CN113527702B - 一种两亲性含磷树冠大分子材料及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种两亲性含磷树冠大分子材料及其制备和应用，所述两亲性含磷树冠大分子材料的结构如式I所示。本发明原料商品化，制备方法简单，易于操作，制备得到的纳米复合物一方面可引起免疫原性肿瘤细胞死亡使得细胞毒性T细胞比例上升，一方面能够促进体内自然杀伤细胞的增殖，从而达到重塑肿瘤微环境，增强抗肿瘤免疫治疗的目的，在肿瘤治疗领域具有良好的应用前景。

Description

一种两亲性含磷树冠大分子材料及其制备和应用
技术领域
本发明属于功能性纳米材料及其制备和应用领域，特别涉及一种两亲性含磷树冠大分子材料及其制备和应用。
背景技术
近年来，免疫治疗作为一种新的治疗策略得到迅速的发展。该治疗方法旨在激活免疫细胞来识别并清除肿瘤细胞，达到抑制肿瘤进展，防止肿瘤复发的目的。部分化疗药物(如紫杉醇、阿霉素或奥沙利铂)能通过诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡(ICD)，释放肿瘤抗原和危险相关分子模式激活抗原，二者被抗原呈递细胞(APC)捕获后将抗原处理并提呈给适应性免疫细胞，产生抗原特异性的免疫反应(Hu M.et al.Small,2020,16(50):1613-6810)。但是，这种免疫调节作用难以产生强烈的抗肿瘤免疫反应，且单纯的化疗药物容易对患者健康的组织造成较大的毒副作用。
自然杀伤(Natural killer,NK)细胞是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞，在肿瘤免疫方面发挥重要作用。与细胞毒性T细胞一样，NK细胞具有多种效应功能，通过释放细胞毒性穿孔素、颗粒酶从而诱发肿瘤凋亡；亦可通过分泌一系列细胞因子如γ-干扰素(IFN-γ)，调节免疫反应而间接杀伤肿瘤细胞。NK细胞主要分布在人体的外周血中，只占外周血淋巴细胞的5％-15％，肿瘤患者及肿瘤术后患者体内NK细胞存在数量少、活性差的缺陷。
树状大分子是一种高度支化的、合成性的、高度单分散的大分子，具有非常精确的核、内部空间和表面功能基团。其中，含磷树状大分子具有和蛋白一样精准的分子结构，因此其拥有较好的临床转化潜力。随着纳米技术和纳米医学的不断发展，含磷树状大分子已广泛地应用于基因载体、抗病毒剂、单核细胞及自然杀伤细胞的增殖剂和金属离子载体。已有学者发现当含磷树状大分子末端修饰磷酸酯基团时能够表现出一定的免疫调节活性，使得存在于外周血单个核细胞(PBMC)中的NK细胞特异性增殖(Griffe L,etal.Angew.Chem.,Int.Ed.,2007,46(16):2523-2526)。同时，扩增后的NK细胞仍具有活性，对多种肿瘤细胞(如乳腺癌、结直肠腺癌、非小细胞肺癌等)具有杀伤作用。
相关研究表明，化疗抗肿瘤需要免疫系统参与，化疗药物如阿霉素(DOX)诱发肿瘤免疫原性细胞死亡后，通过触发损伤相关分子模式(DAMPs)的分泌来增强抗肿瘤免疫。在肿瘤免疫原性死亡过程中的多个具有免疫原性的因子被认为是危险相关分子模式，包括在凋亡前期钙网蛋白(CRT)暴露在细胞表面，在凋亡起泡阶段ATP释放，在凋亡后期高迁移率蛋白B1(HMGB-1)外排。DAMPs可以刺激树突细胞的成熟，并最终诱导抗原特异性CD8+T细胞毒性淋巴细胞的激活。肿瘤内细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)/调节性T细胞(Regulatory cells，Treg)的比例上升，从而打破免疫耐受并引发抗肿瘤效应。此外，研究发现DOX通过肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)/TRAIL受体信号，增敏NK与T细胞对肿瘤的裂解作用(Wennerberg E,et al.Int.J.Cancer,2013,133(7):1643-1652)。
检索国内外相关文献和专利结果尚未发现以表面修饰磷酸酯基团的两亲性含磷树冠大分子胶束作为纳米载体，负载化疗药物DOX用于肿瘤免疫治疗与化疗的联合治疗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有免疫调节活性的两亲性含磷树冠大分子材料及其制备和应用。
本发明的一种如下结构所示的两亲性含磷树冠大分子纳米材料，
Figure BDA0003165068050000021
本发明的一种两亲性含磷树冠大分子纳米材料的制备方法，包括：
(1)将2，3-二苯基马来酸酐和酪胺溶于溶剂中，然后加入N,N-二异丙基乙胺溶液，加热反应，冷却至室温后，过滤，纯化，得到化合物M；其中化合物M为
Figure BDA0003165068050000022
(2)将AB5溶于溶剂中，加入无水碳酸铯，冰浴，加入化合物M，室温反应，减压浓缩，纯化，得到第0.5代含磷树冠大分子M-AB5。
(3)将M-AB5溶于溶剂中，加入无水硫酸钠，冰浴，加入N-甲基二氯硫代磷酰肼MMHPSCl2，室温反应，减压浓缩，纯化，得到第1代含磷树冠大分子M-G1；
(4)将酪胺溶于溶剂中，冰浴，加入甲醛溶液与亚磷酸二甲酯，室温反应，纯化，真空干燥，得到TBP；
(5)将M-G1溶于溶剂中，加入无水碳酸铯，冰浴，加入TBP溶液，室温反应，纯化，真空干燥得到M-G1-TBP；
(6)将M-G1-TBP和水混合，冰浴，加入碱溶液碱解，冷冻干燥，得到表面修饰有磷酸酯基团的含磷树冠大分子M-G1-TBPNa。
上述制备方法的优选方式如下：
所述步骤(1)中2，3-二苯马来酸酐、酪胺的摩尔比为1:1-1:1.5；所述溶剂为乙酸；所述加热反应为160-170℃下90-120分钟；
所述步骤(1)中的纯化工艺为采用二氯甲烷/正戊烷为流动相的柱层析进行纯化。
所述步骤(2)中AB5、化合物M、无水碳酸铯的摩尔比为1:1:1-1:1.5:2；所述溶剂为无水丙酮。
所述步骤(2)中纯化工艺条件：采用甲醇/二氯甲烷为流动相的柱层析进行纯化。
所述步骤(2)中AB5为：将六氯环三磷腈溶于溶剂中，加入无水碳酸铯，冰浴，逐滴滴加4-羟基苯甲醛溶液，室温反应，纯化，真空干燥，得到修饰有五个对羟基苯甲醛的环三磷腈AB5。
进一步地，所述AB5由下列方法制备：将六氯环三磷腈溶于无水四氢呋喃(THF)中，加入无水碳酸铯，冰浴，逐滴滴加4-羟基苯甲醛的四氢呋喃溶液，室温反应，纯化，真空干燥，得到修饰有五个对羟基苯甲醛的环三磷腈AB5；其中所述六氯环三磷腈、4-羟基苯甲醛、无水碳酸铯的质量比为1:1.7:5.6-1:1.8:5.7；所述室温反应时间为24-48h；所述纯化工艺为采用戊烷/乙酸乙酯为流动相的硅胶柱层析进行纯化。
所述AB5的结构式为：
Figure BDA0003165068050000031
所述步骤(3)中M-AB5、MMHPSCl2的摩尔比为1:5-1:6.5；所述溶剂为无水氯仿；所述室温反应时间为3-6h。
所述步骤(3)中纯化工艺条件：将反应溶液浓缩后加入戊烷中搅拌30分钟，过滤收集沉淀后真空干燥得到粉末状产物。将粉末溶解在二氯甲烷中，搅拌，逐滴滴加至戊烷中，搅拌30分钟，收集沉淀。
所述步骤(4)中酪胺、亚磷酸二甲酯、甲醛溶液的质量体积比为2g:3.34mL:2.672mL-2g:3.34mL:3.34mL；所述溶剂为无水四氢呋喃；所述甲醛溶液的体积百分浓度为37％。
所述步骤(4)中纯化工艺条件：采用流动相为丙酮的硅胶柱层析进行纯化。
所述步骤(5)中M-G1、TBP、无水碳酸铯的质量比为1:2.3:3.3-1:2.5:3.6；所述溶剂为无水四氢呋喃；所述室温反应时间为24-48h。
所述步骤(5)中纯化工艺条件：将反应溶液浓缩后加入至甲醇溶液中搅拌30分钟，过滤收集沉淀，将得到的固体于乙醚溶液中洗涤3分钟后真空干燥。
所述步骤(6)中M-G1-TBP和水的质量体积比为100mg:0.8mL-100mg:1.2mL；碱溶液为NaOH溶液，碱解时间为15-30min。
