CN111171328A - 一种磷树状大分子基杂化纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种磷树状大分子基杂化纳米材料及其制备方法和应用,包括以六氯环三磷腈为核通过发散迭代的方法合成磷树状大分子,在其表面修饰吡咯烷并质子化进而得到表面带有正电荷的磷树状大分子,可通过静电吸附直接负载基因,形成杂化纳米材料。本发明的磷树状大分子基杂化纳米材料分子量均一,制备方法简单,反应过程可控性高,易于操作;可用于肿瘤细胞的基因治疗研究,拥有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因传递材料领域,特别涉及一种磷树状大分子基杂化纳米材料及其制备方法和应用。
背景技术
基因治疗作为一种现代医学和分子生物学相结合而诞生的新技术,是通过将外源正常基因导入靶细胞内,用以纠正或补偿基因缺失或异常引起的疾病,从而进行疾病治疗。然而,目前基因治疗最主要的障碍就是缺乏一种安全有效的传递表达载体。在基因载体系统中,主要借助病毒和非病毒载体将外源基因导入靶细胞。病毒载体转染效率高,但临床应用的安全隐患制约了其进一步的应用。而非病毒载体,由于其低细胞毒性、无免疫原性、易操作和高基因装载量等特点,越来越受到研究者们的关注。
非病毒载体中,树状大分子是目前研究最深入的载体之一,它独特的高度支化三维立体结构令其成为一种新型的高分子载体被广泛应用于基因传递中。其中磷树状大分子(Phosphorous dendrimers)与传统聚酰胺胺型树状大分子(PAMAM)相比分子量分布更加均一,其分子结构的高度分散性,以及可精准控制的三维结构和表面化学,受到了研究者的广泛关注。随着纳米技术和纳米医学的不断发展,磷树状大分子作纳米载体或支架,为多种抗肿瘤药物的传递及生物活性化合物的设计提供可能,已广泛应用于催化、材料、生物等领域。然而,关于磷树状大分子用于基因传递的研究却鲜有报道,这主要是因为磷树状大分子的生物特性不被人们深入了解。已有的文献显示磷树状大分子表面甲基化和叔氨质子化修饰,使其具有载体毒性小、报告基因活性好等优异的基因载体性质(Loup et al.,Chem.Eur.J.1999,5,No.12,3644-3650)。
检索国内外文献尚没有发现关于利用磷树状大分子表面修饰氨基吡咯烷为基因载体用于基因治疗的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种磷树状大分子基杂化纳米材料及其制备方法和应用,填补了采用低代磷树状大分子用于基因载体的研究空白。
本发明提供了一种磷树状大分子基杂化纳米材料,所述纳米材料的结构式为:
本发明还提供了一种磷树状大分子基杂化纳米材料的制备方法,包括:
(1)将六氯环三磷腈溶于无水四氢呋喃中,加入无水碳酸盐,冰浴,逐滴加入溶有对羟基苯甲醛的四氢呋喃溶液,室温反应,纯化,真空干燥,得到第0.5代磷树状大分子G0.5;
(2)将步骤(1)制得的第0.5代磷树状大分子溶于无水二氯甲烷中,加入无水硫酸盐,冰浴,逐滴加入N-甲基二氯硫代磷酰肼MMHPSCl2的氯仿溶液,室温反应,后处理,得到第1代磷树状大分子G1;
(3)将第1代磷树状大分子G1溶于无水四氢呋喃中,与步骤(1)、(2)相同,分别加入对羟基苯甲醛和MMHPSCl2进行反应,得到第2代磷树状大分子G2;
(4)将第2代磷树状大分子G2溶于无水四氢呋喃中,与步骤(1)、(2)相同,分别加入对羟基苯甲醛和MMHPSCl2进行反应,得到第3代磷树状大分子G3;
(5)将步骤(2)、(3)或(4)制得的磷树状大分子(包括G1、G2、G3)溶于无水四氢呋喃中,逐滴加入N,N-二异丙基乙基胺冰浴,再逐滴加入1-(2-氨基乙基)吡咯烷,搅拌反应,旋转蒸发,洗涤,真空干燥,得到吡咯烷修饰的磷树状大分子(记作G1NC4,G2NC4和G3NC4);
(6)将步骤(5)制得的吡咯烷修饰的磷树状大分子溶于无水四氢呋喃中,冰浴,逐滴加入氯化氢的乙醚溶液,搅拌反应过夜,旋转蒸发,真空干燥,得到磷树状大分子基杂化纳米材料(记作1-G1,1-G2和1-G3)。
