CN102604114B - 含树枝状聚赖氨酸基元的星型阳离子聚合物及其制备方法 - Google Patents
含树枝状聚赖氨酸基元的星型阳离子聚合物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种含树枝状聚赖氨酸基元的星型阳离子聚合物及其制备方法和应用。该方法包括如下操作步骤：先通过取代反应在β-环糊精C6位上引入叠氮基团，同时利用炔丙胺与N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸之间的偶联反应以及重复多步的缩合、脱保护反应合成含炔基的树枝状聚赖氨酸，然后将上述两产物通过点击化学方法偶联得到含树枝状聚赖氨酸基元的星型阳离子聚合物β-CD-PLLD。所得聚合物具有结构规整、易于调控、分子量分布单一、生物相容性好、可生物降解等优点，有望在基因治疗领域获得广泛应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程材料领域，特别涉及一种含树枝状聚赖氨酸基元的星型阳离子聚合物及其制备方法，以及其作为生物医用材料的潜在应用。
背景技术
基因治疗是目前用于癌症及先天性免疫系统疾病治疗的一种有效方法。该技术实施的关键是选择合适的基因载体及基因导入方法，进而使基因能够在细胞中获得安全、高效、可控且稳定的表达。病毒载体因其高风险性、机体免疫反应、不能大规模生产等缺陷在临床应用方面受到限制，因此具有高转染效率的脂质体及其它阳离子聚合物日益受到重视。
树枝状大分子是近年发展起来的一类具有三维规整结构、高度支化和纳米尺度的单分散性高分子材料，凭借其独特的分子结构、无免疫原性、可生物降解、易于修饰等特性在基因载体方面显示出重要应用前景。1993年，Haensler等首次尝试将聚酰胺-胺(PAMAM)用于基因转染实验(BioconjugateChemistry 1993，4：372-379)。目前，PAMAM及其衍生物已被广泛用作基因载体研究，在特定条件下，其基因转染效率及细胞毒性方面已优于聚乙烯亚胺(PEI)等常用的基因载体(Cancer Letters 2010，298：34-49；MolecularPharmaceutics 2010，5：1734-1746)。这其中，将树枝状基元与多臂分子结合制备星型阳离子聚合物成为国内外研究者关注的热点。星形阳离子聚合物由于其发散的分子结构、臂数、臂长及阳离子的分布等参数易于设计和调节，在基因传递方面显示出独特的优势。Uekama等通过化学偶联将β-CD连接到PAMAM的外围，研究表明连接环糊精分子后的PAMAM抗血浆降解破坏的能力增强，其基因转染能力明显提高(Bioconjugate Chemistry 2003，14：247-254)。Deng等通过点击化学方法高效合成得到结构规整的星型β-CD-PAMAM，并将其用于基因与药物的共传递研究(Journal of Materials Chemistry 2011，21，5273-5281)。然而，PAMAM在较高代数或较高浓度下仍显示出明显的细胞毒性，且其降解产物也有较大的毒性，使其在体内实际应用中受到限制。
因此，如何得到生物相容性好、结构规整可控的新型基因载体材料，便成为当前生物医学工程领域亟待解决的重要课题。迄今为止，通过点击化学方法合成星型环糊精接枝树枝状聚赖氨酸及其应用尚未见报道。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种含树枝状聚赖氨酸基元(PLLD)的星型阳离子聚合物；该聚合物结构规整、易于调控，分子量分布单一，生物相容性好，可生物降解，在基因传递方面显示出重要应用前景。
本发明的另一目的在于提供上述含树枝状聚赖氨酸基元(PLLD)的星型阳离子聚合物的制备方法；该方法首先通过取代反应合成叠氮基团修饰的β-CD，通过连续交替的偶联、脱保护反应合成3代含炔基PLLD；然后通过点击化学方法将叠氮基团修饰的β-CD与含炔基PLLD偶联，合成得到可用作基因载体的星型阳离子聚合物。
本发明的再一目的在于提供上述含树枝状聚赖氨酸基元(PLLD)的星型阳离子聚合物作为基因载体材料在制备基因药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种含树枝状聚赖氨酸基元的星型阳离子聚合物，所述星型阳离子聚合物的分子式如下：
上述含树枝状聚赖氨酸基元的星型阳离子聚合物的制备方法，包括以下操作步骤：
(1)叠氮基团修饰的β-环糊精(β-CD-N3)的合成：
a、称取三苯基膦溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后在室温条件下加入碘单质，升温至55～70℃；再加入干燥的β-环糊精(β-CD)，N2气氛下反应24～48小时；反应结束后，减压蒸馏除去无水N，N-二甲基甲酰胺，冰水浴条件下加入甲醇钠溶液；所得产物在甲醇中沉淀4～7次，然后真空干燥，得到七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精[β-CD-(I)7]；
b、将步骤a所得七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精与叠氮钠溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，N2气氛下升温至50～70℃后反应24～48小时；反应结束后，减压蒸馏除去无水N，N-二甲基甲酰胺，然后滴加到蒸馏水中进行沉淀，再用去离子水反复洗涤3～5次，室温条件下真空干燥，得到叠氮基团修饰的β-环糊精(β-CD-N3)；
(2)含炔基的树枝状聚赖氨酸(PLLD)的合成：
c、1代含炔基树枝状聚赖氨酸的合成：将干燥的炔丙胺和N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，室温条件下通入N2保护5～20分钟后，再加入1-羟基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，然后在室温条件下反应12～24小时；反应结束后减压蒸馏除去无水N，N-二甲基甲酰胺，所得产物用乙酸乙酯萃取，过柱分离；
将分离产物溶解于二氯甲烷中，室温条件下加入三氟乙酸，反应2～4小时后减压蒸馏除去溶剂，所得产物用无水乙醚洗涤后真空干燥，得到1代含炔基树枝状聚赖氨酸；