本发明的一种基于所述两亲性含磷树冠大分子纳米材料的纳米胶束。
本发明提供一种载药纳米胶束，所述载药纳米胶束以含所述两亲性含磷树冠大分子纳米材料和疏水性药物的原料制备获得。
本发明提供一种载药纳米胶束的制备方法，包括：疏水性药物溶液逐滴滴加到M-G1-TBPNa的水溶液中，室温敞口搅拌，离心取上清，冷冻干燥，得到负载疏水药物的纳米复合物。
进一步地，所述疏水性药物为DOX；室温上载12小时；离心参数为：7000rpm，20分钟。
本发明提供一种所述载药纳米胶束在制备免疫治疗/化疗联合治疗药物中的应用。
进一步地，本发明提供一种载药纳米胶束在制备黑色素瘤的免疫治疗/化疗联合治疗药物中的应用。
本发明中以六氯环三磷腈(N3P3Cl6)为核，首先通过发散迭代法合成新型含磷树冠大分子，而后在其表面修饰磷酸酯基团并碱解，得到具有免疫调节活性的两亲性含磷树冠大分子。此类两亲性含磷树冠大分子在水溶液中自组装形成纳米胶束，其内部空腔负载疏水性化疗药物DOX，最终得到集免疫治疗/化疗为一体的抗肿瘤纳米复合物。
本发明提供了一种两亲性含磷树冠大分子纳米胶束作为化疗药物载体的应用，包括如下步骤：
(1)制备不同浓度梯度的M-G1-TBPNa溶液，分别加入芘的丙酮溶液，超声30分钟，静置过夜。通过稳态荧光仪测定混合液在335nm激发波长下的荧光光谱，以I372/I393荧光强度比作为对数函数分析M-G1-TBPNa的临界胶束浓度(CMC)。
(2)制备浓度为1mM的M-G1-TBPNa溶液，按照不同的M-G1-TBPNa与DOX的摩尔比，分别加入不同摩尔量的DOX的甲醇溶液，室温敞口搅拌，离心取上清，冷冻干燥，得到负载DOX的纳米复合物M-G1-TBPNa@DOX。
本发明使用核磁共振(1H NMR、31P NMR和13C NMR)、Zeta电势及水合动力学粒径分析、紫外分光光度计(UV-vis)等手段表征制备的纳米材料M-G1-TBPNa和M-G1-TBPNa@DOX。利用CCK-8法评价纳米材料M-G1-TBPNa@DOX对B16、L929的细胞毒性，利用MTT法评价纳米材料M-G1-TBPNa@DOX对PBMC的细胞毒性。利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪分析B16细胞对DOX的吞噬效果。利用激光共聚焦显微镜和相应的检测试剂盒评价M-G1-TBPNa@DOX引起肿瘤细胞免疫原性死亡的效果。利用流式细胞仪和酶联免疫吸附测定法评价纳米复合物的免疫治疗与化疗的联合治疗效果。
1.临界胶束浓度(CMC)测定
制备不同浓度的M-G1-TBPNa溶液(0.001mg/mL-2mg/mL)，将制备的溶液分别加入到含有荧光探针芘(10μL,4.0×10-4M)的容量瓶中，芘的终浓度为6.0×10-7M，超声30分钟，室温保存过夜。荧光分光光度计测定激发波长为333nm的荧光光谱，设置稳态荧光仪入射狭缝宽度为1.0nm，接收狭缝宽度为1.2nm，记录每份溶液在350-435nm范围内的荧光曲线。以M-G1-TBPNa浓度的lg值与I373/I393的荧光强度比为横纵坐标进行分析，如图9所示，随着M-G1-TBPNa浓度的升高I373/I393的荧光强度比值先升高，随后在208.5μM处有一个明显的下降。这说明材料M-G1-TBPNa能够形成胶束，且临界胶束浓度约为208.5μM。
2.最佳投料比的确定
按照不同的M-G1-TBPNa与DOX摩尔比(1:0.5、1:1、1:2)，将DOX甲醇溶液加入到M-G1-TBPNa的水溶液中，室温敞口避光搅拌过夜。离心取上清，冷冻干燥。将沉淀溶于1mL甲醇中，测定其在480nm处的紫外吸收值，通过与Free DOX的标准曲线对比计算DOX的包封率和上载率。结果如表1所示，当材料M-G1-TBPNa与DOX投料比为1:0.5与1:1时，DOX包封率达到100％，当投料比为1:2时，包封率下降为99.08％。同时测定制备的M-G1-TBPNa@DOX在不同浓度条件下(相对DOX浓度为0、0.25、0.5、0.75、1、2.5、5、7.5、10μM)对B16、L929以及PBMC细胞的毒性。结果如图10(A)所示，在相同DOX浓度范围下，随着DOX投料比增加，材料M-G1-TBPNa@DOX对B16的细胞毒性增强。另一方面，随着DOX浓度的增加，投料比为1:1与1:2的M-G1-TBPNa@DOX对B16细胞的杀伤效果接近，但其杀伤效果显著强于投料比为1:0.5的M-G1-TBPNa@DOX。当相对DOX浓度为10μM时，经投料比为1:1与1:2的M-G1-TBPNa@DOX处理后的B16细胞活力分别降至17.58％与14.87％。如图10(B)与10(C)所示，随着DOX浓度的增加，投料比为1:0.5与1:1的M-G1-TBPNa@DOX对正常细胞L929和外周血单个核细胞PBMC的毒性明显低于投料比为1:2的M-G1-TBPNa@DOX对其产生的毒性。当相对DOX浓度为10μM时，经投料比为1:0.5与1:1的M-G1-TBPNa@DOX处理后的L929细胞活力分别为43.9％与41.6％，经投料比为1:0.5与1:1的M-G1-TBPNa@DOX处理后的PBMC细胞活力分别为60.2％与56.2％。因此，选择投料比为1:1的材料M-G1-TBPNa@DOX进行后续实验。
3.Zeta电势及水动力学直径测试
取制备的M-G1-TBPNa和M-G1-TBPNa@DOX溶解于超纯水至终浓度为250μM，测定其表面电势和水动力学直径。如图11(A)所示，M-G1-TBPNa的水合粒径为149.6nm，负载DOX后M-G1-TBPNa@DOX的水合粒径增加至180.7nm。如图11(B)与图11(C)所示，M-G1-TBPNa的电势为-29.6mV，M-G1-TBPNa@DOX的电势为-38mV。当M-G1-TBPNa包裹疏水性DOX后，Zeta电势有一定程度的降低。
4.紫外(UV-vis)测试
通过UV-vis测试对DOX、M-G1-TBPNa与M-G1-TBPNa@DOX进行表征，如图12所示，M-G1-TBPNa@DOX在480nm处出现的特征峰，证明了DOX的成功负载。
5.体外药物释放测试
分别配置pH＝7.4、pH＝6.5和pH＝5.0的磷酸盐缓冲液，将2mg的M-G1-TBPNa@DOX溶于1mL上述不同缓冲溶液并至于透析袋中。将透析袋置于含有9mL上述缓冲溶液的容器中，置于37℃恒温摇床中，100r/min振荡条件下进行缓释实验。在设定的时间点上取样1mL，再向容器中补充1mL对应的缓冲溶液，测量取出的液体在480nm处的吸光值。缓释结束后，绘制DOX的释放动力学曲线。如图13所示，M-G1-TBPNa@DOX在pH＝7.4与pH＝6.5的缓冲溶液中药物释放缓慢，在48小时释放率分别为7％、12％。而在pH＝5.0条件下，药物释放率达到32％。这是由于DOX在酸性条件下发生质子化，在水中具有更好的溶解性。
6.细胞毒性实验
利用CCK-8评价M-G1-TBPNa@DOX对黑色素瘤细胞B16和小鼠成纤维细胞L929的抑制效果。收集对数生长期的B16细胞，按照1×104个细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，于37℃、5％CO2环境中培养12小时，更换新鲜培养基，加入DOX、M-G1-TBPNa、M-G1-TBPNa@DOX(M-G1-TBPNa：DOX为1:1，相对DOX浓度为0、0.25、0.5、0.75、1、2.5、5、7.5、10μM)与细胞共同孵育24小时，弃掉原培养基，用PBS洗三遍，加入含10％(v/v)CCK-8的新鲜培养基，在培养箱继续孵育3小时。多功能酶标仪于波长450nm处测试各孔的吸光值，以PBS处理的细胞为空白对照，细胞活力记为100％。结果如图14所示，在试验浓度范围内，经M-G1-TBPNa处理过的L929和B16细胞存活率均在90％以上，说明M-G1-TBPNa无细胞毒性。同时，对于B16细胞，在相同DOX浓度下，M-G1-TBPNa@DOX与Free DOX具有相似的细胞毒性。对于L929细胞，由于载体无任何细胞毒性，在相同DOX浓度下，M-G1-TBPNa@DOX能够减弱DOX对正常细胞的毒性。如表2所示，Free DOX、M-G1-TBPNa@DOX与B16细胞共孵育24小时后的DOX半数抑制浓度(IC50)分别为0.44μM和0.60μM，Free DOX、M-G1-TBPNa@DOX与L929细胞共孵育24小时后的DOX半数抑制浓度(IC50)分别为1.46μM和8.26μM。计算得Free DOX与M-G1-TBPNa@DOX的安全系数分别为3.32和13.77，由此得知M-G1-TBPNa@DOX相比于Free DOX更具生物安全性。
