KR101138437B1 - 스피루리나로부터 클로로필 ａ 및 광민감제 제조방법 - Google Patents

스피루리나로부터 클로로필 ａ 및 광민감제 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 스피루리나로부터 클로로필 a(특히, 분말 클로로필 a), 수용성 클로로필 a 유도체, 산 클로린 e6, 염 클로린 e6, 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine), 클로린-PVP 및 수용성 클로린 e6-엽산 결합 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 광민감제를 포함하는 암에 대한 광역학치료용(photodynamic therapy) 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법은 종래의 클로로필 a 및 광민감제의 수득 방법에 비해서 공정과정이 단순하고 빠르고, 정제도가 높으며, 경제적이다.

Description

스피루리나로부터 클로로필 ａ 및 광민감제 제조방법{Methods for Preparing Powder Chlorophyll a and Photosensitizer from Spirulina}
본 발명은 스피루리나로부터 클로로필 a 및 클로로필 a로부터 수득되는 일군의 광민감제들의 제조방법에 관한 것이다.
스피루리나(Spirulina)는 아프리카의 챠드 호수 및 멕시코의 텍스코코 호수와 같은 열대지역 알칼리성 호수의 수면에서 왕성하게 자생하는 극히 작은 조류(藻類 algae)에 속하는 미생물이다. 그 세포 속에는 다량의 클로로필과 피코시아닌이 들어있어서 태양광선을 흡수하여 탄소동화작용을 활발하게 수행하여 자라고 있다. 이러한 색소들이 들어있어서 청남색을 띠고 있으므로 옛날부터 남조류(blue-green algae)로 분류했었다.
스피루리나(Spirulina)라는 이름은 그 모양이 나선형(Spiral)이어서 붙여졌으며, DNA가 2중 나선형인 점을 고려할 때 그 형태가 원시적인 것이다. 전자현미경의 발달로 미생물의 세포구조가 자세히 밝혀지면서 녹조류나 갈조류의 구조는 고등 식물의 구조와 다른 점을 발견하였다. 즉 녹조류의 구조는 고등식물의 구조와 동일하게 진핵세포(eukaryote)구조를 가지고 있는 반면에, 남조류는 세균의 구조와 비슷한 원핵세포(prokaryote)구조를 가진 것이 밝혀짐에 따라, 1960년대 초부터 일부 미생물학자들이 남조류는 조류보다는 세균에 가까우므로, 세균류에 포함시켜야 한다는 주장이 나오게 되었다. 현재는 이 주장을 받아들여 청 남색 균류(blue-green bacteria)로 분류하고 있다. 그러나 산업계에서는 옛날 관행대로 미세조류(微細藻類 micro-algae)라 부르고 있다.
클로로필(엽록소, 葉綠素, chlorophyll)은 광합성을 하는 생물이 가지는 동화색소의 일종이다. 4개의 피롤이 메틴기 －CH＝에 의해 결합된 고리모양 테트라피롤에 시클로펜탄고리가 연결된 포르빈의 유도체인데, 테트라피톨 고리의 중앙에 Mg원자가 1개 배위하고 피롤고리 Ⅳ의 프로피오닐기에 피롤 또는 파르네솔이 에스테르 결합한 것이다. 클로로필은 헤모글로빈의 분자구조와 거의 일치하는 것으로 확인되어,푸른혈액이라고도 불리며, 실제로 동물의 혈액과 놀랍도록 비슷한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 특히, 클로로필은 항암, 항염작용을 하며, 손상된 세포를 재생시키고, 해독작용, 항콜레스테롤 작용에 이르기까지 매우 다양한 작용을 한다.
악성종양에 대한 광역학치료법(이하 PDT)은 현재 광범위하게 임상에 적용되고 있다. PDT의 효율성을 규정하는 중요한 요소 중의 하나는 표적성(Targeting) 또는 선택성(selectivity)으로서 종양조직과 정상조직에 있어 종양조직에만 광민감제를 선택적으로 축적시키는 정도를 나타낸다. 표적성이 높으면 PDT의 효과성이 높아져 치료시간을 단축시킬 수 있으며, 또한 체내에 주입된 약물의 부작용도 줄일 수 있게 된다. 특정 파장을 지닌 빛으로 광민감제를 활성화시키면 활성산소종의 일종인 일중항산소(singlet oxygen)와 라디칼 종(radical species)을 발생시키게 되는데, 이를 통해 직접적으로 종양세포를 죽이게 되며, 면역염증반응을 일으키고 또한 종양의 미소혈관계에 손상을 입히게 된다. 종래 광민감제들의 대부분이 종양에 선택적으로 축적이 되었지만, 피부를 포함한 정상조직에도 일부분 축적이 된 것으로 나타났다.
광민감제의 표적화 전달은 이러한 문제들을 해결할 수 있을 것이다. 이는 종양세포에 대한 선택적 축적정도를 개선시켜 광독성을 강화함으로써 가능할 수 있다. 표적화란 광활성화 물질을 종양추적(특정적)분자와 직접적으로 또는 캐리어를 이용해서 결합시키는 것을 의미한다. 이미 몇 가지 광민감제들이 종양-관련 항원(antigen)에 대한 항체와 결합된 바 있다. 저밀도 지단백(lipoprotein), 인슐린, 스테로이드, 트랜스페린, 상피세포성장인자(EGF)와 같은 리간드들 모두가, 이러한 리간드의 수용체를 과발현하는 세포로의 리간드-기반 광민감제의 표적화를 위하여 논의되어왔다. 사실, 병변세포에서는 수용체 발현의 변화, 특정 세포 표면막 지질과 단백질의 농도 증가뿐만 아니라 세포적 미세환경(cellular microenvironment)의 변화 등이 모두 일어난다.
수용체 매개전달(receptor mediated delivery)을 이용한 여러 전달전략 중에서, 하기와 같은 이유로 엽산수용체 또한 종양특이적 약물 전달을 위한 유용한 타겟이 된다.
첫째, 엽산수용체들은 난소 암, 결장, 유선(mamma gland), 폐, 신장-세포성 암, 상피 종양의 뇌로의 전이 및 신경 내분비 암에서 종양세포 상에서 발현된다.
둘째, 정상 조직에서 엽산 수용체의 발현은 상피세포의 첨단막(apical membrane) 상의 위치로 인해 발현이 심각하게 제한되어있어 정상조식에서의 엽산 수용체에 대한 접근은 거의 일어나지 않는다.
셋째, 극성화된 상피세포 : 엽산수용체의 밀도가 증가한다(극성화된 상피세포 : 암이 악화된 정도에 따른 엽산수용체의 밀도 증가).
넷째, 엽산이 그것의 세포표면상 수용체와 높은 친화성을 나타낸다. 엽산과 거대분자의 결합은 거의 모든 테스트된 상태에서 시험관 내 엽산수용체-발현 암세포로의 이들의 전달을 개선시킬 수 있다.
엽산수용체는 엽산과 결합하여 수용체-매개의 엔도시토시스를 통해 세포 내부로 이를 흡수하는, 수반성(adjoint) 글리코실 포스파티딜 이노시톨 당단백질이다. 비록 엽산수용체에 의한 세포 내로의 엽산 전달에 대한 정확한 작용기전이 확립되어 있지는 않지만, 엽산결합물들이 수용체-매개의 엔도시토시스를 통해 포유류 세포에 파괴되지 않은 채 축적된다는 것은 분명하다. 생리적인 엽산은 특수화된 엔도시토시스 매개 경로를 통해 원형질막을 통과해서 세포질 안으로 이동한다. 암 세포 표면상의 엽산수용체와 결합한 후, 크기에 관계없이 엽산결합물들은 엔도솜이라 불리는 세포내 성분으로 흡수되는 것으로 보여진다.
일반적으로 이러한 선택성 또는 표적성의 정도는 10:1(암세포:정상세포)의 비율을 넘지 못하고 있다. 이에 항체, 올리고당, 트랜스페린, 호르몬 유사체 등과 같은 세포 표면에 특징적인 벡터 리간드와의 결합을 통해 특정 세포군의 막 수용체에 광민감제를 선택적으로 전달하는 방법이 개발되고 있다. 많은 연구결과들이 화학요법에 쓰이는 약물이 이러한 벡터와 결합되면 그렇지 않은 경우보다 변형된 세포에 5-10배 정도 더 많이 운반되고 있음을 보여주고 있다. 그 세포들은 파괴됨이 없이 수용체-매개 엔도시토시스를 통해서 결합물을 바인드할 수 있다.
수용체-매개 엔도시토시스로 이용 가능한 엽산은 세 개의 구성부분으로 이루어져 있으며, 비타민그룹에 속한다. 살아있는 유기물은 주로 다이하이드로폴산(dihydrofolic acid), 데트라하이드로폴산(tetrahydrofolic acid), 5-메틸-테트라하이드로폴산(5-methyl-tetrahydrofolic acid)과 같은 엽산형태로 환원하는데, 이들은 단일 탄소 단편 운반 반응을 촉매하는 효소의 보조인자(cofactor)이다. 엽산 의존적 효소들은 퓨린과 피리미딘 뉴클레오티드의 생합성과, 메티오닌, 히스티딘, 세린 및 글리신의 아미노산의 대사에 참여한다. 이 때문에 엽산은 세포분열과 성장에 반드시 필요한 성분이다. 엽산은 생체 내에 들어간 후에 혈액에 흡수되며 플라즈마와 적혈구와 함께 조직으로 운반된다. 동물세포는 엽산을 합성할 수 없기 때문에 원형질막에 있어 엽산을 바인드하고 흡수하는 특별한 시스템의 존재가 사실상 요구된다.
엽산은 뚜렷한 친수성 특이적인 특징을 나타내는 이가 음이온(dianion)으로, 단순한 확산으로는 세포의 원형질막을 통해서 통과하기 어렵다. 단지 높은 약리학적 농도에서만 수동적인 확산으로 엽산 운반을 할 수 있다. 자연적 생리학 조건에서 엽산은 조직과 혈청 내에서 나노몰 농도로 발견되는데, 이것이 이러한 비타민을 흡수하고 운반하는 세포가 고도로 효과적인 특이한 막 시스템을 가지게 되는 이유이다.
높은 속도로 엽산 운반을 촉진하는 이동성 담체가 있다. 혈액으로의 엽산흡수가 일어나는 소장의 상피세포에 많이 존재한다. 촉매 운반은 다양한 세포에서 엽산 흡수의 주된 경로이다. 그러한 운반의 기질(substrate)은 복원된 형태의 엽산으로, 이는 상기 담체가 TRV(transporter of restored vectors)로 불리는 이유이다. 이는 46 kD의 크기를 가지는 당단백질로 세포 원형질막 내에서 친수성 분자의 막을 통해서 생기는 "채널(channel)"을 형성한다. TRV 매개 운반의 동역학은 마이클리스-멘텐식(Michaelis-Menten equation)에 의존적인 것으로 설명된다. 작용하는 속도는 다소 높으며, 엽산과의 유사성은 대략 200 μM로 상대적으로 낮다.