d、2代含炔基树枝状聚赖氨酸的合成：将步骤c所得1代含炔基树枝状聚赖氨酸与N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，室温条件下通入N2保护5～20分钟后，加入1-羟基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，室温条件下反应24～48小时；反应结束后减压蒸馏除去N，N-二甲基甲酰胺，所得产物用乙酸乙酯萃取，过柱分离；
将分离产物溶解于二氯甲烷中，室温条件下加入三氟乙酸，反应2～4小时，然后减压蒸馏除去溶剂；所得产物用无水乙醚洗涤后真空干燥，得到2代含炔基树枝状聚赖氨酸；
e、3代含炔基树枝状聚赖氨酸的合成：将步骤d所得2代含炔基树枝状聚赖氨酸与N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，室温条件下通入N2保护5～20分钟后，加入1-羟基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，室温条件下反应24～48小时；反应结束后减压蒸馏除去N，N-二甲基甲酰胺，所得产物用乙酸乙酯萃取，过柱分离；
将分离产物溶解于二氯甲烷中，室温条件下加入三氟乙酸，反应2～4小时，然后减压蒸馏除去溶剂；所得产物用无水乙醚洗涤后真空干燥，得到3代含炔基树枝状聚赖氨酸；
(3)星型阳离子聚合物(β-CD-PLLD)的合成：
将步骤b所得叠氮基团修饰的β-环糊精和步骤e所得3代含炔基树枝状聚赖氨酸溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，室温条件下通入N2保护20～30分钟后，加入硫酸铜和抗坏血酸钠，升温至40～50℃反应24～48小时；反应结束后，将产物置于透析袋中透析2～3天，冷冻干燥，得到星型阳离子聚合物(β-CD-PLLD)。
步骤(1)～(3)所述室温为5～35℃；
步骤(1)～(2)所述无水N，N-二甲基甲酰胺的制备方法按照以下操作步骤：将氢化钙加入到N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌6～24小时，然后减压蒸馏，得到无水N，N-二甲基甲酰胺，所述氢化钙的加入量以每500mL N，N-二甲基甲酰胺中加入1～2克计；
步骤a所述干燥的β-环糊精的制备方法按照以下操作步骤：将β-环糊精置于真空干燥箱中，50～80℃条件下干燥12～48小时；
步骤c所述干燥的炔丙胺的制备方法按照以下操作步骤：将氢化钙加入到炔丙胺中搅拌6～24小时，然后减压蒸馏，得到干燥的炔丙胺；所述氢化钙的加入量以每10mL炔丙胺中加入0.1～0.2克计。
步骤a所述β-环糊精、三苯基膦和碘单质的摩尔比为1∶1.2～1.5∶1.4～1.6；所述无水N，N-二甲基甲酰胺以每100毫升中加入5～20克干燥的β-环糊精计；所述甲醇钠溶液中甲醇钠的摩尔数为干燥的β-环糊精摩尔数的1.5～2.0倍。
步骤b所述七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精与叠氮钠的摩尔比为1∶8～12；所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入5～20克七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精计。
步骤c所述炔丙胺、N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸、1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比为1∶0.9～1.0∶1.0～1.2∶1.0～1.2；所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入5～10克N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸计；所述过柱分离是使用硅胶规格为300～600目的硅胶柱，洗脱液为体积比2～8∶1的三氯甲烷与甲醇的混合溶液；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解5～15克分离产物；所述三氟乙酸的使用量为分离产物质量的5～10倍。
步骤d所述1代含炔基树枝状聚赖氨酸、N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸、1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比为1∶2.2～2.4∶2.4～2.8∶2.4～2.8；所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入5～15克N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸计；所述过柱分离是使用硅胶规格为300～600目的硅胶柱，洗脱液为体积比5～12∶1的三氯甲烷与甲醇的混合溶液；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解5～15克分离产物；所述三氟乙酸的使用量为分离产物质量的5～10倍。
步骤e所述2代含炔基树枝状聚赖氨酸、N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸、1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比为1∶4.2～4.8∶4.4～5.0∶4.4～5.0；所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升加入10～20克N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸计；所述过柱分离是使用硅胶规格为300～600目的硅胶柱，洗脱液为体积比12～18∶1的三氯甲烷与甲醇的混合溶液；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解5～15克分离产物；所述三氟乙酸的使用量为分离产物质量的5～10倍；所述3代含炔基树枝状聚赖氨酸的分子式如下：
