CN111620907B - 一种含磷树冠大分子杂化纳米材料及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含磷树冠大分子杂化纳米材料及其制备和应用,杂化纳米材料的结构式如式I所示。本发明原料为商品化来源,制备的含磷树冠大分子的分子量均一,制备方法简单,反应过程可控性高,易于操作;本发明制备的纳米材料可用于肿瘤化疗和基因联合治疗研究,拥有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于功能化杂化纳米材料及其制备和应用领域,特别涉及一种含磷树冠大分子杂化纳米材料及其制备和应用。
背景技术
在癌症的治疗方面,传统药物治疗中往往由于药物无特异性,不可避免的会对正常细胞及组织产生伤害。为了避免传统药物治疗中产生的弊端,选择优良的载体十分重要,这主要是由于良好的药物传递系统可以克服抗癌药物与正常细胞的非特异性结合和水溶性差等问题。其中两亲性树状大分子能够产生超分子胶束,有效地包封疏水性药物且具有高载药量。同时,其超分子胶束的尺寸往往超过肾阈值,使其在体内血液循环过程中不易被肾脏过滤排除,间接增加了药物分子在体内的作用时间。其次,由于肿瘤区域细胞的飞速增殖分裂及大量新生血管的产生,使肿瘤脉管系统与正常组织相比具有较大的孔径尺寸及无效的淋巴引流系统,这种效应使直径较大的高分子类物质更易累积在肿瘤组织区域,这就是肿瘤组织所特有的增强渗透和保留(enhanced permeation and rerention,简称EPR)作用,也称为被动靶向效应。因此,通过EPR效应为基础的被动靶向路径可有助于将药物分子传输至肿瘤组织区域。与此同时,作为肿瘤治疗的另一种手段,基因治疗是现代医学和分子生物学相结合而诞生的新技术,是通过将外源正常基因导入靶细胞内,用以纠正或补偿基因缺失或异常引起的疾病,从而进行疾病治疗。然而,目前基因治疗最主要的障碍就是缺乏一种安全有效的传递表达载体。在基因载体系统中,主要借助病毒和非病毒载体将外源基因导入靶细胞。病毒载体转染效率高,但临床应用的安全隐患制约了其进一步的应用。而非病毒载体,由于其低细胞毒性、无免疫原性、易操作和高基因装载量等特点,越来越受到研究者们的关注。
树状大分子以其独特的高度支化三维立体结构令其成为一种新型的高分子载体被广泛应用于药物和基因传递中。其中含磷树状大分子(Phosphorous dendrimers)与传统聚酰胺胺型树状大分子(PAMAM)相比分子量分布更加均一,其分子结构的高度单分散性,以及可精准控制的三维结构和表面化学,受到了研究者的广泛关注。随着纳米技术和纳米医学的不断发展,含磷树状大分子作纳米载体或支架,为多种抗肿瘤药物的传递及生物活性化合物的设计提供可能,已广泛的应用于催化、材料、生物医学等领域。且已有文献显示含磷树状大分子表面修饰甲基化和叔氨质子化,具有载体毒性小、报告基因活性好等优异的基因载体性质(Loup et al.,Chem.Eur.J.1999,5,No.12,3644-3650),但对于含磷树冠大分子用于基因治疗却未成报道。以此同时,作为含磷树状大分子家族中重要成员的两亲性含磷树冠大分子用于基因和药物传递的研究却鲜有报道。因此,以含磷树冠大分子作为载体通过负载化疗药物和基因,有望制备出一种新型杂化纳米材料用于肿瘤细胞的化疗与基因联合治疗。