TRV는 종양세포에서도 작용한다. 복원된 엽산의 결합력 KM은 1-4 μM 이내이다. 담체의 메토트렉세이트와의 유사성은 4-8 μM 이내에서 약간 더 낮은 KM이고, 그것의 운반 최대 속도는 세포 단백질 그램당 1-12 nmol/min 이내이다. TRV는 엽산의 막을 통한 운반을 수행할 수 있지만, 주어진 산소처리된 엽산에 대한 그것의 유사성은 낮다 (KM은 100-200 μM 이내이다).
엽산의 세포내 이동은 엽산수용체라고 불리는 막 당단백질을 통해 작용하는 수용체-매개의 시스템이 있다. 엽산수용체는 엽산에 대한 결합상수가 1 nM 미만이라는 점에서 기질과 매우 유사하다는 특징을 가지고 있다. 엽산의 수용체 매개 운반은 한 방향 즉 세포 내부쪽으로만 수행된다. 정상조직의 세포들은 약간의 예외를 제외하고는 매우 적은 양의 엽산수용체만을 그 표면 상에서 발현한다. 그러나, 악성으로 형질변환된 세포들, 특히 폐, 신장, 뇌, 대장, 난소에서의 종양 세포와 백혈병에서의 골수 혈액 세포에서는 엽산에 대한 수용체의 양이 그들의 표면 상에서 증가하게 된다. 이러한 엽산수용체의 양적인 증가로 인해 엽산을 현저한 양(세포당 6107 분자 이상)으로 보다 효과적으로 바인딩할 수 있게 된다. 암세포의 진단에 사용되는 단일클론항체가 엽산과 매우 특이적으로 결합하는 것으로 나타나는 한, 이러한 당단백질은 종양 마커로서 언급되어질 수 있다.
엽산의 수용체 매개 운반은 엔도시토시스 메커니즘을 통해서 수행된다. 수용체는 재순환 메커니즘(recirculatory mechanism)을 통해서 작동한다. 즉, 리간드가 분자를 결합하고 방출하면서, 반복적으로 원형질막으로부터 엔도솜으로 그리고 그 반대로 가로질러 통과한다. 그러한 기능의 효율성은 다음과 같은 다양한 요소들에 의해 규정된다:
세포 표면상의 수용체의 수, 세포 밖 엽산-리간드의 농도, 수용체에 대한 엽산의 유사성, 에너지-의존적 엔도시토시스의 속도, 엔도솜으로부터 수용체 분자 방출 속도, 막 내부에서 반복적으로 만들어지기 위한 수용체의 능력 등.
의약물과 결합한 엽산 결합물에서 엽산 수용체와 연합된 부분은 수용체-매개 엔도시토시스를 통해 세포로 들어가게 되고, 한편 다른 부분은 세포의 표면 상에 머물러 있게 될 것이다. 이에 따라 두 가지 타입의 치료 전략이 제안될 수 있다. 세포 내 타겟까지 접근할 필요가 있는 의약물은 엔도시토시스에 의해 시토졸로 운반될 수 있으며, 세포 밖 영역에서 작용할 수 있거나 작용해야 하는 의약물은 엽산수용체를 소비하면서 종양세포 표면 상에 축적될 것이다.
주요한 특징은 약물이 병리적으로 변형된 세포에까지 직접 전달된다는 점이다. 치료효과를 가진 다양한 광민감제들을 이용하는 PDT의 경우, 종양 세포의 직접적인 손상이 아닌, 병소(pathological focus)의 생리학적 조건을 변화시키는 것을 통해 조정된다. 따라서, 친수성 염료(stains), 특히 클로린 e6은 종양조직의 혈관 시스템의 광 손상에 민감하게 되고(광역학치료법의 혈관에 미치는 효과), 이는 형질 변환된 세포의 직접적인 비활성화를 유도하지 않고 종양의 성장을 억제한다. 광민감제를 종양에 선택적으로 운반하는 것은 PDT의 항암치료효과를 획기적으로 개선시킬 수 있는 한 가지 방법이 될 수 있음이 분명하다.
클로린 e6은 천연성분이며, 유기체의 정상적인 세포에는 독성이 없다. 또한 종양치료에 사용되는 다른 광활성 화합물들과 비교하여 악성 세포에 대해 높은 광화학 활성을 가진다. 클로린 e6은 혈액과 기관으로부터 종양부위로 빨리 도달한 후, 종양세포에 높은 농도로 축적된다. 레이저에 의해 활성화된 클로린 e6는 종양에 대한 직접적인 파괴 효과뿐만 아니라 간접적으로도 세포면역을 약화시켜 항-종양 면역조절 효과를 제공한다. 염증 부위와 재생 조직에 클로린이 많이 축적되면 수술 후 상처의 회복이 보다 잘되게 하며 재감염을 막아준다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 물에 용해되지 않는 산 클로린 e6에 나트륨(Na+)를 첨가하여 물에 용해되는 염 클로린 e6를 합성(제조)하고, 물에 용해되지 않는 산 클로린 e6에 보다 물에 잘 용해될 수 있고 완충 작용까지 할 수 있는 글루카민(N-methyl-d-glucamine)을 첨가하여 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)을 합성(제조)하고, 염 클로린 e6에 PVP를 첨가하여 물에 잘 용해할 수 있고, 종양에 대한 항암 효과를 높이는 화합물인 클로린-PVP을 합성(제조)하게 되었다. 그리고 클로린 e6과 엽산을 헥산-1,6-디아민을 통해 말단 링커를 결합시키고, 물에 용해되지 않는 클로린 e6-엽산 화합물에 글루카민(N-methyl-d-glucamine)을 첨가하여 물에 잘 용해할 수 있는 수용성 클로린 e6-엽산 화합물을 합성(제조)함으로써 다양한 매질에서 일중항 산소를 효과적으로 생성하고 종래 포르피린 계열의 광민감제에 비해 현저히 우수한 종양 선택성을 가짐으로써 악성종양에 대한 광역학치료에 유용한 특징을 가진 수용성 클로린 e6-엽산 결합 화합물을 기존의 방법보다 쉽고, 빠르며, 경제적으로 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 스피루리나로 부터 클로로필 a 및 수용성 클로로필 a 유도체, 그리고 광민감제[산 클로린 e6, 염 클로린 e6, 클로린-글루카민(N-methyl-d -glucamine), 클로린-PVP 및 수용성 클로린 e6-엽산 결합 화합물]을 기존의 제조방법과 비교하여 보다 간편하고, 신속하며, 정제도가 향상된 제조방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 본 발명자들은 상술한 장점을 가지는 공정을 개발하는 데 성공하였으며, 이러한 공정에 의해 수득한 광민감제가 암에 대하여 우수한 광역학치료 효과를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 클로로필 a의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 수용성 클로로필 a 유도체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 산 클로린 e6의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 염 클로린 e6의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 클로린-PVP의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 클로린 e6-엽산 결합 화합물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 수용성 클로린 e6-엽산 결합 화합물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상술한 본 발명의 방법에 의해 제조된 광민감제를 포함하는 암에 대한 광역학치료용(photodynamic therapy) 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명은 스피루리나로 부터 클로로필 a(바람직하게는 분말 클로로필 a), 수용성 클로로필 a 유도체, 산 클로린 e6, 염 클로린 e6, 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine), 클로린-PVP, 클로린 e6-엽산 결합 화합물 및 수용성 클로린 e6-엽산 결합 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 광민감제를 포함하는 암에 대한 광역학치료용(photodynamic therapy) 약제학적 조성물을 제공한다.
*본 발명자들은 스피루리나로 부터 클로로필 a 및 수용성 클로로필 a 유도체, 그리고 광민감제[산 클로린 e6, 염 클로린 e6, 클로린-글루카민(N-methyl- d-glucamine), 클로린-PVP 및 수용성 클로린 e6-엽산 결합 화합물]을 기존의 제조방법과 비교하여 보다 간편하고, 신속하며, 정제도가 향상된 제조방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 본 발명자들은 상술한 장점을 가지는 공정을 개발하는 데 성공하였으며, 이러한 공정에 의해 수득한 광민감제가 암에 대하여 우수한 광역학치료 효과를 나타냄을 확인하였다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 하기 화학식 1의 클로로필 a의 제조방법을 제공한다:
(a) 스피루리나에 에탄올을 첨가하여 클로로필 a를 함유하는 스피루리나 추출액을 얻는 단계;
(b) 상기 추출액을 냉동 보관하여 클로로필 a 이외의 무극성 불순물을 침전시켜 제거하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 결과물의 에탄올을 제거하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)의 결과물을 아세톤으로 용해한 다음 냉동 보관하여 클로로필 a 이외의 극성 불순물을 침전 제거하여 클로로필 a를 얻는 단계.
화학식 1
Figure 112011060755841-pat00001
본 발명의 클로로필 a의 제조방법을 상술하면 다음과 같다:
단계 (a): 스피루리나 추출액을 얻는 단계
본 발명에 따르면, 우선 스피루리나에 에탄올을 첨가하여 클로로필 a를 함유하는 스피루리나 추출액을 얻는다.
본 발명에서 사용할 수 있는 스피루리나는 당업계에 공지된 다양한 스피루리나를 포함하며, 예를 들어 Arthrospira ( Spirulina ) platensis , Arthrospira (Spirulina) maxima , Spirulina subsalsa , Spirulina major , Spirulina geitleri , Spirulina siamese , Spirulina princeps , Spirulina laxissima , Spirulina curta , and Spirulina spirulinoides . Among these , Arthrospira ( Spirulina ) platensis , Arthrospira ( Spirulina ) maxima , Spirulina geitleri 및 Spirulina siamese를 포함하며, 바람직하게는, Arthrospira ( Spirulina ) platensis와 Arthrospira (Spirulina) maxima 이며, 가장 바람직하게는, Arthrospira ( Spirulina ) maxima 이다.
추출액의 제조 시 사용되는 에탄올의 농도는 중요하다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 사용되는 에탄올은 70-100 v/v%, 보다 바람직하게는 90-100 v/v% 농도를 갖는다.
단계 (b): 무극성 불순물의 제거
이어, 상기 과정에서 얻은 추출액을 냉동 보관하여 클로로필 a 이외의 무극성 불순물을 침전시켜 제거한다.
상기 냉동 보관은 최종적으로 수득하는 클로로필 a의 순도를 높이는 데 있어서 매우 중요한 처리 과정이다.