步骤(3)所述叠氮基团修饰的β-环糊精、含炔基树枝状聚赖氨酸、硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1∶8～10∶4～5∶10～15；所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升加入5～10克叠氮基团修饰的β-环糊精计；所述透析袋的截留分子量为1000～3000。
上述星型阳离子聚合物可作为基因载体材料在制备基因药物中的应用。
本发明和现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
(1)采用天然氨基酸——赖氨酸分子构建星型阳离子聚合物，所得聚合物生物相容性好、可生物降解，其代谢产物毒性小；
(2)采用液相合成技术制备树枝状聚赖氨酸基元，合成产物结构规整，原料用量少，产物易于分离纯化；
(3)采用点击化学方法将树枝状聚赖氨酸与环糊精偶联，反应效率高、结构易于精确调控，所得星型阳离子聚合物结构规整，分子量分布单一；
(4)以环糊精为星型聚合物的核心，其臂长、臂数及阳离子密度可通过树枝状聚赖氨酸的代数、投料量等因素调控；
(5)星型聚合物表面大量的阳离子可与DNA有效复合，具有较高的转染效率，在基因传递方面有潜在的应用；
(6)星型聚合物表面大量的基团提供了其进一步功能化的可能；
(7)环糊精作为星型树枝状分子的核心，除有利于降低产物的细胞毒性外，其空腔还可用作疏水药物载体，在基因与药物共传递领域有潜在的应用价值。
附图说明
图1为β-环糊精、叠氮基团修饰的β-环糊精的核磁氢谱图。
图2为星型阳离子聚合物A的核磁氢谱图。
图3为叠氮基团修饰的β-环糊精、PLLD、星型阳离子聚合物A的红外光谱图。
图4为星型阳离子聚合物A的水相体积排阻色谱结果图。
图5为不同浓度的聚乙烯亚胺(PEI)、含聚酰胺-胺基元的阳离子聚合物(β-CD-PAMAM)、星型阳离子聚合物A与大鼠成纤维细胞共培养24小时后的细胞活力结果图。
图6为星型阳离子聚合物A用作基因载体对大鼠成纤维细胞的转染效率结果图。
图7为以星型阳离子聚合物A为载体转染pEGFP后的细胞的荧光照片图(A与pEGFP的质量比为50∶1)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例所使用的无水N，N-二甲基甲酰胺的制备方法按照以下操作步骤：将氢化钙加入到N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌6～24小时，然后减压蒸馏，得到无水N，N-二甲基甲酰胺，所述氢化钙的加入量以每500mL N，N-二甲基甲酰胺中加入1～2克计；
以下实施例所使用的干燥的β-环糊精的制备方法按照以下操作步骤：将β-环糊精置于真空干燥箱中，50～80℃条件下干燥12～48小时；
以下实施例所使用的干燥的炔丙胺的制备方法按照以下操作步骤：将氢化钙加入到炔丙胺中搅拌6～24小时，然后减压蒸馏，得到干燥的炔丙胺；所述氢化钙的加入量以每10mL炔丙胺中加入0.1～0.2克计。
实施例1
a、称取三苯基膦溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后在室温25℃条件下加入碘单质，升温至55℃；再加入干燥的β-环糊精(β-CD)，N2气氛下反应48小时；反应结束后，减压蒸馏除去无水N，N-二甲基甲酰胺，冰水浴条件下加入甲醇钠溶液；所得产物在甲醇中沉淀7次，然后真空干燥，得到七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精[β-CD-(I)7]；所述β-环糊精、三苯基膦和碘单质的摩尔比为1∶1.2∶1.4；所述无水N，N-二甲基甲酰胺以每100毫升中加入20克干燥的β-环糊精计；所述甲醇钠溶液中甲醇钠的摩尔数为干燥的β-环糊精摩尔数的1.5倍；
b、将步骤a所得七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精与叠氮钠溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，N2气氛下升温至50℃后反应48小时；反应结束后，减压蒸馏除去无水N，N-二甲基甲酰胺，然后滴加到蒸馏水中进行沉淀，再用去离子水反复洗涤3次，室温5℃条件下真空干燥，得到叠氮基团修饰的β-环糊精(β-CD-N3)；所述七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精与叠氮钠的摩尔比为1∶8；所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入20克七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精计。
实施例2
a、称取三苯基膦溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后在室温35℃条件下加入碘单质，升温至70℃；再加入干燥的β-环糊精(β-CD)，N2气氛下反应24小时；反应结束后，减压蒸馏除去无水N，N-二甲基甲酰胺，冰水浴条件下加入甲醇钠溶液；所得产物在甲醇中沉淀4次，然后真空干燥，得到七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精[β-CD-(I)7]；所述β-环糊精、三苯基膦和碘单质的摩尔比为1∶1.5∶1.6；所述无水N，N-二甲基甲酰胺以每100毫升中加入5克干燥的β-环糊精计；所述甲醇钠溶液中甲醇钠的摩尔数为干燥的β-环糊精摩尔数的2.0倍；
b、将步骤a所得七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精与叠氮钠溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，N2气氛下升温至70℃后反应24小时；反应结束后，减压蒸馏除去无水N，N-二甲基甲酰胺，然后滴加到蒸馏水中进行沉淀，再用去离子水反复洗涤5次，室温35℃条件下真空干燥，得到叠氮基团修饰的β-环糊精(β-CD-N3)；所述七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精与叠氮钠的摩尔比为1∶12；所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入5克七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精计。
实施例3