7.细胞吞噬实验
以2×105细胞/孔的密度将B16细胞种于激光共聚焦专用培养皿中，于37℃、5％CO2条件下培养过夜。替换分别含有Free DOX和M-G1-TBPNa@DOX的新鲜培养基(相对DOX浓度为5μM)，孵育4小时。使用PBS缓冲溶液清洗细胞，每个培养皿加入2.5％多聚甲醛固定，去除固定液，DAPI染色15分钟，PBS洗3次，激光共聚焦显微镜观察材料在B16细胞内的分布情况。如图15(A)显示，Free DOX和M-G1-TBPNa@DOX与B16细胞共培养4小时后，红色荧光分布在细胞浆中。说明M-G1-TBPNa@DOX能够被B16细胞吞噬，并成功将DOX释放在细胞内。
收集对数生长期的B16细胞，按照每孔1×104个细胞的密度种在12孔板中，置于5％CO2、37℃条件下孵育12小时。每个孔板替换含不同浓度的M-G1-TBPNa@DOX(DOX浓度为1、5、10μM)的新鲜培养基，培养4小时。细胞经PBS洗三遍后，消化、离心、收集，用流式细胞仪检测细胞的荧光强度。图15(B)与15(C)显示，随着DOX浓度的增加，各组细胞均显示逐渐增强的荧光强度，进一步证实了通过纳米胶束可实现对DOX的有效递送。
8.体外癌细胞免疫原性死亡(ICD)效应
以2×105细胞/孔的密度将B16细胞种于激光共聚焦专用培养皿中，37℃、5％CO2条件下培养过夜。替换含有Free DOX、M-G1-TBPNa、M-G1-TBPNa@DOX的新鲜培养基(相对DOX浓度为5μM)孵育6小时后，用预冷的PBS洗涤3次。每个孔中加入2.5％多聚甲醛固定15分钟。用PBS洗3次，加入免疫染色封闭液，封闭60分钟后，加入稀释后的CRT兔单抗孵育1小时，洗涤3次。随后加入稀释后的二抗，室温孵育1小时后，洗涤5分钟，共洗涤3次。加入DAPI染细胞核15分钟，PBS洗涤3次。用激光共聚焦显微镜观察细胞中CRT外翻情况。如图16(A)所示，在PBS对照组的肿瘤细胞中几乎检测不到CRT的荧光，这是由于在正常状态下CRT表达在细胞内质网中。M-G1-TBPNa对CRT的表达几乎无影响，DOX与M-G1-TBPNa@DOX处理的B16细胞表面有明显的CRT的荧光信号。
将B16细胞种于24孔板中，于37℃、5％CO2培养过夜。替换含有Free DOX、M-G1-TBPNa、M-G1-TBPNa@DOX的新鲜培养基(相对DOX浓度为5μM)孵育24小时。收集细胞培养液，参照HMGB-1的ELISA试剂盒的操作步骤，在酶标仪450nm下检测HMGB-1的含量。同时，取细胞上层培养液，在96孔板中加入100μL ATP检测工作液，放置3-5分钟后在孔中加入20μL培养液样品，混匀后通过多功能酶标仪测定胞外ATP含量。如图16(B)所示，细胞与M-G1-TBPNa@DOX共培养后，细胞培养液中HMGB-1的浓度显著高于PBS组，释放的HMGB-1可促进肿瘤抗原提呈给T细胞。如图16(C)所示，发现M-G1-TBPNa@DOX组胞外ATP释放量显著高于PBS组，释放的ATP将有利于促进树突细胞对凋亡肿瘤细胞的吞噬作用，加强抗肿瘤免疫响应。
9.体外扩增NK细胞测试
将鼠源的外周血单个核细胞(PBMC)按照每孔1×106个细胞种于6孔板，分别加入IL-2、IL-2+M-G1-TBPNa与IL-2+M-G1-TBPNa@DOX(IL-2浓度为400U/mL，M-G1-TBP浓度为1μM)，37℃、5％CO2条件下培养72小时。离心收集细胞与细胞培养液，利用anti-CD3抗体和anti-CD49b抗体对收集的PBMC进行染色，通过流式细胞仪检测PBMC中NK细胞的比例。利用IFN-γELISA检测试剂盒测定细胞培养液中IFN-γ的含量。如图17(A)所示，相比于PBS组与IL-2组，IL-2+M-G1-TBPNa与IL-2+M-G1-TBPNa@DOX组中NK细胞比例上升，证明材料M-G1-TBPNa与M-G1-TBPNa@DOX在IL-2的存在下，能够使PBMC中的NK细胞有效增殖。如图17(B)所示，经过IL-2+M-G1-TBPNa和IL-2+M-G1-TBPNa@DOX组处理后的PBMC所分泌的IFN-γ含量接近，但均高于PBS组与IL-2组。分泌的IFN-γ可调节体内免疫反应，从而间接杀伤肿瘤细胞。
10.体内肿瘤治疗结果
实验用的4周雌性C57BL/6小黑鼠购自上海斯莱克实验动物中心(中国，上海)。将2×106个B16细胞接种到小鼠的右腿，待肿瘤体积达到约50-80mm3左右时，将小鼠随机分为6组(每组6只)。分组如下：对照组(PBS，100μL)；纯材料组M-G1-TBPNa(浓度为M-G1-TBPNa@DOX中DOX为5mg/kg时对应的M-G1-TBPNa浓度，100μL)；Free DOX组([DOX]＝5mg/kg，100μL)；M-G1-TBPNa@DOX组([DOX]＝5mg/kg，100μL)；aPD-L1抗体组(aPD-L1，100μL)；M-G1-TBPNa@DOX+aPD-L1组([DOX]＝5mg/kg，材料100μL；抗体100μL)。各组材料PBS、M-G1-TBPNa、Free DOX和M-G1-TBPNa@DOX通过尾静脉注射，抗体aPD-L1通过瘤内注射。开始治疗的当天记为第1天，其中材料在第1、4、7、10、13天尾静脉给药，aPD-L1在第2、5、8、11、14天瘤内注射。期间每隔2天记录老鼠体重和肿瘤尺寸，将小鼠肿瘤长记为a，宽记为b，体积等于(a*b2)/2。相对肿瘤体积结果如图18(A)所示，PBS组小鼠肿瘤随着时间迅速增长，aPD-L1组、M-G1-TBPNa组和Free DOX组肿瘤生长受到了一定的抑制。M-G1-TBPNa@DOX组肿瘤抑制效果明显，这是由于纳米药物系统能通过EPR效应将药物递送到肿瘤部位。其中，M-G1-TBPNa@DOX+aPD-L1组治疗的小鼠获得了最高的抗肿瘤活性。小鼠体重变化如图18(B)所示，DOX治疗的小鼠出现突然的体重下降，表明其具有一定的全身毒性。而M-G1-TBPNa、M-G1-TBPNa@DOX和M-G1-TBPNa@DOX+aPD-L1组治疗的小鼠体重略有增加，表明M-G1-TBPNa与M-G1-TBPNa@DOX胶束体系在体内具有良好的生物相容性。
11.体内免疫细胞分析
取16天后小鼠的血液，利用外周血单个核细胞分离试剂盒分离出PBMC。无菌条件下取出其肿瘤组织，剪碎研磨经400目滤网过滤，得到细胞悬液，再通过各种动物肿瘤浸润组织淋巴细胞分离试剂盒分离出淋巴细胞。将分离出的PBMC与肿瘤部位的淋巴细胞用anti-CD3与anti-NK1.1抗体进行标记，通过流式细胞仪对细胞的CD3-NK1.1+细胞进行定量分析。结果如图19(A)与19(B)所示，相比于PBS组，M-G1-TBPNa@DOX+aPD-L1组PBMC中的NK细胞含量与PBS组相比显著提高。如图19(C)与19(D)所示，M-G1-TBPNa@DOX+aPD-L1组肿瘤浸润性淋巴细胞中的NK细胞含量与PBS组相比显著提高，一方面材料刺激血液PBMC中的NK细胞增殖，通过循环作用，NK细胞到达肿瘤部位发挥杀伤作用。另一方面，aPD-L1阻断肿瘤表面的免疫抑制PD-L1受体，使得NK细胞活力得以维持。