所述步骤(1)中的六氯环三磷腈、无水碳酸盐和对羟基苯甲醛的摩尔比为1:12:6。所述步骤(3)中的第1代磷树状大分子、无水碳酸盐和对羟基苯甲醛的摩尔比为1:24:12。所述步骤(4)中的第2代磷树状大分子、无水碳酸盐和对羟基苯甲醛的摩尔比为1:48:24。
所述步骤(1)中的六氯环三磷腈的四氢呋喃溶液浓度为0.010-0.050mmol/mL;对羟基苯甲醛的四氢呋喃溶液浓度为0.060-0.300mmol/mL。
所述步骤(1)中的冰浴的时间为10-60分钟。反应的工艺参数为:室温反应6-24小时。纯化的工艺条件为:采用无水甲醇洗涤三次,再分别用戊烷、甲醇及乙醚分别洗涤三次。
所述步骤(2)中的第0.5代磷树状大分子、无水硫酸盐和N-甲基二氯硫代磷酰肼的摩尔比为1:12:6。
所述步骤(2)中的第0.5代磷树状大分子的无水二氯甲烷溶液浓度为0.010-0.050mmol/mL;N-甲基二氯硫代磷酰肼的氯仿溶液浓度为0.010-0.300mmol/mL。
所述步骤(2)中的后处理步骤为:过滤,旋转蒸发,添加无水四氢呋喃重新溶解产物,逐滴加入至戊烷中,搅拌,移除上清后真空干燥。
所述步骤(1)中的无水碳酸盐为无水碳酸钾或无水碳酸铯;所述步骤(2)中的无水硫酸盐为无水硫酸钠。
所述步骤(5)中的磷树状大分子为G1时,与N,N-二异丙基乙基胺和1-(2-氨基乙基)吡咯烷的摩尔比为1:12:12;磷树状大分子为G2时,与N,N-二异丙基乙基胺和1-(2-氨基乙基)吡咯烷的摩尔比为1:24:24;磷树状大分子为G3时,与N,N-二异丙基乙基胺和1-(2-氨基乙基)吡咯烷的摩尔比为1:48:48。
所述步骤(5)中的冰浴的时间为10-60分钟。反应的工艺参数为:室温反应6-24小时。纯化的工艺条件为:采用溶剂为体积比为1:10的四氢呋喃和正戊烷的沉淀纯化。
本发明还提供了一种磷树状大分子基杂化纳米材料的应用,应用于基因传递。
本发明还提供了一种磷树状大分子基杂化纳米材料的基因传递效率评价方法,包括如下步骤:
(1)按照相应的N/P比,取1-G1,1-G2,1-G3用无菌水稀释,并用无菌水稀释pDNA,然后混合均匀,37℃孵育20分钟,得到不同N/P比的1-G1/pDNA、1-G2/pDNA和1-G3/pDNA复合物,通过凝胶阻滞实验对载体与pDNA形成复合物的能力进行表征;通过水动力学粒径与表面电势对载体/pDNA的电势粒径进行分析。其中N/P比为树状大分子的仲胺基与pDNA骨架上磷酸基团摩尔比,数值范围为0.5:1-6:1;
(2)将HeLa细胞种于96孔板上,于37℃、5%CO2培养24小时,更换新鲜培养基,加入步骤(9)中所得的材料/基因复合物培养24小时,利用CCK-8法评价材料的细胞毒性;
(3)将HeLa细胞种于12孔板上,于37℃、5%CO2培养24小时,更换新鲜培养基,加入步骤(2)中所得的材料/基因复合物,混合均匀,在培养基箱中培育4小时,然后更换新鲜培养基继续培养24小时,检测基因的转染效率。
所述培养基为10%FBS的DMEM培养基,转染时间为4小时,转染后培养时间为24小时。所述pDNA为带有增强的绿色荧光蛋白EGFP基因的质粒。
本发明还提供了一种磷树状大分子基杂化纳米材料的基因治疗效果评价方法,包括如下步骤:
(1)按照相应的N/P比,取1-G1用无菌水稀释,并用DEPC水稀释质粒p53,然后混合均匀,37℃孵育20分钟,得到不同N/P比的1-G1/质粒p53复合物,通过凝胶阻滞实验对载体与质粒p53形成复合物的能力进行表征;通过水动力学粒径与表面电势对载体/质粒p53复合物的电势粒径进行分析。其中N/P比为树状大分子的仲胺基与质粒p53骨架上磷酸基团摩尔比,数值范围为0.5:1-5:1;
(2)将HeLa细胞种于12孔板上,于37℃、5%CO2培养24小时,更换新鲜培养基,加入步骤(12)中所得的载体/质粒p53复合物,混合均匀,在培养基箱中培育4小时,然后更换新鲜培养基继续培养24小时,利用Western blot检测蛋白表达,评测基因的转染效率;