检索国内外文献尚没有发现关于利用含磷树冠大分子表面修饰氨基吡咯烷为药物与基因载体用于肿瘤基因沉默和化疗的联合治疗研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种含磷树冠大分子杂化纳米材料及其制备和应用,填补了采用含磷树冠大分子用于肿瘤化疗和基因联合治疗应用的研究空白。本发明以六氯环三磷腈为核通过发散迭代的方法合成新型含磷树冠大分子,在其表面修饰吡咯烷并质子化进而得到具有两亲性含磷树冠大分子,其内部的疏水空腔可用于负载脂溶性药物,其表面可通过静电吸附直接负载基因,形成杂化纳米材料,用于肿瘤的化疗与基因联合治疗。
本发明的一种如结构式I所示的含磷树冠大分子杂化纳米材料:
本发明的一种含磷树冠大分子杂化纳米材料的制备方法,包括:
(1)将六氯环三磷腈溶于无水四氢呋喃中,加入无水碳酸钾,冰浴,逐滴加入溶有对羟基苯甲醛的四氢呋喃溶液,室温反应,纯化,真空干燥,得到修饰有五个对羟基苯甲醛的环三磷腈AB5;
(2)将4-十二烷氧基苯甲酸溶于无水二氯甲烷中,加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC*HCl活化,然后加入溶有酪胺的甲醇溶液,室温反应,纯化,真空干燥,制得酰胺C12H25;
(3)将步骤(1)制得的AB5溶于无水四氢呋喃中,加入无水碳酸铯,冰浴,逐滴加入溶有步骤(2)制得的C12H25的四氢呋喃溶液,反应,纯化,真空干燥,得到第0.5代的含磷树冠大分子C12G0.5;
(4)将步骤(3)制得的C12G0.5溶于无水二氯甲烷中,加入无水硫酸钠,冰浴,逐滴加入修饰有一个甲基肼的硫代磷酰氯MMHPSCl2溶液,反应,旋转蒸发,添加无水四氢呋喃重新溶解产物,逐滴加入至戊烷中,搅拌,移除上清后真空干燥,得到第一代含磷树冠大分子C12G1;
(5)将步骤(4)制得的C12G1溶于无水四氢呋喃中,逐滴加入N,N-二异丙基乙基胺,冰浴,而后逐滴加入1-(2-氨基乙基)吡咯烷,搅拌反应,旋转蒸发,添加四氢呋喃重新溶解产物,逐滴加入至正戊烷中,搅拌,移除上清后真空干燥,得到吡咯烷修饰的含磷树冠大分子C12G1NC4;
(6)将步骤(5)制得的C12G1NC4溶于无水四氢呋喃中,冰浴,逐滴加入氯化氢的乙醚溶液,搅拌反应,旋转蒸发,真空干燥,得到质子化的纳米材料1-C12G1。
上述制备方法的优选方式如下:
所述步骤(1)中六氯环三磷腈、无水碳酸铯和对羟基苯甲醛的摩尔比为1:12:5;六氯环三磷腈的四氢呋喃溶液浓度为0.010-0.050mmol/mL;对羟基苯甲醛的四氢呋喃溶液0.050-0.250mmol/mL;冰浴的时间为10-60分钟;反应的工艺参数为:室温反应6-24小时;纯化的工艺条件为:采用溶剂为体积比为1:1.5的乙酸乙酯和正己烷的柱层析进行纯化。
所述步骤(2)中的4-十二烷氧基苯甲酸、酪胺和EDC*HCl的摩尔比为1:1:1;4-十二烷氧基苯甲酸的二氯甲烷溶液浓度为0.10-0.50mmol/mL;酪胺的甲醇溶液浓度为0.10-0.50mmol/mL;室温反应时间均为6-24小时;C12H25的纯化工艺条件为:采用溶剂为体积比为1:19的甲醇和二氯甲烷的柱层析进行纯化。
所述步骤(3)中C12H25、AB5和无水碳酸铯的摩尔比为1.1:1:3;酰胺C12H25的四氢呋喃溶液浓度为0.010-0.050mmol/mL;AB5的四氢呋喃溶液0.010-0.050mmol/mL;冰浴的时间为10-60分钟;反应的工艺参数为:室温反应6-24小时;纯化的工艺条件为:采用溶剂为体积比为1:1.5的乙酸乙酯和正己烷的柱层析进行纯化。
