JP5645186B2 - 電荷変換型三元系ポリプレックス - Google Patents
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Description
したがって、トランスフェクションプロセスの間の特定部位における反遮蔽方法(deshielding method)の開発に対して、多くの労力が集中している[7]。
R13は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基と、下記式(I):
で示される化合物又はその誘導体との結合体を表し、
m1は10〜500の整数を表し、m2は1〜5の整数を表す。〕
-NH-(CH2)r-X11 (11)
(式中、X11は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、rは0〜5の整数を表す。)
で示される基、又は下記一般式(12):
-〔NH-(CH2)s1〕t1 -X12 (12)
(式中、X12はX11と同義である。s1及びt1は、それぞれ独立し、かつ〔NH-(CH2)s1〕ユニット間で独立して、s1は1〜5の整数を表し、t1は2〜5の整数を表す。)
で示される基が挙げられ、-NH-NH2 又は -NH-(CH2)2-NH-(CH2)2-NH2 で示されるものが好ましい。
また、本発明は、核酸、カチオン性ポリマー及び前記アニオン性ポリマーを含むポリマー複合体を提供する。
本発明のポリマー複合体において、核酸としては、例えばプラスミドDNA又はsiRNAが挙げられる。
〔式中、R21及びR22は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、R23は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表し、m3は10〜500の整数を表し、m4は1〜5の整数を表す。〕で示される化合物、
〔式中、R31及びR32は、それぞれR21及びR22と同義であり、
R33は、置換されていてもよい炭素数11〜27の飽和若しくは不飽和の直鎖状若しくは分枝状の脂肪族炭化水素基又はステロールオキシカルボニル基を表し、
m5及びm6はそれぞれ独立して0〜500の整数を表し(但し、m5及びm6の合計は10〜500の整数を表す。)、m7は1〜5の整数を表し、m8は1〜5の整数を表す。
「/」の表記は、その左右に示された(m5+ m6)個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕で示される化合物、
〔式中、R41及びR42は、それぞれR21及びR22と同義であり、
R43はR33と同義であり、
R44は、R23と同義であり、
m9及びm10はそれぞれm5及びm6と同義であり、m11及びm12はそれぞれm7及びm8と同義であり、
「/」の表記は、前記と同義である。〕で示される化合物、及び
〔式中、R51及びR52は、それぞれR21及びR22と同義であり、
R53及びR54は、R23と同義であり、
L1は、NH、CO、下記一般式(13):
-(CH2)p1-NH- (13)
(式中、p1は1〜6の整数を表す。)
で示される基、又は下記一般式(14):
-L2a-(CH2)q1-L3a- (14)
(式中、L2aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3aは、NH又はCOを表す。q1は1〜6の整数を表す。)
で示される基を表し、
m13、m14及びm15はそれぞれ独立して0〜500の整数を表し(但し、m13、m14及びm15の合計は10〜500の整数を表す。)、m16及びm17はそれぞれm7及びm8と同義である。nは0〜500の整数を表す。
「/」の表記は、その左右に示された(m13+m14+m15)個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
で示される化合物からなる群から選択されるいずれかの化合物が挙げられる。
本発明のポリマー複合体(ポリプレックス)の好ましい態様において、アニオン性ポリマーは、カチオン性ポリマーと核酸との複合体の表面を覆っており、アニオン性ポリマーは中性pHにおいて負電荷を有し、弱酸性のpHにおいて正電荷を有するように変化することができるものである。
上記アニオン性ポリマーの特定の例としては、図 2A(c)に示されるポリマー(詳細には、“pAsp(DET-Aco)”)を挙げることができる。
遺伝子ベクターの研究分野において、HUVECのような毒性に敏感な初代細胞に遺伝子導入することは非常に困難である。本発明のポリプレックスは、このような種類の細胞に対してDNAやsiRNAなどの核酸を、毒性を惹起することなく高効率でデリバリーすることが可能である。また医学的な観点では、核酸デリバリーの主な障害は効率が低いこと、毒性が高いこと、及び血中で不安定なことが挙げられる。本発明の電荷変換三元系ポリプレックスは、細胞外ではマイナス電荷を帯びているため非常に低毒性であり、in vivoにおける遺伝子ベクターとして極めて有用である。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる米国仮出願61/126,077号(出願日:2008年4月30日)の明細書に記載の内容を包含する。
また、本明細書において列挙される全ての文書および刊行物は、あらゆる目的のために、本明細書においてその全体が参考として組み込まれる。
本発明は、核酸、カチオン性ポリマーおよびアニオン性ポリマーを含むポリマー複合体(ポリプレックス)であって、アニオン性ポリマーは中性pHにおいて負電荷を有し、弱酸性のpHにおいて正電荷を有するように変化することができるポリマー複合体である。また、本発明は、上記ポリマー複合体を構成するアニオン性ポリマーも提供する。
本発明のアニオン性ポリマーは、次式(1)で示されるものであり、電荷変換型ポリマーとして使用される。