a、称取三苯基膦溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后在室温5℃条件下加入碘单质，升温至60℃；再加入干燥的β-环糊精(β-CD)，N2气氛下反应32小时；反应结束后，减压蒸馏除去无水N，N-二甲基甲酰胺，冰水浴条件下加入甲醇钠溶液；所得产物在甲醇中沉淀6次，然后真空干燥，得到七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精[β-CD-(I)7]；所述β-环糊精、三苯基膦和碘单质的摩尔比为1∶1.3∶1.5；所述无水N，N-二甲基甲酰胺以每100毫升中加入15克干燥的β-环糊精计；所述甲醇钠溶液中甲醇钠的摩尔数为干燥的β-环糊精摩尔数的1.8倍；
b、将步骤a所得七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精与叠氮钠溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，N2气氛下升温至60℃后反应32小时；反应结束后，减压蒸馏除去无水N，N-二甲基甲酰胺，然后滴加到蒸馏水中进行沉淀，再用去离子水反复洗涤4次，室温25℃条件下真空干燥，得到叠氮基团修饰的β-环糊精(β-CD-N3)；所述七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精与叠氮钠的摩尔比为1∶10；所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入10克七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精计。
实施例4
将实施例3得到的七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精和β-环糊精原料分别溶解于氘代二甲基亚砜中，进行核磁氢谱表征，结果如图1所示。β-环糊精样品在化学位移4.45ppm处出现6-CH2OH羟基的质子峰；经叠氮基团的取代反应后，所得七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精样品的6-CH2OH上羟基的质子特征峰完全消失，说明β-环糊精C-6位羟基己完全被叠氮基团完全取代。
实施例5
c、1代含炔基树枝状聚赖氨酸的合成：将干燥的炔丙胺和N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，室温条件下通入N2保护5分钟后，再加入1-羟基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，然后在室温5℃条件下反应24小时；反应结束后减压蒸馏除去无水N，N-二甲基甲酰胺，所得产物用乙酸乙酯萃取，过柱分离；所述炔丙胺、N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸、1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比为1∶0.9∶1.0∶1.0；所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入10克N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸计；所述过柱分离是使用硅胶规格为300目的硅胶柱，洗脱液为体积比2∶1的三氯甲烷与甲醇的混合溶液；
将分离产物溶解于二氯甲烷中，室温5℃条件下加入三氟乙酸，反应4小时后减压蒸馏除去溶剂，所得产物用无水乙醚洗涤后真空干燥，得到1代含炔基树枝状聚赖氨酸；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解15克分离产物；所述三氟乙酸的使用量为分离产物质量的5倍；
d、2代含炔基树枝状聚赖氨酸的合成：将步骤c所得1代含炔基树枝状聚赖氨酸与N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，室温35℃条件下通入N2保护5分钟后，加入1-羟基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，室温35℃条件下反应24小时；所述1代含炔基树枝状聚赖氨酸、N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸、1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比为1∶2.2∶2.4∶2.4；所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入15克N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸计；反应结束后减压蒸馏除去N，N-二甲基甲酰胺，所得产物用乙酸乙酯萃取，过柱分离；所述过柱分离是使用硅胶规格为300目的硅胶柱，洗脱液为体积比5∶1的三氯甲烷与甲醇的混合溶液；
将分离产物溶解于二氯甲烷中，室温5℃条件下加入三氟乙酸，反应2小时，然后减压蒸馏除去溶剂；所得产物用无水乙醚洗涤后真空干燥，得到2代含炔基树枝状聚赖氨酸；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解15克分离产物；所述三氟乙酸的使用量为分离产物质量的5倍；
e、3代含炔基树枝状聚赖氨酸的合成：将步骤d所得2代含炔基树枝状聚赖氨酸与N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，室温35℃条件下通入N2保护5分钟后，加入1-羟基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，室温35℃条件下反应24小时；所述2代含炔基树枝状聚赖氨酸、N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸、1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比为1∶4.2∶4.4∶4.4；所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升加入20克N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸计；反应结束后减压蒸馏除去N，N-二甲基甲酰胺，所得产物用乙酸乙酯萃取，过柱分离；所述过柱分离是使用硅胶规格为300目的硅胶柱，洗脱液为体积比12∶1的三氯甲烷与甲醇的混合溶液；