所述步骤(4)中的C12G0.5、MMHPSCl2和无水硫酸钠的摩尔比为1:6:12;C12G0.5的二氯甲烷溶液浓度为0.001-0.10mmol/mL;冰浴的时间为10-60分钟;反应的工艺参数为:室温搅拌反应6-24小时。反应的工艺参数为:室温搅拌反应6-24小时。纯化的工艺条件为:采用溶剂为体积比为1:10的四氢呋喃和正戊烷的沉淀纯化。
所述步骤(5)中C12G1、N,N-二异丙基乙基胺和1-(2-氨基乙基)吡咯烷的摩尔比分别为1:10:10;C12G1的四氢呋喃溶液浓度为0.010-0.050mmol/mL;冰浴的时间为10-60分钟;反应的工艺参数为:室温反应6-24小时;纯化的工艺条件为:采用溶剂为体积比为1:10的四氢呋喃和正戊烷的沉淀纯化。
所述步骤(6)中C12G1NC4和氯化氢的摩尔比为1:10;C12G1NC4的四氢呋喃溶液浓度为0.010-0.050mmol/mL;冰浴的时间为10-60分钟;反应的工艺参数为:室温反应6-24小时。
本发明的一种基于所述含磷树冠大分子杂化纳米材料的自组装胶束。
本发明的一种载药复合纳米材料,所述复合纳米材料的载体为权利要求1所述含磷树冠大分子杂化纳米材料的自组装胶束,载体内部负载疏水性药物,表面吸附基因。
本发明的一种载药复合材料材料的制备方法,包括:
疏水性药物溶液逐滴加入到1-C12G1的水溶液中,室温敞口搅拌,然后离心取上清冻干,得到负载疏水药物的纳米复合物;其中室温敞口搅拌6-24小时;
按照相应的N/P比,将上述负载疏水药物的纳米复合物用无菌水稀释,并用无菌水稀释miRNA,然后混合均匀,37℃孵育20分钟,得到载药复合材料。
所述疏水性药物为DOX;疏水性药物溶液的溶剂为MeOH。
疏水性药物溶液的浓度为0.01mg/mL–1mg/mL;1-C12G1水溶液浓度为0.01mg/mL;
所述N/P比为0.5:1-5:1。
本发明的一种所述载药复合材料材料在制备肿瘤联合治疗药物中的应用。
本发明还提供了一种含磷树冠大分子基杂化纳米材料的药物及基因传递效率评价方法,包括如下步骤:
(1)取不同浓度的阿霉素(DOX)甲醇溶液(浓度为0.01mg/mL–1mg/mL)逐滴加入到1-C12G1的水溶液(浓度为0.01mg/mL)中,室温敞口搅拌,然后离心,上清冻干,得到负载DOX的纳米复合物1-C12G1@DOX;对未上载的DOX通过紫外分光光度计进行定量。计算最终的上载效率及负载率;
(2)按照相应的N/P比,取1-C12G1@DOX用无菌水稀释,并用无菌水稀释miRNA,然后混合均匀,37℃孵育20分钟,得到不同N/P比的1-C12G1@DOX/miRNA复合物;通过凝胶阻滞实验对载体与miRNA形成复合物的能力进行表征;通过水动力学粒径与表面电势对载体/miRNA的电势粒径进行分析。其中N/P比为树状大分子的仲胺基与miRNA骨架上磷酸基团摩尔比,数值范围为0.5:1-5:1;
(3)将装有1-C12G1@DOX溶液的透析袋分别置于pH=5.0和7.4的磷酸缓冲液环境中,放入恒温摇床中,分别测定不同时间点下溶液中DOX的释放量。以盐酸阿霉素组为对照,评价载体@DOX在不同pH下的缓释性能。
(4)将MDA-MB-231细胞种于96孔板上,于37℃、5%CO2培养24小时,更换成含血清的新鲜培养基,加入1-C12G1,1-C12G1/miRNA,1-C12G1@DOX和1-C12G1@DOX/miRNA培养24小时,利用CCK-8法评价材料的细胞毒性;