무극성 불순물을 제거하기 위한 냉동 보관은, 바람직하게는 -80℃ 내지 0℃, 보다 바람직하게는 -50℃ 내지 -10℃, 보다 더 바람직하게는 -40℃ 내지 -10℃, 보다 더욱 더 바람직하게는 -30℃ 내지 -10℃, 가장 바람직하게는 -25℃ 내지 -15℃에서 실시한다.
상기 냉동 보관 처리시간은, 바람직하게는 5-50시간, 보다 바람직하게는 10-40시간, 보다 더 바람직하게는 10-30시간, 가장 바람직하게는 20-28시간이다.
단계 (c): 에탄올 제거
그런 다음, 상기 냉동보관 되어 무극성 불순물이 제거된 결과물로부터 에탄올 용매를 제거한다. 에탄올 용매의 제거는 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 실시할 수 있으며, 예를 들어 농축기를 이용하여 에탄올 용매를 제거할 수 있다.
단계 (d): 극성 불순물의 제거
에탄올 용매가 제거된 결과물을 아세톤으로 용해한 다음 냉동 보관하여 클로로필 a 이외의 극성 불순물을 침전 제거하여 클로로필 a를 얻는다.
*이 냉동 보관은 최종적으로 수득하는 클로로필 a의 순도를 높이는 데 있어서 매우 중요한 처리 과정이며, 이 과정을 통하여 극성 불순물이 제거된다.
극성 불순물을 제거하기 위한 냉동 보관은, 바람직하게는 -80℃ 내지 0℃, 보다 바람직하게는 -50℃ 내지 -10℃, 보다 더 바람직하게는 -40℃ 내지 -10℃, 보다 더욱 더 바람직하게는 -30℃ 내지 -10℃, 가장 바람직하게는 -25℃ 내지 -15℃에서 실시한다. 상기 냉동 보관 처리시간은, 바람직하게는 5-50시간, 보다 바람직하게는 10-40시간, 보다 더 바람직하게는 10-30시간, 가장 바람직하게는 20-28시간이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (d) 이후에 단계 (d)의 결과물로부터 아세톤을 제거하여 분말 클로로필 a를 수득하는 단계를 추가적으로 포함한다. 아세톤 용매의 제거는 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 실시할 수 있으며, 예를 들어 농축기를 이용하여 아세톤 용매를 제거할 수 있다.
실질적으로 상업적으로 유통되는 클로로필 a는 분말상이며, 본 발명은 이러한 분말상의 클로로필 a를 제공하는 데 매우 유리하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 최종적으로 수득되는 클로로필 a는 88-90%의 정제도 및 2.4-2.7%의 수율을 나타낸다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 하기 화학식 2의 수용성 클로로필 a 유도체의 제조방법을 제공한다:
(a) 상기 클로로필 a의 아세톤 용액에 강염기를 처리하여 클로로필 a로부터 파이톨(phytol)을 제거하여 하기 화학식 2의 수용성 클로로필 a 유도체를 수득하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 결과물에 강산을 처리하여 pH를 6-9로 조절하는 단계; 화학식 2
Figure 112011060755841-pat00002
본 발명의 수용성 클로로필 a의 제조방법을 상술하면 다음과 같다:
단계 (a): 클로로필 a의 아세톤 용액에 강염기를 처리하는 단계
본 발명에 따르면, 우선 상기 과정에서 수득한 클로로필 a를 아세톤에 녹인 후 클로로필 a로부터 파이톨(phytol)을 제거하기 위해서 강염기를 첨가하여 교반한다.
상기 강염기의 처리는 클로로필 a로부터 파이톨(phytol)을 제거하기 위해 매우 중요한 과정이다.
상기 화학식 2에서 M+는 바람직하게는 Na+ 또는 K+이고, 가장 바람직하게는 Na+이다.
파이톨(phytol)을 제거하기 위해 사용되는 강염기로는 당업계에서 공지된 다양한 염기를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 무기 염기이고, 보다 바람직하게는 NaOH 또는 KOH이며, 가장 바람직하게는 NaOH이다.
상기 강염기의 첨가에 의해 용액의 pH를 바람직하게는 10-14, 보다 바람직하게는 12-14, 가장 바람직하게는 13-14가 되도록 한다.
상기 교반 시간은 바람직하게는 1시간 내지 5시간, 보다 바람직하게는 3시간 내지 5시간, 가장 바람직하게는 3시간이다.
단계 (b): 강산의 처리
이후 강염기가 첨가되어 교반된 상기 수용성 클로로필 a 유도체를 중화하기 위해서 강산을 첨가한다.
본 발명에 첨가되는 강산으로는 당업계에서 공지된 다양한 산을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 무기산, 보다 바람직하게는 HCl 또는 H2SO4 , 가장 바람직하게는 HCl이다.
상기 강산의 첨가에 의해 용액의 pH를 바람직하게는 7-10, 보다 바람직하게는 8-9로 맞춘다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 진행되면서 생긴 부산물 및 여분의 강염기를 제거하여 정제시키기 위해 상기 증류수에 녹인 수용성 클로로필 a를 다공성 폴리아크릴아마이드 비드에 통과시키는 단계 및 수용성 클로로필 a 유도체에 해당하는 피크만 모은 후 동결건조 시키는 단계를 추가적으로 포함한다.
다공성 폴리아크릴아마이드 비드는 아크릴아마이드 및 N,N'-메틸렌-비스-아크릴아마이드의 공중합체로서 전하를 띄지 않고, 친수성이 매우 강하여 민감한 화합물의 여과를 효율적으로 수행할 수 있도록 한다.
다공성 폴리아크릴아마이드 비드의 입자 크기는 특별하게 제한되지 않지만, 바람직하게는 30-120 μm이며, 보다 바람직하게는 40-100 μm이고, 가장 바람직하게는 45-90 μm이다.
이러한 다공성 폴리아크릴아마이드 비드는 상업적으로 구입 가능하며, 예를 들어 Bio-Rad Laboratories의 Bio-gel P-2 gel, Bio-gel P-4 gel, Bio-gel P-6 gel, Bio-gel P-6D gel, Bio-gel P-10 gel, Bio-gel P-30 gel, Bio-gel P-60 gel, Bio-gel P-100 gel을 포함한다. 상기 Bio-gel P-2 gel은 45-90 μm의 입자 크기를 가지는 비드로 되어 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 방법으로 수득한 수용성 클로로필 a 유도체의 용액에 강산을 처리하는 단계를 포함하는 하기 화학식 3의 산 클로린 e6의 제조방법을 제공한다.
화학식 3
Figure 112011060755841-pat00003
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수용성 클로로필 a 유도체를 증류수에 용해한 후 강산을 처리하여 수용성 클로로필 a 유도체로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써 산 클로린 e6를 합성한다.
본 발명에서 수용성 클로로필 a 유도체 용액은 수용성 용액임을 특징으로 한다.
본 발명에서 이용되는 강산으로는 당업계에서 공지된 다양한 산을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 무기산, 보다 바람직하게는 HCl 또는 H2SO4 , 가장 바람직하게는 HCl이다.
상기 강산의 첨가에 의해 용액의 pH를 바람직하게는 1-3, 보다 바람직하게는 1-2로 맞춘다. 이 경우, pH 3 이상이면 마그네슘 이온 제거율이 크게 감소되는 문제점이 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 방법으로 수득한 산 클로린 e6의 용액에 강염기를 처리하는 단계를 포함하는 하기 화학식 4의 염 클로린 e6의 제조방법을 제공한다.
화학식 4
Figure 112011060755841-pat00004
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 산 클로린 e6를 증류수에 용해한 후 강염기를 처리하여 염 클로린 e6를 합성한다.
본 발명에서 이용되는 강염기로는, 당업계에서 공지된 다양한 염기를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 무기 염기이고, 보다 바람직하게는 NaOH 또는 KOH이며, 가장 바람직하게는 NaOH이다.
상기 화학식 4에서 M+는 바람직하게는 Na+ 또는 K+이고, 가장 바람직하게는 Na+이다.
상기 강염기의 첨가에 의해 용액의 pH를 바람직하게는 7-11, 보다 바람직하게는 7-10, 가장 바람직하게는 8-9가 되도록 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 진행되면서 생긴 부산물 및 여분의 강염기를 제거하여 정제시키기 위해 상기 증류수에 녹인 염 클로린 e6를 다공성 폴리아크릴아마이드 비드에 통과시키는 단계 및 염 클로린 e6에 해당하는 피크만 모은 후 동결건조 시키는 단계를 추가적으로 포함한다.
다공성 폴리아크릴아마이드 비드는 아크릴아마이드 및 N,N'-메틸렌-비스-아크릴아마이드의 공중합체로서 전하를 띄지 않고, 친수성이 매우 강하여 민감한 화합물의 여과를 효율적으로 수행할 수 있도록 한다.
다공성 폴리아크릴아마이드 비드의 입자 크기는 특별하게 제한되지 않지만, 바람직하게는 30-120 ㎛이며, 보다 바람직하게는 40-100 ㎛이고, 가장 바람직하게는 45-90 ㎛이다.
이러한 다공성 폴리아크릴아마이드 비드는 상업적으로 구입 가능하며, 예를 들어 Bio-Rad Laboratories의 Bio-gel P-2 gel, Bio-gel P-4 gel, Bio-gel P-6 gel, Bio-gel P-6D gel, Bio-gel P-10 gel, Bio-gel P-30 gel, Bio-gel P-60 gel, Bio-gel P-100 gel을 포함한다. 상기 Bio-gel P-2 gel은 45-90 ㎛의 입자 크기를 가지는 비드로 되어 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 산 클로린 e6의 용액에 글루카민(N-methyl-d-glucamine)을 처리하는 단계를 포함하는 하기 화학식 5의 클로린-글루카민의 제조방법을 제공한다.
화학식 5
Figure 112011060755841-pat00005
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 산 클로린 e6를 증류수에 용해한 후 글루카민을 첨가하여 클로린-글루카민을 합성한다.
상기 단계에서 글루카민을 첨가함에 있어서, 바람직하게는 글루카민은 산 클로린 e6 1당량(eq)에 2당량(eq)의 글루카민(N-methyl-d-glucamine)을 첨가한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 진행되면서 생긴 부산물 및 여분의 글루카민을 제거하여 정제시키기 위해 상기 증류수에 녹인 클로린-글루카민을 다공성 폴리아크릴아마이드 비드에 통과시키는 단계 및 클로린-글루카민에 해당하는 피크만 모은 후 동결건조 시키는 단계를 추가적으로 포함한다.
다공성 폴리아크릴아마이드 비드는 아크릴아마이드 및 N,N'-메틸렌-비스-아크릴아마이드의 공중합체로서 전하를 띄지 않고, 친수성이 매우 강하여 민감한 화합물의 여과를 효율적으로 수행할 수 있도록 한다.