〔式中、R11及びR12は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、
R13は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基と、下記式(I):
(式中、Ra及びRbは、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、複素環基、複素環アルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基若しくはアリールオキシ基を表す。また、RaとRbとが結合し、それぞれが結合している炭素原子と共に芳香環又はシクロアルキル環を形成していてもよい。Ra及びRbがそれぞれ結合している炭素原子間の結合は、単結合又は二重結合である。)
で示される化合物又はその誘導体との結合体を表し、
m1は10〜500の整数を表し、m2は1〜5の整数を表す。〕
-NH-(CH2)r-X11 (11)
(式中、X11は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、rは0〜5の整数を表す。)
-〔NH-(CH2)s1〕t1 -X12 (12)
(式中、X12はX11と同義である。s1及びt1は、それぞれ独立し、かつ〔NH-(CH2)s1〕ユニット間で独立して、s1は1〜5の整数を表し、t1は2〜5の整数を表す。)
本発明において、前記式(I)で示される化合物としては、例えば下記式(Ia)〜(Ig)で示される化合物のうちの少なくとも1種が挙げられる。
本発明の複合体の構成成分である特定のカチオン性高分子は、少なくとも一部にポリカチオン部分を有するカチオン性高分子である。
本発明において、カチオン性ポリマー(ポリカチオン)としては、上記pAsp(DET)(上記pAsp(DET-Aco)の基本骨格となるpAsp(DET)も含む)には限定はされず、カチオン性基を側鎖に有するポリペプチドとして公知のものが全て含まれ、これらは、当業者の技術常識により、pAsp(DET)の場合と同様に本発明の実施に利用することができる。ここで言うカチオン性基とは、水素イオンが配位して既にカチオンとなっている基に限らず、水素イオンが配位すればカチオンとなる基も含む意味である。カチオン性基を側鎖に有するポリペプチドとは、塩基性側鎖を有する公知のアミノ酸(リシン、アルギニン、ヒスチジン等)がペプチド結合してなるもののほか、各種アミノ酸がペプチド結合し、その側鎖がカチオン性基を有するように置換されたものも含まれる。
カチオン性ポリマー(モノポリマー)としては、例えば次式(2)〜(4)に示される化合物を挙げることができる。
〔式中、R21及びR22は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、R23は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表し、m3は10〜500の整数を表し、m4は1〜5の整数を表す。〕で示される化合物、
〔式中、R31及びR32は、それぞれR21及びR22と同義であり、
R33は、置換されていてもよい炭素数11〜27の飽和若しくは不飽和の直鎖状若しくは分枝状の脂肪族炭化水素基又はステロールオキシカルボニル基を表し、
m5及びm6はそれぞれ独立して0〜500の整数を表し(但し、m5及びm6の合計は10〜500の整数を表す。)、m7は1〜5の整数を表し、m8は1〜5の整数を表す。
「/」の表記は、その左右に示された(m5+ m6)個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕で示される化合物、
〔式中、R41及びR42は、それぞれR21及びR22と同義であり、
R43はR33と同義であり、
R44は、R23と同義であり、
m9及びm10はそれぞれm5及びm6と同義であり、m11及びm12はそれぞれm7及びm8と同義であり、
「/」の表記は、前記と同義である。〕で示される化合物が挙げられる。
-NH-(CH2)r-X21 (22)
〔式(22)中、X21は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、rは0〜5の整数を表す。〕
-〔NH-(CH2)s2〕t2 -X22 (23)
〔式(23)中、X22は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表す。s2及びt2は、それぞれ独立し、かつ〔NH-(CH2)s2〕ユニット間で独立して、s2は1〜5(好ましくは2)の整数を表し、t2は2〜5(好ましくは2)の整数を表す。〕
一般式(2)中、-R23基としては、具体的には「-NH-NH2」又は「-NH-(CH2)2-NH-(CH2)2-NH2」が特に好ましく、中でもエチレンジアミンユニットを含む後者がより好ましい。
一般式(2)中、m3は、限定はされないが、100〜500、好ましくは30〜150(より好ましくは60〜100)の整数を表し、m4は、限定はされないが、好ましくは1〜5(より好ましくは1〜2)の整数を表す。
上記式(2)〜(4)で表されるポリ(アミノ酸)は、例えば、公知のアスパラギン酸エステル由来のN−カルボン酸無水物の重合により製造したポリアミノ酸エステルを、R2 3、R33及びR44の基のポリアミン残基に対応するポリアミンを用いてアミノリシスを行うことによりポリ(アミノ酸)の側鎖にポリアミン残基を導入し、こうして導入したポリアミン部分のアミノ基と、上記脂肪族炭化水素残基を有するアシル基に対応するカルボン酸のカルボキシル基を必要により活性化した後、上記アミノ基に対して活性化カルボン酸の適量を反応させることにより、製造することができる。