(5)将MDA-MB-231细胞种于激光共聚焦显微镜培养皿中,于37℃、5%CO2培养24小时,更换成含血清的新鲜培养基,加入1-C12G1,1-C12G1/miRNA,1-C12G1@DOX和1-C12G1@DOX/miRNA,培养4小时,PBS洗涤三次,分别用DIPA和鬼笔环肽染色液染色。通过激光共聚焦显微镜观察DOX吞噬情况。
(6)将MDA-MB-231细胞种于12孔板,于37℃、5%CO2培养24小时,更换成含血清的新鲜培养基,加入1-C12G1,1-C12G1/miRNA,1-C12G1@DOX和1-C12G1@DOX/miRNA,培养4小时,PBS洗涤三次,胰酶消化后离心收集细胞,PBS重悬,通过流式细胞仪定量分析材料对DOX吞噬效率。
(7)将MDA-MB-231细胞种于6孔板,在37℃、5%CO2环境中培养24小时,更换新鲜培养基,加入1-C12G1,1-C12G1/miRNA,1-C12G1@DOX和1-C12G1@DOX/miRNA,与细胞共孵育4小时,PBS洗涤三次后,更换新鲜培养基,培养24小时,胰酶消化后离心收集细胞,凋亡试剂盒处理后,利用流式细胞仪对细胞凋亡进行定量分析。
所述培养MDA-MB-231细胞所用有血清培养基为含10%FBS和1%双抗的RPMI 1640培养基。
本发明使用核磁共振(1H NMR,31P NMR和13C NMR)、水动力学粒径及Zeta电势表征制备的纳米材料。然后利用凝胶阻滞实验评价纳米载体压缩基因的能力,CCK-8法评价纳米材料对MDA-MB-231细胞的毒性。利用流式细胞仪评价杂化纳米材料对MDA-MB-231细胞的治疗效果。
本发明中以六氯环三磷腈为核通过发散迭代的方法合成含磷树冠大分子,在其表面修饰吡咯烷并质子化进而得到具有两亲性含磷树冠大分子。两亲性树冠大分子能够产生超分子胶束,其内部的疏水空腔可用于负载脂溶性药物,其表面可通过静电吸附直接负载基因,形成杂化纳米材料,用于肿瘤的化疗与基因联合治疗。
有益效果
(1)本发明的方法简单,反应可控性强,易于操作分离,成本低廉,终产物分子量均一,原料来源商品化,具有良好的发展前景;
(2)本发明制备得到的含磷树冠大分子纳米材料能够自组装成胶束,进而在内部负载疏水性药物,其表面电势为正,能够通过静电吸附与基因形成稳定的复合物,同时含磷树冠大分子在一定浓度条件下未见对细胞的明显毒性,具有用于药物和基因传递的应用前景。
附图说明
图1为本发明的吡咯烷修饰的含磷树冠大分子的合成示意图;
图2为实施例1中的C12H25的核磁共振氢谱图(A)和碳谱图(B);
图3为实施例1中的C12G0.5的核磁共振氢谱图(A)、磷谱图(B)和碳谱图(C);
图4为实施例1中的C12G1的核磁共振氢谱图(A)、磷谱图(B)和碳谱图(C);
图5为实施例1中的C12G1NC4的核磁共振氢谱图(A)、磷谱图(B)和碳谱图(C);
图6为实施例2中荧光染料法测定1-C12G1临界胶束浓度的结果图;
图7为实施例3中同氮磷比下纳米复合物的凝胶阻滞实验电泳图谱(泳道1为纯miR-21i,泳道2-8为不同氮磷比下的纳米复合物);
图8为实施例3中不同氮磷比下纳米复合物的表面电势(A)与水动力学粒径图(B);
图9为实施例4中在pH 5.0和pH 7.4条件下,1-C12G1@DOX/miR21-i的药物缓释图;
图10为实施例5中纳米复合物对MDA-MB-231细胞活力的抑制效果;
图11为实施例6中共聚焦显微镜观察细胞摄取效果图;
图12为实施例6中细胞的吞噬流式细胞术结果图(A)和分析直方图(B);
图13为实施例7中流式细胞术细胞凋亡分布图(A)和分析直方图(B);