(3)在裸鼠体内构建HeLa皮下瘤模型,通过瘤内注射步骤(2)中制备的1-G1/质粒p53复合物的生理盐水溶液,3天后将裸鼠处死取其肿瘤通过Western blot检测蛋白表达,来评价肿瘤部位基因治疗效果。
所述培养基为10%FBS的DMEM培养基,转染时间为4小时,转染后培养时间为24小时。所述质粒p53为具有人体抑癌基因p53和绿色荧光蛋白EGFP基因的质粒。
本发明使用核磁共振(1H NMR,31P NMR和13C NMR)、Zeta电势及动态光散射分析(DLS)表征制备的纳米材料。然后利用凝胶阻滞实验评价纳米载体压缩基因的能力,CCK-8法评价纳米材料对HeLa细胞的毒性。利用流式细胞仪和免疫印迹法评价载体的基因转染效果。
有益效果
(1)本发明制备方法简单,反应可控性强,易于操作分离,成本低廉,终产物分子量均一,原料来源商品化;
(2)本发明制备得到的磷树状大分子纳米材料表面电势为正,能够通过静电吸附与基因形成稳定的复合物,同时磷树状大分子在一定浓度条件下未见对细胞的明显毒性,具有用于基因传递的应用前景。
附图说明
图1为本发明的磷树状大分子基杂化纳米材料的合成示意图;
图2为实施例1中的G1的核磁共振氢谱图、磷谱图和碳谱图;
图3为实施例1中的G2的核磁共振氢谱图、磷谱图和碳谱图;
图4为实施例1中的G3的核磁共振氢谱图、磷谱图和碳谱图;
图5为实施例1中的G1NC4的核磁共振氢谱图、磷谱图和碳谱图;
图6为实施例1中的G2NC4的核磁共振氢谱图、磷谱图和碳谱图;
图7为实施例1中的G3NC4的核磁共振氢谱图、磷谱图和碳谱图;
图8为实施例2中的不同氮磷比下纳米复合物的凝胶阻滞实验电泳图谱(泳道1为DNA mark,泳道2-8为不同氮磷比下的纳米复合物,泳道9为纯质粒DNA);其中,A为1-G1/pDNA,B1-G2/pDNA,C为1-G3/pDNA;
图9为实施例2中的不同氮磷比下纳米复合物的表面电势图(A)与水动力学粒径图(B);图10为实施例3中的载体/pDNA复合物对HeLa细胞的毒性结果图;其中,A为1-G1以及1-G1/pDNA,B为1-G2以及1-G2/pDNA,C为1-G3以及1-G3/pDNA;
图11为实施例4中的不同氮磷比下复合物在HeLa细胞中的绿色荧光蛋白基因转染的荧光显微镜图。
图12为实施例5中的不同氮磷比下流式细胞仪表征纳米复合物在HeLa细胞中的转染效率效果。其中图12中的A为1-G1/pDNA,1-G2/pDNA和1-G3/pDNA绿色荧光蛋白表达量的流式结果图,B为流式结果定量图。
图13为实施例6中的不同氮磷比下纳米复合物的凝胶阻滞实验电泳图谱(泳道1为DNA mark,泳道2-7为不同氮磷比下的纳米复合物,泳道8为纯质粒DNA);
图14为实施例6中的不同氮磷比下纳米复合物的表面电势图(A)与水动力学粒径图(B);图15为实施例7中的不同氮磷比下复合物在HeLa细胞中的绿色荧光蛋白基因转染的荧光显微镜图。
图16为实施例8中的不同氮磷比下流式细胞仪表征纳米复合物在HeLa细胞中的转染效率效果。其中图16中的A为1-G1/质粒p53绿色荧光蛋白表达量的流式结果图,B为流式结果定量图。
图17为实施例9中的纳米复合物在HeLa细胞中的Western blot试验结果图,其中(A)为Western blot的蛋白条带图,(B)为蛋白条带的灰度定量图。
图18为实施例10中的纳米复合物在裸鼠皮下瘤中的Western blot试验结果图,其中(A)为Western blot的蛋白条带图,(B)为蛋白条带的灰度定量图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)取六氯环三磷腈(0.4mmol)溶于10mL无水四氢呋喃中,加入无水碳酸铯(4.8mmol)活化;然后逐滴加入10mL溶有对羟基苯甲醛(2.4mmol)的四氢呋喃溶液,室温反应12小时,薄层色谱分析(TLC)检测反应进程,过滤去除沉淀,无水甲醇洗涤三次,最后真空干燥得到G0.5。
