JP5661626B2 - アニオン性ポリマー、該アニオン性ポリマーを用いたポリイオンコンプレックスおよび三元系ポリマー複合体、ならびに薬学組成物 - Google Patents

Description

本発明は、低分子ＲＮＡを含む側鎖がグラフトされたアニオン性ポリマー、該アニオン性ポリマーを用いたポリイオンコンプレックスおよび三元系ポリマー複合体、ならびに薬学組成物に関する。

ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）とは、１９〜２１塩基対の二本鎖ＲＮＡであり、強力かつ特異的な遺伝子発現抑制現象として知られるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡ
ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を担う主要分子である（非特許文献１）。２００１年にＴｕｓｃｈｌらによって哺乳類細胞におけるＲＮＡｉが報告されて以来（非特許文献２）、あらゆる疾病治療への適用を目指した研究開発が活発に行われている。但し、先行する開発は目や呼吸器など患部への到達が容易な部位に対するものであり、適用範囲が限定的である。そもそも、ｓｉＲＮＡは生理的環境にて易分解性の不安定な化学種であり、マウスに単独で静脈投与した場合には速やかに（ｔ１／２＝数分）腎排泄されることが知られている。したがって、ｓｉＲＮＡの体内動態を改善するドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）は、ｓｉＲＮＡ実用化の鍵を握るものとして切望されている。

しかし、全身性のＤＤＳは、未だ研究室レベルに留まり、実用化には程遠い。最も前衛的な成果を発表しているＡｌｎｙｌａｍ及びＰｒｏｔｉｖａ
Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの両社によるＳＮＡＬＰ（Ｓｔａｂｌｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｐｉｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の系であっても、肝臓への受動的な取り込みのため肝臓以外の組織への適用は困難である（非特許文献３）。一方、血流中への長期滞留という点のみについては、協和発酵社によるＷｒａｐｐｅｄ
ｌｉｐｏｓｏｍｅの系が、一本鎖ＤＮＡを対象としながらも飛躍的な滞留性向上に成功したため（非特許文献４）、今後のｓｉＲＮＡへの展開が大いに期待されているが、リポソームの場合、安定すぎて内部の薬剤を放出するのが困難な場合が多い。

前述したように、ｓｉＲＮＡの適用を拡大するにあたっては、ｓｉＲＮＡの体内動態を改善し、血流中へのｓｉＲＮＡ投与を可能とする技術が極めて重要である。これまでに、プラスミドＤＮＡやアンチセンスＤＮＡにつき、ポリエチレングリコール−ポリリジンブロックコポリマー（ＰＥＧ−ＰＬｙｓ）を用いて当該ＤＮＡを内包したナノメートルスケールの構造体（すなわち高分子ミセル）が形成され、その有用性が報告されている（非特許文献５〜８）。このような高分子ミセルは、上記ブロックコポリマー中のポリカチオン部分（ＰＥＧ−ＰＬｙｓではポリリジン部分）と、ポリアニオンである核酸分子（ＤＮＡ等）との静電相互作用による自己組織化によって形成される。形成された高分子ミセルは、ポリカチオンとポリアニオンとのポリイオンコンプレックス部分が内核様部分となり、その表層がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で覆われたような、コア−シェル型の構造となる。そのため、当該高分子ミセルは、生体内異物認識機構や腎排泄を回避し得ることが期待される。

本発明者等は、上記プラスミドＤＮＡやアンチセンスＤＮＡがｓｉＲＮＡの類縁体であることに鑑み、ｓｉＲＮＡの体内動態を改善する方策として、ＰＥＧ−ＰＬｙｓを用いてｓｉＲＮＡを内包する高分子ミセルの形成を試みた。しかしながら、実際に得られたものは、構造安定性が低く、目的のコア−シェル型のミセル構造を十分に備えるものではなく、培養がん細胞へのｓｉＲＮＡ送達能に極めて乏しいものであった。そのため、ＰＥＧ−ＰＬｙｓを、ｓｉＲＮＡのキャリアとして利用することは極めて困難であった。

また、アニオン性ｓｉＲＮＡとポリカチオンとの間の静電相互作用により形成されたポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）がＤＤＳに利用されている（特許文献１および非特許文献９〜１１）。しかし、ｓｉＲＮＡは、主にそのサイズが小さいこと（２１塩基対）に起因して、生理学的条件において安定なミセルを形成することが困難であるので、生物学的環境におけるＰＩＣの安定化が問題となっている（非特許文献１２）。安定なＰＩＣを形成するためには、多数かつ高密度のアニオン性電荷を有する長い２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が好ましい。ポリカチオンと累積的な相互作用を生じるからである。しかし、長鎖ｄｓＲＮＡ構造は、Ｔｏｌｌ様受容体−３（ＴＬＲ３）による認識およびプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）の活性化を含む複数の経路によるＩＦＮ−α応答を引き起こすという問題がある（非特許文献１３〜１５）。

さらに、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）も、ｓｉＲＮＡと同じく低分子ＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡと同様のメカニズムで遺伝子発現を抑制し得るので、ｓｉＲＮＡと同様にＤＤＳに利用されることが期待されている。しかし、ｍｉＲＮＡを用いたＤＤＳに関しても、ｓｉＲＮＡの場合と同じ問題がある。

以上のように、生物学的環境において安定で、かつ、所望でない免疫応答を引き起こさない低分子ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ）の送達手段が強く望まれている。

国際公開第２００８／０６２９０９号パンフレット

Ｆｉｒｅ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｂｙ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３９１，ｐ．７４４−７４５，１９９８ Ｓａｙｄａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｄｕｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＲＮＡｓ ｍｅｄｉａｔｅＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４１１，ｐ．４９４−４９８，２００１ Ｔｒａｃｙ Ｓ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｎｏｎ−ｈｕｍａｎｐｒｉｍａｔｅｓ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４４１，ｐ．１１１−１１４，２００６ Ｍａｓａｈｉｒｏ Ｙａｍａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｕｓｉｎｇ ｗｒａｐｐｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｖｏｌ．１１４，ｐ．２６８−２７５，２００６ Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘｍｉｃｅｌｌｅｓ ｗｉｔｈ ｎａｒｒｏｗ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｆｏｒｍ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｂｌｏｃｋｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｉｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｌｉｎｅ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｖｏｌ．２９，ｐ．８５５６−８５５７，１９９６ Ｍ．Ａ．Ｗｏｆｌｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｌｏｃｋ ｃｏ−ｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｈｕｍ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，ｖｏｌ．７，ｐ．２１２３−２１３３，１９９６ Ｓ．Ｋａｔａｙｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｏｌｙｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）ｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．，Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．８，ｐ．７０２−７０７，１９９７ Ｓ．Ｋａｔａｙｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）ｂｌｏｃｋｃｏｐｏｌｙｍｅｒ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．８７，ｐ．１６０−１６３，１９９８ Ｓｉｏｍｉ ＭＣ．Ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ；ｔｏｗａｒｄｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ２００９；６１：６６８−６７１ Ｉｔａｋａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｆｒｏｍＰＥＧ−ｂａｓｅｄ ｂｌｏｃｋ ｃａｔｉｏｍｅｒ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｄｉａｍｉｎｅ ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎ ｗｉｔｈ ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ ｐＫ（ａ） ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２００４；１２６：１３６１２−１３６１３ Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｍｉｃｅｌｌｅｓｗｉｔｈ ａ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ ｃｏｒｅ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００９；１０：１１９−１２７ Ｇａｒｙ ＤＪ， Ｐｕｒｉ Ｎ， Ｗｏｎ ＹＹ． Ｐｏｌｙｍｅｒ−ｂａｓｅｄ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｐｏｌｙｍｅｒ−ｂａｓｅｄＤＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２００７；１２１：６４−７３ Ｊｕｄｇｅ Ａ， ＭａｃＬａｃｈｌａｎ Ｉ． Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｗｅｒｉｎｇ ＲＮＡ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００８；１９：１１１−１２４ Ｊｕｄｇｅ ＡＤ， Ｓｏｏｄ Ｖ， Ｓｈａｗ ＪＲ， Ｆａｎｇ Ｄ， ＭｃＣｌｉｎｔｏｋ Ｋ， ＭａｃＬａｃｈｌａｎ Ｉ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｉＲＮＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００５；２３：４５７−４６２ Ｍａｒｑｕｅｓ ＪＴ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＢＲＧ． Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍ ｂｙ ｓｉＲＮＡｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００５；２３：１３９９−１４０５

本発明はこのような問題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、生物学的環境において安定で、かつ、所望でない免疫応答を引き起こさない低分子ＲＮＡ送達を実現し得るアニオン性ポリマー、ポリイオンコンプレックスおよび三元系ポリマー複合体を提供することにある。