图14为吡咯烷修饰的含磷树状大分子的合成示意图和纳米胶束双载复合物的制备示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)取六氯环三磷腈(0.4mmol)溶于10mL无水四氢呋喃中,加入无水碳酸铯(4.8mmol)活化;然后逐滴加入10mL溶有对羟基苯甲醛(2.0mmol)的四氢呋喃溶液,室温反应12小时,薄层色谱分析(TLC)检测反应进程,过滤去除沉淀,然后通过柱层析进行纯化(乙酸乙酯和正己烷,v:v=1:1.5),最后真空干燥得到AB5(MW=775)。
(2)取4-十二烷氧基苯甲酸(3.64mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中,加入EDC*HCl(3.64mmol)活化;然后逐滴加入10mL溶有酪胺(3.64mmol)的甲醇溶液,室温反应12小时,薄层色谱分析(TLC)检测反应进程,通过柱层析进行纯化(甲醇和二氯甲烷,v:v=1:19),最后真空干燥得到酰胺(C12H25,MW=425)。
(3)将(1)中的C12H25(0.495mmol)溶于10mL无水四氢呋喃中,加入无水碳酸铯(1.35mmol),冰浴20分钟,逐滴加入10mL溶有AB5(0.45mmol)的四氢呋喃溶液,室温反应12小时,核磁(31P NMR)检测反应进程,然后通过柱层析进行纯化(正己烷和乙酸乙酯,v:v=4:6),真空干燥得到第0.5代的含磷树冠大分子C12G0.5(MW=1165)。
(4)将0.35mmol的C12G0.5溶于50mL无水二氯甲烷中,加入无水硫酸钠(4.2mmol),冰浴20分钟,逐滴加入2.1mmol的甲基肼的硫代磷酰氯(MMHPSCl2)溶液,室温反应6小时,核磁(31P NMR和1H NMR)检测反应进程,过滤除去沉淀,旋转蒸发除去有机溶剂,添加10mL无水四氢呋喃重新溶解产物,逐滴加至100mL戊烷中,搅拌0.5小时,移除上清后真空干燥,得到第一代含磷树冠大分子C12G1(MW=1960)。
(6)将0.1mmol的C12G1溶于10mL无水四氢呋喃中,逐滴加入1mmol的N,N-二异丙基乙基胺冰浴,冰浴20分钟,而后逐滴加入1mmol的1-(2-氨基乙基)吡咯烷,搅拌反应过夜,核磁(31P NMR和1H NMR)检测反应进程,旋转蒸发除去有机溶剂,添加10mL无水四氢呋喃重新溶解产物,逐滴加至100mL戊烷中,搅拌0.5小时,移除上清后真空干燥,得到吡咯烷修饰的磷树冠大分子C12G1NC4(MW=2745)。
(7)将C12G1NC4(0.4mmol)溶于10mL无水四氢呋喃中,冰浴20分钟,逐滴加入氯化氢的乙醚溶液(4.0mmol),搅拌反应过夜,旋转蒸发,真空干燥,得到两性含磷树状大分子1-C12G1(MW=3067)。
表1.主要原料的来源及规格参数
本发明使用400MHz核磁共振仪进行氢谱(1H NMR)、磷谱(31P NMR)、碳谱(13C NMR)测试(如附图2-5),结果如下:
C12H25:
C12G0.5:
31P{1H}NMR(162MHz,CDCl3):δ=7.40(m,P0)ppm.
C12G1:
31P{1H}NMR(162MHz,CDCl3):δ=8.36(m,P0),62.41,62.44(s,P1)ppm.
C12G1NC4:
31P{1H}NMR(162MHz,CDCl3):δ=8.56(m,P0),68.27,68.49(s,P1)ppm.