(2)取硫代磷酰氯(30.7mmol)溶于100mL无水三氯甲烷中,-61℃条件下逐滴加入10mL溶有甲基肼(61.4mmol)的三氯甲烷溶液,滴加完毕后室温搅拌过夜,核磁(31P NMR)检测反应,然后过滤得到修饰有一个甲基肼的硫代磷酰氯MMHPSCl2的三氯甲烷溶液,该溶液的浓度通过核磁氢谱特征质子峰积分计算。
(3)取G0.5(0.4mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中,加入无水硫酸钠(4.8mmol),冰浴20分钟,逐滴加入2.4mmol的MMHPSCl2溶液,室温反应6小时,核磁(31P NMR和1H NMR)检测反应进程,过滤除去沉淀,旋转蒸发除去有机溶剂,添加5mL无水四氢呋喃重新溶解产物,逐滴加至50mL戊烷中,搅拌0.5小时,移除上清后真空干燥,得到G1。
(4)取G1(0.4mmol)溶于10mL无水四氢呋喃中,加入无水碳酸铯(9.6mmol)活化;然后逐滴加入10mL溶有对羟基苯甲醛(4.8mmol)的四氢呋喃溶液,室温反应12小时,薄层色谱分析(TLC)检测反应进程,过滤去除沉淀,无水甲醇洗涤三次,最后真空干燥得到G1.5。
(5)取G1.5(0.4mmol)溶于10mL无水四氢呋喃中,加入无水硫酸钠(9.6mmol),冰浴20分钟,逐滴加入4.8mmol的MMHPSCl2溶液,室温反应6小时,核磁(31P NMR和1H NMR)检测反应进程,过滤除去沉淀,旋转蒸发除去有机溶剂,添加10mL无水四氢呋喃重新溶解产物,逐滴加至100mL戊烷中,搅拌0.5小时,移除上清后真空干燥,得到G2。
(6)取G2(0.4mmol)溶于10mL无水四氢呋喃中,加入无水碳酸铯(19.2mmol)活化;然后逐滴加入10mL溶有对羟基苯甲醛(9.6mmol)的四氢呋喃溶液,室温反应12小时,薄层色谱分析(TLC)检测反应进程,过滤去除沉淀,无水甲醇洗涤三次,最后真空干燥得到G2.5。
(7)取G2.5(0.4mmol)溶于10mL无水四氢呋喃中,加入无水硫酸钠(19.2mmol),冰浴20分钟,逐滴加入9.6mmol的MMHPSCl2溶液,室温反应6小时,核磁(31P NMR和1H NMR)检测反应进程,过滤除去沉淀,旋转蒸发除去有机溶剂,添加10mL无水四氢呋喃重新溶解产物,逐滴加至100mL戊烷中,搅拌0.5小时,移除上清后真空干燥,得到G3。
(8)取G1(G2和G3,0.4mmol)溶于10mL无水四氢呋喃中,加入N-乙基二异丙胺(4.8mmol),冰浴,而后逐滴加入吡咯烷(4.8mmol,9.6mmol和19.2mmol),室温反应12小时,核磁(31P NMR)检测反应进程,旋转蒸发除去有机溶剂,添加10mL无水四氢呋喃重新溶解产物,逐滴加至100mL戊烷中,搅拌0.5小时,移除上清后真空干燥,得到G1NC4(G2NC4和G3NC4)。
(9)取G1NC4(G2NC4和G3NC4,0.4mmol)溶于10mL无水四氢呋喃中,冰浴,而后逐滴加入氯化氢的乙醚溶液(4.8mmol,9.6mmol和19.2mmol),搅拌反应过夜,旋转蒸发,真空干燥,得到磷树状大分子基杂化纳米材料(1-G1,1-G2和1-G3)。
本发明使用400MHz核磁共振仪进行氢谱(1H NMR)、磷谱(31P NMR)、碳谱(13C NMR)测试,结果如下:
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ=3.50(d,3J(H-P1)=16Hz,18H,),7.05(d,3J(H-H)=8Hz,12H,),7.61(d,3J(H-H)=8Hz,12H,),7.65(d,3J(H-P1)=2.2Hz,6H,)ppm.
31P{1H}NMR(162MHz,CDCl3):δ=8.16(s,P0),62.35(s,P1)ppm.
13C{1H}NMR(100MHz,CDCl3):δ=31.99(d,2J(C-P1)=12Hz,),121.35(s,),128.63(s,),131.31(s, ),140.63(d,3J(C-P1)=18Hz,),151.66(s,)ppm.