此外，肿瘤部位分离出的淋巴细胞通过尼龙毛柱获取T淋巴细胞悬液，将获取的T细胞分别用anti-CD4与anti-CD8抗体进行标记，通过流式细胞仪对肿瘤组织中CD4+T细胞与CD8+T细胞进行定量分析。如图20所示，M-G1-TBPNa@DOX+aPD-L1组处理后肿瘤浸润性CD4+T与CD8+T细胞含量明显高于其它组，说明M-G1-TBPNa@DOX+aPD-L1在不同程度上恢复了T细胞的免疫应答功能，其中M-G1-TBPNa@DOX+aPD-L1组中CD8+/CD4+T的比例最高。这是由于DOX引起的肿瘤细胞免疫原性死亡刺激了树突细胞的熟化，增强了树突细胞抗原提呈的能力，最终诱导抗原特异性CD8+T细胞毒性淋巴细胞的激活。同时联合aPD-L1抗体，aPD-L1阻断肿瘤表面的免疫抑制PD-L1受体，打破免疫耐受，增强T细胞抗肿瘤的活力。
有益效果
(1)本发明的方法简单，反应可控性强，易于操作分离，成本低廉，终产物分子量均一，具有良好的发展前景；
(2)本发明制备得到的两亲性含磷树冠大分子可在水中自组装为纳米胶束，其内部的疏水空腔能够包封疏水药物形成稳定的复合物，具有良好的水溶性和生物相容性。纳米胶束在引起肿瘤细胞发生免疫原性死亡的同时具有促进NK细胞增殖的能力，可用于小鼠黑色素瘤的免疫治疗与化疗的联合治疗；
(3)本发明的材料自身具有一定的免疫调节活性，同时有具有良好的药物作用效果，在肿瘤免疫治疗和化疗等生物医学方面具有良好的应用潜力。
(4)本发明原料商品化，制备方法简单，易于操作，制备得到的纳米复合物一方面可引起免疫原性肿瘤细胞死亡使得细胞毒性T细胞比例上升，一方面能够促进体内自然杀伤细胞的增殖，从而达到重塑肿瘤微环境，增强抗肿瘤免疫治疗的目的，在肿瘤治疗领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明两亲性含磷树冠大分子M-G1-TBPN合成流程及M-G1-TBPNa@DOX纳米复合物制备示意图；
图2为实施例1制备的AB5的核磁共振氢谱图(A)和磷谱图(B)；
图3为实施例1制备的M的核磁共振氢谱图(A)和碳谱图(B)；
图4为实施例1制备的M-AB5的核磁共振氢谱图(A)、磷谱图(B)和碳谱图(C)；
图5为实施例1制备的M-G1的核磁共振氢谱图(A)、磷谱图(B)和碳谱图(C)；
图6为实施例1制备的TBP的核磁共振氢谱图(A)和磷谱图(B)；
图7为实施例1制备的M-G1-TBP的核磁共振氢谱图(A)和磷谱图(B)；
图8为实施例1制备的M-G1-TBPNa的核磁共振氢谱图(A)和磷谱图(B)；
图9为实施例1中制备的M-G1-TBPNa的临界胶束浓度图；
图10为实施例1中不同投料比条件下M-G1-TBPNa、Free DOX和M-G1-TBPNa@DOX与B16细胞共孵育24小时后的细胞活力图(A)、与L929细胞共孵育24小时后的细胞活力图(B)以及与PBMC细胞共孵育24小时后的细胞活力图(C)；
图11为实施例1中制备的M-G1-TBPNa和M-G1-TBPNa@DOX水动力学粒径图(A)，M-G1-TBPNa的表面电势图(B)与M-G1-TBPNa@DOX的表面电势图(C)；
图12为实施例1中制备的Free DOX(1)、M-G1-TBPNa@DOX(2)与M-G1-TBPNa(3)的紫外光谱图；
图13为实施例1中制备的M-G1-TBPNa@DOX在不同pH条件下的药物释放动力学曲线；
图14为实施例1中制备的M-G1-TBPNa、M-G1-TBPNa@DOX与Free DOX与B16细胞共孵育24小时后的细胞活力图(A)以及与L929细胞共孵育24小时后的细胞活力图(B)；
图15为实施例1中制备的M-G1-TBPNa@DOX、Free DOX与B16细胞共孵育4小时后吞噬阿霉素的激光共聚焦显微镜图(A)，B16细胞经不同浓度的M-G1-TBPNa@DOX处理后的流式图(B)与平均荧光强度定量图(C)；其中(B)图中横坐标从左到右标尺数字依次为100、101、102、103、104；
图16为实施例1中制备的M-G1-TBPNa@DOX与Free DOX与B16细胞共孵育6小时后，B16细胞CRT的表达情况图(A)以及孵育24小时后细胞培养液中HMGB-1含量的定量分析图(B)与ATP含量的定量分析图(C)；
图17为实施例1中纳米复合物与PBMC细胞共培养72小时后的NK细胞流式细胞分析图(A)及培养液上清中IFN-γ含量图(B)；其中(A)图中各横坐标从左到右、纵坐标从下到上的标尺数值均依次为100、101、102、103。
图18为16天内小鼠相对肿瘤体积变化图(A)和小鼠体重变化图(B)；
图19为不同组处理下的小鼠PBMC中NK细胞的流式分析图(A)和定量图(B)，肿瘤部位浸润性NK细胞的流式分析图(C)和定量图(D)；其中图(A)和图(C)中各横坐标从左到右、纵坐标从下到上的标尺数值均依次为100、101、102、103、104；图(B)中纵坐标从下到上的标尺数值均依次为0、3、6、9、12、15；图(D)中纵坐标从下到上的标尺数值均依次为0、1.5、3.0、4.5、6。
图20为不同组处理下的各组小鼠肿瘤部位浸润性T细胞的流式分析图(A)，CD4+T细胞的定量图(B)，CD8+T细胞的定量图(C)以及CD8+/CD4+T细胞比例定量分析图(D)；其中图(A)中各横坐标从左到右、纵坐标从下到上的标尺数值均依次为100、101、102、103、104。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
除非特殊说明，否则所有化学试剂都是可商购的，无需进一步纯化即可直接使用。各化学试剂购自Sigma-Aldric与国药控股化学试剂有限公司(中国上海)。阿霉素(DOX)购自北京华丰药业有限公司(中国北京)。B16细胞(小鼠黑色素瘤细胞系)来自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。RPMI-1640培养基(1640培养基，GIBCO,Invitrogen,Carlsbad,CA)，胎牛血清(FBS,GIBCO)，青霉素-链霉素(HyClone,Thermo Scientific,Logan,UT)和胰蛋白酶0.25％溶液(HyClone)购自杭州吉诺生物医学技术有限公司(中国杭州)。Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自上海七海生物科技有限公司(中国上海)。HMGB-1检测试剂盒购自茁彩生物科技有限公司(中国上海)。MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、ATP检测试剂盒与Anti-CRT购自上海碧云天生物公司(中国上海)。C57BL/6黑鼠购自上海斯莱克实验动物中心(中国上海)。Anti-CD8、Anti-CD4、Anti-NK1.1、Anti-CD3、Anti-CD49b购自Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA)。所有实验中使用的电阻率高于18.2MΩ.cm的水均通过实验室水净化系统(Cascada I,PALL，北京，中国)进行净化。
实施例1
(1)将六氯环三磷腈(2.26mmol，786mg)与无水碳酸铯(13.56mmol，4.418g)投入含有无水THF(40mL)的反应瓶中，冰浴，逐滴滴加4-羟基苯甲醛(11.3mmol，1.38g)。随后，撤去冰浴，于室温下搅拌过夜。反应后离心，并在减压条件下浓缩至透明溶液，随后通过硅胶柱层析(戊烷/乙酸乙酯)纯化，最终以76％产率得到无色油状AB5。
(2)将2，3-二苯基马来酸酐(4mmol，1g)和酪胺(4mmol，0.548g)溶解于乙酸，160℃-170℃下，逐滴加入N，N-二异丙基乙胺(DAPIPEA)溶液，反应90分钟。待上述物质冷却至室温后，加入50mL蒸馏水，过滤，得到黄色沉淀物。通过柱层析(流动相为二氯甲烷/正戊烷)纯化，最终以95％的产率得到黄色粉末化合物M。
(3)将步骤(1)得到的AB5溶于5mL的无水丙酮，加入无水碳酸铯(1mmol，656mg)，冰浴，逐滴滴加步骤(2)制得的化合物M(1mmol，370mg)，室温反应过夜。离心取上清，在减压条件下浓缩，得到黄色油状物质。随后通过柱层析(流动相为甲醇/二氯甲烷)纯化，以85％的产率得到黄色粉末M-AB5。