实施例2
制备1-C12G1浓度从0.001mg/mL到2mg/mL的溶液。分别将制备的溶液加入到含有荧光探针芘溶液(10μL,4.0×10-4M)的烧瓶中,芘的终浓度为6.0×10-7M。将超声30分钟,室温保存过夜,以确定胶束的形成。荧光分光光度计测定激发波长为335nm的荧光光谱,激发和发射带宽为5nm。以1-C12G1浓度的lg值与I373/I393的荧光强度比为横纵坐标进行分析(如附图6所示)。结果显示,随着1-C12G1浓度的升高I373/I393的荧光强度比值在151μM处有一个明显的下降,这说明材料1-C12G1能够形成胶束,且临界胶束浓度为151μM。
实施例3
取阿霉素(DOX)溶于甲醇中,然后按照不同的摩尔比(1-C12G1:DOX=1:10,1:15,1:20和1:25)将一定量的DOX甲醇溶液加入到1-C12G1的水溶液中,室温敞口搅拌过夜。随后将混合溶液移入离心管,7000转/分钟、20分钟离心2次,每次离心结束后取出上清液,再用适量超纯水重悬沉淀后再进行下一次离心。将沉淀溶于1mL甲醇中,测定其在481nm处的紫外吸收值,通过与纯DOX的标准曲线对比计算DOX的包封率和上载率(表2)。结果显示,随着1-C12G1与DOX的摩尔比升高,DOX的包封率和上载率逐渐上升,当达到1:30时,上载率达到最大值,因此选择1:30作为两者最佳混合比例进行后续实验。
将1-C12G1@DOX在不同的N/P比条件下(0.25,0.5,1,2,3,4和5),分别与1μg miRNA(miRNA-21i)通过静电作用形成1-C12G1@DOX/miR-21i复合物于室温下孵育15-30min后进行琼脂糖凝胶电泳实验。结果显示在N/P为3条件下材料能够完全负载miR-21i,这说明1-C12G1@DOX具有良好的压缩miR-21i的能力(如附图7所示)。
1-C12G1@DOX在不同的N/P比条件下(1,3,5和10),分别与5μg miR-21i通过静电作用形成1-C12G1@DOX/miR-21i复合物,于室温下孵育15-30min后加入PBS缓冲液至终体积为1mL。通过马尔文激光粒度仪(Malvern,ΜK,633nm激光)对其水动力学粒径及表面电势进行了表征(如附图8)。结果显示,在不同的N/P比条件下,1-C12G1@DOX/miR-21i复合物的水动力学粒径与表面电势都处于合适的基因传递范围内,这说明各载体都具有良好的压缩miR-21i的能力,适合被细胞吸附和内吞,有利于细胞内基因的传递。由于在N/P为5时,1-C12G1@DOX/miR-21i的电势和水合粒径约为25mV和250nm,为最佳细胞吞噬的条件,因此选用N/P为5进行后续实验。
表2.1-C12G1与DOX在不同摩尔比条件下DOX的包封率及上载率
实施例4
选取pH 7.4PBS的缓冲液(0.2M)和pH 5.0的梓檬酸缓冲液(0.2M)模拟体内的中性血液环境和癌细胞内的溶酶体酸性环境,进行释放动力学研究。药物释放动力学研究中,将1-C12G1@DOX/miR-21i复合物溶于对应缓冲液,置于透析袋(分子截留量为10,000)中,随后分别以上述两种缓冲液(20mL每组)为外液,置于37℃恒温摇窗中,90rpm振荡条件下进行缓释实验。在设定的时间点上取样3mL,并补充等体积的相应新鲜缓冲液。为研究纯药的释放动力学,盐酸阿霉素(DOX*HCl)被溶解在pH 7.4PBS的缓冲液中,置于pH 7.4的缓释外液中进行释放研究,采用相同的取样方法。最终所有样品经紫外分光光度计测定,绘制DOX的释放动力学曲线(如附图9所示)。结果显示,在37℃、pH 7.4条件下,8小时内,接近80%的未经任何大分子负载的自由DOX*HCl快速释放到了外液介质中,而1-C12G1@DOX/miR-21i复合物在pH 7.和pH 5.0条件下均以一种相对缓慢且持续的方式释放DOX,8小时内,最多不超过45%的DOX药物从1-C12G1@DOX/miR-21i复合物中释放到外液介质中。与此同时在pH=5.0条件下,1-C12G1@DOX/miR-21i复合物的药物释放能力更强。