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ=3.2(d,3J(H-P1)=16Hz,18H,),3.4(d,3J(H-P2)=16Hz,36H,),7.05(d,3J(H-H)=8Hz,12H,),7.23(d,3J(H-H)=8Hz,12H,),7.61(m,54H,C0 5-H and)ppm.
31P{1H}NMR(162MHz,CDCl3):δ=8.4(s,P0),62.35(s,P1),63.0(s,P2)ppm.
13C{1H}NMR(100MHz,CDCl3):δ=31.86(d,2J(C-P2)=12Hz,),33.05(d,2J(C-P2)=12Hz,C0 6)121.36(s,),121.83(d,3J(C-P1)=4Hz,),128.29(s,),128.72(s,),131.59(s,),132.01(s,),138.97(d,3J(C-P1)=14Hz,C0 5),140.54(d,3J(C-P2)=18Hz,C1 5),151.34(d,2J(C-P0)=7Hz,),151.76(d,2J(C-P0)=7Hz,)ppm.
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ=3.2(m,18H,),3.3(d,3J(H-P2)=10Hz,36H,),3.4(d,3J(H-P3)=14Hz,72H,),6.90(d,3J(H-H)=8Hz,12H,),7.23(m,72H,),7.61(m,126H, and)ppm.
31P{1H}NMR(162MHz,CDCl3):δ=8.3(s,P0),61.91(s,P2),62.24(s,P1),62.79(s,P3)ppm.
13C{1H}NMR(100MHz,CDCl3):δ=31.86(d,2J(C-P2)=12Hz,),33.05(d,2J(C-P2)=12Hz,)121.36(s,),121.83(d,3J(C-P2)=4Hz,and),128.29(s,and),128.72(s,),131.59(s,),132.01(s,and),138.97(d,3J(C-P1)=14Hz,and),140.54(d,3J(C-P2)=18Hz,),151.34(m,and),151.76(d,2J(C-P2)=7Hz,)ppm.
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ=1.74(brs,48H,C10-H),2.52(brs,48H,C9-H),2.63(m,24H,C8-H),3.04(m,24H,C7-H),3.17(d,3J(H-P1)=12Hz,18H,),4.12(m,12H,NH-P1),6.94(d,3J(H-H)=8Hz,12H,),7.48(m,18H,and)ppm.
31P{1H}NMR(162MHz,CDCl3):δ=8.23(s,P0),68.53(s,P1)ppm.
13C{1H}NMR(100MHz,CDCl3):δ=23.54(s,),30.79(d,2J(C-P1)=10Hz,),39.74(s,),53.79(s,),56.18(d,2J(C-P1)=8Hz,),121.04(s,),127.46(s,),132.88(s,),135.82(d,3J(C-P1)=13Hz,),150.62(s,)ppm.
1H NMR(400MHz,CDCl3)(400MHz,CDCl3)δ=1.71(brs,96H,C10-H),2.52(brs,96H,C9-H),2.59(m,48H,C8-H),2.98(m,48H,C7-H),3.14(d,3J(H-P1)=8Hz,36H,C1 6-H),3.27(d,3J(H-P1)=12Hz,18H,C0 6-H),4.03(m,24H,NH),7.06(d,3J(H-H)=8Hz,12H,C0 2-H),7.17(d,3J(H-H)=8Hz,24H,C1 2-H),7.43(brs,12H,C0 3-H),7.55(d,3J(H-H)=8Hz,24H,C1 3-H),7.66(m,18H,and)ppm.
31P{1H}NMR(162MHz,CDCl3)(162MHz,CDCl3)δ=8.11(s,P0),62.73(s,P1),68.44(s,P2)ppm.
13C{1H}NMR(100MHz,CDCl3)(100MHz,CDCl3)δ=23.54(s,C10),30.79(d,2J(C-P2)=11Hz,C1 6),33.07(d,2J(C-P0)=12Hz,C0 6),39.80(s,CH2C8),53.79(s,CH2C9),56.19(d,2J(C-P2)=8Hz,C7),121.27(s,C0 2),121.51(s,C1 2),127.50(s,C1 3),128.29(s,C0 3),132.16(s,C0 4),133.33(s,C1 4),135.32(m,and),150.62(m,C0 1andC1 1)ppm.
1H NMR(400MHz,CDCl3)(400MHz,CDCl3)δ=1.70(brs,192H,C10-H),2.48(brs,192H,C9-H),2.57(m,96H,C8-H),3.03(m,96H,C7-H),3.13(d,3J(H-P2)=8Hz,72H,C2 6-H),3.30(m,54H,C0 6-H,C1 6-H),4.05(m,48H,NH),7.00(d,3J(H-H)=8Hz,12H,C0 2-H),7.18(m,72H,C1 2-H,C2 2-H),7.58(m,126H,C0 3-H,C1 3-H,C2 3-H, and)ppm.