将分离产物溶解于二氯甲烷中，室温5℃条件下加入三氟乙酸，反应4小时，然后减压蒸馏除去溶剂；所得产物用无水乙醚洗涤后真空干燥，得到3代含炔基树枝状聚赖氨酸；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解15克分离产物；所述三氟乙酸的使用量为分离产物质量的5倍。
实施例6
c、1代含炔基树枝状聚赖氨酸的合成：将干燥的炔丙胺和N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，室温条件下通入N2保护20分钟后，再加入1-羟基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，然后在室温35℃条件下反应12小时；反应结束后减压蒸馏除去无水N，N-二甲基甲酰胺，所得产物用乙酸乙酯萃取，过柱分离；所述炔丙胺、N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸、1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比为1∶1.0∶1.2∶1.2；所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入5克N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸计；所述过柱分离是使用硅胶规格为600目的硅胶柱，洗脱液为体积比8∶1的三氯甲烷与甲醇的混合溶液；
将分离产物溶解于二氯甲烷中，室温35℃条件下加入三氟乙酸，反应2小时后减压蒸馏除去溶剂，所得产物用无水乙醚洗涤后真空干燥，得到1代含炔基树枝状聚赖氨酸；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解5克分离产物；所述三氟乙酸的使用量为分离产物质量的10倍；
d、2代含炔基树枝状聚赖氨酸的合成：将步骤c所得1代含炔基树枝状聚赖氨酸与N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，室温5℃条件下通入N2保护20分钟后，加入1-羟基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，室温5℃条件下反应48小时；所述1代含炔基树枝状聚赖氨酸、N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸、1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比为1∶2.4∶2.8∶2.8；所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入5～15克N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸计；反应结束后减压蒸馏除去N，N-二甲基甲酰胺，所得产物用乙酸乙酯萃取，过柱分离；所述过柱分离是使用硅胶规格为300～600目的硅胶柱，洗脱液为体积比12∶1的三氯甲烷与甲醇的混合溶液；
将分离产物溶解于二氯甲烷中，室温35℃条件下加入三氟乙酸，反应4小时，然后减压蒸馏除去溶剂；所得产物用无水乙醚洗涤后真空干燥，得到2代含炔基树枝状聚赖氨酸；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解5克分离产物；所述三氟乙酸的使用量为分离产物质量的10倍；
e、3代含炔基树枝状聚赖氨酸的合成：将步骤d所得2代含炔基树枝状聚赖氨酸与N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，室温5℃条件下通入N2保护20分钟后，加入1-羟基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，室温5℃条件下反应48小时；所述2代含炔基树枝状聚赖氨酸、N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸、1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比为1∶4.8∶5.0∶5.0；所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升加入10克N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸计；反应结束后减压蒸馏除去N，N-二甲基甲酰胺，所得产物用乙酸乙酯萃取，过柱分离；所述过柱分离是使用硅胶规格为600目的硅胶柱，洗脱液为体积比18∶1的三氯甲烷与甲醇的混合溶液；
将分离产物溶解于二氯甲烷中，室温35℃条件下加入三氟乙酸，反应4小时，然后减压蒸馏除去溶剂；所得产物用无水乙醚洗涤后真空干燥，得到3代含炔基树枝状聚赖氨酸；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解5克分离产物；所述三氟乙酸的使用量为分离产物质量的10倍。
实施例7
c、1代含炔基树枝状聚赖氨酸的合成：将干燥的炔丙胺和N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，室温条件下通入N2保护15分钟后，再加入1-羟基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，然后在室温25℃条件下反应18小时；反应结束后减压蒸馏除去无水N，N-二甲基甲酰胺，所得产物用乙酸乙酯萃取，过柱分离；所述炔丙胺、N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸、1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比为1∶0.9∶1.1∶1.1；所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入8克N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸计；所述过柱分离是使用硅胶规格为500目的硅胶柱，洗脱液为体积比6∶1的三氯甲烷与甲醇的混合溶液；