本発明において、カチオン性高分子は、上記の通りポリカチオン部分のみからなるポリマー(ホモポリマー)であってもよいが、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)部分及びポリカチオン部分を有するブロックコポリマー又はグラフトポリマーであってよく、限定はされず、本発明の複合体の用途等によって適宜好ましい態様を選択することができる。
本発明のポリプレックスは、核酸とブロックコポリマー中の一部(ポリカチオン部分)とが相互作用してイオンコンプレックスとなるコア部分を形成し、当該ブロックコポリマー中の他の部分(PEG部分を含む部分)がコア部分の周囲にシェル部分を形成した状態の、コア-シェル型のミセル状複合体ということができる。
ブロックコポリマーとしては、下記一般式(1)で示されるものが挙げられる。
〔式中、R51及びR52は、それぞれR21及びR22と同義であり、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表す。
R53及びR54は、R23と同義であり、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表す。
L1は、NH、CO、下記一般式(13):
-(CH2)p1-NH- (13)
(式中、p1は1〜6の整数を表す。)
で示される基、又は下記一般式(14):
-L2a-(CH2)q1-L3a- (14)
(式中、L2aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3aは、NH又はCOを表す。q1は1〜6の整数を表す。)
で示される基を表し、
m13、m14及びm15はそれぞれ独立して0〜500の整数を表し(但し、m13、m14及びm15の合計は10〜500の整数を表す。)、m16は1〜5の整数を表し、m17は1〜5の整数を表し、nは0〜500の整数を表す。
「/」の表記は、その左右に示された(m13+m14+m15)個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
また上記アルキル基の置換基としては、例えば、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、炭素数1〜6のアルコキシカルボニル基、炭素数2〜7のアシルアミド基、シロキシ基、シリルアミノ基、及びトリアルキルシロキシ基(各アルキルシロキシ基は、それぞれ独立に、炭素数1〜6である)等が挙げられる。
上記置換基がアセタール化ホルミル基である場合、酸性の温和な条件下で加水分解することにより、他の置換基であるホルミル基(アルデヒド基;-CHO)に転化することができる。
-(CH2)p1-NH- (4)
〔式(4)中、p1は1〜6(好ましくは2〜3)の整数を表す。〕
で示される基、又は下記一般式(5):
-L2a-(CH2)q1-L3a- (5)
〔式(5)中、L2aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3aは、NH又はCOを表す。q1は1〜6(好ましくは2〜3)の整数を表す。〕
で示される基を表す。
また、ポリカチオン部分を構成する各モノマー単位の重合度であるm13、m14及びm15については、それぞれ互いに独立して、0〜500(好ましくは0〜100、より好ましくは10〜100、さらに好ましくは20〜100、さらにより好ましくは30〜100)の整数を表す(但し、m13、m14及びm15の合計(m13+m14+m15)は、10〜500(好ましくは10〜300、より好ましくは20〜200、さらに好ましくは30〜150、さらに好ましくは40〜120、さらにより好ましくは50〜100、特に好ましくは60〜70)である。)。
一般式(5)で示されるカチオン性高分子の製造方法は、限定はされないが、例えば、R51とPEG鎖のブロック部分とを含むセグメント(PEGセグメント)を予め合成しておき、このPEGセグメントの片末端(R51と反対の末端)に、所定のモノマーを順に重合し、その後必要に応じて側鎖をカチオン性基を含むように置換又は変換する方法、あるいは、上記PEGセグメントと、カチオン性基を含む側鎖を有するブロック部分とを予め合成しておき、これらを互いに連結する方法などが挙げられる。当該製法における各種反応の方法及び条件は、常法を考慮し適宜選択又は設定することができる。
-(CH2)p2-NH2 (6)
〔式(6)中、p2は1〜5(好ましくは2〜3)の整数を表す。〕
で示される基、又は一般式(7):
-L2b-(CH2)q2-L3b (7)
〔式(7)中、L2bは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3bは、NH2又はCOOHを表す。q2は1〜6(好ましくは2〜3)の整数を表す。〕
で示される基であることが好ましい。
本発明の複合体において、コア部分の構成成分として内包する核酸は、1つの態様ではプラスミドDNA又はsiRNA(small interfering RNA)である。siRNAは、RNA干渉(RNAi:RNA interference)利用して目的の遺伝子の発現を抑制し得るものであればよく、例えば、目的遺伝子としては、癌(腫瘍)遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、細胞周期関連遺伝子、増殖シグナル遺伝子等が好ましく挙げられる。また、siRNAの塩基長は、通常、30塩基未満(好ましくは19〜21塩基)であればよく、限定はされない。
siRNA等の核酸分子はポリアニオンとなるため、前記ブロックコポリマーのポリカチオン部分の側鎖と、静電的相互作用により結合(会合)することができる。
本発明の複合体は、核酸とポリカチオンとでポリプレックスを形成させ、そこに電荷変換型ポリマーである前記アニオン性ポリマー(例えばpAsp(DET-Aco))を添加することにより得ることができる高分子化合物の複合体であり、三元系ポリプレックス(ポリイオンコンプレックス:PIC)とも呼ばれる。