实施例5
本实施例利用CCK-8法评价1-C12G1@DOX/miR-21i对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制效果:收集对数生长期MDA-MB-231细胞,按照10,000细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上,培养于添加100U/mL青霉素,100U/mL链霉素和10%FBS的800μL RPMI 1640培养液中,于5%CO2,37℃条件下孵育过夜。弃掉培养基后,每孔更换含有材料(相对DOX浓度为4、8、20、28、40、80、200nM)或生理盐水(对照组)的新鲜培养基,5%CO2,37℃继续孵育24小时。随后弃掉原培养基,加入含100μL含有10%CCK-8的新鲜培养基溶液,继续培养3h后,多功能酶标仪测试波长450nm下测试吸光值,结果如附图10所示。
与生理盐水对照组相比,在试验浓度范围内1-C12G1处理过的MDA-MB-231细胞,其存活率均在80%以上,说明1-C12G1本身不具肿瘤细胞抑制性。与1-C12G1相比,1-C12G1/miR-21i对MDA-MB-231细胞的抑制有明显的提升,这说明miR-21i能够在MDA-MB-231细胞内行使其生物学功能。相对与其他实验组,1-C12G1@DOX/miR-21i复合物对MDA-MB-231细胞的抑制效果最明显。
实施例6
以MDA-MB-231细胞为模型细胞来检验细胞对纯DOX,1-C12G1@DOX和1-C12G1@DOX/miR-21i的吞噬效果。以2×105/孔的密度将MDA-MB-231细胞种于直径20mm,载玻片厚度0.13-0.17mm激光共聚焦专用培养皿中,于37℃及5%CO2条件下培养过夜。随后将培养基换成900μL含FBS的RPMI 1640培养基,按照每孔1μM DOX制备100μL各材料加入细胞中转染4h。使用PBS缓冲溶液清洗细胞,每个培养皿加入1mL 4%多聚甲醛固定液,固定20min,去除固定液,分别用DIPA和鬼笔环肽染色液染色。激光共聚焦显微镜观察材料在MDA-MB-231细胞内的分布情况(如附图11所示)。
结果显示,将纯DOX,1-C12G1@DOX和1-C12G1@DOX/miR-21i与细胞培养4h后,大量的红色荧光(DOX)分布在细胞胞浆中。那么可以说明1-C12G1@DOX和1-C12G1@DOX/miR-21i能够成功的将DOX运输到细胞内。
采用与上述方法相同的操作培养细胞与6孔板上,材料孵育4小时,每孔300μL胰酶消化,离心收集后用200μL PBS重悬,通过流式细胞术定量表征(如附图12所示)。流式细胞结果显示,1-C12G1@DOX和1-C12G1@DOX/miR-21i能够成功的将DOX运输到细胞内。其运输效果与纯DOX进入细胞效果相似。
实施例7
将2×105个MDA-MB-231细胞接种于6孔板上,培养过夜,更换含有材料的新鲜培养基(相对DOX浓度为1μM),孵育4h后,换成新鲜培养基。继续培养48h后胰酶消化离心收集所有细胞,PBS冲洗细胞两次,重悬于100mL 1×binding buffer中,加入5μL FITC Annexin-V和5μL PI,混匀后避光反应15min,加入400μL l×binding buffer待检测。每个样品至少检测1000个细胞,使用流式细胞仪检测细胞凋亡(如附图13A所示,图13B为定量分析柱状图)。