将分离产物溶解于二氯甲烷中，室温25℃条件下加入三氟乙酸，反应3小时后减压蒸馏除去溶剂，所得产物用无水乙醚洗涤后真空干燥，得到1代含炔基树枝状聚赖氨酸；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解10克分离产物；所述三氟乙酸的使用量为分离产物质量的8倍；
d、2代含炔基树枝状聚赖氨酸的合成：将步骤c所得1代含炔基树枝状聚赖氨酸与N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，室温25℃条件下通入N2保护15分钟后，加入1-羟基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，室温5～35℃条件下反应30小时；所述1代含炔基树枝状聚赖氨酸、N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸、1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比为1∶2.3∶2.6∶2.6；所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入10克N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸计；反应结束后减压蒸馏除去N，N-二甲基甲酰胺，所得产物用乙酸乙酯萃取，过柱分离；所述过柱分离是使用硅胶规格为500目的硅胶柱，洗脱液为体积比10∶1的三氯甲烷与甲醇的混合溶液；
将分离产物溶解于二氯甲烷中，室温25℃条件下加入三氟乙酸，反应3小时，然后减压蒸馏除去溶剂；所得产物用无水乙醚洗涤后真空干燥，得到2代含炔基树枝状聚赖氨酸；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解10克分离产物；所述三氟乙酸的使用量为分离产物质量的8倍；
e、3代含炔基树枝状聚赖氨酸的合成：将步骤d所得2代含炔基树枝状聚赖氨酸与N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，室温25℃条件下通入N2保护10分钟后，加入1-羟基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，室温20℃条件下反应32小时；所述2代含炔基树枝状聚赖氨酸、N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸、1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比为1∶4.6∶4.6∶4.6；所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升加入15克N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸计；反应结束后减压蒸馏除去N，N-二甲基甲酰胺，所得产物用乙酸乙酯萃取，过柱分离；所述过柱分离是使用硅胶规格为400目的硅胶柱，洗脱液为体积比16∶1的三氯甲烷与甲醇的混合溶液；
将分离产物溶解于二氯甲烷中，室温25℃条件下加入三氟乙酸，反应3小时，然后减压蒸馏除去溶剂；所得产物用无水乙醚洗涤后真空干燥，得到3代含炔基树枝状聚赖氨酸；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解10克分离产物；所述三氟乙酸的使用量为分离产物质量的9倍。
实施例8
将实施例7所得3代含炔基树枝状聚赖氨酸(PLLD)溶解于双蒸水中，在截留分子量为500的透析袋中透析3天后进行质谱分析，结果为M/Z+＝952.1(M+H+)。理论计算得到的PLLD的分子式为C45H89N15O7；分子量为951.30。说明用该方法成功得到结构完整的3代含炔基树枝状聚赖氨酸PLLD。
实施例9
将实施例1得到的所得叠氮基团修饰的β-环糊精和实施例5得到的3代含炔基树枝状聚赖氨酸溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，室温25℃条件下通入N2保护20分钟后，加入硫酸铜和抗坏血酸钠，升温至50℃反应24小时；所述叠氮基团修饰的β-环糊精、含炔基树枝状聚赖氨酸、硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1∶8∶4∶10；所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升加入10克叠氮基团修饰的β-环糊精计；反应结束后，将产物置于截留分子量为1000的透析袋中透析3天，冷冻干燥，得到星型阳离子聚合物(β-CD-PLLD)。
实施例10
将实施例2得到的叠氮基团修饰的β-环糊精和实施例6得到的3代含炔基树枝状聚赖氨酸溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，室温35℃条件下通入N2保护30分钟后，加入硫酸铜和抗坏血酸钠，升温至40℃反应48小时；所述叠氮基团修饰的β-环糊精、含炔基树枝状聚赖氨酸、硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1∶10∶5∶15；所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升加入5克叠氮基团修饰的β-环糊精计；反应结束后，将产物置于截留分子量为3000的透析袋中透析2天，冷冻干燥，得到星型阳离子聚合物A(β-CD-PLLD)。
实施例11
将实施例3得到的叠氮基团修饰的β-环糊精和实施例7得到的3代含炔基树枝状聚赖氨酸溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，室温5℃条件下通入N2保护25分钟后，加入硫酸铜和抗坏血酸钠，升温至45℃反应32小时；所述叠氮基团修饰的β-环糊精、含炔基树枝状聚赖氨酸、硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1∶9∶4∶12；所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升加入8克叠氮基团修饰的β-环糊精计；反应结束后，将产物置于截留分子量为2000的透析袋中透析3天，冷冻干燥，得到星型阳离子聚合物(β-CD-PLLD)。
