭ ｓｉＶＥＧＦを用いてもナノ粒子は細胞に毒性を示さなかった。

［試験例５］
蛍光ラベルｓｉＲＮＡ担持ＣａＰナノ粒子を用いた細胞内動態観察
ＰａｎＣ−１細胞を５ｘ１０^４細胞／ディシュで３５−mmガラスベースディシュ（Iwaki, Japan）に播いた。１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地１mL／ディシュ中で２４時間培養後、培地を交換し、Ｃｙ５−ラベルｓｉＧＬ３担持ナノ粒子溶液１２０μLを培地１mLに加えた（１００ｎＭ ｓｉＧＬ３）。ナノ粒子添加後３および２４時間に、細胞をＰＢＳで３回すすぎ、培地を加え、共焦点画像の取り込みをおこなった。画像取り込み前に、核をHoechst 33342（Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan）で１０分間染色し、エンドソーム／リソソームをLysoTracker Green（Molecular Probes, Eugene, OR, USA）で３０分間染色した。

共焦点画像の取り込みは、液浸プランアポクロマート６３ｘ対物レンズ（開口数１．２、Zeiss）を備えたZeiss LSM 510 METAレーザー走査顕微鏡（Carl Zeiss, Jena, Germany）を用いた。LysoTracker、Ｃｙ５およびHoechst33342のための励起波長は、それぞれ４８８nm（アルゴンレーザー）、６３３nm（Ｈｅ−Ｎｅレーザー）および７１０nm（Mai Taiレーザー、２光子モードで操作される）である。

Ｃｙ５ラベル化ｓｉＧＬ３は、北海道システムサイエンスへの委託合成により得た。なお、各Ｃｙ５−ラベルｓｉＧＬ３担持ナノ粒子溶液の調製は、実施例３、４及び比較例３、４において、ｓｉＬｕｃに代えてＣｙ５−ラベルｓｉＧＬ３を用いた以外は同様に行った。

〔結果〕
図９に、Ｃｙ５−ラベルｓｉＧＬ３担持ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）／ＣａＰナノ粒子を用いた例；図１０に、Ｃｙ５−ラベルｓｉＧＬ３担持ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ａｃｏ）／ＣａＰナノ粒子を用いた例；図１１に、Ｃｙ５−ラベルｓｉＧＬ３担持ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ｃａｒ）／ＣａＰナノ粒子を用いた例；そして図１２に、Ｃｙ５−ラベルｓｉＧＬ３担持ｍＰＥＧ−ＰＡＡ／ＣａＰナノ粒子を用いた例を示す。また各（Ａ）は３時間後、各（Ｂ）は２４時間後の共焦点画像を示す。

図９（Ａ）及び（Ｂ）に示すとおり、３および２４時間ともに、緑で示すエンドソーム内に、Ｃｙ５−ｓｉＧＬ３の赤が無い、すなわち両者のマージの結果観察される黄色で示される領域が見られないことから、３時間でエンドソームからＣｙ５−ｓｉＧＬ３が脱出していることがわかる。

図１０（Ａ）に示すとおり、緑で示すエンドソーム内に、赤で示すＣｙ５−ｓｉＧＬ３の存在を示す黄色がほとんど存在しないことから、３時間で大部分のＣｙ５−ｓｉＧＬ３がエンドソームから脱出したことがわかる。また図１０（Ｂ）から、２４時間後にも同様に、Ｃｙ５−ｓｉＧＬ３を示す赤とエンドソームを示す緑が見て取れることからＣｙ５−ｓｉＧＬ３がエンドソームから脱出していることがわかる。

図１１（Ａ）に示すとおり、エンドソーム内に、Ｃｙ５−ｓｉＧＬ３が存在することを示す黄色が見て取れることから、３時間ではまだＣｙ５−ｓｉＧＬ３がエンドソームから脱出していないことがわかる。また図１１（Ｂ）から、２４時間後には、Ｃｙ５−ｓｉＧＬ３を示す赤とエンドソームを示す緑が見て取れることからＣｙ５−ｓｉＧＬ３がエンドソームから脱出していることがわかる。