(4)将步骤(3)制得的M-AB5(0.279mmol，310mg)溶于10mL无水氯仿，加入无水硫酸钠，冰浴，逐滴滴加N-甲基二氯硫代磷酰肼(1.68mmol)，搅拌3小时。随后减压浓缩至2mL，滴加至20mL戊烷中，搅拌30分钟，过滤并收集沉淀物减压干燥成粉末状。将粉末溶解在5mL二氯甲烷中，搅拌，逐滴滴加至50mL戊烷中，搅拌30分钟，收集沉淀，以91％的产率得到黄色粉末M-G1。
(5)将酪胺(2.0g)除水干燥，加入30mL的无水THF搅拌30分钟。冰浴，逐滴滴加37％的甲醛溶液(3.56mL)，反应10分钟后，逐滴滴加亚磷酸二甲酯(3.34mL)，室温反应20小时。将反应液旋转蒸发至粘稠油状，加入10mL二氯甲烷溶解，而后逐滴滴加至含有100mL的正戊烷中，搅拌30分钟。收集沉淀物并将其溶解于DCM中，随后通过柱层析(流动相为丙酮)纯化，真空干燥后得到TBP。
(6)将步骤(4)制得的M-G1(100mg)溶于无水THF中，加入无水碳酸铯(331.62mg)，冰浴，逐滴加入溶解于无水THF的TBP(232.86mg)溶液，搅拌48小时，离心收集上清，旋转蒸发得到粗产物。将反应溶液浓缩至2mL后加入至20mL甲醇溶液中搅拌30分钟，过滤收集沉淀，将得到的固体于乙醚溶液中洗涤3分钟，真空干燥得到M-G1-TBP。
(7)取60mg步骤(6)中制得的M-G1-TBP，按照100mg/1mL的产物/超纯水的比例，加入600μL超纯水，冰浴，逐滴滴加2.24mL NaOH碱解20分钟，冷冻干燥，得到表面修饰有磷酯酸钠基团的两亲性含磷树冠大分子M-G1-TBPNa。
本发明使用核磁共振仪进行氢谱(1H NMR)、磷谱(31P NMR)、碳谱(13C NMR)测试，结果如下：
AB5:
Figure BDA0003165068050000131
31P-{1H}NMR(121.5MHz,CDCl3)δ＝5.21(2d,2JP-P＝86.4Hz,P0),20.79(dd,2JP-P＝88.5Hz,2JP-P＝84.6Hz,P0’)ppm.
1H NMR(300.1MHz,CDCl3)δ＝7.20(m,10H,C0 2-H),7.75(m,10H,C0 3-H),9.90(2s,5H,C0 5H)ppm.
M：
Figure BDA0003165068050000132
1H NMR(400.1MHz,CDCl3)δ＝2.94(t,3JH-H＝7.5Hz,2H,C5-H),3.87(t,3JH-H＝7.5Hz,2H,C6-H),6.79(d,3JH-H＝8.4Hz,2H,C2-H),7.13(d,3JH-H＝8.4Hz,2H,C3-H),7.27-7.45(m,10H,C10-H,C11-H and C12-H)ppm.
13C-{1H}NMR(125.8MHz,CDCl3)δ＝34.17(s,C5),40.31(s,C6),115.84(s,C2),128.96(s,C9),129.00(s,C11),130.26(s,C10),130.28(s,C12),130.48(s,C3),130.51(s,C4),136.54(s,C＝C),154.77(s,C1),171.15(s,C＝O)ppm.
M-AB5:
Figure BDA0003165068050000141
31P-{1H}NMR(121MHz,CDCl3)δ＝7.35(m,N3P3)ppm.
1H NMR(400.1MHz,CDCl3)δ＝3.03(t,3JH-H＝7.3Hz,2H,C5-H),3.88(t,3JH-H＝7.3Hz,2H,C6-H),7.06(d,3JH-H＝8.5Hz,2H,C2-H),7.24-7.29(m,12H,C0 2-H andC3-H),7.35-7.46(m,10H,C10-H,C11-H andC12-H),7.81-7.89(m,10H,C0 3-H),9.98(s,1H,C0 5-H),9.99(s,2H,C0 5-H),10.00(s,2H,C0 5-H)ppm.
13C-{1H}NMR(75.5MHz,CDCl3)δ＝33.44(s,C5),39.19(s,C6),120.77(m,C2),121.31(m,C0 2),128.32(s,C10),129.10(s,C9),129.56(s,C12),129.81(s,C11),130.21(s,C3),131.21(s,C0 3),131.24(s,C0 3),131.26(s,C0 3),134.06(s,C0 4),134.15(s,C0 4),134.17(s,C0 4),136.30(s,C4),136.42(s,C＝C),148.83(m,C1),154.64(m,C0 1),170.30(s,C＝O),190.49(s,C0 5),190.55(s,C0 5)ppm.
M-G1:
Figure BDA0003165068050000142
31P-{1H}NMR(81.0MHz,CDCl3)δ＝8.36(m,N3P3),62.45,62.51,62.57(s,P1＝S)ppm.
1H NMR(500.3MHz,CDCl3)δ＝2.95(t,3JH-H＝7.8Hz,2H,C5-H),3.45(d,3JH-P＝13.9Hz,6H,C0 6-H),3.48(d,3JH-P＝13.8Hz,9H,C0 6-H),3.80(t,3JH-H＝7.8Hz,2H,C6-H),6.92(d,3JH-H＝8.3Hz,2H,C2-H),6.98(d,3JH-H＝8.7Hz,4H,C0 2-H),7.07(d,3JH-H＝8.7Hz,6H,C0 2-H),7.08(d,3JH-H＝8.3Hz,2H,C3-H),7.35-7.48(m,10H,C10-H,C11-H andC12-H),7.60(d,3JH-H＝8.7Hz,4H,C0 3-H),7.62(d,3JH-H＝8.7Hz,6H,C0 3-H),7.65(s,3H,C0 5-H),7.68(s,2H,C0 5-H)ppm.
13C-{1H}NMR(125.8MHz,CDCl3)δ＝31.91(d,3JC-P＝12.3Hz,C0 6),32.01(d,3JC-P＝12.6Hz,C0 6),33.98(s,C5),39.36(s,C6),121.17(br s,C2),121.34(br s,C0 2),121.43(brs,C0 2),128.46(s,C9),128.64(s,C0 3 and C11),129.87(s,C3 and C12),129.98(s,C10),131.18(s,C0 4),131.27(s,C0 4),131.31(s,C0 4),135.13(s,C4),136.25(s,C＝C),140.74(d,3JC-P＝17.6Hz,C0 5),140.67(d,3JC-P＝17.7Hz,C0 5),148.90(br s,C1),151.67(br s,C0 1),151.77(br s,C0 1),151.82(br s,C0 1),170.60(s,C＝O)ppm.
TBP:
Figure BDA0003165068050000151
31P-{1H}NMR(162MHz,CDCl3)δ＝27.08(s,PO3Me).
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝2.64(m,2H,C1 5-H)；2.96(m,2H,C1 6-H)；3.17(d,2JH-P＝8.0Hz,4H,C1 7-H)；3.71(d,3JH-P＝8.0Hz,12H,OMe)；6.74(m,2H,C1 2-H)；6.95(d,2H,C1 3-H)；8.64(s,1H,OH).
M-G1-TBP:
Figure BDA0003165068050000152
31P-{1H}NMR(162MHz,CDCl3)δ＝8.33,8.37(m,N3P3)；26.85,27.01(m,PO3Me)；63.19,63.24(s,P1).