实施例12
将实施例10所得星型阳离子聚合物A溶解于重水中进行核磁氢谱表征。结果如图2所示，化学位移在1.5-2.0ppm处的质子峰对应于树枝状聚赖氨酸基元的质子氢；化学位移在2.5-4.5ppm处的质子峰对应于树枝状聚赖氨酸基元和环糊精的质子氢；化学位移在7.8ppm处的质子峰对应于含炔基的树枝状聚赖氨酸与含叠氮基的β-环糊精通过点击化学反应形成的氮杂环的质子氢。说明树枝状聚赖氨酸与β-环糊精通过点击化学反应成功合成得到星型阳离子聚合物A。
实施例13
将实施例10所得星型阳离子聚合物A、实施例3得到的七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精(β-CD-N3)、实施例7所得3代含炔基树枝状聚赖氨酸(PLLD)通过溴化钾压片法进行红外光谱表征。结果如图3所示，样品A出现了β-CD-N3和PLLD的特征吸收峰，进一步证明星型阳离子聚合物A成功合成。且原本出现在β-CD-N3样品图谱中2100cm-1处叠氮基团的特征吸收峰在样品A的图谱中完全消失，说明β-CD-N3的7个叠氮基团全部与PLLD反应，得到了结构明确的星型阳离子聚合物A。
实施例14
将实施例10所得星型阳离子聚合物A溶解于蒸馏水中配制成浓度5mg/mL的水溶液，经0.2μm的过滤头过滤后，注入体积排阻色谱进行分子量分布表征，结果如图4所示，计算得到该星型阳离子聚合物A的多分散性系数d＝1.00(水相GPC，以葡聚糖为标准物)，进一步说明实施例10所得星型阳离子聚合物A结构规整明确，分子量分布单一。
实施例15
将市售的聚乙烯亚胺(PEI，重均分子量为25000)、星型阳离子聚合物环糊精接枝3代聚酰胺-胺(β-CD-PAMAM)、以及实施例10所得星型阳离子聚合物A(β-CD-PLLD)溶解于磷酸盐缓冲溶液中，过滤灭菌后分别按照一定的浓度梯度(10、20、50、100、200μg/mL)加入到融合度达70％的大鼠成纤维细胞中共培养。24小时后，采用MTT比色法测定物质的细胞毒性，结果如图5所示。PEI和β-CD-PAMAM在高浓度条件下均表现出明显的细胞毒性，而实施例10所得星型阳离子聚合物A在高浓度条件下仍保持了很好的生物相容性。
实施例16
将实施例10所得星型阳离子聚合物A按照质量比50∶1与pEGFP复合，然后将该复合物用于对大鼠成纤维细胞的转染实验，转染效率结果如图6所示，其中质量比为50∶1的复合物实施转染后的细胞的荧光照片如图7所示。星型阳离子聚合物A表现出较好的基因传递能力，当A与pEGFP的质量比为50∶1时，基因转染效率达38％，有潜在的应用前景。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种含树枝状聚赖氨酸基元的星型阳离子聚合物的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：
（1）叠氮基团修饰的β-环糊精的合成：
a、称取三苯基膦溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺中，然后在温度为5～35℃条件下加入碘单质，升温至55～70℃；再加入干燥的β-环糊精，N2气氛下反应24～48小时；反应结束后，减压蒸馏除去无水N,N-二甲基甲酰胺，冰水浴条件下加入甲醇钠溶液；所得产物在甲醇中沉淀4～7次，然后真空干燥，得到七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精；
b、将步骤a所得七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精与叠氮钠溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺中，N2气氛下升温至50～70℃后反应24～48小时；反应结束后，减压蒸馏除去无水N,N-二甲基甲酰胺，然后滴加到蒸馏水中进行沉淀，再用去离子水反复洗涤3～5次，温度为5～35℃条件下真空干燥，得到叠氮基团修饰的β-环糊精；
（2）含炔基的树枝状聚赖氨酸的合成：
c、1代含炔基树枝状聚赖氨酸的合成：将干燥的炔丙胺和N,N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺中，温度为5～35℃条件下通入N2保护5～20分钟后，再加入1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯，然后在温度为5～35℃条件下反应12～24小时；反应结束后减压蒸馏除去无水N,N-二甲基甲酰胺，所得产物用乙酸乙酯萃取，过柱分离；
将分离产物溶解于二氯甲烷中，温度为5～35℃条件下加入三氟乙酸，反应2～4小时后减压蒸馏除去溶剂，所得产物用无水乙醚洗涤后真空干燥，得到1代含炔基树枝状聚赖氨酸；
d、2代含炔基树枝状聚赖氨酸的合成：将步骤c所得1代含炔基树枝状聚赖氨酸与N,N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺中，温度 为5～35℃条件下通入N2保护5～20分钟后，加入1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯，温度为5～35℃条件下反应24～48小时；反应结束后减压蒸馏除去N,N-二甲基甲酰胺，所得产物用乙酸乙酯萃取，过柱分离；
将分离产物溶解于二氯甲烷中，温度为5～35℃条件下加入三氟乙酸，反应2～4小时，然后减压蒸馏除去溶剂；所得产物用无水乙醚洗涤后真空干燥，得到2代含炔基树枝状聚赖氨酸；
e、3代含炔基树枝状聚赖氨酸的合成：将步骤d所得2代含炔基树枝状聚赖氨酸与N,N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺中，温度为5～35℃条件下通入N2保护5～20分钟后，加入1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯，温度为5～35℃条件下反应24～48小时；反应结束后减压蒸馏除去N,N-二甲基甲酰胺，所得产物用乙酸乙酯萃取，过柱分离；
将分离产物溶解于二氯甲烷中，温度为5～35℃条件下加入三氟乙酸，反应2～4小时，然后减压蒸馏除去溶剂；所得产物用无水乙醚洗涤后真空干燥，得到3代含炔基树枝状聚赖氨酸；