다공성 폴리아크릴아마이드 비드의 입자 크기는 특별하게 제한되지 않지만, 바람직하게는 30-120 ㎛이며, 보다 바람직하게는 40-100 ㎛이고, 가장 바람직하게는 45-90 ㎛이다.
이러한 다공성 폴리아크릴아마이드 비드는 상업적으로 구입 가능하며, 예를 들어 Bio-Rad Laboratories의 Bio-gel P-2 gel, Bio-gel P-4 gel, Bio-gel P-6 gel, Bio-gel P-6D gel, Bio-gel P-10 gel, Bio-gel P-30 gel, Bio-gel P-60 gel, Bio-gel P-100 gel을 포함한다. 상기 Bio-gel P-2 gel은 45-90 ㎛의 입자 크기를 가지는 비드로 되어 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 염 클로린 e6의 용액에 폴리비닐필로리돈(polyvinylpyrrolidone)을 처리하는 단계를 포함하는 클로린-PVP의 제조방법을 제공한다.
화학식 5-1
Figure 112011060755841-pat00006
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 염 클로린 e6를 증류수에 용해한 후 폴리비닐필로리돈(polyvinylpyrrolidone)을 첨가하여 클로린-PVP를 합성한다.
바람직하게는, 상기 단계에서 폴리비닐필로리돈(polyvinylpyrrolidone)을 첨가함에 있어서, 폴리비닐필로리돈은 염 클로린 e6 1당량(eq)에 2당량(eq)을 첨가한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 진행되면서 생긴 부산물 및 여분의 폴리비닐필로리돈을 제거하여 정제시키기 위해 상기 증류수에 녹인 클로린-PVP을 다공성 폴리아크릴아마이드 비드에 통과시키는 단계 및 클로린-PVP에 해당하는 피크만 모은 후 동결건조 시키는 단계를 추가적으로 포함한다.
다공성 폴리아크릴아마이드 비드는 아크릴아마이드 및 N,N'-메틸렌-비스-아크릴아마이드의 공중합체로서 전하를 띄지 않고, 친수성이 매우 강하여 민감한 화합물의 여과를 효율적으로 수행할 수 있도록 한다.
다공성 폴리아크릴아마이드 비드의 입자 크기는 특별하게 제한되지 않지만, 바람직하게는 30-120 ㎛이며, 보다 바람직하게는 40-100 ㎛이고, 가장 바람직하게는 45-90 ㎛이다.
이러한 다공성 폴리아크릴아마이드 비드는 상업적으로 구입 가능하며, 예를 들어 Bio-Rad Laboratories의 Bio-gel P-2 gel, Bio-gel P-4 gel, Bio-gel P-6 gel, Bio-gel P-6D gel, Bio-gel P-10 gel, Bio-gel P-30 gel, Bio-gel P-60 gel, Bio-gel P-100 gel을 포함한다. 상기 Bio-gel P-2 gel은 45-90 ㎛의 입자 크기를 가지는 비드로 되어 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 하기 화학식 6의 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 제조방법을 제공한다:
(a) 엽산과 [tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트를 반응시켜 γ-{(tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산을 수득하는 단계;
(b) 상기 γ-{[tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산에 트리플루오로-아세트산을 첨가하여 반응시킴으로서 γ-(6-아미노헥실)엽산을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 단계에서 제조한 γ-(6-아미노헥실)엽산에 산 클로린 e6를 첨가하여 반응시키는 단계.
화학식 6
Figure 112011060755841-pat00007
본 발명의 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6의 제조방법을 상술하면 다음과 같다:
단계 (a): γ-{( tert -부틸-N-(6- 아미노헥실 )] 카르바메이트 }엽산의 수득
우선, 엽산과 [tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트를 반응시켜 γ-{(tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산을 제조한다. 본 반응은 바람직하게는 상온에서 실시한다. 반응 대기조건은 비활성 대기 조건이며, 예를 들어 질소 대기 조건이다.
단계 (b): γ-(6- 아미노헥실 )엽산의 수득
이후 상기에서 수득된 γ-{[tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산에 트리플루오로-아세트산을 반응시켜 γ-(6-아미노헥실)엽산을 제조한다. 본 반응은 바람직하게는 상온에서 실시한다.
단계 (c): [γ-(6- 아미노헥실 )엽산]- 클로린 e6 의 수득
상기 단계에서 제조한 γ-(6-아미노헥실)엽산에 산 클로린 e6을 반응시켜 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6을 제조한다. 본 반응은 바람직하게는 암실에서 실시한다. 반응 대기조건은 비활성 대기 조건이며, 예를 들어 질소 대기 조건이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6에 글루카민(N-methyl-d-glucamine) 또는 NaOH를 첨가하는 단계를 포함하는 하기 화학식 7 또는 화학식 7-1의 수용성 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 제조방법을 제공한다.
화학식 7
Figure 112011060755841-pat00008
화학식 7-1
Figure 112011060755841-pat00009
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 산 클로린 e6-엽산 화합물에 소량의 증류수를 첨가한 후 글루카민 또는 NaOH를 첨가하여 수용성 클로린 e6-엽산 화합물을 합성한다.
본 발명에서 글루카민 또는 NaOH의 첨가는 산 클로린 e6-엽산 화합물을 증류수에 용해될 수 있도록 하는 매우 중요한 단계이다.
상기 단계에서 글루카민 또는 NaOH을 첨가함에 있어서, 바람직하게는, 산 클로린 e6-엽산 화합물 1당량(eq)에 3당량(eq)의 글루카민(N-methyl-d-glucamine) 또는 NaOH를 첨가한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 진행되면서 생긴 부산물 및 여분의 글루카민 또는 NaOHf를 제거하여 정제시키기 위해 상기 증류수에 녹인 산 클로린 e6-엽산 화합물을 다공성 폴리아크릴아마이드 비드에 통과시키는 단계 및 산 클로린 e6-엽산 화합물에 해당하는 피크만 모은 후 동결건조 시키는 단계를 추가적으로 포함한다.
다공성 폴리아크릴아마이드 비드는 아크릴아마이드 및 N,N'-메틸렌-비스-아크릴아마이드의 공중합체로서 전하를 띄지 않고, 친수성이 매우 강하여 민감한 화합물의 여과를 효율적으로 수행할 수 있도록 한다.
다공성 폴리아크릴아마이드 비드의 입자 크기는 특별하게 제한되지 않지만, 바람직하게는 30-120 ㎛이며, 보다 바람직하게는 40-100 ㎛이고, 가장 바람직하게는 45-90 ㎛이다.
이러한 다공성 폴리아크릴아마이드 비드는 상업적으로 구입 가능하며, 예를 들어 Bio-Rad Laboratories의 Bio-gel P-2 gel, Bio-gel P-4 gel, Bio-gel P-6 gel, Bio-gel P-6D gel, Bio-gel P-10 gel, Bio-gel P-30 gel, Bio-gel P-60 gel, Bio-gel P-100 gel을 포함한다. 상기 Bio-gel P-2 gel은 45-90 ㎛의 입자 크기를 가지는 비드로 되어 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면 본 발명은 상기 화학식 4의 염 클로린 e6, 상기 화학식 5의 클로린-글루카민, 상기 화학식 5-1의 클로린-PVP, 상기 화학식 6의 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 또는 상기 화학식 7 또는 화학식 7-1의 수용성 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6를 포함하는 암에 대한 광역학치료용(photodynamic therapy) 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "암"은 형질전환된 세포의 억제되지 않는 증식과 무질서한 성장 결과로 빚어지는 복합적인 질환을 일컬으며, 본 발명에서는 광역학적 치료를 위해 고형암을 의미한다. 고형암이란 혈액암을 제외한 모든 덩어리로 이루어진 암을 의미한다. 고형암의 종류로는 뇌종양(Brain Tumor), 양성성상세포종 (Low- grade astrocytoma), 악성성상세포종 (High-grade astrocytoma), 뇌하수체 선종 (Pituitary adenoma), 뇌수막종 (Meningioma), 뇌림프종 (CNS lymphoma), 핍지교종 (Oligodendroglioma), 두개내인종 (Craniopharyngioma), 상의세포종 (Ependymoma), 뇌간종양 (Brain stem tumor), 두경부 종양(Head & Neck Tumor), 후두암 (Larygeal cancer), 구인두암 (Oropgaryngeal cancer), 비강/부비동암 (Nasal cavity/PNS tumor), 비인두암 (Nasopharyngeal tumor), 침샘암 (Salivary gland tumor), 하인두암 (Hypopharyngeal cancer), 갑상선암 (thyroid cancer), 구강암 (Oral cavity tumor), 흉부종양(Chest Tumor), 소세포성 폐암 (Small cell lung cancer), 비소세포성 폐암 (NSCLC), 흉선암 (Thymoma), 종격동 종양 (Mediastinal tumor), 식도암 (Esophageal cancer), 유방암 (Breast cancer), 남성유방암 (Male breast cancer), 복부종양 (Abdomen-pelvis Tumor), 위암 (Stomach cancer), 간암 (Hepatoma), 담낭암 (Gall bladder cancer), 담도암 (Billiary tract tumor), 췌장암 (pancreatic cancer), 소장암 (Small intestinal tumor), 대장(직장)암 (Large intestinal tumor), 항문암 (Anal cancer), 방광암 (Bladder cancer), 신장암 (Renal cell carcinoma), 전립선암 (Prostatic cancer), 자궁경부암 (Cervix cancer), 자궁내막암 (Endometrial cancer), 난소암 (Ovarian cancer), 자궁육종 (Uterine sarcoma), 피부암(Skin Cancer) 등이 있다.
본 발명의 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 7-1의 화합물 또는 화학식 5-1 클로린-PVP은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물 또는 수화물로 제조될 수 있다.
염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알콜(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로아이오딕산 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
상기 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 7-1의 화합물 또는 화학식 5-1 클로린-PVP의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 7-1의 화합물 또는 화학식 5-1 클로린-PVP의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄술포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔술포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며 당업계에서 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여하는 것이 바람직하고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-1000 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 스피루리나로부터 클로로필 a(특히, 분말 클로로필 a), 수용성 클로로필 a 유도체, 산 클로린 e6, 염 클로린 e6, 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine), 클로린-PVP 및 수용성 클로린 e6-엽산 결합 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
(b) 본 발명은 스피루리나로부터 에탄올과 아세톤을 이용해 저온 냉동침전 방법으로 불순물을 제거하는 방법을 통해 효율적으로 클로로필 a(특히, 분말 클로로필 a)를 수득하고, 상기에서 수득한 클로로필 a에 염기를 처리하여 수용성 클로로필 a 유도체를 형성시키고, 산을 처리하여 산 클로린 e6를 형성시키고, NaOH를 첨가하여 염 클로린 e6을 수득하고, 글루카민(N-methyl-d-glucamine)을 첨가하여 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)을 수득하고, PVP를 첨가하여 클로린-PVP을 수득한다. 분말 클로로필 a를 높은 순도로 수득하고 이로부터 클로로필 a에서 형성되어진 높은 순도의 수용성 클로로필 a 유도체, 염 클로린 e6, 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)과 클로린-PVP을 제조할 수 있는 매우 뛰어난 효과를 가진다.