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝2.75(m,20H,C1 5-H)；2.88(m,2H,C5-H)；3.04(m,20H,C1 6-H)；3.19(m,40H,C1 7-H)；3.49(m,15H,C0 6-H)；3.74(dd,3JHP＝10.4Hz,120H,OMe)；3.80(dd,3JHN＝10.4Hz,2H,C6-H)；7.02(m,54H,C3-H,C2-H,C0 2-H,C1 2-H and C1 3-H)；7.27(s,5H,C0 5-H)；7.32-7.39(m,10H,C10-H,C11-H and C12-H)；7.61(m,10H,C0 3-H).
M-G1-TBPNa:
Figure BDA0003165068050000153
31P-{1H}NMR(162MHz,D2O/CD3CN 9:1)δ＝6.91(s,PO3HNa)；9.26(s,N3P3)；64.45(s,P1).
1H NMR(400MHz,D2O/CD3CN 9:1)δ＝2.90-3.96(m,99H,C5-H,C5-H,C0 6-H,C1 5-H,C1 6-H and C1 7-H)；6.76-7.55(m,64H,C0 2-H,C1 2-H,C10-H,C11-H,C12-H,C3-H,C2-H and C1 3-H,)；7.81(s,10H,C0 3-H)；8.04(s,5H,C0 5-H).
实施例2
制备不同浓度的M-G1-TBPNa溶液(0.001mg/mL-2mg/mL)，将制备的溶液分别加入到含有荧光探针芘(10μL,4.0×10-4M)的容量瓶中，芘的终浓度为6.0×10-7M，超声30分钟，室温保存过夜。荧光分光光度计测定激发波长为333nm的荧光光谱，设置稳态荧光仪入射狭缝宽度为1.0nm，接收狭缝宽度为1.2nm，记录每份溶液在350-435nm范围内的荧光曲线。以M-G1-TBPNa浓度的lg值与I373/I393的荧光强度比为横纵坐标进行分析，如图9所示，随着M-G1-TBPNa浓度的升高I373/I393的荧光强度比值先升高，随后在208.5μM处有一个明显的下降。这说明材料M-G1-TBPNa能够形成胶束，且临界胶束浓度约为208.5μM。
实施例3
取盐酸阿霉素(DOX)溶于甲醇中，随后加入与盐酸阿霉素等摩尔量的三乙胺(TEA)，超声处理5分钟，使盐酸阿霉素去质子化为阿霉素。按照不同的摩尔比(M-G1-TBPNa：DOX＝1:0.5、1:1、1:2)将一定量的DOX甲醇溶液加入到M-G1-TBPNa水溶液中，室温敞口避光搅拌过夜。随后将混合溶液移入离心管，7000rpm、20分钟离心2次，每次离心结束后取上清，用适量超纯水重悬沉淀后再进行下一次离心。将沉淀溶于1mL甲醇中，测定其在480nm处的紫外吸收值，通过与纯DOX的标准曲线对比计算DOX的包封率和上载率。结果如表1所示，当材料M-G1-TBPNa与DOX投料比为1:0.5与1:1时，DOX包封率达到100％，当投料比为1:2时，包封率有所下降为99.08％。考虑到随着DOX的投料比升高，M-G1-TBPNa@DOX对小鼠成纤维细胞L929和外周血单个核细胞PBMC可能更具毒性，因此选择三种不同的投料比进行细胞毒性实验，以确定最佳投料比。
表1.M-G1-TBPNa与DOX在不同摩尔比条件下DOX的包封率及上载率
Figure BDA0003165068050000161
实施例4
以投料比1:0.5、1:1、1:2所制备的M-G1-TBPNa@DOX为试验组，通过CCK-8法测定不同投料比下M-G1-TBPNa@DOX(相对DOX浓度范围为0-10μM)对B16细胞的细胞毒性。收集对数生长期的B16细胞，按照1×104细胞每孔的密度接种在3个96孔细胞培养板上，置于5％CO2，37℃条件下孵育12小时。弃掉培养基后，每孔更换含有材料(相对DOX浓度为0、0.25、0.5、0.75、1、2.5、5、7.5、10μM)的新鲜培养基，5％CO2、37℃孵育24小时。随后弃掉原培养基，加入含100μL含有10％CCK-8的新鲜培养基溶液，继续培养3小时后，多功能酶标仪测试波长450nm下测试吸光值，以PBS处理的细胞为空白对照，细胞活力记为100％。结果如图10(A)所示，在相同DOX浓度范围下，随着DOX投料比增加，材料M-G1-TBPNa@DOX对B16的细胞毒性增强。另一方面，随着DOX浓度的增加，投料比为1:1与1:2的M-G1-TBPNa@DOX对B16细胞的杀伤效果接近，但其杀伤效果显著强于投料比为1:0.5的M-G1-TBPNa@DOX。当相对DOX浓度为10μM时，经投料比为1:1与1:2的M-G1-TBPNa@DOX处理后的B16细胞活力分别降至17.58％与14.87％。
采用CCK8法测定不同投料比下M-G1-TBPNa@DOX(相对DOX浓度范围为0-10μM)对L929细胞的细胞毒性。结果如图10(B)所示，随着DOX浓度增加，投料比为1:2的M-G1-TBPNa@DOX对正常细胞L929的细胞毒性明显强于投料比为1:0.5与1:1的M-G1-TBPNa@DOX。在相同DOX浓度下，投料比为1:1的M-G1-TBPNa@DOX对正常细胞L929的毒性效果与投料比为1:0.5的M-G1-TBPNa@DOX效果相近。当相对DOX浓度为10μM时，经投料比为1:0.5与1:1的M-G1-TBPNa@DOX处理后的L929细胞活力分别为43.9％与41.6％。
利用MTT法测定不同投料比下M-G1-TBPNa@DOX(相对DOX浓度范围为0-10μM)对PBMC细胞的细胞毒性：收集对数生长期的PBMC细胞，按照1×104细胞每孔的密度接种在3个96孔细胞培养板上，置于5％CO2，37℃条件下孵育12小时。孔板离心后，吸去培养基，每孔更换含有材料(相对DOX浓度为0、0.25、0.5、0.75、1、2.5、5、7.5、10μM)的新鲜培养基，5％CO2，37℃继续孵育24小时。随后孔板离心，吸去原培养基，加入含10μL MTT溶液，继续培养4小时后，每孔加入100μL formazan溶解液，混匀后再培养箱内继续孵育，直至在普通光学显微镜下观察发现formazan全部溶解。以PBS处理的细胞为空白对照，细胞活力记为100％。多功能酶标仪测试波长570nm下测试吸光值，结果如图10(C)所示，随着DOX浓度增加，投料比为1:2的M-G1-TBPNa@DOX对PBMC的细胞毒性明显强于投料比为1:0.5与1:1的M-G1-TBPNa@DOX。在相同DOX浓度下，投料比为1:1的M-G1-TBPNa@DOX对PBMC的毒性效果与投料比为1:0.5的M-G1-TBPNa@DOX效果相近。当相对DOX浓度为10μM时，经投料比为1:0.5与1:1的M-G1-TBPNa@DOX处理后的PBMC细胞活力分别为60.2％与56.2％。
因此，最终选择投料比为1:1的M-G1-TBPNa@DOX进行后续实验。
实施例5
将实施例1与实施例3中合成的M-G1-TBPNa、M-G1-TBPNa@DOX配置成浓度为250μM的水溶液，测定表面电势和水动力学直径。如图11(A)所示，M-G1-TBPNa的水合粒径为149.6nm，负载DOX后M-G1-TBPNa@DOX的水合粒径增加至180.7nm。如图11(B)与图11(C)所示，M-G1-TBPNa的电势为-29.6mV，M-G1-TBPNa@DOX的电势为-38mV。当M-G1-TBPNa包裹疏水性DOX后，Zeta电势有一定程度的降低。
实施例6
通过UV-vis测试对DOX、M-G1-TBPNa、M-G1-TBPNa@DOX进行表征，如图12所示，M-G1-TBPNa@DOX在480nm处出现的特征峰，证明了DOX的成功负载。
实施例7