31P{1H}NMR(162MHz,CDCl3)(162MHz,CDCl3)δ=8.15(s,P0),62.53(s,P1),62.74(s,P2),68.38(s,P3)ppm.
13C{1H}NMR(100MHz,CDCl3)(100MHz,CDCl3)δ=23.54(s,C10),30.71(d,2J(C-P2)=11Hz,C2 6),33.13(d,2J(C-P1)=12Hz,C1 6),39.77(s,CH2 C8),53.77(s,CH2 C9),56.18(d,2J(C-P2)=8Hz,CH2 C7),121.56(d,3J(C-P)=4Hz,C1 2 and C2 2),121.79(s,C0 2),127.50(s,C2 3),128.29(s,C1 3),132.38(s,C1 4),133.25(s,C2 4),135.33(m,and),150.92(m,C0 1,C1 1and C2 1)ppm.
实施例2
将1-G1,1-G2和1-G3在不同的N/P比条件下(0.5,1,2,3,4,5和6),分别与1μg pDNA质粒(具有EGFP基因,能够表达绿色荧光蛋白)通过静电作用形成载体/pDNA复合物,于室温下孵育15-30min后进行琼脂糖凝胶电泳实验。结果显示在N/P为3条件下所有材料均能够完全负载质粒,这说明各载体都具有良好的压缩pDNA的能力(图8A-C)。将1-G1,1-G2和1-G3在不同的N/P比条件下(10,20和30),分别与5μg pDNA质粒通过静电作用形成载体/pDNA复合物,于室温下孵育15-30min后,加入1mL PBS缓冲液。通过马尔文激光粒度仪(Malvern,ΜK,633nm激光)对其水动力学粒径及表面电势进行了表征(图9A-B)。结果显示,在三个实验N/P比条件下,各载体/pDNA复合物的水动力学粒径与表面电势都处于合适的基因传递范围内,适合被细胞吸附和内吞,有利于细胞内基因的传递。
实施例3
收集对数生长期HeLa细胞,按照8000个细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上,置于5%CO2,37℃条件下孵育过夜,更换成含血清培养基,加入的材料/基因复合物培养24小时,(最终材料浓度为93.5、187.5、375、750、1500、3000nM)及其与pDNA复合物。之后将细胞培养板继续放置在5%CO2,37℃继续孵育24小时。随后弃掉原培养基,加入含100μL含有10%CCK-8的无血清培养基,继续培养3小时后,放置在多功能酶标仪中于测试波长450nm下测试吸光值,结果如图10A-C所示。1-G1、1-G2和1-G3在试验浓度范围内对HeLa细胞略有毒性,浓度为3000nM时细胞存活率为60%左右,负载pDNA后,1-G1、1-G2和1-G3与基因复合物各浓度的细胞存活率较纯材料相比有了明显的下降,说明负载基因减少了表面电荷有助于增强材料的细胞生物相容性。
实施例4
以宫颈癌细胞(HeLa)为模型细胞来检验1-G1,1-G2和1-G3在不同的N/P比条件下(10,20和40)的基因转染效率。以5×104/孔的密度将HeLa种于24孔板中,培养于500μL含有链霉素(100U/mL)和胎牛血清(10%)的DMEM培养液中,于37℃及5%CO2条件下培养12h。随后更换成新鲜培养液,按照每孔5μg pDNA,N/P比10、20和30制备载体/pDNA复合物加入细胞中转染4h。使用PBS缓冲溶液清洗细胞,添加500μL新鲜培养液,于37℃及5%CO2条件下培养24h。利用荧光显微镜检测EGFP的表达情况。
各材料与pDNA复合物在HeLa细胞中的基因转染效率荧光显微镜结果(图11)显示,在实验设计的N/P比条件下,1-G1,1-G2和1-G3都显示出了良好的基因转染效率,其中1-G1/pDNA在N/P为20的条件下转染效率最佳。
实施例5
以5×104/孔的密度将HeLa种于24孔板中,培养于500μL含有链霉素(100U/mL)和胎牛血清(10%)的DMEM培养液中,于37℃及5%CO2条件下培养12h。随后更换成新鲜培养液,按照每孔5μg pDNA,N/P比10、20和30制备载体/pDNA复合物加入细胞中转染4h。使用PBS缓冲溶液清洗细胞,添加500μL新鲜培养液,于37℃及5%CO2条件下培养24h。使用PBS缓冲溶液清洗细胞,按每孔200μL的胰酶消化细胞1min,1000rpm离心5min,最后用1mL PBS将获得的细胞重新分散。制备好细胞溶液后用流式细胞仪检测细胞释放的绿色荧光,设定FSH-H/SSC-H为细胞门,设定FL2-H为Cy3荧光通道,每个材料的不同N/P比样品采取1×104,重复三次。