또한, 본 발명은 스피루리나를 이용하여 비교적 간단한 공정으로 대량생산에 적합한 방식으로 분말 클로로필 a 수득과 NaOH를 첨가하여 수용성 클로로필 a 유도체의 합성 및 제조, NaOH를 첨가하여 광민감제 염 클로린 e6의 합성 및 제조, 글루카민(N-methyl-d-glucamine)을 첨가하여 광민감제 클로린-글루카민(N-methyl-d- glucamine)의 합성 및 제조, PVP를 첨가하여 광민감제 클로린-PVP의 합성 및 제조할 수 있는 장점을 가진다.
(c) 본 발명은 산 클로린 e6와 엽산을 헥산-1,6-디아민을 통해 말단 링커를 결합시킴으로써, 산 클로린 e6와 엽산이 결합된 형태의 화합물인 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 를 비교적 간단하고 빠른 시간내에 제조하는 방법을 제공할 수 있는 효과를 가진다.
또한 본 발명은 산 클로린 e6와 엽산이 결합된 형태의 화합물인 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 를 3당량의 글루카민(N-methyl-d-glucamine) 또는 3당량의NaOH를 첨가함으로써 수용성 클로린 e6-엽산 화합물을 제조하는 방법과 다공성 폴리아크릴아마이드 비드를 통한 정제하는 방법을 제공할 수 있는 효과를 가진다.
도 1은 본원발명의 전체 공정을 간략하게 그림으로 나타낸 것이다.
도 2는 클로로필 a의 표준물질(standard) HPLC 측정 결과이다.
도 3은 스피루리나로부터 측정된 클로로필 a의 HPLC 측정 결과이다.
도 4는 에탄올과 아세톤으로 불순물을 제거한 후 측정된 클로로필 a의 HPLC 측정 결과이다.
도 5는 에탄올과 아세톤으로 불순물을 제거한 후 측정된 클로로필 a의 Mass spectrometer 측정 결과이다.
도 6은 클로로필 a 유도체의 HPLC 측정 결과이다.
도 7은 산 클로린 e6의 HPLC 측정 결과이다.
도 8은 산 클로린 e6의 Mass spectrometer 측정 결과이다.
도 9는 산 클로린 e6의 NMR 측정 결과이다.
도 10은 염 클로린 e6의 Mass spectrometer 측정 결과이다.
도 11은 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)의 HPLC 측정 결과이다.
도 12는 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)의 Mass spectrometer 측정 결과이다.
도 13은 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)의 NMR 측정 결과이다.
도 14는 클로린-PVP의 Mass spectrometer 측정 결과이다.
도 15는 클로린-PVP의 NMR 측정 결과이다.
도 16은 클로린-PVP의 HPLC 측정 결과이다.
도 17은 γ-{(tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산의 질량분석스펙트럼(negative mode) 결과이다.
도 18은 γ-{(tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산의 브루커(Bruker) AVANCE-500 NMR 분석 결과이다.
도 19는 γ-(6-아미노헥실)엽산의 질량분석스펙트럼 결과이다. 여기에서 A는 네가티브 모드, B는 포지티브 모드 측정 결과이다.
도 20은 γ-(6-아미노헥실)엽산의 Bruker AVANCE-500 NMR 측정 결과이다.
도 21은 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 의 질량분석스펙트럼(Positive mode) 결과이다.
도 22은 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 의 NMR 측정 결과이다.
도 23는 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 의 브루커(Bruker) AVANCE-500 NMR 측정 결과이다.
도 24는 클로린 e6 결합물의 전자흡수 스펙트럼이다.
도 25는 광원노출이 없는 경우 헬라 세포 내 클로린-글루카민(N-methyl- d-glucamine) 및 클로린-PVP의 농도에 따른 세포독성을 나타낸 그래프이다
도 26은 12.5 J/㎠의 조사량으로 조사한 경우 헬라 세포 내에서클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)과 클로린-PVP의 농도별 광역학적 활성을 나타낸 그래프이다.
도 27은 시간에 따른 헬라 세포 내 염 클로린 e6 및 수용성 클로린 e6-엽산(conjugate)의 축적 비교 그래프이다.
도 28은 외인성 엽산을 첨가한 경우 시간에 따른 헬라 세포 내 염 클로린 e6 및 수용성 클로린 e6-엽산(conjugate)의 축적 비교 그래프이다.
도 29는 광원노출이 없는 경우 헬라 세포 내 염 클로린 e6 및 수용성 클로린 e6-엽산(conjugate)의 농도에 따른 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 30은 염 클로린 e6 및 수용성 클로린 e6-엽산(conjugate)의 농도별 광역학적 활성을 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 출발물질로서 적합한 스피루리나의 선택
분말 클로로필 a를 얻기 위한 출발물질로서 초음파 분쇄 스피루리나 시료를 준비하였다. 이어 초음파 분쇄 스피루리나에 클로로필 a 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는지 확인하였다. 초음파 분쇄 스피루리나 1 g을 취하여 에탄올 10 ml를 첨가하여 30분, 1시간 30분, 3시간, 6시간 및 12시간 동안 교반시킨 후 여과하여 추출용액을 얻었다. 추출용액에 대하여 HPLC(high pressure liquid chromatography) 분석과 분자량 분석(mass spectrometry)을 하였고, Agilent 1200과 Agilent 6320 ion trap LC/MS 시스템(Agilent)을 이용하여 실시하였다. 샘플 주입 볼륨은 10 ㎕, 용매 유속은 1 ㎖/min로 하였다. 전개액으로는 메탄올과 아세토나이트릴이 1:1로 혼합된 것을 이용하였다. 레퍼런스로는, Sigma-Aldrich 회사의 클로로필 a를 사용하였다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, (주)Shandong Binzhou Tianjian Biotechnology Co. Ltd 에서 구입한 스피루리나 시료의 경우, 머무름시간(retention time) 약 16.955 min에서 클로로필 a 에 해당하는 피크가 관찰되었다. 따라서 이후 실시예에서는 (주)Shandong Binzhou Tianjian Biotechnology Co. Ltd 에서 구입한 스피루리나 시료(Arthrospira ( Spirulina ) platensis 와 Arthrospira ( Spirulina ) maxima를 이용하였다.
실시예 2: 스피루리나로부터 분말 클로로필 a의 제조
(주)Shandong Binzhou Tianjian Biotechnology Co. Ltd 에서 구입한 스피루리나(spirulina)에 에탄올을 첨가시키고 교반하여 여과시킨 후 클로로필 a 이외의 성분들을 제거하기 위하여 빛에 노출되지 않게 호일로 잘 감싼 후 24시간 동안 -20℃ 냉동고에 넣어 두었다. 무극성 불순물은 침전되어, 여과하여 클로로필 a 추출액과 분리되었다. 여과된 클로로필 a 추출액을 농축기로 에탄올 용매를 완전히 제거한 후 아세톤으로 용해한 후 클로로필 a 이외의 성분들을 제거하기 위하여 빛에 노출되지 않게 호일로 잘 감싼 후 24시간 동안 -20℃ 냉동고에 넣어 두었다. 극성 불순물은 침전되어, 여과하여 클로로필 a 추출액과 분리되었다. 추출액을 모아서 농축기로 아세톤 용매를 완전히 제거하여 최종적으로 분말 클로로필 a를 수득하였다.
상기 여과된 추출액을 소량 취한 후 HPLC로 클로로필 a 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는지 확인하였다. HPLC는 Agilent 1200 시스템을 이용하여 실시하였고, 샘플 주입 볼륨은 10 ㎕, 용매 유속은 1 ㎖/min로 하였다. 전개액으로는 메탄올과 아세토나이트릴이 1:1로 혼합된 것을 이용하였다. 그 결과, 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 머무름시간(retention time) 약 16.069 min에서 클로로필 a에 해당하는 피크가 관찰되었고, 머무름시간 0-16 min의 불순물들이 상당량 제거되었음을 알 수 있었다. 그리고 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 질량분석 스펙트럼 측정 결과 클로리필 a의 분자량에 해당하는 893이 측정되었다. 또한, HPLC 크로마토그램에서 클로로필 a의 정제도가 89.0 %임을 확인할 수 있었다. 과정 A의 클로로필 a에 대한 수율은 2.5% 이었다. 레퍼런스로는 Sigma-Aldrich 회사의 클로로필 a를 사용하였다.
실시예 3: 클로로필 a로부터 수용성 클로로필 a 유도체 제조
상기 실시예 2의 과정에서 얻은 클로로필 a의 아세톤 용액 500 ㎖에 5 N NaOH 2-3 ㎖을 처리하여 용액의 pH를 13-14이 되도록 조절한 다음 클로로필 a로부터 파이톨 그룹을 제거하는 반응을 위해 3시간 동안 교반하면서 실시하여 화학식 2의 수용성 클로로필 a 유도체를 수득하였다. 이어, 반응결과물에서 아세톤 용매를 여과과정을 통해 완전히 제거 한 후 침전된 수용성 클로로필 a 유도체를 수득하였다. 그런 다음, 소량의 증류수에 침전된 수용성 클로로필 a 유도체를 용해한 다음 5 N HCl을 1-3 ㎖ 첨가하여 pH를 8-9로 조정하였다. 반응이 진행되면서 생성된 부산물 및 여분의 NaOH를 제거하여 수용성 클로로필 a 유도체를 정제하기 위해, 다공성 폴리아크릴아마이드 비드(Bio-gel P-2 gel, Bio-Rad Laboratories)에 상기 pH 8-9의 용액을 통과시켰다. 수용성 클로로필 a 유도체에 해당하는 피크만 모은 후 동결건조 하였다. 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이 머무름시간(retention time) 약 5.065 min에서 클로로필 a 유도체에 해당하는 피크가 관찰되었다. HPLC 크로마토그램에서 수용성 클로로필 a 유도체의 정제도가 93.0%임을 확인할 수 있었다. 수용성 클로로필 a 유도체에 대한 수율은 52.0% 이었다.