分别配置pH＝7.4、pH＝6.5和pH＝5.0的磷酸盐缓冲液，随后将2mg的M-G1-TBPNa@DOX溶于1mL上述不同缓冲溶液并至于透析袋中，将透析袋置于含有9mL上述不同缓冲溶液的容器中，置于37℃恒温摇床中，100r/min振荡条件下进行缓释实验。在设定的时间点上取样1mL，再向容器中补充1mL对应的缓冲溶液，测量取出的液体在480nm处的吸光值。缓释结束后，绘制DOX的释放动力学曲线。如图13所示，M-G1-TBPNa@DOX在pH＝7.4与pH＝6.5的缓冲溶液中药物释放缓慢，在48小时释放率分别为7％、12％。而在pH＝5.0条件下，药物释放率达到32％。这是由于DOX在酸性条件下发生质子化，在水中具有更好的溶解性。
实施例8
利用CCK-8评价M-G1-TBPNa@DOX对黑色素瘤细胞B16和小鼠成纤维细胞L929的抑制效果。收集对数生长期的B16细胞，按照1×104个细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，于37℃、5％CO2环境中培养12小时，更换新鲜培养基，加入DOX、M-G1-TBPNa、M-G1-TBPNa@DOX(M-G1-TBPNa：DOX为1:1，相对DOX浓度为0、0.25、0.5、0.75、1、2.5、5、7.5、10μM)与细胞共同孵育24小时，弃掉原培养基，用PBS洗三遍，加入含10％(v/v)CCK-8的新鲜培养基，在培养箱继续孵育3小时。多功能酶标仪于波长450nm处测试各孔的吸光值，以PBS处理的细胞为空白对照，细胞活力记为100％。结果如图14所示，在试验浓度范围内，经M-G1-TBPNa处理过的L929和B16细胞存活率均在90％以上，说明M-G1-TBPNa无细胞毒性。同时，对于B16细胞，在相同DOX浓度下，M-G1-TBPNa@DOX与Free DOX具有相似的细胞毒性。对于L929细胞，由于载体无任何细胞毒性，在相同DOX浓度下，M-G1-TBPNa@DOX能够减弱DOX对正常细胞的毒性。如表2所示，Free DOX、M-G1-TBPNa@DOX与B16细胞共孵育24小时后的DOX半数抑制浓度(IC50)分别为0.44μM和0.60μM，Free DOX、M-G1-TBPNa@DOX与L929细胞共孵育24小时后的DOX半数抑制浓度(IC50)分别为1.46μM和8.26μM。计算得Free DOX与M-G1-TBPNa@DOX的安全系数分别为3.32和13.77，由此得知M-G1-TBPNa@DOX相比于Free DOX更具生物安全性。
表2.DOX与M-G1-TBPNa@DOX的半数抑制浓度(IC50)值与安全指数(SI)
样品 IC50/L929(μM) IC50/B16(μM) 安全指数(SI)
DOX 1.46±0.46 0.44±0.32 3.32
M-G1-TBPNa@DOX 8.26±0.54 0.60±0.18 13.77
实施例9
以B16细胞为模型细胞，检验Free DOX和M-G1-TBPNa@DOX的细胞吞噬效率。以2×105/孔的密度将B16细胞种于激光共聚焦专用培养皿中，于37℃及5％CO2条件下培养过夜。加入分别含有Free DOX和M-G1-TBPNa@DOX的新鲜培养基(相对DOX浓度为5μM，)孵育4小时。使用PBS缓冲溶液清洗细胞，每个培养皿加入1mL 2.5％多聚甲醛固定，去除固定液，DAPI染色15分钟，PBS洗3次，激光共聚焦显微镜观察材料在B16细胞内的分布情况。如图15(A)显示，Free DOX和M-G1-TBPNa@DOX与B16细胞共培养4小时后，红色荧光分布在细胞浆中。说明M-G1-TBPNa@DOX能够被B16细胞吞噬，并成功将DOX释放在细胞内。
收集对数生长期的B16细胞，按照每孔1×104个细胞的密度种在12孔板中，置于5％CO2，37℃条件下孵育12小时。每个孔板替换含不同浓度的M-G1-TBPNa@DOX(DOX浓度为1、5、10μM)的新鲜培养基，培养4小时。细胞经PBS洗三遍后，消化、离心、收集，用流式细胞仪检测细胞的荧光强度。图15(B)与15(C)显示，随着DOX浓度的增加，各组细胞均显示逐渐增强的荧光强度，验证了DOX可经纳米胶束有效递送至癌细胞内。
实施例10
以2×105细胞/孔的密度将B16细胞种于激光共聚焦专用培养皿中，37℃及5％CO2条件下培养过夜。加入分别含有Free DOX、M-G1-TBPNa、M-G1-TBPNa@DOX的新鲜培养基(相对DOX浓度为5μM)孵育6小时，用预冷的PBS洗涤3次。每孔中加入2.5％多聚甲醛固定15分钟，用PBS洗3次，加入免疫染色封闭液，封闭60分钟后，加入稀释后的CRT兔单抗孵育1小时，洗涤3次。随后加入稀释后的二抗，室温孵育1小时后，洗涤5分钟，共洗涤3次。加入DAPI染细胞核15分钟，PBS洗涤3次。用激光共聚焦扫描显微镜观察细胞中CRT外翻情况。如图16(A)所示，在PBS对照组的肿瘤细胞中几乎检测不到CRT的荧光，这是由于在正常状态下CRT表达在细胞内质网中。纯材料M-G1-TBPNa对CRT的表达几乎无影响，DOX或M-G1-TBPNa@DOX处理的B16细胞的表面有明显的CRT的荧光信号。
将B16细胞种于24孔板中，于37℃、5％CO2培养过夜。替换含有Free DOX、M-G1-TBPNa、M-G1-TBPNa@DOX的新鲜培养基(相对DOX浓度为5μM)孵育24小时。收集细胞培养液，参照HMGB-1的ELISA试剂盒的操作步骤，在酶标仪450nm下检测HMGB-1的含量。同时，取细胞上层培养液，在96孔板中加入100μL ATP检测工作液，放置3-5分钟后在孔中加入20μL培养液样品，混匀后通过多功能酶标仪测定胞外ATP含量。如图16(B)所示，细胞与M-G1-TBPNa@DOX共培养后，细胞培养液中HMGB-1的浓度著高于PBS组，释放的HMGB-1可促进肿瘤抗原提呈给T细胞。如图16(C)所示，发现M-G1-TBPNa@DOX组胞外ATP释放量显著高于PBS组，释放的ATP将有利于促进树突细胞对凋亡肿瘤细胞的吞噬作用，加强抗肿瘤免疫响应。
实施例11
将鼠源的外周血单个核细胞(PBMC)按照每孔1×106个细胞种于6孔板，分别加入IL-2、IL-2+M-G1-TBPNa与IL-2+M-G1-TBPNa@DOX(IL-2浓度为400U/mL，M-G1-TBP浓度为1μM)，37℃、5％CO2条件下培养72小时。离心收集细胞与细胞培养液，利用anti-CD3抗体和anti-CD49b抗体对收集的PBMC进行染色，通过流式细胞仪检测PBMC中NK细胞的比例。利用IFN-γELISA检测试剂盒测定细胞培养液中IFN-γ的含量。如图17(A)所示，相比于PBS组与IL-2组，IL-2+M-G1-TBPNa与IL-2+M-G1-TBPNa@DOX组中NK细胞比例上升，证明材料M-G1-TBPNa与M-G1-TBPNa@DOX在IL-2的存在下，能够使PBMC中的NK细胞有效增殖。如图17(B)所示，经过IL-2+M-G1-TBPNa和IL-2+M-G1-TBPNa@DOX组处理后的PBMC所分泌的IFN-γ含量接近，但均高于PBS组与IL-2组。分泌的IFN-γ可调节体内免疫反应，从而间接杀伤肿瘤细胞。
实施例12
实验用的4周雌性C57BL/6小黑鼠购自上海斯莱克实验动物中心(中国，上海)。将2×106个B16细胞接种到小鼠的右腿，待肿瘤体积达到约50-80mm3左右时，将小鼠随机分为6组(每组6只)。分组如下：对照组(PBS，100μL)；纯材料组M-G1-TBPNa(浓度为M-G1-TBPNa@DOX中DOX为5mg/kg时对应的M-G1-TBPNa浓度，100μL)；Free DOX组([DOX]＝5mg/kg，100μL)；M-G1-TBPNa@DOX组([DOX]＝5mg/kg，100μL)；aPD-L1抗体组(aPD-L1，100μL)；M-G1-TBPNa@DOX+aPD-L1组([DOX]＝5mg/kg，材料100μL；抗体100μL)。各组材料PBS、M-G1-TBPNa、Free DOX和M-G1-TBPNa@DOX通过尾静脉注射，抗体aPD-L1通过瘤内注射。开始治疗的当天记为第1天，其中材料在第1、4、7、10、13天尾静脉给药，aPD-L1在第2、5、8、11、14天瘤内注射。期间每隔2天记录老鼠体重和肿瘤尺寸，将小鼠肿瘤长记为a，宽记为b，体积等于(a*b2)/2。相对肿瘤体积结果如图18(A)所示，PBS组小鼠肿瘤随着时间迅速增长，aPD-L1组、M-G1-TBPNa组和Free DOX组肿瘤生长受到了一定的抑制。M-G1-TBPNa@DOX组抑制效果明显，这是由于纳米药物系统能通过EPR效应将药物递送到肿瘤部位。其中，M-G1-TBPNa@DOX+aPD-L1组治疗的小鼠获得了最高的抗肿瘤活性。小鼠体重变化如图18(B)所示，DOX治疗的小鼠出现突然的体重下降，表明DOX具有一定的全身毒性。而M-G1-TBPNa、M-G1-TBPNa@DOX和M-G1-TBPNa@DOX+aPD-L1组治疗的小鼠体重均略有增加，表明M-G1-TBPNa与M-G1-TBPNa@DOX胶束体系在体内具有良好的生物相容性。