各材料与pDNA复合物(图12A-B)在HeLa细胞中的基因转染效率流式结果显示,在实验设计的N/P比条件下,1-G1,1-G2和1-G3都显示出了良好的基因转染效率,其中1-G1/pDNA在N/P为20的条件下转染效率最佳。
实施例6
将1-G1在不同的N/P比条件下(0.5,1,2,3,4和5),分别与1μg质粒p53(具有人体抑癌基因p53和EGFP的质粒)通过静电作用形成1-G1/质粒p53复合物,于室温下孵育15-30min后进行琼脂糖凝胶电泳实验。结果显示在N/P为2条件下所有材料均能够完全负载质粒,这说明各载体都具有良好的压缩的能力(图13)。将1-G1在不同的N/P比条件下(10,20和30),分别与5μg质粒p53通过静电作用形成载体/pDNA复合物。于室温下孵育15-30min后加入1mLPBS缓冲液。通过马尔文激光粒度仪(Malvern,ΜK,633nm激光)对其水动力学粒径及表面电势进行了表征(图14A-B)。结果显示,在不同的N/P比条件下,1-G1/质粒p53复合物的水动力学粒径与表面电势都处于合适的基因传递范围内,适合被细胞吸附和内吞,有利于细胞内基因的传递。
实施例7
以5×104/孔的密度将HeLa种于24孔板中,培养于500μL含有链霉素(100U/mL)和胎牛血清(10%)的DMEM培养液中,于37℃及5%CO2条件下培养12h。随后更换成新鲜培养液,按照每孔5μg的质粒p53,N/P比10、20和30制备载体/质粒p53复合物加入细胞中转染4h。使用PBS缓冲溶液清洗细胞,添加500μL新鲜培养液,于37℃及5%CO2条件下培养24h。利用荧光显微镜检测EGFP的表达情况。
材料与质粒p53复合物在HeLa细胞中的基因转染效率荧光显微镜结果(图15)显示,在实验设计的N/P比为20的条件下,1-G 1/质粒p53表达荧光蛋白的效率最佳。
实施例8
以5×104/孔的密度将HeLa种于24孔板中,培养于500μL含有链霉素(100U/mL)和胎牛血清(10%)的DMEM培养液中,于37℃及5%CO2条件下培养12h。随后更换成新鲜培养液,按照每孔5μg的质粒p53,N/P比10、20和30制备载体/质粒p53复合物加入细胞中转染4h。使用PBS缓冲溶液清洗细胞,添加500μL新鲜培养液,于37℃及5%CO2条件下培养24h。使用PBS缓冲溶液清洗细胞,按每孔200μL的胰酶消化细胞1min,1000rpm离心5min,最后用1mLPBS将获得的细胞重新分散。制备好细胞溶液后用流式细胞仪检测细胞释放的绿色荧光,设定FSH-H/SSC-H为细胞门,设定FL2-H为Cy3荧光通道,每个材料的不同N/P比样品采取1×104,重复三次。
1-G 1/质粒p53复合物(图16A-B)在HeLa细胞中的基因转染效率流式结果显示,在实验设计的N/P比为20的条件下,1-G 1/质粒p53表达荧光蛋白的效率最佳。
实施例9
将每孔2×105/孔的密度将HeLa种植于6孔板中,培养过夜,而后替换培养基,加入一定浓度的1-G 1/质粒p53复合物与细胞共培养4小时。然后更换为新鲜培养基,继续培养24小时。利用胰酶消化并收集细胞,将细胞在冰上裂解,并于4℃,12000rpm离心5分钟,收集上清蛋白液。随后依次进行SDS-PAGE电泳、转膜、免疫反应、ECL化学显影剂定影实验,并对凝胶图像进行分析。相关的研究显示,p53蛋白通过调控其下游基因p21进而引起细胞周期蛋白(Cyclin D1和CDK4)的改变,从而防止癌变。免疫蛋白印迹实验结果显示(图17A-B),相对于1-G1/质粒p53复合物而言,裸p53质粒几乎没有明显的基因表达增强现象。反之,1-G1/质粒p53复合物具有明显的基因表达增强现象。同时p53的下游调控蛋白p21的表达量也明显增高,表明1-G1/质粒p53复合物能够显著促进p53质粒的转染及表达,表达的p53蛋白具有良好的生物活性能够发挥其生物学活性,调控其下游p21蛋白行使功能。
实施例10