本発明のアニオン性ポリマーは、カルボキシル基を有する繰り返し単位で構成される主鎖と、該主鎖のカルボキシル基の１部に結合した、下記式で表される側鎖と、を含む：
−Ａ−Ｂ−Ｘ
ここで、Ａは、１つ以上のアミノエチル結合を有する残基であり、Ｂは、生体内で開裂し得る結合であり、Ｘは低分子ＲＮＡである。
好ましい実施形態においては、上記主鎖は、カルボキシル基を有するポリアミノ酸、カルボキシル基を有するポリビニル、カルボキシル基を有するポリエステル、カルボキシル基を有する多糖類、カルボキシル基を有するデンドリマー（カスケードポリマー）およびその組み合わせで構成される。
好ましい実施形態においては、上記生体内で開裂し得る結合は、ジスルフィド結合、アセタール結合およびヒドラゾン結合から選択される結合である。
好ましい実施形態においては、上記アニオン性ポリマーは、下記一般式（Ｉ）で表される：
ここで、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、水素原子、あるいは非置換または置換の直鎖状または分岐状Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル基、あるいはポリエチレングリコール鎖であり、Ａは、１つ以上のアミノエチル結合を有する残基であり、Ｂは、生体内で開裂し得る結合であり、Ｑは、水酸基またはアミノエチル結合が水酸基により置換されているＡ由来の基であり、Ｘは低分子ＲＮＡであり、ｌは１〜５００の整数であり、ｍは１〜４９９の整数であり、ｎは１〜５の整数であり、ただし、ｌとｍの合計は１０〜５００であり、ｌおよびｍで表される繰り返し単位はランダムに配列している。
好ましい実施形態においては、上記一般式（Ｉ）におけるＡは−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−であり、Ｑは−ＯＨである。
好ましい実施形態においては、上記一般式（Ｉ）におけるｌは２以上の整数である。
本発明の別の局面によれば、ポリイオンコンプレックスが提供される。このポリイオンコンプレックスは、上記のアニオン性ポリマーと、ポリエチレンイミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリ−（２−〔（２−アミノエチル）アミノ〕−エチル−アスパルタミド（ｐＡｓｐ（ＤＥＴ））、ポリエチレングリコールとポリアルギニンとのブロック共重合体、ポリエチレングリコールとポリリジンとのブロック共重合体、および、ポリエチレングリコールとポリ−（２−〔（２−アミノエチル）アミノ〕−エチル−アスパルタミドとのブロック共重合体（ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ））からなる群から選択されるカチオン性ポリマーと、を含む。
本発明のさらに別の局面によれば、三元系ポリマー複合体が提供される。この三元系ポリマー複合体は、上記のポリイオンコンプレックスと、下記一般式（ＩＩ）で表される電荷変換型ポリマーと、を含む：
Ｒ^１１およびＲ^１２は、それぞれ独立して、水素原子、あるいは非置換または置換の直鎖状または分岐状Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル基、あるいはポリエチレングリコール鎖であり、Ｒ^１３は、第１級アミンを有するアミン化合物由来の残基と下記式（１０）で表される化合物またはその誘導体との結合体であり：
ここで、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、水素原子、あるいは非置換または置換のアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、複素環基、複素環−アルキル基、水酸基、アルコキシル基またはアリールオキシ基であり、ただし、Ｒ^ａとＲ^ｂとが一緒になって、それぞれが結合している炭素原子とともに芳香族環またはシクロアルキル環を形成してもよく、Ｒ^ａおよびＲ^ｂが結合している炭素原子間の結合は単結合または二重結合であり、
ｍ１は１０〜５００の整数であり、ｍ２は１〜５の整数である。
好ましい実施形態においては、上記第１級アミンを有するアミン化合物由来の残基は、下記式（１１）または（１２）で表される：
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｒ−ＮＨ_２ （１１）
式（１１）において、ｒは０〜５の整数であり；
−〔ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｓ１〕_ｔ１−ＮＨ_２ （１２）
式（１２）において、ｓ１は、〔ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｓ１〕ユニット間でそれぞれ独立して１〜５の整数であり、ｔ１は２〜５の整数である。
好ましい実施形態においては、上記第１級アミンを有するアミン化合物由来の残基は、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ_２−または−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ_２である。
好ましい実施形態においては、上記式（１０）で表される化合物は、下記式（Ｉａ）〜（Ｉｇ）で表される化合物から選択される少なくとも１つの化合物である：
本発明のさらに別の局面によれば、薬学組成物が提供される。この薬学組成物は、上記のポリイオンコンプレックスと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。
本発明の別の薬学組成物は、上記の三元系ポリマー複合体と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。

本発明によれば、グラフトによりポリマー側鎖に低分子ＲＮＡを導入することにより、生物学的環境において安定で、かつ、所望でない免疫応答を引き起こさない低分子ＲＮＡ送達手段を実現し得るアニオン性ポリマーが得られ得る。さらに、本発明のアニオン性ポリマーから形成されるポリイオンコンプレックスは、アニオン性ポリマーへの低分子ＲＮＡ導入量が多く、かつ、会合度が非常に大きいので、非常に高い低分子ＲＮＡ送達能を有する。

実施例１で得られたアニオン性ポリマーについての、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の観察結果を示す図である。 実施例２および比較例１のポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）の安定性を、アガロースゲル電気泳動により分析した結果を示す図である。 Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞による実施例２のＰＩＣまたは比較例１のＰＩＣの取り込みをフローサイトメトリーで調べた結果を示すグラフである。 ＡおよびＢは、実施例２のＰＩＣまたは比較例１のＰＩＣについてのＢ１６Ｆ１０−Ｌｕｃ細胞内のｓｉＲＮＡの分布を、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）で観察した結果を示す画像であり；Ｃは、実施例２のＰＩＣまたは比較例１のＰＩＣについて、ｓｉＲＮＡのエンドソームからの移行効率を示すグラフである。 Ａは、実施例２のＰＩＣまたは比較例１のＰＩＣについて遺伝子抑制効率を示すグラフであり；Ｂは、実施例２のＰＩＣまたは比較例１のＰＩＣについて、ＭＴＴアッセイで細胞毒性を調べた結果を示すグラフである。 実施例３のＰＩＣまたは比較例２のＰＩＣについて遺伝子抑制効率を示すグラフである。 実施例２のＰＩＣおよび比較例１のＰＩＣを含む種々のＰＩＣについて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりインターフェロン−α産生を調べた結果を示すグラフである。 遺伝子抑制効果に対するアニオン性ポリマーの鎖長依存性を調べた結果を示すグラフである。 実施例２のＰＩＣまたは比較例１のＰＩＣについてノックダウンアッセイの結果を示すグラフである。 実施例２のＰＩＣまたは比較例１のＰＩＣについてノックダウンアッセイの結果を示すグラフである。 実施例４のＰＩＣまたは比較例３のＰＩＣについてノックダウンアッセイの結果を示すグラフである。 実施例５のＰＩＣについてノックダウンアッセイの結果を示すグラフである。

以下、本発明の好ましい実施形態を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施形態には限定されない。また、本明細書は、本願の優先権主張の基礎となる米国仮出願61/126,077号の明細書に記載の内容を包含する。さらに、本明細書において示されるすべての文書および刊行物は、その全体が本明細書に参考として援用される。

Ａ．アニオン性ポリマー
本発明のアニオン性ポリマーは、カルボキシル基を有する繰り返し単位で構成される主鎖と、該主鎖のカルボキシル基の１部に結合した、下記式で表される側鎖と、を含む：
−Ａ−Ｂ−Ｘ
ここで、Ａは、１つ以上のアミノエチル結合を有する残基であり、Ｂは、生体内で開裂し得る結合であり、Ｘは低分子ＲＮＡである。

本明細書においては、「低分子ＲＮＡ」とは、鎖長（二重鎖の場合は二重鎖を構成する部分の長さ）が５０塩基以下のＲＮＡをいう。低分子ＲＮＡの代表例としては、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡが挙げられる。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡとしては、例えば、標的とする遺伝子またはポリヌクレオチドに対し、公知の方法で設計されたすべてのものを用いることができる。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの鎖長（２本鎖ｓｉＲＮＡの場合は二重鎖を構成する部分の長さ）は、好ましくは１５〜５０塩基、より好ましくは１８〜３０塩基であることができ、当該技術分野で公知の化合物、また、それらと同様な作用または機能を有するすべてのヌクレオチドを包含する。限定されるものでないが、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの具体例は、遺伝子療法の対象となりうる遺伝子を参照して設計することができる。このような遺伝子としては、限定されるものでないが、非小細胞肺癌等に関係のあるＰＫＣα、悪性黒色腫等に関係のあるＢＣＬ−２、クローン病に関係のあるＩＣＡＭ−１、Ｃ型肝炎に関係のあるＨＣＶ、関節リュウマチもしくは乾癬に関係のあるＴＮＦα、喘息に関係のあるアデノシンＡＩ受容体、卵巣癌等に関係のあるｃ−ｒａｆ ｋｉｎａｓｅ、膵臓癌等に関係のあるＨ−ｒａｓ、冠動脈疾患に関係のあるｃ−ｍｙｃ、大腸癌に関係のあるＰＫＡ Ｒｉａ、エイズに関係のあるＨＩＶ、固形癌に関係のあるＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、癌に関係のあるＶＥＧＦ受容体、腎臓癌に関係のあるリボヌクレオチド還元酵素、ＣＭＶ性網膜炎に関係のあるＣＭＶ ＩＥ２、前立腺癌に関係のあるＭＭＰ−９、悪性グリオーマに関係のあるＴＧＦβ２、多発性硬化症に関係のあるＣＤ４９ｄ、糖尿病に関係のあるＰＴＰ−１Ｂ、癌に関係のあるｃ−ｍｙｂ、乳癌等に関係のあるＥＧＦＲ、癌に関係のあるｍｄｒ１、ａｕｔｏｔａｘｉｎ及びＧＬＵＴ−１の遺伝子を挙げることができる。アンチセンス核酸についても同様に、当該術分野で公知のものまたはそれらと同様の機能または作用を有するすべてのものを対象とすることができる。なお、本明細書の以下の部分においては、簡単のため、低分子ＲＮＡの代表例としてｓｉＲＮＡを用いる場合について記載するが、当該記載はｍｉＲＮＡおよび他の低分子ＲＮＡについても同様に適用され得ることはいうまでもない。