실시예 4: 광민감제 산 클로린 e6 의 제조
상기 실시예 3의 클로로필 a 유도체 침전물을 증류수로 용해한 후 여기에 1 N HCl 또는 1N H2SO4를 첨가하여 수용성 클로로필 a 유도체 용액의 pH를 1-2로 조정하고 3시간 동안 교반시켜 클로로필 a 유도체로부터 마그네슘을 제거하여, 광민감제 산 클로린 e6 침전물을 형성시켰다. 여과를 한 후 동결건조기를 이용하여 증류수를 완전히 제거하였다. 상기에서 얻은 산 클로린 e6 침전물을 소량 취한 후, HPLC로 산 클로린 e6 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는지 확인하였다. 그 결과, 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이 머무름 시간 약 5.008 min에서 산 클로린 e6에 해당하는 피크가 관찰되었고, 산 클로린 e6의 정제도는 95% 이었다. 도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이 질량분석 스펙트럼 측정 결과 산 클로린 e6에 해당하는 분자량 597.6 이 측정되었다. 그리고 도 9에서 확인할 수 있는바와 같이 NMR 스펙트럼 결과는 다음과 같이 나타났다: -2.61 (s, 1H, NH), -2.05 (s, 1H, NH), 1.21 (m, 1H), 1.65.-1.72 (m, 7H,), 2.78 (s, 6H), 3.33 (s, 3H), 3.68 (q, J = 6.7 Hz, 2H), 4.55 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.60 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 18.9 Hz, 1H), 5.57 (d, J = 18.8 Hz, 1H), 6.15 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 6.45 (d, J = 18.0 Hz, 1H), 8.35 (dd, J = 17.8, 11.6 Hz, 1H), 9.10 (s, 1H), 9.62 (s, 1H), 9.75 (s, 1H)
실시예 5: 광민감제 염 클로린 e6 의 제조
상기 실시예 4에서 여과하여 얻어진 산 클로린 e6을 분리한 후 동결건조기로 증류수를 완전히 제거하였다. 산 클로린 e6에 소량의 증류수를 넣어주고, 1 N NaOH 또는 1 N KOH를 미량 첨가하여 pH 8-9로 맞춘 후, 3시간 동안 교반시켜주었다. 여과한 후 여분의 NaOH 또는 KOH 제거를 위해 다공성 폴리아크릴아마이드 비드(Bio-gelP-2 gel, Bio-Rad Laboratories)를 통과시켜주고, 염 클로린 e6에 해당하는 피크만 모아서 동결건조 시킨 후 염 클로린 e6를 수득하였다. 도 10에서 확인할 수 있는바와 같이 , 질량분석 스펙트럼 측정 결과 염 클로린 e6에 해당하는 분자량 641이 측정 되었다. HPLC 크로마토그램에서 염 클로린 e6의 정제도가 97.0%임을 확인할 수 있었다. 염 클로린 e6에 대한 수율은 90.0% 이었다.
실시예 6: 광민감제 클로린 - 글루카민(N-methyl-d-glucamine)의 제조
여과하여 얻어진 산 클로린 e6를 분리한 후 동결건조기로 미량의 수분을 완전히 제거하였다. 동결건조 완료하여 미량의 수분이 완전히 제거된 산 클로린 e6 1.0 g에 증류수를 10 ml을 채워준 후 클로린 1 당량(eq) 대비 2 당량(2eq)의 0.7 g 글루카민(N-methyl-d-glucamine, Sigma-Aldrich)을 넣어주고 1시간 동안 교반시켰다. 물에 용해되지 않는 산 클로린 e6는 2 당량의 글루카민(N-methyl-d-glucamine)에 의해 증류수로 용해되어 들어갔다. 여과한 후 여분의 글루카민(N-methyl-d-glucamine) 제거를 위해 다공성 폴리아크릴아마이드 비드(Bio-gel P-2 gel, Bio-Rad Laboratories)를 통과시켜주고, 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)에 해당하는 피크만 모아서 동결건조시켜 증류수를 완전히 제거하여 최종 산물인 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)을 수득한다. HPLC 크로마토그램에서 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)의 정제도가 98.0%임을 확인할 수 있었다. 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)에 대한 수율은 87.0% 이었다.
도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이 머무름 시간 약 8.409 분에서 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)에 해당하는 피크가 관찰되었다. 도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이 질량분석 스펙트럼 측정 결과 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)에 해당하는 분자량 995 가 측정되었다. 그리고 도 13에서 확인할 수 있는바와 같이 NMR 스펙트럼 결과는 다음과 같이 나타났다: -2.56 (s, 1H, NH), -1.99 (s, 1H, NH), 1.56-1.48 (m, 4H), 2.81-2.76 (m, 5H), 2.89 (td, J = 15.9, 7.9, 7.9 Hz, 1H), 3.42 (s, 3H), 3.49 (s, 3H), 3.51 (s, 3H), 3.84 (q, J = 6.7 Hz, 2H, 8(1)), 4.59 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.87 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 5.14 (d, J = 18.9 Hz, 1H), 5.62 (d, J = 18.8 Hz, 1H), 6.17 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 6.47 (d, J = 18.0 Hz, 1H), 8.36 (dd, J = 17.8, 11.6 Hz, 1H), 9.14 (s, 1H), 9.69 (s, 1H), 9.70 (s, 1H)
실시예 7: 광민감제 클로린 - PVP 의 제조
상기 실시예 5에서 수득된 염 클로린 e6에 소량의 증류수를 넣어주고, 염 클로린 e6 1 g 에 폴리비닐필로리딘{polyvinylpyrrolidone(PVP), Sigma-Aldrich} 1당량을 정확히 넣어주고, 3시간 동안 교반시켰다. 여과하여 여분의 PVP 제거를 위해 다공성 폴리아크릴아마이드 비드(Bio-gel P-2 gel, Bio-Rad Laboratories)를 통과시켜주고, 클로린-PVP에 해당하는 피크만 모아서 동결건조기를 이용하여 수분을 완전히 제거하고 클로린-PVP을 수득하였다. HPLC 크로마토그램에서 클로린-PVP의 정제도가 98.0%임을 확인할 수 있었다. 클로린-PVP에 대한 수율은 80.0% 이었다.
도 16에서 확인할 수 있는 바와 같이 머무름 시간 약 3.25 분에서 클로린-PVP에 해당하는 피크가 관찰되었다. 도 14에서 확인할 수 있는 바와 같이 질량분석 스펙트럼 측정 결과 클로린-PVP에 해당하는 분자량 597(positive mode)과 595(negative mode) 가 측정되었다. 그리고 도 15에서 확인할 수 있는바와 같이 NMR 스펙트럼 결과는 다음과 같이 나타났다: -1.98 (s, 1H, NH), -1.71 (s, 1H, NH), 1.56-1.48 (m, 1H, 17(1)), 1.61 (t, J = 6.7 Hz, 3H, 8(2)) 1.63 (d, J = 7.2 Hz, 3H, 18(1)), 2.15-2.06 (m, 1H17(1)), 2.32-2.22 (m, 1H, 17(2)), 2.60 (td, J = 15.9, 7.9, 7.9 Hz, 1H, 17(2)), 3.21 (s, 3H, 7(1)), 3.45 (s, 3H, 2(1)), 3.54 (s, 3H, 12(1)), 3.71 (q, J = 6.7 Hz, 2H, 8(1)), 4.43 (d, J = 10.0 Hz, 1H, 17), 4.58 (q, J = 7.2 Hz, 1H, 18), 5.29 (d, J = 18.9 Hz, 1H, 15(1)), 5.38 (d, J = 18.8 Hz, 1H, 15(1)), 6.09 (d, J = 11.6 Hz, 1H, 3(2)), 6.36 (d, J = 18.0 Hz, 1H, 3(2)), 8.20 (dd, J = 17.8, 11.6 Hz, 1H, 3(1)), 9.06 (s, 1H, 20), 9.61 (s, 1H, 5), 9.70 (s, 1H, 10)
실시예 8: [γ-(6- 아미노헥실 )엽산]- 클로린 e6 의 제조
실시예 8-1: γ-{( tert -부틸-N-(6- 아미노헥실 )] 카르바메이트 }엽산의 제조
상온, 질소 대기 하에서, 무수 디메틸설폭사이드{(dimethylsulfoxide)DMSO}와 피리딘 내 엽산(1615 mg, 3.66 mmol, Sigma-Aldrich) 용액에 [tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트(= N-boc-1,6- hexanediamine, Sigma-Aldrich) (871 ㎎, 4.03mmol) 및 디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(1887 ㎎, 9.15 mmol) (또는 1,1'-carbonyldiimidazole, Sigma-Aldrich)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 상온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과한 후, 0℃로 냉각된 무수 에테르의 강력하게 교반되는 용액 안으로 상기 여과액을 천천히 부었다. 노란색의 침전물을 여과하여 모은 다음, 에테르로 씻어 DMSO 잔류물을 제거하고 진공 상태에서 건조시켰다. 2132 ㎎을 수득하였고, 91.0%의 수율을 나타냈다. γ-{(tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산은 도 17에서 확인할 수 있는 바와 같이 질량분석 스펙트럼 측정 결과 분자량은 638.5에 해당하는 분자량 640.0(positive mode) 으로 나타났다. 도 18에서 확인할 수 있는바와 같이 NMR 스펙트럼 결과는 다음과 같이 나타났다: 1.90-1.85 (m, 1H, β-glutamic), 2.10-1.99 (m, 1H, β-glutamic), 2.31 (t, J = 7.5, 7.5 Hz, 2H, α-glutamic), 4.33 (ddd, J = 9.8, 7.7, 4.9 Hz, 1H), 4.48 (d, J = 6.0 Hz, 2H, CH2N), 6.64 (d, J = 8.8 Hz, 2H, benzoyl), 6.94 (t, J = 6.0, Hz, 1H, CH2NH), 7.65 (d, J = 8.8 Hz, 2H, benzoyl), 8.13 (d, J = 7.7 Hz, 1H, CHNH), 8.65 (s, 1H, pteridine), 11.44 (br s, 1H)
실시예 8-2: γ-(6- 아미노헥실 )엽산의 제조
상기 실시예 8-1-a 에서 제조되어진 γ-{(tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산(2232 ㎎, 3.49 mmol, Sigma-Aldrich)을 트리플루오로-아세트산(TFA, Sigma-Aldrich)으로 처리하고, 대기 온도에서 2시간 동안 교반한 다음 TFA를 진공 하에서 증발시켰다. 잔류물을 무수 DMF(Sigma-Aldrich)에 넣은 다음, 피리딘(Sigma-Aldrich치)을 노란색 침전물이 형성될 때까지 방울방울 넣어주었다. 노란색의 침전물을 여과하여 모은 다음 에테르로 세척하고 진공 하에서 건조시켜 γ-(6-아미노헥실)엽산을 제조하였다. γ-{(tert-부틸-N-(6-아미노헥실)]카르바메이트}엽산을 출발물질로 하여 제조된 γ-(6-아미노헥실)엽산은 1652 mg을 수득하였고, 수율은 87.9%를 나타내었다.