本発明の三元系ポリプレックスは、核酸とポリカチオン部分とが静電的相互作用をしてコア部分を形成し、その外側をアニオン性ポリマー(例えばpAsp(DET-Aco))が覆う形態となっている。
本発明のPICの大きさは、限定はされないが、例えば、動的光散乱測定法(DLS)による粒径が5〜200 nmであることが好ましく、より好ましくは10〜150nmである。
本発明の三元系ポリプレックスの大きさは、限定はされないが、例えば、動的光散乱測定法(DLS)による粒径が30〜150nmであることが好ましく、より好ましくは50〜100nmである。
本発明においては、上述した三元系ポリプレックス(単に「ポリプレックス」ということもある)を含む核酸送達デバイスが提供される。本発明の送達デバイスは、標的細胞内へ安定したまま送達することが困難であった核酸を、容易に安定化状態にすることができる。また、細胞内外のpHの変化を利用し、ポリプレックスのコア部分に内包した所望の核酸を、in vitroおよびin vivoのいずれにおいても、標的細胞内に効率的に導入する手段として使用することができる。
本発明の送達デバイスは、各種疾患の原因となる細胞に所望の核酸を導入する治療(遺伝子治療)に用いることができる。よって本発明は、前記ポリプレックスを含む各種疾患の治療用の医薬組成物、当該医薬組成物を有効成分として含む各種疾患用の遺伝子治療剤、及び、前述したPICを用いる各種疾患の治療方法(特に遺伝子治療方法)を提供することもできる。
上記医薬組成物については、薬剤製造上一般に用いられる賦形剤、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤及び等張化剤等を適宜選択して使用し、常法により調製することができる。また、医薬組成物の形態は、通常、静脈内注射剤(点滴を含む)が採用され、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態等で提供される。
本発明の核酸送達用キットは、前記アニオン性ポリマー又は本発明のポリマー複合体を含むことを特徴とするものである。当該キットは、例えば癌細胞等の各種標的細胞に対してsiRNAを導入する、RNAiを利用した遺伝子治療に好ましく用いることができる。
本発明のキットにおいて、ポリマーの保存状態は、限定はされず、その安定性(保存性)及び使用容易性等を考慮して溶液状又は粉末状等の状態を選択できる。
本発明のキットは、標的細胞内に導入する所望の核酸(例えばプラスミドDNA又はsiRNA)をコア部分としたポリイオンコンプレックス(PIC)を調製するために使用され、調製したPICは、標的細胞への核酸送達デバイスとして有効に用いることができる。
1. 材料
N,N-ジメチルホルムアミド(DMF) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd, Japan)、ジクロロメタン(DCM) (Wako, Japan)、n-ブチルアミン、エチレンジアミン(1,2-ジアミノエタン)、ジエチレントリアミン(ビス(2-アミノエチル)アミン) (Tokyo Chemical Industry
Co. Ltd, Japan)を購入して、使用前に再蒸留した。酢酸および塩酸を購入して、さらに精製することなく使用した(Wako, Japan)。1-メチル-2-ピロリジノン(NMP)、cis-アコニチン酸無水物、無水コハク酸、ウシ血清アルブミンをSigma (St. Louis, MO)から購入した。β-ベンジル-L-アスパラテート-N-カルボキシ-無水物(BLA-NCA)を、Nippon OilおよびFats Co., Ltd.(Tokyo, Japan)から得た。
2-1. PBLA (ポリ(β-ベンジル-L-アスパラテート))の合成 (2)
n-ブチルアミンの末端アミノ基によって開始されるBLA-NCAの開環重合によってPBLAを調製した。n-ブチルアミン(0.0417 mmol)を5 mLのDMF/DCM (1:10)に溶解した。8 mLのDMF/DCM (1:10)中のBLA-NCA (4.60 mmol)溶液をn-ブチルアミンの溶液に添加し、反応混合物をアルゴン雰囲気下35°Cで48時間撹拌した。得られるポリマーをジエチルエーテル(150 mL)に沈殿させた。粗沈殿物をジエチルエーテルで2回洗浄し、白色粉末として最終生成物を得た。1H NMR測定から、BLA単位の重合度(DP)は、 102であると計算された。JEOL EX
300分光計を使用して300MHzにおいて全てのNMRスペクトルを記録した。テトラメチルシランからダウンフィールドへの化学シフトをppmでレポートした。1H NMR (CDCl3): δ0.87 (3H, CH3CH2CH2CH2NH), δ1.27 (3H, CH3CH2CH2CH2NH), δ2.69, 3.12(206H, COCHCH2COOCH2Ph, CH3CH2CH2CH2NH), δ4.28 (102H, COCHNH), δ5.07(204H, COOCH2Ph), δ7.27(510H, COOCH2Ph), δ8.88(102H, COCHNH).
PBLA (0.802 mmolのベンジルエステル)をNMP (10 mL)に溶解した。ジエチレントリアミン(DET) (40.1 mmol)を溶液に添加して、反応混合物を0°Cで1時間撹拌した。得られた溶液を10% 酢酸水溶液(30 mL)に滴下した。中和溶液を0.01M 塩酸溶液(× 3)および蒸留水(× 3)に対して4°Cで透析した。凍結乾燥の後に、白色粉末のpAsp(DET)を塩酸塩として得た。1H NMRにおいてベンジルピークは確認されなかった。pAsp(EDA)の合成は、DETの代わりにエチレンジアミン(EDA)を使用することを除いて、同様に行った。