図１２（Ａ）に示すとおり、エンドソーム内に、Ｃｙ５−ｓｉＧＬ３が存在することを示す黄色が見て取れることから、３時間ではまだＣｙ５−ｓｉＧＬ３がエンドソームから脱出していないことがわかる。また図１２（Ｂ）から、２４時間後でも、黄色が一部認められることからＣｙ５−ｓｉＧＬ３がエンドソームから完全には脱出していないことがわかる。

［試験例６］
遺伝子ノックダウン（リアルタイムＰＣＲ）
ＰａｎＣ−１細胞を８ｘ１０^４細胞／ウェルで６ウェルプレートに播いた。１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地１mL／ウェル中で２４時間培養後、培地を交換し、実施例３〜６及び比較例３〜６で得られたナノ粒子溶液１２０μLを培地１mLに加えた（６０ｎＭ ｓｉＲＮＡ）。３時間細胞をナノ粒子に曝した後、新たな培地に交換した。２４時間後、細胞をトリプシン処理で剥がし回収した（ｎ＝９）。

細胞のＲＮＡをRNeasy Mini Kit（Qiagen, Valencia, CA, USA）を用い、製造者の指示に従って抽出した。ｃＤＮＡ合成（QuantiTect Reverse Transcription, Qiagen, Valencia, CA, USA）を実施する前に、抽出したＲＮＡ量を測定し、検体間でのＲＮＡ濃度を一定値に揃えた。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲをABI 7500 Fast Real-time RT-PCR System（Applied Biosystems, Foster City, CA）とQuantiTect SYBR Green PCR Master Mix（Qiagen, Valencia, CA, USA）を用いて実施した。Ｎ＝９で実施した。アクチン遺伝子をハウスキーパーとして使用し、データを統計解析前に正規化した。

統計処理は、分散分析(ANOVA)を処理効果を検査するために行い、ソフトウェアGraphPad Prisma 3.0 (GraphPad Software, Inc.)を用いて、Bonferroni'sテストを各処理群間の事後対比較として使用した。統計的有意性をp<0.05に対して*および**で表した。結果を平均値(± SEM)として表した。

ゲノムＤＮＡ除去の後、１４μLのＲＮＡ溶液を１μLのQuantiscript Reverse Transcriptase、４μLのQuantiscript RT Buffer、１μLのRT Primer Mixと混合し、合計２０μL（ＲＮＡ濃度８３．３ng/mL)にした。その後、４２℃で３０分インキュベーションしてから９５℃で３分インキュベーションした。

ｃＤＮＡ合成の後、リアルタイムＰＣＲをQIAGEN QuantiTect SYBR Green PCRキットを用いて行った。詳細には、１２．５μLの２×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix、１μLのフォワードプライマー（１０μＭ）、１μLのリバースプライマー（１０μＭ）、８．５μLのRNaseフリー水を添加した９６穴プレートに対して、２μLのｃＤＮＡ溶液を添加し、合計２５μLとして以下のＰＣＲサイクルを行った。５０℃で２分、９５℃で１５分の活性化プロセスを１回行い、続いて９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で３８秒のサイクルを４０回行い、最後に９５℃で１５秒、６０℃で１分、９５℃で１５秒という解離プロセスを１回行った。

ヒトＶＥＧＦフォワード(配列番号５)：5’-AGTGGTCCCAGGCTGCAC-3’、
ヒトＶＥＧＦリバース(配列番号６)：5’-TCCATGAACTTCACCACTTCGT-3’

ヒトアクチンフォワード(配列番号７)：5’-CCAACCGCGAGAAGATGA-3’、
ヒトアクチンリバース(配列番号８)：5’-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3’