上記主鎖としては、カルボキシル基を有する繰り返し単位で構成され、かつ、上記側鎖が適切に導入され得る限り、任意の適切な構成が採用され得る。上記繰り返し単位の元となるカルボキシル基含有モノマーの好ましい具体例としては、アミノ酸、ビニルモノマー、ジカルボン酸とジオール、単糖類等が挙げられる。本発明の効果が得られる限り、このようなモノマーは、単独で重合してもよく、複数のモノマーを共重合してもよい。したがって、上記主鎖の具体例としては、カルボキシル基を有するポリアミノ酸、カルボキシル基を有するポリビニル、カルボキシル基を有するポリエステル、カルボキシル基を有する多糖類、カルボキシル基を有するデンドリマー（カスケードポリマー）およびその組み合わせが挙げられる。

上記生体内で開裂し得る結合としては、ＤＤＳにおいて利用可能な任意の適切な化学結合が採用され得る。このような結合の代表例としては、ジスルフィド結合、アセタール結合、ケタール結合、ヒドラゾン結合、エノールエーテル結合、エノールエステル結合、アミド結合、イミン結合、イミニウム結合、エナミン結合、シリルエーテル結合、シラザン結合、シリルエノールエーテル結合、ジオール結合、ジアゾ結合、エステル結合、スルホン結合、およびケイ素−炭素結合が挙げられる。好ましくは、ジスルフィド結合、アセタール結合、ヒドラゾン結合である。例えば、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）は、還元的環境下において容易に開裂する。このような特性を利用することにより、細胞への高いｓｉＲＮＡ送達能を達成することができる。具体的には、生体内においては、グルタチオンの濃度差に起因して、細胞外では非還元的環境であり（約１０μＭ）、細胞内では還元的環境である（約１０ｍＭ）。したがって、本発明のアニオン性ポリマーを用いるポリイオンコンプレックスおよび三元系ポリマー複合体（いずれも後述）は、標的細胞に達するまではｓｉＲＮＡを内包した形態を安定して維持することができ、かつ、標的細胞に取り込まれた後は、ジスルフィド結合におけるイオウ原子間の結合が開裂することにより、ｓｉＲＮＡを標的細胞内にスムーズかつ効率的に放出することができる。その結果、ＲＮＡｉによる遺伝子発現の抑制効率（ノックダウン効率）等を飛躍的に向上させることができる。また例えば、アセタール結合およびヒドラゾン結合は、細胞内外のｐＨの差により容易に開裂する。具体的には、生体内においては、細胞外のｐＨは約７であるのに対し、細胞内後期エンドソーム内のｐＨは４〜５である。アセタール結合およびヒドラゾン結合は、細胞外では結合を維持し、細胞内後期エンドソーム内では容易に開裂する。その結果、ジスルフィド結合の場合と同様に、本発明のアニオン性ポリマーを用いるポリイオンコンプレックスおよび三元系ポリマー複合体は、標的細胞に達するまではｓｉＲＮＡを内包した形態を安定して維持することができ、かつ、標的細胞に取り込まれた後は、ｓｉＲＮＡを標的細胞内にスムーズかつ効率的に放出することができる。以上のように、本発明のアニオン性ポリマーは、ｓｉＲＮＡを上記特定の共有結合により固定化しているので、ｓｉＲＮＡの送達手段としてのポリイオンコンプレックスおよび三元系ポリマー複合体に用いる場合、生理的環境にて易分解性の不安定な化学種であるｓｉＲＮＡを、標的細胞内に導入するまで極めて安定な状態で保持することができ、しかも、細胞外から細胞内への環境変化に応答して効率的にｓｉＲＮＡを放出する（細胞内に導入する）ことができる。特に、共有結合を介して複数のｓｉＲＮＡを１つの高分子上に固定化することにより、静電相互作用によりｓｉＲＮＡ単体を内包する場合に比べて、格段に安定したポリイオンコンプレックスを形成することができる。さらに、ポリカルボン酸を有する繰り返し単位に、ｓｉＲＮＡを含む側鎖としてｓｉＲＮＡを導入することにより、ｓｉＲＮＡの導入量（含有量）が格段に多いポリイオンコンプレックスを形成することができる。以上のような効果が相乗的に発揮されることにより、本発明のアニオン性ポリマーを用いたポリイオンコンプレックスおよび三元系ポリマー複合体は、ｓｉＲＮＡのインテリジェントベクターとして、極めて有用性が高い。

好ましくは、上記アニオン性ポリマーは、下記一般式（Ｉ）で表される：
ここで、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、水素原子、あるいは非置換または置換の直鎖状または分岐状Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル基、あるいはポリエチレングリコール鎖であり、Ａは、１つ以上のアミノエチル結合を有する残基であり、Ｂは、生体内で開裂し得る結合であり、Ｑは、水酸基またはアミノエチル結合が水酸基により置換されているＡ由来の基であり、ＸはｓｉＲＮＡであり、ｌは１〜５００の整数であり、ｍは１〜４９９の整数であり、ｎは１〜５の整数であり、ただし、ｌとｍの合計は１０〜５００であり、ｌおよびｍで表される繰り返し単位はランダムに配列している。

上記Ｒ^１およびＲ^２についての上記非置換または置換の直鎖状または分岐状Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル基としては、代表的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、デシル基、ウンデシル基が挙げられる。置換された場合の置換基としては、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシカルボニル基、Ｃ_２〜Ｃ_７アシルアミド基、同一または異なるトリ（Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル）シロキシ基、シロキシ基およびシリルアミノ基が挙げられる。ポリエチレングリコール鎖としては分子量２０００から２００００の構造が挙げられる。

本明細書においては、上記Ａについての「１つ以上のアミノエチル結合を有する残基」とは、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−の部分を含む残基をいう。このような残基の具体例としては、下記が挙げられる：
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−〔ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ１−〕_ｑ１−、
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−Ｎ｛〔−（ＣＨ_２）_ｐ２−ＮＨ_２〕〔−（ＣＨ_２）_ｐ３−ＮＨ−〕_ｑ２｝、
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−Ｎ｛〔−（ＣＨ_２）_ｐ４−ＮＨ−〕〔〔−（ＣＨ_２）_ｐ５−ＮＨ−〕_ｑ３Ｈ〕｝、
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−〔ＮＲ^ｃＨ−（ＣＨ_２）_ｐ６−〕−Ｃ｛〔−（ＣＨ_２）_ｐ７−ＮＨ_２〕〔−ＮＨ−〕｝、
ここで、ｐ１〜ｐ７、およびｑ２〜ｑ３は、それぞれ独立して、１〜５の整数であり、ｑ１は０〜５の整数であり、Ｒ^ｃは、水素原子、シス−アコニチル基またはシス−シトラコニル基である。

１つの実施形態においては、上記Ａは−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−であり、上記Ｑは−ＯＨである。

上記ｌとｍの合計は、好ましくは５０〜５００であり、さらに好ましくは８０〜２２０である。ｌは、好ましくは２以上の整数であり、さらに好ましくは２〜１８の整数である。ｓｉＲＮＡの導入率（ｌとｍの合計に対するｌの比率に対応する）は、好ましくは３％〜３０％であり、さらに好ましくは３％〜６％である。例えば、アニオン性ポリマーの重合度が１００である場合には、ポリマー鎖１本に対して３個〜３０個のｓｉＲＮＡ分子が導入され得る。このように、本発明によれば、ポリマー鎖に複数のｓｉＲＮＡを導入できるので、本発明のポリマーを用いてポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）を形成する場合、静電相互作用によりｓｉＲＮＡを内包するＰＩＣに比べて、ｓｉＲＮＡの含有量が格段に多くなる。その結果、ｓｉＲＮＡを大量に標的細胞に送達することができる。

一例として、主鎖としてポリアスパラギン酸を用い、カチオン性ポリマーとしてポリ−（２−〔（２−アミノエチル）アミノ〕−エチル−アスパルタミド（ｐＡｓｐ（ＤＥＴ））を用いる場合の本発明のアニオン性ポリマーの製造方法を説明する。便宜上、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の合成方法から説明する。公知の方法で合成したβ−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸のＮ−カルボキシ酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）を、ｎ−ブチルアミンにより開環重合し、ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸エステル）（ＰＢＬＡ）を合成する。ＰＢＬＡは、代表的には、無水酢酸を用いてＮ末端をアセチル化することにより保護され得る（アセチル基で保護されたＰＢＬＡをＰＢＬＡ−Ａｃとも称する）。次に、ジエチレントリアミン（ＤＥＴ）を用いたＰＢＬＡ−Ａｃのベンジル基のアミノ加水分解により、ＰＢＬＡ−Ａｃの側鎖にＮ−｛Ｎ−（２−アミノエチル）−２−アミノエチル｝を導入し、さらに、塩酸溶液で透析することにより、ポリ〔Ｎ−｛Ｎ−（２−アミノエチル）−２−アミノエチル｝アスパラギン酸アミド〕塩酸塩（ｐＡｓｐ（ＤＥＴ））が得られる。この反応スキームは下記の通りである。