pAsp(DET) (0.055 mmolの一級アミン)を0.5 M NaHCO3 緩衝液 (pH 9.0, 50 mL)に溶解した。Cis-アコチニン酸無水物(2.76 mmol ) (Aco)を溶液に添加し、0°Cで3時間撹拌した。反応混合物をAmicon Ultra (MWCO=10,000; Millipore (Billerica, MA))を用いて精製した(×3 蒸留水使用)。凍結乾燥の後に、最終生成物を白色粉末として得た。1H NMRから計算したところ、変換収率は99%を超えた。pAsp(EDA-Suc)の合成は、AcoおよびpAsp(DET)の代わりにコハク酸無水物(Suc)およびpAsp(EDA)を用いることを除いて、同様に行った。
スキーム:
pAsp(DET) (4)、pAsp(EDA-Suc) (5)およびpAsp(DET-Aco) (6)の合成スキーム (a) BLA-NCA, DMF/DCM; (b) DET (またはEDA), NMP; (c) cis-アコニチン酸無水物(またはコハク酸無水物), pH 9.0 緩衝液
CAGプロモーターとルシフェラーゼをコードするプラスミドは、RIKEN Bioresource Center (Japan)によって提供された(H. Niwa et al. Gene, 1991, 108, 193-199)。また、SEYFP-F46L (Venus)のフラグメント(これは、黄色蛍光タンパク質の変異体であり、F46Lの変異を含む(T. Nagai et al. Nat. Biotechnol., 2002, 20, 87-90))はRIKENによって提供され、このフラグメントをpCAccベクターに挿入した(pCAcc+Venus)。コンピテントなDH5 E. coli 中でこのプラスミドを増幅させ、HiSpeed Plasmid MaxiKit (QIAGEN Science Co., Inc., Germany)を用いて精製した。プラスミド濃度は、260 nmの吸光度によって決定した。
種々のN/P比率(4~8)でpAsp(DET) (1 mg/mL)とプラスミドDNA (50 μg/mL)とを単純に混合することによって、正のポリプレックスを得た。ここでN/P比率は、pAsp(DET)中のアミン単位のpDNAのリン酸単位に対する過剰なモル比率として規定される。RTで15分間インキュベートした後、正のポリプレックスにpAsp(DET-Aco) (またはpAsp(EDA-Suc))溶液(1 mg/mL)を添加した。pAsp(DET)とpAsp(DET-Aco) (またはpAsp(EDA-Suc))との間のモル比率は、1〜4の間で変動させた。RTで15分以上インキュベーションした後、三元系ポリプレックスを得た。
各ポリプレックスを水性緩衝液(pH 5.5 酢酸緩衝液 (10 mM)またはpH 7.4 Tris-HCl緩衝液(10 mM))中に希釈した。プラスミドDNAの最終濃度は33 μg/mLであった。各サンプルを37°Cでインキュベートした後、Zetasizer Nano-ZS (green badge, ZEN3500, Malvern,
Ltd. Malvern, U. K.)を使用して633nmのHe-Neイオンレーザーを用いて動的光散乱(DLS)測定を行った。
DNA/pAsp(DET) 正のポリプレックス(N/P比率= 6) およびDNA/pAsp(DET)/pAsp(DET-Aco)三元系ポリプレックス(N/P ratio = 6)のpH 7.4でのDLS分布を図 5.に示す。
正のポリプレックスおよび三元系ポリプレックスのゼータ電位を、Zetasizer Nano-ZS (green badge, ZEN3500, Malvern, Ltd. Malvern, U. K.)を使用して633 nm のHe-Neイオンレーザーを用いて、レーザードップラー電気泳動から決定した(検出角度173°、温度37°C)。各複合体を水性緩衝液(pH 5.5 酢酸緩衝液(10 mM)またはpH 7.4 Tris-HCl緩衝液(10 mM))中に希釈した。プラスミドDNAの最終濃度は、33 μg/mLであった。各サンプルを37°Cでインキュベートした。得られた電気泳動の移動度から、各複合体のゼータ電位をSmoluchowski方程式: ζ = 4πηυ/e (式中、ηは溶媒の粘度であり、υは電気泳動移動度であり、そしてeは溶媒の誘電率である)によって計算した。
ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)をコラーゲンでコーティングした24ウェル培養プレートにまき、インスリン、hEGF、GA-1000、hFGF-BおよびFBS (5%)を含む400 μLのEBMTM-2中で一晩インキュベートした。40 μLの各サンプル溶液を培地に添加した(1 μg プラスミドDNA/ウェル)。24時間インキュベートした後、培地をサンプルを含まない新しい培地と交換し、その後さらに24時間インキュベートした。400 μLのDulbeccco’s PBSで細胞を洗浄し、100 μLのセルカルチャーPromega溶解緩衝液によって溶解した。溶解物のルシフェラーゼ活性は、Mithras LB 940 (Berthold Technologies)を用いて光ルミッセンス強度から評価した。Micro BCATM タンパク質アッセイ試薬キット(Pierce)によって決定した溶解物中のタンパク質の量により、得られたルシフェラーゼを正規化した。Venus (YFP)発現の観察は、Biozeero BZ-8000 (Keyence)を用いて450-490 nm (発光フィルター: 510-560 nm)の励起波長において行った。
細胞毒性アッセイのために、HUVECをサンプルと共に24時間インキュベートし、MTTアッセイ(Cell Counting Kit-9, Dojindo, Kumamoto, Japan)によって生存率を評価した。製造業者によって提供されたプロトコルに従って、450 nmにおいて吸光度を読み取ることによって各ウェルを測定した。同時にTris-HCl 緩衝液(10 mM, pH 7.4)のみと共にインキュベートしたコントロール細胞に対する相対値(%)として結果を表した。