도 19에서 확인할 수 있는 바와 같이 상기 γ-(6-아미노헥실)엽산의 질량분석스펙트럼 결과 분자량은 Negative mode에서 538.79, Positive mode 540.8 으로 나타났다. 도 20에서 확인할 수 있는 바와 같이 NMR 스펙트럼 결과는 다음과 같이 나타났다: 8.64 (s, 1H pteridine), 7.92 (d, J =8 Hz, 1H, NH-glutamic), 7.82 (brt, J =4 Hz 1H, NH), 7.65 (d, J = 9 Hz, 2H, benzoyl), 6.93 (br t, J =6 Hz 1H, NH), 6.74 (br t, J =6 Hz 1H, NH), 6.63 (d, J = 9 Hz, 2H, benzoyl), 4.49 (d, J= 6 Hz, 2H, NCH2Ar), 4.36-4.23 (m, 1H, glutamic), 3.01 (m, 2H, NCH2-hexyl), 2.88 (m, 2H, BOCNCH2-hexyl), 2.29-2.15 (m, 2H, glutamic), 1.98-1.82 (m, 2H, glutamic), 1.41-1.16 (m, 8H hexyl), 1.36 (s, 9H, tBu)
실시예 8-3: γ-(6- 아미노헥실 )엽산- 클로린 e6 의 제조
질소 대기 하의 빛이 차단된 환경에서, 상기 실시예 8-1-b에서 제조한 γ-(6-아미노헥실)엽산 용액에 산 클로린 e6를 첨가하여 실온에서 12-48 시간 동안 교반한 다음, 0℃로 냉각된 에테르의 강력하게 교반되는 용액 안으로 상기 혼합물을 천천히 부었다. 이후 어두운 적색의 침전물을 여과하여 모은 다음, 에테르와 디클로로메탄(Dichlorlmethane, DCM, Sigma-Aldrich)으로 세척한 후 진공하에서 건조시켜 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6을 제조하였다. 도 21에서 확인할 수 있는 바와 같이 질량분석 스펙트럼 측정 결과 분자량은 결과 분자량은 1116 (negative mode)으로 나타났다. 도 22에서 확인할 수 있는바와 같이 NMR 스펙트럼 결과는 다음과 같이 나타났다: 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 12.2 (s, 1H, COOH), 11.68 (s, 1H, COOH), 10.37(s, 1H, NH), 9.78(s, 1H), 9.64(s, 1H), 9.15(s, 1H), 8.88(s, 1H, NH), 8.8(s, 1H), 8.20(q,1H), 7.56(s, 2H), 7.15(s, 2H), 6.89(s, 2H, NH2), 6.38(d, 1H), 6.15(d, 1H), 5.80(s, 1H), 5.40(m, 1H), 4.59(m, 2H) , 4.22(t.2H), 4.02(s, 2H), 3.59(s, 3H), 3.43(s, 3H), 3.20(s, 3H), 3.7(q, 1H), 2.65(m, 1H), 2.08-2.41(m, 8H), 1.89(t, 2H), 1.52-1.78(m, 12H), 1.28(m, 4H), 1.08-1.10(m, 7H), -1.72(s, 1H, NH), -1.96(s, 1H, NH)
실시예 9: 수용성 클로린 e6 -엽산 결합 화합물의 제조
상기 실시예 8-1-c에서 제조한 [γ-(6-아미노헥실)엽산]-클로린 e6 의 정확한 무게를 측정한 뒤 소량의 증류수를 부어주고 산 클로린 e6-엽산 화합물 1 당량에 3 당량의 글루카민(N-methyl-d-glucamine) 또는 NaOH를 가하여 3시간 동안 교반하여 주었다. 증류수에 용해되지 않는 산 클로린 e6-엽산 화합물은 3 당량의 글루카민(N-methyl-d-glucamine)또는 NaOH 의해 증류수에 용해되어 들어갔다. 반응이 끝난 후 여분의 글루카민(N-methyl-d-glucamine) 또는 NaOH를 제거하기 위해 다공성 폴리아크릴아마이드 비드(Bio-gel P-2 gel, Bio-Rad Laboratories)에 통과시켜 주고, 수용성 클로린 e6-엽산 화합물에 해당하는 피크만 모아서 동결 건조하였다.
도 23에서 확인할 수 있는바와 같이 NMR 스펙트럼 결과는 다음과 같이 나타났다: -2.13(brs, 1H, NH), -1.78(brs, 1H, NH), 1.16-1.73(m, 9H, 17(1), hexyl), 1.61-1.63(m, 6H, 8(2), 18(1)), 1.76-2.02(m, 2H, glutamic), 2.08-2.23(m, 4H, 17(2), 17(1), glutamic), 2.68-2.74(m, 1H, 17(2)), 2.86-3.04(m, 4H, NCH, hexyl), 3.23(s, 3H, 2(1)), 3.49(s, 3H,2(1)), 3.51(s, 3H, 12(1)), 3.79(m, 2H, 8(1)), 4.25-4.31(m, 1H, glutamic), 4.43(m, 1H, 17), 4.44(m, 2H, NCH, Ar), 4.54(m, 1H, 18), 5.07(d, J=17.5Hz, 1H, 15(1)), 5.33(m, 1H, 15(1)), 6.14(d, J=11.3Hz, 1H, 3(2)), 6.42(d, J=18.1Hz, 1H, 3(2)), 6.57(d, J=8.6Hz, 2H, benzoyl), 6.88(m, 1H, NHCH, Ar), 7.60(d, J=7.5Hz, 2H, BENZOYL), 7.75(m, 1H, HN-hexyl), 7.90(m, 1H, HN-hexyl), 8.28(dd, J=17.7, 11.7Hz, 1H, 3(1)), 8.60(s, 1H, pteridine), 9.05(s, 1H, 20), 9.69(s, 1H, 5), 9.72(s, 1H, 10),
11.38(s, 1H, OH)
실시예 10: 광민감제들의 시험관내 생물학적 효과 조사
실시예 10-1: 본 발명 클로린 - 글루카민(N-methyl-d-glucamine)과 클로린 - PVP의 시험관 내 생물학적 효과 조사
10-1.1 세포독성( 항증식성 분석)
세포의 증식 강도, 광민감제의 농도, 및 광학적 파워를 고려하여 세포 독성을 조사하였다. 이를 위해 단일층의 세포를 담은 3개의 75㎠ 세포 배양 플라스크가 사용되었다. 세포로는 자궁경부암 세포인 HeLa 종양 세포(ATCC에서 구입)의 단일층 배양물을 사용하였다.
HeLa 종양 세포의 배양액은 10% 우태아 혈청(Fetal Bovine Serum, Hyclone) 및 100 Units/㎖의 페니실린과 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신의 혼합액(Hyclone)을 첨가한 영양배지 RPMI- 1640 배지(Sigma-Aldrich) 내에서 성장시켰다.
플라스크 내에 세포 배양물을 접종(영양 배지 2.0 ㎖ 당 100,000 cells) 한 후 4일째에 광민감제를 최종농도가 각각 1, 2.5, 5.0, 7.5 및 10.0 mcg/㎖씩 첨가하였다.
플라스크는 빛을 차단하기 위해 광-보호 커버로 싼 후 37℃에서 1 시간 동안 배양시켰다. 세포를 Hank's 용액(Sigma-Aldrich)을 이용하여 4회 세척하였다. 신선한 영양 배지 2.0 ㎖를 첨가하고 20-24 시간 후에 유효한 세포 단일층을 트립신 용액(GIBCO)으로 분산시키고, 헤마토사이토미터(H-1401, MARIENFELD)를 이용하여 살아있는 종양세포를 계수하였다.
도 25은 24시간 동안 배양 후, HeLa 세포의 수를 대조구에 대한 비율을 %로 나타내어 보여주고 있다. 세포 생존율은 약 85%가 넘는 생존율을 보이는 실험결과들을 통해 HeLa와 광활성 화합물인 클로린-글루카민(N-methyl-d-glucamine)과 클로린-PVP을 배양하더라도 광원 노출이 없는 경우에는 세포독성을 유발하지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.(도 25).
10-1.2 클로린 - 글루카민(N-methyl-d-glucamine)과 클로린 - PVP 의 광독성 (광역학적인 활성) 분석
광민감제들의 광역학 효과를 조사하기 위해, 자궁경부암 세포인 HeLa 세포를 96 웰 플레이트(BD Falcon)에 이식 후 20~24시간 후에, 영양배지에 조사하고자 하는 광민감제 용액을 최종 농도가 2.5, 5.0 또는 10 mcg/㎖가 되도록 첨가하였다. 플라스크는 빛을 차단하기 위해 광-보호 커버로 싼 후 37℃에서 3 시간 동안 배양시켰다. 그 다음 Hank's 용액으로 세척한 후, 레이저 의료기기 "LD 680-2000"(파장 670-690 nm, LATUS 2.662.6, LATUS)를 이용하여 12.5 J/㎠(400㎽)의 조사량으로 조사되었다. 1시간 후에 세포 생존율을 측정하기 위해, 세포 증식 및 독성을 측정하는 방법인 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide, Sigma-Aldrich) 어쎄이를 시행하였다. MTT 어쎄이 시행 후, 마이크로 플레이트 리더기(ELx808, Bio-Tek)를 이용하여 샘플의 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 MTT 어쎄이을 통해 측정된 결과 값을 대조구에 대한 % 비율로 나타내었다.
도 26은 3시간 동안 광민감제로 배양시키고 12.5 J/㎠의 조사량으로 광노출을 추가로 시킨 다음 HeLa 세포의 증식 억제 정도를 대조구에 대한 비율를 %로 나타낸 것이다.
광역학적 활성에 대한 분석으로 이의 높은 효율성을 확인할 수 있었다. 2.5 mcg/㎖의 농도에서 약 50%, 10mcg/㎖에선 약 25%까지 HeLa 세포의 증식을 억제하였다(도 26).
실시예 10-2: 수용성 클로린 e6 -엽산 화합물의 시험관 내 생물학적 효과 조사
10-2.1 수용성 클로린 e6 -엽산 화합물의 세포내 축적 및 경쟁 분석
광활성 화합물의 세포내 축적과 표적화된 운반은, 엽산수용체를 과발현하는 다수의 종양세포 타입 중 하나인 HeLa 세포를 이용하여 조사하였다.