次に、上記と同様にして得られたＰＢＬＡのベンジル基を脱保護し、ポリ（アスパラギン酸）ナトリウム塩（ｐＡｓｐ）を得る。一方、２，２´−ジチオジピリジンと２−アミノエタンチオール塩酸塩とを反応させて、２−（２−ピリジルジチオ）エチルアミン塩酸塩（ＰＤＴＡ）を得る。トリアジン系縮合剤ＤＭＴ−ＭＭを用いたｐＡｓｐ中のカルボキシル基とＰＤＴＡ中の１級アミノ基との縮合反応により、２−（２−ピリジルジチオ）エチルアミンで変性したポリ（アスパラギン酸）（ｐＡｓｐ（−ＳＳ−Ｐｙ））を合成する。次いで、センス鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を、ｓｓＲＮＡ−ＳＨの５´鎖末端のチオール基による置換反応によりｐＡｓｐ（−ＳＳ−Ｐｙ）に導入し、さらに、分子篩クロマトグラフィーで精製して、センス鎖ＲＮＡがグラフトされたｐＡｓｐ〔ｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｓＲＮＡ）〕を得る。このｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｓＲＮＡ）を、アンチセンス鎖ＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）でアニールし、本発明のアニオン性ポリマーであるジスルフィド結合によりｓｉＲＮＡがグラフトされたポリ（アスパラギン酸）〔ｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）〕を得る。この反応スキームは下記の通りである。

Ｂ．ポリイオンコンプレックス
本発明のポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）は、上記Ａ項に記載の本発明のアニオン性ポリマーと、カチオン性ポリマーと、を含む。カチオン性ポリマーとしては、本発明のアニオン性ポリマーとＰＩＣを形成し得るかぎり、任意の適切なポリマーが採用され得る。カチオン性ポリマーの具体例としては、ポリエチレンイミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリ−（２−〔（２−アミノエチル）アミノ〕−エチル−アスパルタミド（ｐＡｓｐ（ＤＥＴ））、ポリエチレングリコールとポリアルギニンとのブロック共重合体、ポリエチレングリコールとポリリジンとのブロック共重合体、および、ポリエチレングリコールとポリ−（２−〔（２−アミノエチル）アミノ〕−エチル−アスパルタミドとのブロック共重合体（ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ））が挙げられる。

上記ＰＩＣは、上記アニオン性ポリマーと上記カチオン性ポリマーとの静電相互作用により形成される。さらに、例えばＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）のようなＰＥＧとカチオン性ポリマーとのジブロックコポリマーをカチオン性ポリマーとして使用した場合、カチオン鎖が静電的性質等に起因してアニオン性ポリマーとＰＩＣコアを形成し、水との親和性の高いＰＥＧ鎖がその周りを覆うシェルとなる、コア−シェル型のミセル構造を有するＰＩＣを形成する。この場合、当該コア部分にｓｉＲＮＡが内包されたものとなる。

上記ＰＩＣの粒径は、目的に応じて適切に設定され得る。ＰＩＣの粒径は、例えば６０ｎｍ〜２００ｎｍである。ＰＩＣの粒径は、アニオン性ポリマーとカチオン性ポリマーとの組み合わせ、カチオン性ポリマーの分子量等を調整することにより制御することができる。

本発明のＰＩＣは、非常に高いｓｉＲＮＡ会合度にて形成され得る。例えば、会合度の指標として拡散係数Ｄを用いると、ＨＥＰＥＳ緩衝液における本発明のＰＩＣの拡散係数Ｄは、対応するアニオン性ポリマー（本発明のアニオン性ポリマー）の拡散係数Ｄに対して、好ましくは１／１０〜１／２０である。一方、モノマー性のｓｉＲＮＡとカチオン性ポリマーとのＰＩＣの拡散係数Ｄは、ｓｉＲＮＡの拡散係数Ｄに対して１／３程度である。このように、本発明によれば、グラフト化によってｓｉＲＮＡを側鎖に導入することにより、モノマー性のｓｉＲＮＡのＰＩＣに比べて格段に会合度の大きいＰＩＣを形成することができる。さらに、本発明のＰＩＣは、ＰＩＣを構成するアニオン性ポリマー自体に非常に多くのｓｉＲＮＡが導入されているので、上記会合度との相乗効果により、ｓｉＲＮＡの送達量が格段に大きくなる。

本発明のＰＩＣは、例えばカチオン性ポリマーがｐＡｓｐ（ＤＥＴ）である場合には、生理的条件下での安定性を向上させる観点からＮ／Ｐ比が２以上であることが好ましく、ポリマーによる毒性を抑制する観点からＮ／Ｐ比が２００以下であることが好ましい。Ｎ／Ｐ比は、さらに好ましくは５〜５０、特に好ましくは７〜３０である。なお、Ｎ／Ｐ比とは、ｓｉＲＮＡのリン酸基に対するｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の総アミノ基のモル比をいう。

Ｃ．三元系ポリマー複合体
本発明の三元系ポリマー複合体は、上記Ｂ項に記載の本発明のポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）と、電荷変換型ポリマーと、を含む。本発明に用いられる電荷変換型ポリマーは、中性条件下（細胞外）では負電荷を帯び、酸性条件下（細胞内後期エンドソーム内）では正電荷に変換される。したがって、本発明の三元系ポリマー複合体は、上記ＰＩＣのカチオン性ポリマーと電荷変換型ポリマーとの静電相互作用により、ＰＩＣから形成されたコア−シェル型ミセルの外表面が電荷変換型ポリマーで覆われた構造を有する。ＰＩＣから形成されたミセルを電荷変換型ポリマーで覆うことにより、ＰＩＣ単独の場合に比べて、より低毒性とより高いｓｉＲＮＡ送達率とを実現することができる。

上記電荷変換型ポリマーは、下記一般式（ＩＩ）で表される：
Ｒ^１１およびＲ^１２は、それぞれ独立して、水素原子、あるいは非置換または置換の直鎖状または分岐状Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル基、あるいはポリエチレングリコール鎖であり、Ｒ^１３は、第１級アミンを有するアミン化合物由来の残基と下記式（１０）で表される化合物またはその誘導体との結合体であり：
ここで、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、水素原子、あるいは非置換または置換のアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、複素環基、複素環−アルキル基、水酸基、アルコキシル基またはアリールオキシ基であり、ただし、Ｒ^ａとＲ^ｂとが一緒になって、それぞれが結合している炭素原子とともに芳香族環またはシクロアルキル環を形成してもよく、Ｒ^ａおよびＲ^ｂが結合している炭素原子間の結合は単結合または二重結合であり、ｍ１は１０〜５００の整数であり、ｍ２は１〜５の整数である。

上記式（１０）においてＲ^ａおよびＲ^ｂが置換された場合の置換基としては、任意の適切な炭化水素基が挙げられる。より詳細には、炭化水素基は、飽和または不飽和の非環式炭化水素基、あるいは飽和または不飽和の環式炭化水素基であり得る。炭化水素基が非環式炭化水素基である場合には、直鎖状であってもよく分岐状であってもよい。炭化水素基の具体例としては、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_２０アルケニル基、Ｃ_４〜Ｃ_２０シクロアルキル基、Ｃ_６〜Ｃ_１８アリール基、Ｃ_６〜Ｃ_２０アラルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルコキシ基、Ｃ_６〜Ｃ_１８アリールオキシ基が挙げられる。

好ましくは、上記第１級アミンを有するアミン化合物由来の残基は、下記式（１１）または（１２）で表される：
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｒ−ＮＨ_２ （１１）
式（１１）において、ｒは０〜５の整数であり；
−〔ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｓ１〕_ｔ１−ＮＨ_２ （１２）
式（１２）において、ｓ１は、〔ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｓ１〕ユニット間でそれぞれ独立して１〜５の整数であり、ｔ１は２〜５の整数である。さらに好ましくは、上記第１級アミンを有するアミン化合物由来の残基は、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ_２−または−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ_２である。

好ましくは、上記式（１０）で表される化合物は、下記式（Ｉａ）〜（Ｉｇ）で表される化合物から選択される少なくとも１つの化合物である：

上記第１級アミンを有するアミン化合物由来の残基と上記式（１０）で表される化合物またはその誘導体との結合体は、例えば、上記式（１０）で表される化合物とアミン化合物のアミノ基とが結合（共有結合）して、下記式（１０´）に示されるような構造をとる。ここで、誘導体とは、上記式（１０）を基本骨格として当該化合物から派生する任意の化合物をいう。例えば、上記式（Ｉｃ）で表される化合物のカルボキシル基をアルキル基としたもの、上記式（Ｉｂ）または（Ｉｅ）で表される化合物のメチル基と他のアルキル基としたもの、上記式（Ｉｄ）、（Ｉｆ）または（Ｉｇ）等で表される化合物の芳香環またはシクロアルキル環の少なくとも１個の炭素原子をハロゲン原子で置換したもの等が挙げられる。

上記結合体に関しては、例えば、上記式（Ｉ）で表される化合物が上記式（Ｉｂ）または（Ｉｃ）で表される化合物である場合、当該結合体の上記式（１０´）で表される構造としては、以下のとおりである：