〔結果〕
図１３に結果を示す。
ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）−ｓｉＬｕｃは、実施例３で調製した、ｓｉＬｕｃ担持ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）／ＣａＰナノ粒子をトランスフェクションした細胞のＶＥＧＦのｍＲＮＡを測定した。ＶＥＧＦの発現は抑制されなかった。一方ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）−ｓｉＶＥＧＦは、実施例５で調製した、ｓｉＶＥＧＦ担持ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ａｃｏ）／ＣａＰナノ粒子をトランスフェクションした細胞のＶＥＧＦのｍＲＮＡを測定した。ＶＥＧＦの発現が２０％以下まで抑制された。

ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ｃａｒ）−ｓｉＬｕｃは、比較例３で調製した、ｓｉＬｕｃ担持ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ｃａｒ）／ＣａＰナノ粒子をトランスフェクションした細胞のＶＥＧＦのｍＲＮＡを測定した。ＶＥＧＦの発現は抑制されなかった。一方ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ｃａｒ）−ｓｉＶＥＧＦは、比較例５で調製した、ｓｉＶＥＧＦ担持ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−Ｃａｒ）／ＣａＰナノ粒子をトランスフェクションした細胞のＶＥＧＦのｍＲＮＡを測定した。ＶＥＧＦの発現が約５０％まで抑制された。

ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ａｃｏ）−ｓｉＬｕｃは、実施例４で調製した、ｓｉＬｕｃ担持ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ａｃｏ）／ＣａＰナノ粒子をトランスフェクションした細胞のＶＥＧＦのｍＲＮＡを測定した。ＶＥＧＦの発現は抑制されなかった。一方ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ａｃｏ）−ｓｉＶＥＧＦは、実施例６で調製した、ｓｉＶＥＧＦ担持ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＥＤＡ−Ａｃｏ）／ＣａＰナノ粒子をトランスフェクションした細胞のＶＥＧＦのｍＲＮＡを測定した。ＶＥＧＦの発現が３０％以下まで抑制された。

ＰＥＧ−ｐＡＡｓｉＬｕｃは、比較例４で調製した、ｓｉＬｕｃ担持ｍＰＥＧ−ＰＡＡ／ＣａＰナノ粒子をトランスフェクションした細胞のＶＥＧＦのｍＲＮＡを測定した。ＶＥＧＦの発現は抑制されなかった。一方ＰＥＧ−ＰＡＡｓｉＶＥＧＦは、比較例６で調製した、ｓｉＶＥＧＦ担持ｍＰＥＧ−ＰＡＡ／ＣａＰナノ粒子をトランスフェクションした細胞のＶＥＧＦのｍＲＮＡを測定した。ＶＥＧＦの発現が約５０％まで抑制された。

以上のように、本発明の少なくとも１種の生物活性物質を担持するチャージコンバージョンポリマー含有リン酸カルシウム粒子を含む水性分散組成物は、遺伝子研究用の組成物として、あるいは治療用の医薬組成物として、その有用性が期待される。

Claims (18)

1. ポリエチレングリコール−ポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）ブロックコポリマーであって、ポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）ブロックの側鎖カルボン酸又は１級アミンに、場合によりカチオン性セグメント（Ｓ¹）を介して、酸性条件下で脱離するアニオン性セグメント（Ｔ¹）が結合していることを特徴とする、チャージコンバージョンポリマー。
2. ポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）ブロックが、ポリリシン、ポリオルニチン、ポリアスパラギン酸又はポリグルタミン酸から選択されるブロックである、請求項１記載のポリマー。
3. 式（Ｉ）：
   
   〔式中、
   Ｒ¹及びＲ²の一方は、下記式：
   
   （式中、Ｒは、水素又はＣ_1〜6アルキルであり；Ｌは、ポリエチレングリコールブロックとポリ（酸性又は塩基性アミノ酸）ブロックとをつなぐリンカーであり、ｏは、ポリエチレングリコールブロックの分子量が２，０００〜２０，０００になるような数である）の基であり、他方は、Ｒ¹の場合、ヒドロキシであるか、又はカルボキシルの保護基であり、Ｒ²の場合、水素であるか、又はアミノの保護基であり；
   Ｘは、−ＮＨ−又は−Ｃ（Ｏ）−であり；
   Ｓ¹は、カチオン性セグメントであるが、Ｘが−ＮＨ−の場合、単結合であってもよく；
   Ｔ¹は、酸性条件下で脱離するアニオン性セグメントであり；そして
   ｍは、１〜５であり、ｎは、１０〜２００であり、ｐ、ｑ及びｒは、独立して０又は１であるが、ｐ、ｑ及びｒが同時に０であることはなく、またｑ及びｒが同時に１であることもない〕で表される請求項１に記載のポリマー。
4. Ｌが、下記式：
   