实施例13
实验用的4周雌性C57BL/6小黑鼠购自上海斯莱克实验动物中心(中国，上海)。将2×106个B16细胞接种到小鼠的右腿，待肿瘤体积达到约50-80mm3左右时，将小鼠随机分为6组(每组6只)。分组如下：对照组(PBS，100μL)；纯材料组M-G1-TBPNa(浓度为M-G1-TBPNa@DOX中DOX为5mg/kg时对应的M-G1-TBPNa浓度，100μL)；Free DOX组([DOX]＝5mg/kg，100μL)；M-G1-TBPNa@DOX组([DOX]＝5mg/kg，100μL)；aPD-L1抗体组(aPD-L1，100μL)；M-G1-TBPNa@DOX+aPD-L1组([DOX]＝5mg/kg，材料100μL；抗体100μL)。各组材料PBS、M-G1-TBPNa、Free DOX和M-G1-TBPNa@DOX通过尾静脉注射，抗体aPD-L1通过瘤内注射。开始治疗的当天记为第1天，其中材料在第1、4、7、10、13天尾静脉给药，aPD-L1在第2、5、8、11、14天瘤内注射。取16天后小鼠的血液，利用外周血单个核细胞分离试剂盒分离出PBMC。无菌条件下取出其肿瘤组织，剪碎研磨经400目滤网过滤，得到细胞悬液，再通过各种动物肿瘤浸润组织淋巴细胞分离试剂盒分离出淋巴细胞。将分离出的PBMC与肿瘤部位的淋巴细胞用anti-CD3与anti-NK1.1抗体进行标记，通过流式细胞仪对细胞的CD3-NK1.1+细胞进行定量分析。结果如图19(A)与19(B)所示，相比于PBS组，M-G1-TBPNa@DOX+aPD-L1组PBMC中的NK细胞含量与PBS组相比显著提高。如图19(C)与19(D)所示，M-G1-TBPNa@DOX+aPD-L1组肿瘤浸润性淋巴细胞中的NK细胞含量与PBS组相比显著提高，一方面材料刺激血液中PBMC中的NK细胞增殖，通过循环作用，NK细胞到达肿瘤部位发挥杀伤作用。另一方面，aPD-L1阻断肿瘤表面的免疫抑制PD-L1受体，使得NK细胞活力得以维持。
无菌条件下取出各组小鼠的肿瘤组织，剪碎研磨经400目滤网过滤，得到细胞悬液，再通过各种动物肿瘤浸润组织淋巴细胞分离试剂盒分离出淋巴细胞。通过尼龙毛柱获取T淋巴细胞悬液，将获取的T细胞分别用anti-CD4与anti-CD8抗体进行标记，通过流式细胞仪对肿瘤组织中CD4+T细胞与CD8+T细胞进行定量分析。如图20所示M-G1-TBPNa@DOX+aPD-L1组处理后肿瘤浸润性CD4+T与CD8+T细胞含量明显高于其它组，说明M-G1-TBPNa@DOX+aPD-L1在不同程度上恢复了T细胞的免疫应答功能，其中M-G1-TBPNa@DOX+aPD-L1组中CD8+/CD4+T的比例最高。这是由于DOX引起的肿瘤细胞免疫原性死亡刺激了树突细胞的熟化，增强了树突细胞抗原提呈的能力，最终诱导抗原特异性CD8+T细胞毒性淋巴细胞的激活。同时联合aPD-L1抗体，aPD-L1阻断肿瘤表面的免疫抑制PD-L1受体，打破免疫耐受，增强T细胞抗肿瘤的活力。

Claims (8)

1.一种用于制备免疫治疗/化疗联合治疗药物的载药纳米胶束，其特征在于，所述载药纳米胶束以含两亲性含磷树冠大分子纳米材料和疏水性药物的原料制备获得；其中疏水性药物为DOX；
其中如下结构式I所示的两亲性含磷树冠大分子纳米材料，
Figure FDA0003959564780000011
2.根据权利要求1所述载药纳米胶束，其特征在于，所述两亲性含磷树冠大分子纳米材料的制备方法，包括：
(1)将2，3-二苯基马来酸酐和酪胺溶于溶剂中，然后加入N,N-二异丙基乙胺溶液，加热反应，冷却至室温后，过滤，纯化，得到化合物M；其中化合物M为
Figure FDA0003959564780000012
(2)将AB5溶于溶剂中，加入无水碳酸铯，冰浴，加入化合物M，室温反应，减压浓缩，纯化，得到第0.5代含磷树冠大分子M-AB5；其中所述AB5的结构式为
Figure FDA0003959564780000013
所述M-AB5的结构式为
Figure FDA0003959564780000014
(3)将M-AB5溶于溶剂中，加入无水硫酸钠，冰浴，加入N-甲基二氯硫代磷酰肼MMHPSCl2，室温反应，减压浓缩，纯化，得到第1代含磷树冠大分子M-G1；其中
MMHPSCl2的结构式为
Figure FDA0003959564780000015
所述M-G1的结构式为
Figure FDA0003959564780000021
(4)将酪胺溶于溶剂中，冰浴，加入甲醛溶液与亚磷酸二甲酯，室温反应，纯化，真空干燥，得到TBP；其中TBP的结构式为
Figure FDA0003959564780000022
(5)将M-G1溶于溶剂中，加入无水碳酸铯，冰浴，加入TBP溶液，室温反应，纯化，真空干燥得到M-G1-TBP；其中M-G1-TBP为
Figure FDA0003959564780000023
(6)将M-G1-TBP和水混合，冰浴，加入碱溶液碱解，冷冻干燥，得到表面修饰有磷酸酯基团的含磷树冠大分子M-G1-TBPNa；其中M-G1-TBPNa结构式为
Figure FDA0003959564780000024
3.根据权利要求2所述载药纳米胶束，其特征在于，所述步骤(1)中2，3-二苯基马来酸酐、酪胺的摩尔比为1:1-1:1.5；所述溶剂为乙酸；所述加热反应为160-170℃下加热90-120分钟；
所述步骤(2)中AB5、化合物M、无水碳酸铯的摩尔比为1:1:1-1:1.5:2；所述溶剂为无水丙酮。
4.根据权利要求2所述载药纳米胶束，其特征在于，所述步骤(3)中M-AB5、MMHPSCl2的摩尔比为1:5-1:6.5；所述溶剂为无水氯仿；所述室温反应时间为3-6h。
5.根据权利要求2所述载药纳米胶束，其特征在于，所述步骤(4)中酪胺、亚磷酸二甲酯、甲醛溶液的质量体积比为2g:3.34mL:2.672mL-2g:3.34mL:3.34mL；所述溶剂为无水四氢呋喃。
6.根据权利要求2所述载药纳米胶束，其特征在于，所述步骤(5)中M-G1、TBP、无水碳酸铯的质量比为1:2.3:3.3-1:2.5:3.6；所述溶剂为无水四氢呋喃；所述室温反应时间为24-48h。
7.根据权利要求2所述载药纳米胶束，其特征在于，所述步骤(6)中M-G1-TBP和水的质量体积比为100mg:0.8mL-100mg:1.2mL；碱溶液为NaOH溶液，碱解时间为15-30min。
8.一种权利要求1所述载药纳米胶束在制备黑色素瘤的免疫治疗/化疗联合治疗药物中的应用。
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Tailored Control and Optimisation of the Number of Phosphonic Acid Termini on Phosphorus-Containing Dendrimers for the Ex-Vivo ACHTUNGTRENUNGActivation of Human Monocytes;Olivier Rolland;《CHEMISTRY-A EUROPEAN JOURNAL》;20081231(第14期);第4836-4850页 *

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