Ｄ．薬学組成物
本発明の薬学組成物は、上記Ｂ項に記載の本発明のポリイオンコンプレックスと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。本発明の別の薬学組成物は、上記Ｃ項に記載の本発明の三元系ポリマー複合体と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。薬学的に許容されるキャリアとしては、目的とする投与形式に応じて任意の適切なキャリアが採用され得る。具体例としては、希釈剤、賦形剤、精製水、脱イオン水、等張剤、ｐＨ調整剤、緩衝液、単糖、オリゴ糖、糖アルコール、ポリエチレングリコールが挙げられる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。以下の実施例において用いたＲＮＡ、５´鎖末端チオール化ＲＮＡ、５´鎖末端Ｃｙ３標識化ＲＮＡは、北海道システム・サイエンス社により合成されたものである。ＲＮＡの配列は以下のとおりである：
（１）ｓｉＳｃｒａｍｂｌｅ（チオール変性）：５´−（ＨＳＣ_６Ｈ_１２−）ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵｄＴｄＴ−３´（センス鎖：配列番号１）、５´−ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡｄＴｄＴ−３´（アンチセンス鎖：配列番号２）；
（２）ｓｉＬｕｃ（チオール変性およびＣｙ３標識化）：５´−（ＨＳＣ_６Ｈ_１２−）ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ−３´（センス鎖：配列番号３）、５´−（Ｃｙ３−）ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ−３´（アンチセンス鎖：配列番号４）。

＜製造例１＞
ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸エステル）の合成
β−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸エステル（以下、ＢＬＡと称する）のＮ−カルボキシ酸無水物（以下、ＢＬＡ−ＮＣＡと称する）を、Bae Y, Nishiyama N, Kataoka K. In vivo antitumor activity of the
folate- conjugated pH-sensitive polymeric micelle selectively releasing
adriamycin in the intracellular acidic compartments. Bioconj Chem
2007;18:1131-1139に記載の手順にしたがって合成した。ｎ−ブチルアミンにより上記ＢＬＡ−ＮＣＡを開環重合し、次いで、無水酢酸を用いて開環重合体のＮ末端をアセチル化することにより、ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸エステル）（以下の製造例においては、Ｎ末端を保護されたものも脱保護されたものも便宜的にＰＢＬＡと称する）を合成した。具体的には以下のとおりである：ジクロロメタン（ＤＣＭ）（２．５ｍＬ）中のｎ−ブチルアミン（２５．０μＬ、０．２５３ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（４．０ｍＬ）に溶解したＢＬＡ−ＮＣＡ（６．９ｇ、２７．９ｍｍｏｌ）に加え、アルゴン雰囲気下でＤＣＭ（３６ｍＬ）により希釈し、次いで、３５℃で４８時間攪拌した。ＩＲにおけるＮＣＡのピークの消失によりモノマーが完全に消費されたのを確認した後、反応混合物に無水酢酸（１００μＬ、１．０６ｍｍｏｌ）を加え、３５℃で１時間攪拌し、ＰＢＬＡのω−末端の１級アミノ基を保護した。この溶液を過剰量のジエチルエーテルに注ぎ、ＰＢＬＡを沈殿させた。回収したＰＢＬＡをＤＣＭ（５００ｍＬ）に溶解し、次いで、このＰＢＬＡ溶液にベンゼン（４００ｍＬ）を加えた。ＤＣＭを蒸発させて除去した後、試料を凍結乾燥し、ＰＢＬＡを得た（４．３５ｇ、収率６３％）。分子篩クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によれば、得られたＰＢＬＡの分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は１．１であった。さらに、^１Ｈ ＮＭＲによれば、得られたＰＢＬＡの重合度は９５であった。

＜製造例２＞
ポリ〔Ｎ−｛Ｎ−（２−アミノエチル）−２−アミノエチル｝アスパラギン酸アミド〕塩酸塩の合成
ジエチレントリアミン（ＤＥＴ）を用いたＰＢＬＡのベンジル基へのアミノリシスにより、ＰＢＬＡの側鎖にＮ−｛Ｎ−（２−アミノエチル）−２−アミノエチル｝を導入した。具体的には以下のとおりである：ＤＣＭ（５ｍＬ）およびベンゼン（２０ｍＬ）の混合物から凍結乾燥したＰＢＬＡ（１０３ｍｇ、４．９５μｍ）を、アルゴン雰囲気下でＮＭＰ（１０ｍＬ）に溶解した。また、ＤＥＴ（２．４ｍＬ、２３．５ｍｍｏｌ、ＰＢＬＡのベンジル基に対して５０当量）をＮＭＰ（１０ｍＬ）に溶解した。次いで、このＤＥＴ溶液に上記ＰＢＬＡ溶液を加え、アルゴン雰囲気下、０℃で１時間攪拌した。反応した溶液を０℃の１Ｍ ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）に滴下して中和し、次いで、分画分子量が６０００〜８０００Ｄａの透析膜を用いて、０．０１Ｍ ＨＣｌ水溶液に対して２４時間、さらに脱イオン水に対して２４時間透析した。透析した溶液を凍結乾燥し、ポリ〔Ｎ−｛Ｎ−（２−アミノエチル）−２−アミノエチル｝アスパラギン酸アミド〕塩酸塩（以下、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）と称する）を得た（９８．０ｍｇ、収率７９％）。^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）により、ＰＢＬＡからｐＡｓｐ（ＤＥＴ）への定量的な変換を確認した。

＜製造例３＞
ポリ（アスパラギン酸）ナトリウム塩の合成
ＰＢＬＡ側鎖のベンジルエステル基を脱保護し、ポリ（アスパラギン酸）ナトリウム塩（以下、ｐＡｓｐと称する）を得た。具体的には以下のとおりである：凍結乾燥したＰＢＬＡ（９８．０ｍｇ、４．７１μｍｏｌ）を０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液（５ｍＬ）に溶解し、次いで、空気雰囲気下、室温で１時間攪拌した。この溶液を、分画分子量が６０００〜８０００Ｄａの透析膜を用いて、脱イオン水に対して４８時間透析し、次いで、凍結乾燥してｐＡｓｐを得た（５２．３ｍｇ、収率８５％）。^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）により、脱保護が完了したことを確認した。

＜製造例４＞
２−（２−ピリジルジチオ）エチルアミン塩酸塩の合成
２，２´−ジチオジピリジン（１１ｇ、５０ｍｍｏｌ）を、氷酢酸（８ｍＬ）を含むメタノール（７５ｍＬ）に溶解した。この溶液に、２−アミノエタンチオール塩酸塩（１．１４ｇ、１０ｍｍｏｌ）のメタノール（２０ｍＬ）溶液を、アルゴン雰囲気下で３０分かけて滴下した。反応混合物を、アルゴン雰囲気下、室温でさらに２４時間攪拌し、次いで減圧下で濃縮して黄色の油状物（１０〜１５ｍＬ）を得た。この油状物を過剰量のジエチルエーテルに滴下して沈殿させ、次いで、メタノール（２０ｍＬ）に再度溶解した。この沈殿サイクルを複数回繰り返して未反応の２，２´−ジチオジピリジンを除去し、無色の固体として２−（２−ピリジルジチオ）エチルアミン塩酸塩（以下、ＰＤＴＡと称する）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）により、ＰＤＴＡを同定した。

＜製造例５＞
２−（２−ピリジルジチオ）エチルアミンで変性したポリ（アスパラギン酸）の合成
側鎖を２−（２−ピリジルジチオ）エチルアミンで変性したポリ（アスパラギン酸）（ｐＡｓｐ（−ＳＳ−Ｐｙ））を、ｐＡｓｐ中のカルボキシル基とＰＤＴＡ中の１級アミノ基との縮合反応により合成した。ｐＡｓｐ（２０．０ｍｇ、Ａｓｐ残基：０．１４６ｍｍｏｌ）の水（３ｍＬ）溶液を、トリアジン系縮合剤ＤＭＴ−ＭＭ（８．０７ｍｇ、０．０２９２ｍｍｏｌ）の水（１ｍＬ）溶液と混合した。このｐＡｓｐ溶液を空気雰囲気下の室温で３０分間置いた後、ＰＤＴＡ（７．８１ｍｇ、０．０３５０ｍｍｏｌ）の水（１ｍＬ）溶液を加え、空気雰囲気下の室温で３時間攪拌した。生成物を、脱イオン水に対する４８時間の透析（４回）（分画分子量：３５００Ｄａ）により精製し、凍結乾燥により回収した（２１．８ｍｇ、収率９５％）。^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）によれば、ｐＡｓｐのカルボキシレート側鎖に対するピリジル基の導入率は１５％であった。これは、ｐＡｓｐ鎖１本について約１４のピリジルジスルフィド部分が導入されたことに相当する。