（3）星型阳离子聚合物的合成：
将步骤b所得叠氮基团修饰的β-环糊精和步骤e所得3代含炔基树枝状聚赖氨酸溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，温度为5～35℃条件下通入N2保护20～30分钟后，加入硫酸铜和抗坏血酸钠，升温至40～50℃反应24～48小时；反应结束后，将产物置于透析袋中透析2～3天，冷冻干燥，得到星型阳离子聚合物；
所得星型阳离子聚合物的分子式如下：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）～（2）所述无水N,N-二甲基甲酰胺的制备方法按照以下操作步骤：将氢化钙加入到N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌6～24小时，然后减压蒸馏，得到无水N,N-二甲基甲酰胺，所述氢化钙的加入量以每500mL N,N-二甲基甲酰胺中加入1～2克计；
步骤a所述干燥的β-环糊精的制备方法按照以下操作步骤：将β-环糊精置于真空干燥箱中，50～80℃条件下干燥12～48小时；
步骤c所述干燥的炔丙胺的制备方法按照以下操作步骤：将氢化钙加入到炔丙胺中搅拌6～24小时，然后减压蒸馏，得到干燥的炔丙胺；所述氢化钙的 加入量以每10mL炔丙胺中加入0.1～0.2克计。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤a所述β-环糊精、三苯基膦和碘单质的摩尔比为1:1.2～1.5:1.4～1.6；所述无水N,N-二甲基甲酰胺以每100毫升中加入5～20克干燥的β-环糊精计；所述甲醇钠溶液中甲醇钠的摩尔数为干燥的β-环糊精摩尔数的1.5～2.0倍。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤b所述七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精与叠氮钠的摩尔比为1:8～12；所述无水N,N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入5～20克七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精计。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤c所述炔丙胺、N,N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸、1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比为1:0.9～1.0:1.0～1.2:1.0～1.2；所述无水N,N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入5～10克N,N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸计；所述过柱分离是使用硅胶规格为300～600目的硅胶柱，洗脱液为体积比2～8:1的三氯甲烷与甲醇的混合溶液；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解5～15克分离产物；所述三氟乙酸的使用量为分离产物质量的5～10倍。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤d所述1代含炔基树枝状聚赖氨酸、N,N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸、1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比为1:2.2～2.4:2.4～2.8:2.4～2.8；所述无水N,N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入5～15克N,N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸计；所述过柱分离是使用硅胶规格为300～600目的硅胶柱，洗脱液为体积比5～12:1的三氯甲烷与甲醇的混合溶液；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解5～15克分离产物；所述三氟乙酸的使用量为分离产物质量的5～10倍。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤e所述2代含炔基树枝状聚赖氨酸、N,N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸、1-羟基苯并三唑和苯并三 氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比为1:4.2～4.8:4.4～5.0:4.4～5.0；所述无水N,N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升加入10～20克N,N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸计；所述过柱分离是使用硅胶规格为300～600目的硅胶柱，洗脱液为体积比12～18:1的三氯甲烷与甲醇的混合溶液；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解5～15克分离产物；所述三氟乙酸的使用量为分离产物质量的5～10倍；所述3代含炔基树枝状聚赖氨酸的分子式如下：
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述叠氮基团修饰的β-环糊精、含炔基树枝状聚赖氨酸、硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1:8～10:4～5:10～15；所述无水N,N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升加入5～10克叠氮基团修饰的β-环糊精计；所述透析袋的截留分子量为1000～3000。
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