세포를 3일간 엽산이 제거된 RPMI-1640 배지에서 배양하여 Hank's 용액/RPMI-1640 배지 (9/1)에 이식했다. 3시간 후에 트립신 용액을 이용하여 기질로부터 세포를 수집하여 Hank's 용액에 옮겼다(105 cells/㎖). 세포 현탁액에 클로린 e6-엽산 결합물을 2×10-7 M/l의 농도로 첨가하고, 37℃에서 배양하였다. 1, 5, 10, 15, 24 시간 후에, 시료를 원심분리하고, 침전물을 차가운 Hank's 용액 내에서 세척한 후, 상기 침전물을 Hank's 용액에 초기 현탁액 내 세포 농도까지 넣었다. 얻어진 시료 내의 염 클로린 e6와 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 상대적 농도는 λσ=40 5 nm, λper=665 nm에서의 현탁액의 형광 세기로 측정하였다.
표 1에 HeLa 세포 내의 염 클로린 e6와 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 농도(상대적인 값 units/104 cl.)를 시간에 따라 측정한 값을 나타내었다.
배양시간(hours) 염 클로린 e6 수용성 클로린 e6 -엽산 화합물
1 0.75 0.42
3 1.22 1.55
6 1.53 2.05
12 1.79 5.45
18 0.78 15.2
24 0.42 17.0
상기 표 1을 통해, 염 클로린 e6와 수용성 클로린 e6-엽산 화합물 모두 세포에 축적됨을 알 수 있었다. 그러나, 축적의 동역학은 다르게 나타났다. 대부분의 염 클로린 e6가 6시간 이내에 세포에 축적되는 반면에, 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 축적은 18시간에 걸쳐 선형적으로 증가하였다.
3시간 배양한 후에, 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 축적 수치가 염 클로린 e6의 축적 수치보다 뚜렷하게 높게 나타났다(도 27).
24시간 노출한 후에 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 축적 수치는 염 클로린 e6의 축적 수치보다 평균적으로 10배 가량 높게 나타났다. 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 축적 수치가 24시간에 걸쳐 지속적으로 증가하였는데, 이는 비특이적인 세포 흡수 보다는 수용체-매개의 엔도시토시스를 통한 활발한 운반이 일어남을 시사하는 것이다.
외인성 엽산의 존재가 염 클로린 e6 와 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 HeLa 세포내의 축적에 미치는 영향을 조사하기 위해서, 엽산을 염 클로린 e6 와 수용성 클로린 e6-엽산 화합물 첨가 전에 4 μM/l의 농도로 세포 현탁액에 첨가한 후에 염 클로린 e6와 수용성 클로린 e6-엽산 화합물과 함께 24시간 동안 배양하였다. 이후 시료를 원심분리하고, 상층액을 수거하고 침전물을 차가운 Hank's 용액 내에서 다시 세척하였다. 수득된 두번째 침전물을 다시 Hank's 용액에 넣었다.
형광 세기를 측정하여 HeLa 세포 내 염 클로린 e6과 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 축적량을 비교하였다.
24시간 노출 후에, 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 축적량이 염 클로린 e6의 축적량보다 많았다. 도 28은 4 μM/l의 엽산이 HeLa 세포에서의 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 축적을 상당량 감소시켰음을 보여준다(p < 0.05). 반면에 엽산의 존재는 염 클로린 e6의 축적량에는 영향을 미치지 않았다. 사실상, 클로린 e6의 세포 내 축적은 배양 매질 내 길항적인 농도의 엽산의 존재에 의해 영향을 받지 않았다. 그러나, 길항적인 엽산의 존재 하에서 수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 축적이 감소하더라도, 여전히 염 클로린 e6에 비해서는 우월한 것으로 나타났다. 이는 엽산의 존재가 또한 비특이적인 축적을 증가시킬 수 있음을 제시하는 것이다.
10-2.2 세포독성( 항증식성 분석)
세포의 증식 강도, 광민감제의 농도, 및 광학적 파워를 고려하여 세포 독성을 조사하였다. 이를 위해 단일층의 세포를 담은 3개의 75 ㎠ 세포 배양 플라스크가 사용되었다. 세포로는 자궁경부암 세포인 HeLa종양 세포의 단일층 배양물을 사용하였다.
HeLa 종양 세포의 배양액은 10% 우태아 혈청 및 100 Units/㎖의 페니실린과 100 ㎍/㎖l의 스트렙토마이신을 첨가한 영양배지 RPMI-1640 배지 내에서 성장시켰다. 플라스크 내에 세포 배양물을 접종(영양 배지 2.0 ㎖ 당 100,000 cells) 한 후 4일째에 광민감제를 각각 0, 25, 50, 75, 100, 125 ㎍/㎖씩 첨가하였다.
플라스크는 빛을 차단하기 위해 광-보호 커버로 싼 후, 1시간 동안 37.5 ℃에서 배양하였다. 세포를 Hank's 용액을 이용하여 4회 세척하였다. 신선한 영양 배지 2.0 ㎖를 첨가하고, 20-24 시간 후에 헤마토사이토미터를 이용하여 종양세포를 계수하였다.
표 2는 24시간 동안 배양 후 HeLa세포의 수를 대조구에 대한 비율을 %값으로 보여주고 있다.
광민감제 농도(㎍/㎖) 염 클로린 e6 수용성 클로린 e6-엽산 화합물
0 100 100
1 102.5 104.5
5 99.1 100.2
10 95.5 97.4
25 92.0 95.6
50 88.8 91.9
100 85.4 87.8
상기 표 2를 통해 알 수 있듯이, 약 90%의 생존율을 보이는 실험결과을 통해 HeLa 세포와 광활성 화합물인 염 클로린 e6과 수용성 클로린 e6-엽산 화합물을 24시간 동안 배양하더라도 광원노출이 없는 경우에는 세포독성을 유발하지 않는다는 것을 확인할 수 있었다(도 29). 또한, 엽산을 첨가하더라도 클로린 e6에서 세포독성이 보이지 않는 성질이 변형되지 않았다.
10-2.3 염 클로린 e6 와 수용성 클로린 e6 -엽산 화합물의 광독성 (광역학적 활성) 분석
HeLa 세포 배양물에 대한 광민감제들의 광역학 효과를 조사하기 위해, 엽산이 제거된 배양액에 이식한 후 3일째에 되었을 때, 영양배지의 조사하고자 하는 광민감제 용액을 최종 농도가 0.1, 0.5, 1.0, 5.0 또는 10 ㎍/㎖가 되도록 첨가하였다. 플라스크들을 광 보호 커버로 싸고 37℃에서 3시간 동안 배양시켰다. 그 다음 Hank's 용액으로 세척한 후, 레이저 의료기기 "LD 680-2000"(파장 670-690 nm)를 이용하여 3.3 J/㎠의 조사량으로 조사되었다. 1시간 후, 세포 생존율을 측정하기 위해, 세포 증식 및 독성을 측정하는 방법인 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol -2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 어쎄이를 시행하였다. MTT 어쎄이 시행 후, 마이크로 플레이트 리더기를 이용하여 샘플의 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 MTT 어쎄이를 통해 측정된 결과값을 대조구에 대한 % 비율로 나타내었다. 표 3은 3 시간 동안 광민감제로 배양시키고 3.3 J/㎠의 조사량으로 광노출을 추가로 시킨 다음 HeLa 세포의 수를 대조구에 대한 비율을 %로 나타낸 것이다.
광민감제 농도(㎍/㎖) 염 클로린 e6 수용성 클로린 e6-엽산 화합물
0.1 88.0 65.1
0.5 82.0 40.3
1.0 64.1 10.6
5.0 25 0.3
10.0 5.8 -
광역학적 활성에 대한 분석으로 이의 높은 효율성을 확인할 수 있었다. 5-10 mcg/㎖의 농도에서 수용성 클로린 e6-엽산 화합물은 HeLa 세포의 증식을 완전히 억제하였다.
다른 실험에서, 세포들은 광민감제와 함께 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 동일한 레이저기기인 "LD 680-2000"(파장 670-690 ㎚)를 이용하여 1.5-15 J/㎠의 조사량으로 조사되었다.
도 30은 농도에 다른 광민감제의 광독성을 실험한 것으로, 수용성 클로린 e6-엽산 화합물이 염 클로린 e6에 비해 낮은 농도에서도 광독성을 나타냄을 보여주었다.
본 실험은 클로린 e6의 광생물학적 활성이 엽산결합을 통해 향상되었음을 보여주었다. 따라서, 엽산 수용체를 과발현하는 HeLa 세포를 이용하여 24시간 동안 배양한 후에는 수용성 클로린 e6-엽산 화합물이 염 클로린 e6보다 평균적으로 10배 정도 많이 축적되었다.
종양세포들은 정상세포와 비교해서 과발현하는 수용체의 수와 유형이 상당히 다르게 나타난다. 특정 수용체의 과발현 현상이 광민감제의 종양선택적 운반에 종종 이용된다. 엽산수용체를 과발현하는 HeLa 세포의 경우 엽산 표적 리간드(folate-targeting ligand)를 이용하게 된다.
수용성 클로린 e6-엽산 화합물의 HeLa 세포내의 축적은 엽산 특이적인 것이며 비결합 클로린 e6보다 훨씬 더 크게 이루어진다고 결론 내릴 수 있다.

Claims (4)

  1. 화학식 1
    Figure 112012010052432-pat00010

    (a) 상기 화학식 1의 클로로필 a의 아세톤 용액에 강염기를 처리하여 클로로필 a로부터 파이톨(phytol)을 제거하여 하기 화학식 2의 수용성 클로로필 a 유도체를 수득하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 결과물에 강산을 처리하여 pH를 6-9로 조절하여 하기 화학식 2의 수용성 클로로필 a 유도체를 제조하는 단계;

    화학식 2
    Figure 112012010052432-pat00011


    (c) 상기 (b) 단계의 화학식 2의 수용성 클로로필 a 유도체의 용액에 강산을 처리하여 하기 화학식 3의 산 클로린 e6를 제조하는 단계; 및
    화학식 3
    Figure 112012010052432-pat00012

    (d) 상기 (c) 단계의 화학식 3의 산 클로린 e6의 용액에 글루카민(N-methyl-d-glucamine)을 처리하는 단계를 포함하는 하기 화학식 5의 클로린 e6와 글루카민의 이온결합으로 연결된 염의 제조방법.
    화학식 5
    Figure 112012010052432-pat00013

  2. 제 1 항에 있어서, 상기 글루카민은 산 클로린 e6 1당량(eq)에 2당량(eq)을 첨가하는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 5의 클로린 e6와 글루카민의 이온결합으로 연결된 염의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 제1항의 결과물을 다공성 폴리아크릴아마이드 비드에 통과시켜 정제하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화학식 5 의 클로린 e6와 글루카민의 이온결합으로 연결된 염의 제조방법.
  4. 삭제
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WO2019032683A3 (en) * 2017-08-08 2019-03-21 Board Of Trustees Of Michigan State University LIGHT-EMITTING ORGANIC SALTS FOR ENHANCED PHOTODYNAMIC THERAPY AND IMAGING

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