＜実施例１＞
ジスルフィド結合によりｓｉＲＮＡがグラフトされたポリ（アスパラギン酸）の合成
センス鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を、ｓｓＲＮＡ−ＳＨの５´鎖末端のチオール基による置換反応によりｐＡｓｐ（−ＳＳ−Ｐｙ）に導入し、次いで、分子篩クロマトグラフィーで精製して、未反応の生成物および２−チオピリドンを除去した。センス鎖ＲＮＡがグラフトされたｐＡｓｐ〔ｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｓＲＮＡ）〕を、アンチセンス鎖ＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）またはＣｙ３で標識されたａｓＲＮＡ（Ｃｙ３−ａｓＲＮＡ）でアニールし、最終生成物であるジスルフィド結合によりｓｉＲＮＡがグラフトされたポリ（アスパラギン酸）〔ｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）〕を得た。概略的なプロトコルは以下のとおりである：ｐＡｓｐ（−ＳＳ−Ｐｙ）（０．３０２ｍｇ、０．０２００ｍｍｏｌ）とｓｓＲＮＡ−ＳＨ（２．００ｍｇ、０．３００ｍｍｏｌ、ピリジル基に対して１当量）とを５００ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）５ｍＬに溶解し、空気雰囲気下の暗所で２４時間攪拌した。粗生成物を分子篩クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製した。ＳＥＣのチャートから計算したところ、ピリジルジスルフィド基からジスルフィド結合を有するｓｓＲＮＡへの置換度は３０％であった。これは、ｐＡｓｐ鎖１本について約４個のｓｓＲＮＡ分子が導入されたことに相当する。次に、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ１５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、分画分子量：３０００Ｄａ）を用いた遠心限外ろ過を繰り返して上記で得られたｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｓＲＮＡ）を脱塩し、次いで、ａｓＲＮＡでアニールした。アニールは、ｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｓＲＮＡ）とａｓＲＮＡとの混合物を暗所において９５℃で１０分間加熱し、次いで、暗所で室温まで徐冷することにより行った（１．２４ｍｇ、収率８３％）。
上記と同様にして、ｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｓＲＮＡ）をＣｙ３−ａｓＲＮＡでアニールして、Ｃｙ３で標識されたｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）〔ｐＡｓｐ（−ＳＳ−Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ）〕を得た。

＜実施例２＞
ポリカチオン（ｐＡｓｐ（ＤＥＴ））とｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）とからのポリイオンコンプレックスの調製
ポリカチオン（カチオン性ポリマー）としてｐＡｓｐ（ＤＥＴ）を用い、ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）とｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）とからポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）をＮ／Ｐ比＝２０で調製した。ここで、Ｎ／Ｐ比は、ｓｉＲＮＡのリン酸基に対するｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の総アミノ基のモル比である。具体的には、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）中のｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）溶液（ｓｉＲＮＡ濃度＝１５μＭ）２０μＬを、同じ緩衝液中のｐＡｓｐ（ＤＥＴ）溶液１０μＬと混合し、４℃で終夜インキュベートした（最終ｓｉＲＮＡ濃度＝１０μＭ）。

＜実施例３＞
ポリカチオン（ＰＥＩ）とｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）とからのポリイオンコンプレックスの調製
ポリカチオンとして直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）系の市販のトランスフェクション試薬であるＥｘＧｅｎ５００を用いたこと以外は実施例２と同様にしてＰＩＣを調製した。

＜実施例４＞
ポリカチオン（ＰＥＩ）とｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）とからのポリイオンコンプレックスの調製
ポリカチオンとしてＰＥＩ（Ｍｗ＝２２０００）を用い、Ｎ／Ｐ比＝６としたこと以外は実施例２と同様にしてＰＩＣを調製した。

＜実施例５＞
ポリカチオン（ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ））とｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）とからのポリイオンコンプレックスの調製
ポリカチオンとしてＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いたこと以外は実施例２と同様にしてＰＩＣを調製した。ここで、ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）は、ポリエチレングリコール（Ｍｗ＝１２０００）とｐＡｓｐ（ＤＥＴ）（Ｍｗ＝２００００）とのブロック共重合体である。

＜比較例１＞
ｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）の代わりにモノマー性ｓｉＲＮＡを用いたこと以外は実施例２と同様にして、ＰＩＣを調製した。

＜比較例２＞
ｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）の代わりにモノマー性ｓｉＲＮＡを用いたこと以外は実施例３と同様にして、ＰＩＣを調製した。

＜比較例３＞
ｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）の代わりにモノマー性ｓｉＲＮＡを用いたこと以外は実施例４と同様にして、ＰＩＣを調製した。

＜比較例４＞
ｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）の代わりにモノマー性ｓｉＲＮＡを用いたこと以外は実施例５と同様にして、ＰＩＣを調製した。

＜評価１＞
ｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）のポリアクリルアミドゲル電気泳動
実施例１で得られたｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）に供した。その結果、モノマー性ｓｉＲＮＡの位置にはバンドは観察されず、一方で、高分子側に複数のバンドが観察された（図１）。このことから、ｓｉＲＮＡがｐＡｓｐの側鎖に導入され、ｓｉＲＮＡグラフト化ポリマーが形成されたことが示唆される。このｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）溶液に還元剤ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加すると、高分子側のバンドが消失し、モノマー性ｓｉＲＮＡのバンドが再度出現した。このことから、還元環境下におけるジスルフィド結合の開裂によりｓｉＲＮＡが放出されたことがわかる。

＜評価２＞
ＰＩＣの蛍光相関分光法測定
ｓｉＲＮＡの代わりにＣｙ３−ｓｉＲＮＡを用いたこと以外は比較例１と同様にしてＰＩＣを調製した。得られたＰＩＣを、ｓｉＲＮＡ濃度が１００ｎＭとなるまでＨＥＰＥＳ緩衝液、５０ｍＭのＤＴＴを含むＨＥＰＥＳ緩衝液、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ、または、１０％ＦＢＳおよび５０ｍＭのＤＴＴを含むＤＭＥＭでそれぞれ希釈し、試料を作成した。ＤＴＴを含む試料については、希釈後、４℃で終夜インキュベートした。また、ｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）の代わりにｐＡｓｐ（−ＳＳ−Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ）を用いたこと以外は実施例２と同様にしてＰＩＣを調製した。このＰＩＣについても上記と同様にして試料を作成した。以下、Ｃｙ３で標識されたＰＩＣについては、対応する実施例および比較例の番号に準じて、例えば「実施例２の標識化ＰＩＣ」のように記載する。
上記で得られた試料について、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製ＬＳＭ−５１０−ＭＥＴＡを用いて蛍光相関分光法（ＦＣＳ）測定を行った。測定は、室温、サンプリング時間２０秒で１０回繰り返した。それぞれの試料について、拡散係数Ｄを求めた。結果を表１に示す。
表１から明らかなように、ＨＥＰＥＳ緩衝液中、実施例２の標識化ＰＩＣの拡散係数Ｄは、実施例１の標識化ポリマーのＤの約１／１４である。一方、比較例１の標識化ＰＩＣの拡散係数Ｄは、モノマー性Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡのＤの約１／３にすぎない。このことから、本発明の実施例のＰＩＣでは、比較例のＰＩＣに比べて、会合度が格段に大きいことが示唆される。さらに、培地（ＤＭＥＭ）中の比較例１の標識化ＰＩＣの拡散係数Ｄは、ＨＥＰＥＳ緩衝液中のＤの約３倍の大きさであり、かつ、フリーのモノマー性Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡのＤ（培地中および緩衝液中のいずれも）に近い。このことは、ＨＥＰＥＳ緩衝液中で調製された比較例１の標識化ＰＩＣが、高いイオン強度および血清蛋白との相互作用に起因して、培地中で崩壊していることが示唆される。一方、実施例２のＰＩＣの拡散係数Ｄは培地中でも緩衝液中でも同等であり、当該ＰＩＣは培地中であっても安定であることが示唆される。ところが、ＤＴＴを含む還元環境下においては、実施例２のＰＩＣの培地中のＤは、フリーのモノマー性Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡのＤと同程度まで増加しており、ｐＡｓｐ（−ＳＳ−Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ）のジスルフィド結合の開裂によりＣｙ３−ｓｉＲＮＡがＰＩＣから放出されたことが示唆される。

＜評価３＞
ポリアニオン交換反応に対するＰＩＣの安定性
０．１μｇのモノマー性ｓｉＲＮＡを含む比較例１のＰＩＣ溶液（２μＬ）を、ヘパリン溶液（ＨＥＰＥＳ緩衝液３μＬ中、０、０．５、１．０、１．５、２．０または２．５μｇ）と混合し、次いで、室温で３０分間インキュベートした。各溶液のヘパリンの最終濃度は、それぞれ、０、０．１、０．２、０．３、０．４または０．５μｇ／μＬであった。０．１μｇのｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）を含む実施例２のＰＩＣについても同様にして溶液を作成した。さらに、これらのそれぞれの溶液にＤＴＴを加えた溶液も作成した。作成したそれぞれの溶液についてＰＩＣの安定性を、アガロースゲル電気泳動により分析した。結果を図２Ａ〜図２Ｃに示す。実施例２のＰＩＣからｓｉＲＮＡを完全に放出するには０．４μｇ／μＬのヘパリンが必要であり（図２Ｂ）、これは、比較例１のＰＩＣからｓｉＲＮＡを完全に放出するに必要なヘパリンの量（０．２μｇ／μＬ：図２Ａ）の２倍であった。一方、ＤＴＴの存在下においては、実施例２のＰＩＣからｓｉＲＮＡを完全に放出するには０．２μｇ／μＬのヘパリンで十分であり（図２Ｃ）、これは、比較例１のＰＩＣからｓｉＲＮＡを完全に放出するに必要なヘパリンの量と同等であった。これらの結果から、ｓｉＲＮＡをｐＡｓｐ骨格にグラフトすることにより、ＰＩＣの安定性を高めることができることがわかる。その結果、酸化還元電位に応じて、本発明のＰＩＣからｓｉＲＮＡをスムーズかつ選択的に放出することができる。