   （式中、ｓは、１〜１０である）の２価基から選択される、請求項３に記載のポリマー。
5. Ｔ¹が、脂肪族不飽和ジ−又はトリカルボン酸から誘導されるモノアシル基である、請求項３に記載のポリマー。
6. 式（Ｉａ）：
   
   （式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｘ、Ｓ¹、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒは、請求項３に記載のとおりであり；Ｒ′は、水素、Ｃ_1〜6アルキル又は−ＣＨ₂ＣＯＯＨである）で表される、請求項５に記載のポリマー。
7. Ｘが−Ｃ（Ｏ）−であり；ｒが０である、請求項３〜６のいずれかに記載のポリマー。
8. 式（Ｉｂ）：
   
   （式中、Ｒ、ｎ及びｏは、請求項３に記載のとおりであり；Ｓ¹は、カチオン性セグメントであり；Ｒ²は、水素又はアミノ保護基であり；Ｒ′は、水素、Ｃ_1〜6アルキル又は−ＣＨ₂ＣＯＯＨである）で表される、請求項７に記載のポリマー。
9. Ｓ¹が、−ＮＨ−（Ｃ_2〜20アルキレン）−ＮＨ−（ここで、前記アルキレン部分は、直鎖状又は分岐鎖状であってよく、１個以上の−ＮＨ−若しくは−Ｎ（Ｃ_1〜6アルキル）−で中断されていてもよい）である、請求項７又は８に記載のポリマー。
10. Ｓ¹が、−（ＮＨ−ＣＨ₂ＣＨ₂）_ｔ−ＮＨ−（ここで、ｔは、１〜５である）である、請求項９に記載のポリマー
11. 少なくとも１種の生物活性物質を担持するチャージコンバージョンポリマー含有リン酸カルシウム粒子を含む水性分散組成物の調製方法であって、
    （ｉ）カルシウムイオンを含む水性溶液を調製する工程、
    （ii）生物活性物質、リン酸イオン、及び請求項１〜１０のいずれかに記載のポリマーを含む水性溶液を調製する工程、及び
    （iii）溶液（ｉ）を溶液（ii）に一定速度で加える工程
    を含む方法。
12. 請求項１１に記載の方法により得られる、少なくとも１種の生物活性物質を担持するチャージコンバージョンポリマー含有リン酸カルシウム粒子を含む水性分散組成物。
13. 少なくとも１種の生物活性物質、リン酸イオン、カルシウムイオン、及び請求項１〜１０のいずれかに記載のポリマーから構成されるハイブリッド粒子を含む水性分散組成物。
14. 粒子の平均粒径が、１０〜５００nmの範囲である、請求項１２又は１３に記載の水性分散組成物。
15. 生物活性物質が、核酸である、請求項１２〜１４のいずれかに記載の水性分散組成物。
16. in vitroで細胞内に生物活性物質を導入するための方法であって、
    （ｉ）請求項１２〜１５のいずれかに記載の水性分散組成物を標的細胞に添加する工程；
    （ii）所与の条件で培養する工程
    を含む方法。
17. in vivoで細胞内に生物活性物質を導入するための方法であって、請求項１２〜１５のいずれかに記載の水性分散組成物を、被験対象（ヒトを除く）に投与する工程を含む方法。
18. 請求項１２〜１５のいずれかに記載の水性分散組成物を有効成分として含むことを特徴とする、遺伝子研究用又は治療用医薬組成物。