ウシ血清アルブミン(BSA)溶液(Tris-HCl 緩衝液中(10 mM, pH 7.4))によって各サンプルを希釈した。最終プラスミド濃度は33 μg/mLであり、最終BSA濃度は2 mg/mLであった。37°Cでインキュベートした後、上記に説明したとおりにDLSによって複合体のサイズを測定した。
ラベルIT核酸ラベリングキット(Mirus, Madison, WI)を用いてCy5でpDNAをラベルした。HUVEC (30,000細胞)を35 mm ガラスベースディッシュ(Iwaki, Japan)にまき、インスリン、hEGF、GA-1000、hFGF-BおよびFBS (5%)を含む1mLのEBMTM-2中で一晩インキュベートした。培地を新しい培地と交換した後、3 μg Cy 5-ラベルpDNAを含むポリプレックスまたは三元系複合体の溶液120 μL(N/P =6; pAsp(DET-Aco) (またはpAsp(EDA-Suc)/pAsp(DET)モル比率= 2)をガラスディシュに塗布した。インキュベートの後、培地を除去して細胞をPBSで二回洗浄した。細胞内分布をCLSMで観察し、その後、酸性の後期エンドソームおよびリソソームをLysoTracker Green (Molecular Probes, Eugene, OR)で染色し、核をHoechst 33342 (Dojindo Laboratories, Japan)で染色した。LSM 510 (Carl Zeiss, Germany)を使用して(63×対物レンズ(C-Apochromat, Carl Zeiss, Germany)使用)、LysoTraker、Cy 5、およびHoechst 33342について、それぞれ488 nm (Arレーザー)、633 nm (He-Neレーザー)および710 nm (Mai Taiレーザー)の励起波長で、CLSM観察を行った。
プラスミドDNAとポリカチオンとの間のポリプレックスを調製した。ポリカチオンとして、本発明者らは、ポリ{N-[N’-(2-アミノエチル)-2-アミノエチル]アスパルトアミド} (pAsp(DET)) (図 2Aを参照のこと)を選択した。これは、本発明者らのグループによって、従来のポリカチオン(PEIを含む)と比較して細胞毒性の低い、エンドソームを破壊し膜を不安定化する部分であることが証明されている[9]。ポリカチオンの量が過剰であるので(N/P比率= 4~8)、ポリプレックスは、およそ+40 mVのゼータ電位の正の表面電荷を示した。次いで、ポリプレックスに、1〜4モル等価の電荷変換型ポリマーであるポリ(N-{N’-[(N’’-cis-アコニチル)-2-アミノエチル]-2-アミノエチル}アスパルトアミド) (pAsp(DET-Aco)) (図 2Aを参照のこと)を添加して三元系ポリプレックスを形成した。
(1)Poly(L-lysine) (PLL)ホモポリマーの合成
三方コックを備えたナス型フラスコを真空乾燥させ、アルゴン(Ar)雰囲気下でLys(TFA)-NCA (1.01 g, 3.77 mmol)を加え、次いでDMSO (8 mL)を加えて溶解させた。開始剤としてn-ブチルアミン(5.4 mg, 73.8 mmol)をモノマー溶液に加え、35℃の恒温槽中で48時間ほど攪拌した。反応終了後、激しく攪拌した過剰量のジエチルエーテル中に重合溶液をゆっくりと滴下していき、ポリマーを沈殿させた。約1時間攪拌を続け、ポリマーがほぼ全てが沈殿した後に、上澄み溶液をデカンテーションにて除去した。沈殿したポリマーは、室温にて減圧乾燥させた。1H NMRによる分析から、連鎖長(リジンの重合度(DP))は52であった。
PAsp(DET(x)) (x= aco and suc)は、実施例1と同様にして合成した。カチオン性ポリマーPAsp(DET)の連鎖長(アスパラギン酸ユニット数)は133のものを用いた。
(i) pDNA/PLL カチオン性polyplex
HEPESバッファー(10mM, pH 7.4) に溶解させたpDNA(CAG-Luc)とPLL(DP= 52)をN/P=2になるように混合し、4℃にて一晩静置してpDNA/PLLポリプレックス(2/3 OD)を調整した。
(ii) 三元系polyplex
上述のカチオン性ポリプレックスpDNA/PLL溶液に対し、PAsp(DET(aco))またはPAsp(EDA(suc))を所定量添加して4℃にて3時間静置させた後、三元系ポリプレックスを調整した。
三元系polyplexの粒径およびゼータ電位測定は、実施例1と同様に行った。
24穴well dish に1well あたり2万個の細胞をまき、24時間培養後、31μlのポリプレックス(pDNA濃度:2/3OD)を添加した。24時間細胞とポリプレックスを接触させ、培地(DMEM)の交換を行った後さらに24時間培養を行った。遺伝子発現活性は、Luciferase Assay法にて評価した。
培養細胞としては、ヒト肝癌細胞(Huh-7)と正常ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を用いた。
6穴well dish に1well あたり4万個の細胞(Huh-7)をまき、24時間培養後、蛍光色素であるCy5にてラベル化されたpDNAを用いて調整したポリプレックス(pDNA濃度:2/3 OD)を60μl添加した。24時間細胞後にポリプレックスを接触させ、2〜3回PBSで洗浄した後、トリプシン処理を行った。測定はBD Biosciences社のBD LSR IIアナライザーを用いた。
35 mmシャーレに、細胞(Huh-7)を5万個/wellまき、24時間培養後、蛍光色素であるCy5にてラベル化されたpDNAを用いて調製したポリプレックス(pDNA濃度:2/3OD)を90μl添加した。24時間細胞を行い、次いでポリプレックスを接触させた後、5 μM Lysto Tracker(20 μL)とHoechst(10 μL)を用いて核およびエンドソームを染色した。測定を行う直前に、3回PBS 洗浄を行い、2 mlの培地を加え観察を行った。共焦点レーザー顕微鏡はカールツァイス社製のLSM-510を用いた。