＜評価４＞
細胞によるｓｉＲＮＡの取り込み
Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞による実施例２のＰＩＣまたは比較例１のＰＩＣの取り込みをフローサイトメトリーにより調べた。具体的には以下のとおりである。ルシフェラーゼを発現するマウスメラノーマ細胞Ｂ１６Ｆ１０−Ｌｕｃ（Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ社）を１２ウェル培養プレートに播種し（２００００細胞／ウェル）、次いで、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（１ｍＬ／ウェル）中で２４時間インキュベートした。モノマー性Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ、ＰＡｓｐ（−ＳＳ−Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ）、またはそれらのＰＡｓｐ（ＤＥＴ） ＰＩＣ（すなわち、実施例２および比較例１の標識化ＰＩＣ）を各ウェルに適用した（最終ｓｉＲＮＡ濃度＝１００ｎＭ）。１２時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、トリプシン処理により回収した。回収した細胞を１００ｇで遠心分離し、ＰＢＳ中に再懸濁した。ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＢＤ ＬＳＲ装置を用いて蛍光強度を調べた。実施例２の標識化ＰＩＣでインキュベートした細胞は、比較例１の標識化ＰＩＣでインキュベートした細胞の５倍の蛍光強度を示した（図３Ａおよび図３Ｂ）。この結果から、ｓｉＲＮＡをｐＡｓｐ骨格にグラフトすることにより、細胞のｓｉＲＮＡの取り込みが顕著に改善されることがわかる。これは、培地中であっても安定なＰＩＣが形成されることに起因すると推察される。

＜評価５＞
細胞内のｓｉＲＮＡの分布
Ｂ１６Ｆ１０−Ｌｕｃ細胞をガラス皿に播種し（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ ０．２ｍＬ中に２００００細胞）、２４時間インキュベートした。次いで、比較例１のＰＩＣまたは実施例２のＰＩＣを各ウェルに適用し（最終ｓｉＲＮＡ濃度＝１００ｎＭ）、さらに１２時間インキュベートした。酸性の後期エンドソームおよびリソソームをＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで、細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色した後、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）観察を行った。結果を図４Ａおよび図４Ｂに示す。図示された顕微鏡画像は、赤色および黄色の画素を有する。これらは、それぞれ、細胞質領域およびＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで染色された後期エンドソーム／リソソームからのＣｙ３信号に対応する。
実施例２のＰＩＣでインキュベートした細胞は、Ｃｙ３-ｓｉＲＮＡ由来の蛍光画素（赤色および黄色の画素として観察される）の数が、比較例１のＰＩＣでインキュベートした細胞よりも多かった（図４Ａおよび図４Ｂ）。このことは、上記フローサイトメトリーの結果と合致している。さらに、実施例２のＰＩＣでインキュベートした細胞においては、黄色画素に比べて格段に多くの赤色画素が明確に観察される。このことから、Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡがエンドソームから細胞質へと効果的に移行していることが示唆される。次いで、ＣＬＳＭ画像における赤色画素および黄色画素の数を基にＣｙ３-ｓｉＲＮＡと後期エンドソーム／リソソームとの共存比を計算することにより、エンドソームから細胞質への移行効率を評価した（図４Ｃ）。共存比は、実施例２のＰＩＣで処理された細胞については約３０％であり、一方、比較例１のＰＩＣで処理された細胞については約６０％であった。このことから、比較例１のＰＩＣに比べて、実施例２のＰＩＣの方がより効率的にエンドソームから移行していることがわかる。実施例２のＰＩＣにおけるこのような優れたエンドソームからの移行は、効率的な細胞によるｓｉＲＮＡの取り込み（上記評価４）と整合している。

＜評価６＞
ＰＩＣの遺伝子抑制効果および細胞毒性
Ｂ１６Ｆ１０−Ｌｕｃ細胞を２４ウェルプレートに播種し（１００００細胞／ウェル）、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（０．５ｍＬ／ウェル）中で２４時間インキュベートした。次いで、モノマー性Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ、実施例１のアニオン性ポリマー、またはそれらのｐＡｓｐ（ＤＥＴ） ＰＩＣ（すなわち、実施例２および比較例１のＰＩＣ）を各ウェルに適用した（最終ｓｉＲＮＡ濃度＝１００ｎＭ）。４８時間後、細胞を０．５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、Ｐｒｏｍｅｇａ社製の細胞培養溶解緩衝液０．２ｍＬで溶解した。可溶化液のルシフェラーゼ活性を、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ ＳｙｓｔｅｍおよびＢｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＭｉｔｈｒａｓ ＬＢ ９４０を用いたフォトルミネセンス強度から決定した。ｓｉＲＮＡを含まない対照ウェルに対するパーセントとして、得られたルミネセンス強度から相対発光強度単位（ＲＬＵ）を計算した。図５Ａは、ルシフェラーゼ（ｓｉＬｕｃ、標的配列）に対するｓｉＲＮＡまたはネガティブコントロール（ｓｉＳｃｒａｍｂｌｅ、非標的配列）に対するｓｉＲＮＡを含むＰＩＣで４８時間インキュベートした後の細胞からのＲＬＵを示す。実施例２のＰＩＣの遺伝子抑制効率は約８０％であり、比較例１のＰＩＣの遺伝子抑制効率（約３０％）よりも格段に高かった。さらに、ポリカチオンがＰＥＩである実施例３のＰＩＣおよび比較例２のＰＩＣについても同様の結果が得られた（図６）。このことから、本発明のアニオン性ポリマーを用いることによる効果は、ポリカチオンがｐＡｓｐ（ＤＥＴ）であるＰＩＣに限定されないことがわかる。さらに、ｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＳｃｒａｍｂｌｅ）またはモノマー性ｓｉＳｃｒａｍｂｌｅ由来のＰＩＣはルシフェラーゼ発現の減少を示さず、上記遺伝子抑制が標的に特異的であることが確認された。

モノマー性ｓｉＲＮＡ、実施例１のアニオン性ポリマー、またはそれらのｐＡｓｐ（ＤＥＴ） ＰＩＣ（すなわち、実施例２および比較例１のＰＩＣ）の細胞毒性を、上記遺伝子抑制試験と同様の条件下のＭＴＴアッセイにより調べた（図５Ｂ）。その結果、実施例２のＰＩＣを含む調べた系はすべて、細胞生存率の有意な減少を示さなかった。

＜評価７＞
ＩＦＮ−α産生についての評価
上記評価６の遺伝子抑制試験と同様の条件において、モノマー性ｓｉＲＮＡをＢ１６Ｆ１０−Ｌｕｃ、ｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）、ｐｏｌｙ（Ｉ）：ｐｏｌｙ（ｃ）またはそれらのｐＡｓｐ（ＤＥＴ） ＰＩＣで４８時間インキュベートした（各ウェルへのｐｏｌｙ（Ｉ）：ｐｏｌｙ（ｃ）のトランスフェクション量＝６５０ｎｇ（ｓｉＲＮＡ重量と同量）、ｐｏｌｙ（Ｉ）：ｐｏｌｙ（ｃ）／ｐＡｓｐ（ＤＥＴ） ＰＩＣについてのＮ／Ｐ比＝２０）。次いで、各ウェルの培地１００μＬを回収し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりインターフェロン−α産生を評価した。ｐｏｌｙ（Ｉ）：ｐｏｌｙ（ｃ）およびそのｐＡｓｐ（ＤＥＴ） ＰＩＣはポジティブコントロールとして用いた。なお、ｐｏｌｙ（Ｉ）：ｐｏｌｙ（ｃ）は、シグマアルドリッチ社から購入した。ＥＬＩＳＡ試験には、マウスインターフェロンα ＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅ社製）を製造者プロトコルにしたがって用いた。結果を図７に示す。ＩＮＦ−α産生に関して、非処理細胞と実施例２のＰＩＣで処理された細胞との間で違いは認められなかった。一方、ｐｏｌｙ（Ｉ）：ｐｏｌｙ（ｃ）、特にそのｐＡｓｐ（ＤＥＴ） ＰＩＣは、明らかにＩＮＦ−α産生を刺激した。

＜評価８＞
遺伝子抑制効果の鎖長依存性
ＥｘＧｅｎ５００をポリカチオンとして用い、当該ポリカチオンとモノマー性ｓｉＲＮＡ、ｐＡｓｐ_１００（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）またはｐＡｓｐ_２００（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）とからＰＩＣを形成した。ここで、ｐＡｓｐ_１００（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）は製造例６で得られたものであり、ｐＡｓｐ_２００（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）は、製造例１に準じて得られた重合度１９５のＰＢＬＡを用い、製造例６と同様にして得られたものである。ＰＩＣは、Ｎ／Ｐ比＝６で、製造者プロトコルにしたがって形成した。ｐＡｓｐ_１００（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）の１分子にはｓｉＲＮＡ分子が平均４個含まれており、ｐＡｓｐ_２００（−ＳＳ−ｓｉＲＮＡ）の１分子にはｓｉＲＮＡ分子が平均８個含まれている。
Ｂ１６Ｆ１０−Ｌｕｃを発現するマウスメラノーマ細胞を２４ウェルプレートに播種し（１００００細胞／ウェル）、２４時間インキュベートした。ＰＩＣを図８に示すｓｉＲＮＡ濃度で各ウェルに適用し、さらに４８時間インキュベートした。その後、ルシフェラーゼ活性を、評価６と同様にしてフォトルミネセンス強度から決定した。結果を図８に示す。この図から、より長いｐＡｓｐ鎖を用いることにより、より効率的な遺伝子抑制効果が得られることが示唆される。