所有动物实验均严格按照动物保护协会标准进行。实验用的3-4周的雌性BALB/C裸鼠购自上海斯莱克实验动物中心(中国,上海)。按照3×106HeLa细胞/鼠的剂量在裸鼠右腿部注射肿瘤细胞。在肿瘤体积达到0.5-1.2cm3(大约在注射肿瘤细胞两周后)时随机将成瘤裸鼠分为4组(对照组、裸质粒p53组、1-G1组和1-G1/质粒p53组),每组裸鼠数量为3只,通过瘤内注射1-G1/质粒p53复合物的生理盐水溶液,3天后将裸鼠处死取其肿瘤通过Westernblot检测蛋白表达,来评价肿瘤部位基因转染情况(参见图18A-B)。实验结果显示,裸p53质粒几乎没有明显的基因表达增强现象。反之,1-G1/质粒p53具有明显的基因表达增强现象,由于p53是一个重要的抗癌基因,p53蛋白通过调控其下游基因p21进而引起细胞周期蛋白的改变,从而防止癌变,从而实现对HeLa的基因治疗。图18显示相关细胞周期蛋白量明显降低。综上所述,本发明制备的磷树状大分子纳米材料1-G1可用于基因治疗研究,拥有良好的应用前景。
Claims (9)
2.一种磷树状大分子基杂化纳米材料的制备方法,包括:
(1)将六氯环三磷腈溶于无水四氢呋喃中,加入无水碳酸盐,冰浴,逐滴加入溶有对羟基苯甲醛的四氢呋喃溶液,室温反应,纯化,真空干燥,得到第0.5代磷树状大分子G0.5;
(2)将步骤(1)制得的第0.5代磷树状大分子溶于无水二氯甲烷中,加入无水硫酸盐,冰浴,逐滴加入N-甲基二氯硫代磷酰肼MMHPSCl2的氯仿溶液,室温反应,后处理,得到第1代磷树状大分子G1;
(3)将第1代磷树状大分子G1溶于无水四氢呋喃中,与步骤(1)、(2)相同,分别加入对羟基苯甲醛和MMHPSCl2进行反应,得到第2代磷树状大分子G2;
(4)将第2代磷树状大分子G2溶于无水四氢呋喃中,与步骤(1)、(2)相同,分别加入对羟基苯甲醛和MMHPSCl2进行反应,得到第3代磷树状大分子G3;
(5)将步骤(2)、(3)或(4)制得的磷树状大分子溶于无水四氢呋喃中,逐滴加入N,N-二异丙基乙基胺冰浴,再逐滴加入1-(2-氨基乙基)吡咯烷,搅拌反应,旋转蒸发,洗涤,真空干燥,得到吡咯烷修饰的磷树状大分子;
(6)将步骤(5)制得的吡咯烷修饰的磷树状大分子溶于无水四氢呋喃中,冰浴,逐滴加入氯化氢的乙醚溶液,搅拌反应过夜,旋转蒸发,真空干燥,得到磷树状大分子基杂化纳米材料。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中的六氯环三磷腈、无水碳酸盐和对羟基苯甲醛的摩尔比为1:12:6。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中的六氯环三磷腈的四氢呋喃溶液浓度为0.010-0.050mmol/mL;对羟基苯甲醛的四氢呋喃溶液浓度为0.060-0.300mmol/mL。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中的第0.5代磷树状大分子、无水硫酸盐和N-甲基二氯硫代磷酰肼的摩尔比为1:12:6。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中的第0.5代磷树状大分子的无水二氯甲烷溶液浓度为0.010-0.050mmol/mL;N-甲基二氯硫代磷酰肼的氯仿溶液浓度为0.010-0.300mmol/mL。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中的无水碳酸盐为无水碳酸钾或无水碳酸铯;所述步骤(2)中的无水硫酸盐为无水硫酸钠。
8.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(5)中的磷树状大分子为G1时,与N,N-二异丙基乙基胺和1-(2-氨基乙基)吡咯烷的摩尔比为1:12:12;磷树状大分子为G2时,与N,N-二异丙基乙基胺和1-(2-氨基乙基)吡咯烷的摩尔比为1:24:24;磷树状大分子为G3时,与N,N-二异丙基乙基胺和1-(2-氨基乙基)吡咯烷的摩尔比为1:48:48。
9.一种如权利要求1所述的磷树状大分子基杂化纳米材料的应用,其特征在于:应用于基因传递。
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