(1)Poly(L-lysine) (PLL)ホモポリマーの合成
1H NMRによる分析から、脱保護前のポリマーP[Lys(TFA)]の連鎖長(リジンの重合度(DP))は52であった。またゲル浸透クロマトグラフィー(GPC:Gel Permeation Chromatography)による分析の結果、オリゴマーなどを含まず、単分散性の高いポリマーであった(図10)。
脱保護後のポリマーサンプルに対しも、同様に1H NMRおよびGPCによる分析を行った。
その結果、P[Lys(TFA)]側鎖の保護基TFAの除去を確認し、さらに水系GPCによる分析からは主鎖の加水分解などは認められなかった。ポリマーの回収率は77%であった。
PAsp[DET(aco)]およびPAsp[EDA(suc)]は、実施例1と同様にして合成した。
カチオン性のポリプレックスpDNA/PLLに対して、PAsp[DET(aco)]またはPAsp[EDA(suc)]を添加して三元系ポリプレックスの形成を試みた。ゼータ電位測定からは、PAsp(DET(x))をpDNAに対して等倍, 2倍, 3倍, 4倍, 5倍モルと順に添加することにより、負の表面電荷を示唆する結果が得られた(図11)。さらに、光散乱測定からはPAsp(DET(x))の添加量に関わらず、約110~130 nmの粒径を有するポリプレックスの形成が認められた。これらの結果から、2次凝集などを伴わずに、安定した粒径を有するアニオン性の三元系polyplexが形成されたと考えられる。
PAsp(EDA(suc))を添加した三元系polyplexにおいては、遺伝子発現活性は何も加えていないカチオン性pDNA/PLLと同等もしくはそれ以下であった。一方、PAsp[DET(aco)]を添加した三元系polyplexの遺伝子発現活性は、pDNA/PLL と比較してHuh-7に対しては約20倍、HUVECでは約10倍の活性上昇が認められた(図12)。PAsp[DET(aco)]はpHに応答してポリマーの電荷が反転するCharge-Conversion機能を有しているため、この特性が発現活性上昇に寄与したと思われる。
カチオン性ポリプレックスであるpDNA/PLLのみ、そしてこれにPAsp[DET(aco)]またはPAsp[EDA(suc)]を添加して得られた2つの三元系ポリプレックスに対する細胞内取り込み評価を行った。フローサイトメーターによる分析の結果、どのポリプレックスにおいてもほぼ同様の取り込み量であった(図13)。
PAsp[DET(aco)]添加系においては、若干の取り込み量増加が見られたが、この増加量では、20倍もの遺伝子発現活性上昇を説明できない。つまりポリプレックスの細胞内動態挙動の違いが遺伝子発現活性上昇に反映しているものと予想される。
カチオン性ポリプレックスであるpDNA/PLLのみ、そしてこれにPAsp[DET(aco)]またはPAsp[EDA(suc)]を添加して得られた2つの三元系ポリプレックスに対する細胞内動態観察を共焦点レーザー顕微鏡を用いて行った。カチオン性ポリプレックスpDNA/PLLおよびPAsp[EDA(suc)]を添加した三元系ポリプレックスにおいては、黄色の領域が多く観察されている(図14)。これはポリプレックスがエンドソーム内にトラップされた状態を反映している。一方で、PAsp[DET(aco)] を添加した三元系ポリプレックスにおいては、赤い領域が多く分布している。これはポリプレックスがエンドソームから脱出し、細胞質中に移行した状態を強く示唆している(図14)。
(1)N−スクシイミジルオクタデカノエートの合成
N−スクシンイミジルオクタデカノエートの合成は、公知方法[N.M.Howarth,W.E.Lindsell,E.Murray,P.N.Preson,Tetrahedron 61(2005)8875-8887.]に従って行った。ステアリン酸(1.87g,6.56mmol)とN−ヒドロキシスクシンイミド(0.76g,6.56mmol)を80mLのジクロロメタン(DCM)に溶解し、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸(WSC)(1.25g,6.56mmol)と48時間反応させた。その後、水で洗浄し、DCMで2回抽出、MgSO2で乾燥することによって白色の粉末を得た(収量1.4g,収率56%)。ステアリン酸のカルボキシル基の転換率は、1H-NMRによって算出したところ96%であった。
poly(L-Lysine)(分子量20,000)とDIPEAをメタノールに溶解し、少量のジクロロメタンに溶解したN−スクシンイミジルオクタデカノエートと4℃で24時間反応させた。反応後、ジエチルエテール中で再沈し、濾過したサンプルをメタノール/水(1:1 v/v)に溶解した後、4℃で0.01M HCl水溶液に対して3回、蒸留水に対して1回透析を行った。その後、凍結乾燥によって回収することによって、側鎖にステアロイル基が15%、28%および45%導入されたpoly(L-Lysine)(PLL-ST)を合成した。
siRNA/PLL-STポリプレックスは、HEPESバッファー(10mM, pH 7.4) に溶解させたsiRNAとPLL-STをsiRNAのリン酸残基とリシン残基の比が1.4になるように混合し、その後、PAsp(DET(aco))を異なる混合比で混合して4℃にて3時間静置させることにより、三元系ポリプレックスを調製した。
(1)siRNAを搭載した三元系ポリプレックスの遺伝子ノックダウン効率の評価