结果显示与对照组相比1-C12G1对细胞没有影响,1-C12G1负载miR-21i后凋亡细胞增加3%左右。与纯DOX组相比1-C12G1@DOX和1-C12G1@DOX/miR-21i组凋亡细胞比例明显提高,说明1-C12G1作为基因和药物载体能够显著地促进DOX和miR-21i的协同治疗效果。
Claims (11)
2.一种含磷树冠大分子杂化纳米材料的制备方法,包括:
(1)将六氯环三磷腈溶于无水四氢呋喃中,加入无水碳酸钾,冰浴,逐滴加入溶有对羟基苯甲醛的四氢呋喃溶液,室温反应,纯化,真空干燥,得到修饰有五个对羟基苯甲醛的环三磷腈AB5;
(5)将步骤(4)制得的C12G1溶于无水四氢呋喃中,逐滴加入N, N-二异丙基乙基胺,冰浴,而后逐滴加入1-(2-氨基乙基)吡咯烷,搅拌反应,旋转蒸发,添加四氢呋喃重新溶解产物,逐滴加入至正戊烷中,搅拌,移除上清后真空干燥,得到吡咯烷修饰的含磷树冠大分子C12G1NC4 ;
3.根据权利要求2所述制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中的4-十二烷氧基苯甲酸、酪胺和EDC*HCl的摩尔比为1:1:1;4-十二烷氧基苯甲酸的二氯甲烷溶液浓度为0.10-0.50mmol/mL;酪胺的甲醇溶液浓度为0.10-0.50 mmol/mL;室温反应时间均为6-24小时;C12H25的纯化工艺条件为:采用溶剂为体积比为1:19的甲醇和二氯甲烷的柱层析进行纯化。
4.根据权利要求2所述制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中C12H25、AB5和无水碳酸铯的摩尔比为1.1:1:3;酰胺C12H25的四氢呋喃溶液浓度为0.010-0.050 mmol/mL;AB5的四氢呋喃溶液0.010-0.050 mmol/mL;冰浴的时间为10-60分钟;反应的工艺参数为:室温反应6-24小时;纯化的工艺条件为:采用溶剂为体积比为1:1.5的乙酸乙酯和正己烷的柱层析进行纯化。
5.根据权利要求2所述制备方法,其特征在于,所述步骤(5)中C12G1、N, N-二异丙基乙基胺和1-(2-氨基乙基)吡咯烷的摩尔比分别为1:10:10;C12G1的四氢呋喃溶液浓度为0.010-0.050 mmol/mL;冰浴的时间为10-60分钟;反应的工艺参数为:室温反应6-24小时;纯化的工艺条件为:采用溶剂为体积比为1:10的四氢呋喃和正戊烷的沉淀纯化。
6.根据权利要求2所述制备方法,其特征在于,所述步骤(6)中C12G1NC4和氯化氢的摩尔比为1:10;C12G1NC4的四氢呋喃溶液浓度为0.010-0.050 mmol/mL;冰浴的时间为10-60分钟;反应的工艺参数为:室温反应6-24小时。
7.一种基于权利要求1所述含磷树冠大分子杂化纳米材料1-C12G1的自组装胶束。
8.一种载药复合纳米材料,其特征在于,所述复合纳米材料的载体为权利要求1所述含磷树冠大分子杂化纳米材料1-C12G1的自组装胶束,载体内部负载疏水性药物,表面吸附基因。
9.一种载药复合材料的制备方法,包括:
疏水性药物溶液逐滴加入到权利要求1所述含磷树冠大分子杂化纳米材料1-C12G1的水溶液中,室温敞口搅拌,然后离心取上清冻干,得到负载疏水药物的纳米复合物;
按照相应的N/P比,将上述负载疏水药物的纳米复合物用无菌水稀释,并用无菌水稀释miRNA,然后混合均匀,37 ℃ 孵育20分钟,得到载药复合材料。
10.根据权利要求9所述制备方法,其特征在于,所述疏水性药物为DOX;疏水性药物溶液的浓度为0.01 mg/mL-1 mg /mL;1-C12G1水溶液浓度为0.01 mg/mL;所述N/P比为0.5:1-5:1。
11.一种权利要求8所述载药复合纳米材料在制备肿瘤联合治疗药物中的应用。
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