＜評価９＞
ノックダウンアッセイ（１）
ホタルルシフェラーゼを発現するプラスミドＤＮＡ（ｐＧＬ３）およびウミシイタケルシフェラーゼを発現するプラスミドＤＮＡ（ｐＲＬ）を、遺伝子導入用カチオン性脂質ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（インビトロジェン社製）を用い、製造者プロトコルにしたがって、培養されたヒト肝癌細胞（Ｈｕｈ−７）にトランスフェクトした。本評価におけるノックダウンの標的遺伝子はｐＧＬ３であり、コントロールはｐＲＬである。プラスミドＤＮＡのトランスフェクションから４時間後、培地を新しい培地に取り替え、次いで、実施例２のＰＩＣをトランスフェクトした（ｓｉＲＮＡ濃度＝１０〜５０ｎＭ）。さらに４４時間インキュベートした後、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ルシフェラーゼの量を定量化した（図９Ａ）。さらに、比較例１のＰＩＣを用いたこと以外は上記と同様にしてルシフェラーゼの量を定量化した（図９Ｂ）。図９Ａから明らかなように、実施例２のＰＩＣは、ｐＲＬの発現に影響を与えることなくｐＧＬ３の発現のみを抑制した。このことから、実施例２のＰＩＣは、細胞のホメオスタシスに悪影響を与えないことが示唆される。一方、図９Ｂから明らかなように、比較例１のＰＩＣは、ｐＧＬ３の発現を有意に抑制しなかった。

ＧＬ３ルシフェラーゼ遺伝子の安定発現株であるマウスメラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ１０−Ｌｕｃ）で、遺伝子ノックダウンアッセイを行った。コントロールとして、ＥＧＦＰ配列を導入したｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＥＧＦＰ）を用いた。当該細胞を、複数のＮ／Ｐ比およびｓｉＲＮＡの最終濃度が１００ｎＭの実施例２に対応するＰＩＣまたは比較例１に対応するＰＩＣでトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、上記と同様にしてルシフェラーゼの量を定量化した（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。図１０Ａから明らかなように、実施例２に対応するＰＩＣは、Ｎ／Ｐ比が４以上で、ＧＬ３の発現を顕著に抑制した。この結果から、実施例２に対応するＰＩＣは、細胞毒性を示すことなく配列特異的な遺伝子ノックダウン効果を示すことがわかる。一方、図１０Ｂから明らかなように、比較例１に対応するＰＩＣは、ＧＬ３の発現を有意に抑制しなかった。

ノックダウンアッセイ（２）
実施例４および比較例３のＰＩＣを用いたこと以外は上記ノックダウンアッセイ（１）と同様にして試験を行った。実施例４に対応するＰＩＣについての結果を図１１Ａに、比較例３に対応するＰＩＣについての結果を図１１Ｂに示す。図１１Ａから明らかなように、実施例４に対応するＰＩＣは、ｐＲＬに比べてＧＬ３の発現をより効果的に抑制した。一方、図１１Ｂから明らかなように、比較例３に対応するＰＩＣは、ＧＬ３の発現を特異的に抑制しなかった。

ノックダウンアッセイ（３）
実施例５のＰＩＣを用いたこと以外は上記ノックダウンアッセイ（１）と同様にして試験を行った。結果を図１２に示す。図１２から明らかなように、ｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＧＬ３）からのＰＩＣは、Ｎ／Ｐ比が４以上で大きくなるにしたがって、ＧＬ３の発現を抑制した。一方、ｐＡｓｐ（−ＳＳ−ｓｉＥＧＦＰ）からのＰＩＣは、ＧＬ３の発現に変化がなかった。これらの結果から、本発明の実施例のＰＩＣは、低い細胞毒性で、細胞特異的な遺伝子ノックダウン効果を有することがわかる。

本発明のアニオン性ポリマー、ポリイオンコンプレックス、三元系ポリマー複合体、および薬学組成物は、製薬、医療等の分野で好適に用いられ得る。

配列番号１：ネガティブコントロールに対するセンス鎖ｓｉＲＮＡ
配列番号２：ネガティブコントロールに対するアンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ
配列番号３：ルシフェラーゼに対するセンス鎖ｓｉＲＮＡ
配列番号４：ルシフェラーゼに対するアンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ

Claims (13)

1. 下記一般式（ｉ）で表される繰り返し単位および下記一般式（ｉｉ）で表される繰り返し単位で構成されるアニオン性ポリマー：
   式中、ＲおよびＲ’’は、繰り返し単位ごとにそれぞれ独立して、任意の有機基であり、
   −Ｒ’は、繰り返し単位ごとにそれぞれ独立して、式−Ａ−Ｂ−Ｘで表され、Ｑは、水酸基またはアミノエチル結合が水酸基により置換されているＡ由来の基である（ここで、Ａは、１つ以上のアミノエチル結合を有する残基であり、Ｂは、生体内で開裂し得る結合であり、Ｘは低分子ＲＮＡである。）。
2. カルボキシル基を有するポリアミノ酸、カルボキシル基を有するポリビニル、カルボキシル基を有するポリエステル、カルボキシル基を有する多糖類、カルボキシル基を有するデンドリマー（カスケードポリマー）およびその組み合わせに由来する構造を有する、請求項１に記載のアニオン性ポリマー。
3. 前記生体内で開裂し得る結合が、ジスルフィド結合、アセタール結合およびヒドラゾン結合から選択される結合である、請求項１または２に記載のアニオン性ポリマー。
4. 下記一般式（Ｉ）で表される、請求項１から３のいずれかに記載のアニオン性ポリマー：
   ここで、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、水素原子、あるいは非置換または置換の直鎖状または分岐状Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル基、あるいはポリエチレングリコール鎖であり、Ａは、１つ以上のアミノエチル結合を有する残基であり、Ｂは、生体内で開裂し得る結合であり、Ｑは、水酸基またはアミノエチル結合が水酸基により置換されているＡ由来の基であり、Ｘは低分子ＲＮＡであり、ｌは１〜５００の整数であり、ｍは１〜４９９の整数であり、ｎは１〜５の整数であり、ただし、ｌとｍの合計は１０〜５００であり、ｌおよびｍで表される繰り返し単位はランダムに配列している。
5. 前記一般式（Ｉ）におけるＡが−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−であり、Ｑが−ＯＨである、請求項４に記載のアニオン性ポリマー。
6. 前記一般式（Ｉ）におけるｌが２以上の整数である、請求項４または５に記載のアニオン性ポリマー。
7. 請求項１から６のいずれかに記載のアニオン性ポリマーと、
   ポリエチレンイミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリ−（２−〔（２−アミノエチル）アミノ〕−エチル−アスパルタミド（ｐＡｓｐ（ＤＥＴ））、ポリエチレングリコールとポリアルギニンとのブロック共重合体、ポリエチレングリコールとポリリジンとのブロック共重合体、および、ポリエチレングリコールとポリ−（２−〔（２−アミノエチル）アミノ〕−エチル−アスパルタミドとのブロック共重合体（ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ））からなる群から選択されるカチオン性ポリマーと
   を含む、ポリイオンコンプレックス。
8. 請求項７に記載のポリイオンコンプレックスと、下記一般式（ＩＩ）で表される電荷変換型ポリマーと、を含む、三元系ポリマー複合体：
   Ｒ^１１およびＲ^１２は、それぞれ独立して、水素原子、あるいは非置換または置換の直鎖状または分岐状Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル基、あるいはポリエチレングリコール鎖であり、Ｒ^１３は、第１級アミンを有するアミン化合物由来の残基と下記式（１０）で表される化合物またはその誘導体との結合体であり：
   ここで、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、水素原子、あるいは非置換または置換のアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、複素環基、複素環−アルキル基、水酸基、アルコキシル基またはアリールオキシ基であり、ただし、Ｒ^ａとＲ^ｂとが一緒になって、それぞれが結合している炭素原子とともに芳香族環またはシクロアルキル環を形成してもよく、Ｒ^ａおよびＲ^ｂが結合している炭素原子間の結合は単結合または二重結合であり、
   ｍ１は１０〜５００の整数であり、ｍ２は１〜５の整数である。
9. 前記第１級アミンを有するアミン化合物由来の残基が下記式（１１）または（１２）で表される、請求項８に記載の三元系ポリマー複合体：
   −ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｒ−ＮＨ_２ （１１）
   式（１１）において、ｒは０〜５の整数であり；
   −〔ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｓ１〕_ｔ１−ＮＨ_２ （１２）
   式（１２）において、ｓ１は、〔ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｓ１〕ユニット間でそれぞれ独立して１〜５の整数であり、ｔ１は２〜５の整数である。
10. 前記第１級アミンを有するアミン化合物由来の残基が、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ _２ または−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ_２である、請求項８に記載の三元系ポリマー複合体。
11. 前記式（１０）で表される化合物が、下記式（Ｉａ）〜（Ｉｇ）で表される化合物から選択される少なくとも１つの化合物である、請求項８に記載の三元系ポリマー複合体：
    
12. 請求項７に記載のポリイオンコンプレックスと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む、薬学組成物。
13. 請求項８から１１のいずれかに記載の三元系ポリマー複合体と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む、薬学組成物。