siRNAを搭載した三元系ポリプレックスの遺伝子ノックダウン効率は、ステアロイル基の導入効率の増加に伴って増強され、PAsp(DET(aco))を添加した場合は、混合比が0.7および1.4の時は遺伝子ノックダウン効率が増強されるが、混合比が2.8および5.6の時は遺伝子ノックダウン効率が低下することが確認された(図16(A))。PAsp(DET(aco))の混合比が0.7および1.4の時は、PAsp(DET)が露出されることによって、ポリプレックスのエンドソーム脱出が促進され、混合比が2.8および5.6の時は、ポリプレックスの表面がアニオン性になることによってその細胞内取り込み量が減少するものと考えられ、その結果として図16(A)の結果が得られたものと考えられる。
siRNAを搭載した三元系ポリプレックスの細胞毒性は、PLL-STのステアロイル基導入率が28%および45%であってPAsp(DET(aco))の混合比が0.7および1.4の三元系ポリプレックスにおいて、増加が認められたが、PLL-STのステアロイル基導入率が15%の三元系ポリプレックスおよびPLL-STのステアロイル基導入率が28%および45%であってPAsp(DET(aco))の混合比が2.8および5.6の三元系ポリプレックスにおいては、減少することが明らかになった(図16(B))。これらの結果は、PLLのステアロイル基の過度の導入はその細胞毒性を増加させうるが、PAsp(DET(aco))の添加によって細胞毒性を低減することができることを示している。
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Claims (9)
- 次式(1):
〔式中、R 11 はCH 2 CH 2 CH 2 CH 3 を表し、R 12 は水素原子を表し、R 13 は一級アミンを有するア ミン化合物由来の残基と、下記式 (Ia)-(Ig):
から選択されるいずれかの化合物との結合体を表し、
m1は10〜500の整数を表し、m2は1〜5の整数を表す。〕
で示されるアニオン性ポリマー。 - 一級アミンを有するアミン化合物由来の残基が、下記一般式(11):
-NH-(CH2)r-X11 (11)
(式中、X11は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、rは0〜5の整数を表す。)
で示される基、又は下記一般式(12):
-〔NH-(CH2)s1〕t1 -X12 (12)
(式中、X12はX11と同義である。s1及びt1は、それぞれ独立し、かつ〔NH-(CH2)s1〕ユニット間で独立して、s1は1〜5の整数を表し、t1は2〜5の整数を表す。)
で示される基である、請求項1に記載のアニオン性ポリマー。 - 一級アミンを有するアミン化合物由来の残基が、-NH-NH2又は-NH-(CH2)2-NH-(CH2)2-NH2 で示されるものである、請求項1に記載のアニオン性ポリマー。
- 前記式(I)で示される化合物が、下記式(Ib)又は(Ic)で示される化合物である、 請求項1に記載のアニオン性ポリマー。
- 核酸、カチオン性ポリマー及び請求項1〜4のいずれか1項に記載のアニオン性ポリマーを含むポリマー複合体。
- 核酸がプラスミドDNA又はsiRNAである、請求項5に記載のポリマー複合体。
- カチオン性ポリマーが次式(2):
〔式中、R21及びR22は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、R23は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表し、m3は10〜500の整数を表し、m4は1〜5の整数を表す。〕で示される化合物、
次式(3):
〔式中、R31及びR32は、それぞれR21及びR22と同義であり、
R33は、置換されていてもよい炭素数11〜27の飽和若しくは不飽和の直鎖状若しくは分枝状の脂肪族炭化水素基又はステロールオキシカルボニル基を表し、
m5及びm6はそれぞれ独立して0〜500の整数を表し(但し、m5及びm6の合計は10〜500の整数を表す。)、m7は1〜5の整数を表し、m8は1〜5の整数を表す。
「/」の表記は、その左右に示された(m5+ m6)個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕で示される化合物、
次式(4):
〔式中、R41及びR42は、それぞれR21及びR22と同義であり、
R43はR33と同義であり、
R44は、R23と同義であり、
m9及びm10はそれぞれm5及びm6と同義であり、m11及びm12はそれぞれm7及びm8と同義であり、
「/」の表記は、前記と同義である。〕で示される化合物、及び
次式(5):
〔式中、R51及びR52は、それぞれR21及びR22と同義であり、
R53及びR54は、R23と同義であり、
L1は、NH、CO、下記一般式(13):
-(CH2)p1-NH- (13)
(式中、p1は1〜6の整数を表す。)
で示される基、又は下記一般式(14):
-L2a-(CH2)q1-L3a- (14)
(式中、L2aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3aは、NH又はCOを表す。q1は1〜6の整数を表す。)
で示される基を表し、
m13、m14及びm15はそれぞれ独立して0〜500の整数を表し(但し、m13、m14及びm15の合計は10〜500の整数を表す。)、m16及びm17はそれぞれm7及びm8と同義であり、nは0〜500の整数を表す。
「/」の表記は、その左右に示された(m13+m14+m15)個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
で示される化合物からなる群から選択されるいずれかの化合物である請求項6に記載のポリマー複合体。 - 請求項5〜7のいずれか1項に記載のポリマー複合体を含む、細胞内への核酸送達デバイス。
- 請求項5〜7のいずれか1項に記載のポリマー複合体を含む、細胞内への核酸送達用キット。
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