CN113024400A - 一种秋水仙碱衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种秋水仙碱衍生物及其制备方法和应用，属于医药技术领域；本发明制备一种低毒的秋水仙碱衍生物，然后将其与一种磷脂复合制备磷脂复合物，并采用一种唾液酸衍生物修饰于表面赋予该磷脂复合物靶向性，用于制备一种抗肿瘤的更为安全有效的秋水仙碱衍生物注射剂。本发明将唾液酸衍生物修饰在秋水仙碱衍生物与磷脂复合的磷脂复合物表面，既可以稳定磷脂复合物，又可以赋予纳米载体中性粒细胞靶向性，使所述的秋水仙碱衍生物用于制备治疗肿瘤的主动靶向纳米剂型药物。

Description

一种秋水仙碱衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种秋水仙碱衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
中性粒细胞是白细胞中最丰富的种群，既往的观点认为中性粒细胞是人体抵御病原的第一道防线，是维持人体正常免疫功能所必需的炎症细胞。但近年来的研究结果却颠覆了对中性粒细胞的传统认知：中性粒细胞在肿瘤背景下会表现出明确的免疫抑制功能。通过临床研究发现，外周血中性粒细胞水平较高的胃癌患者对化疗的反应较差，与中性粒细胞水平较低的患者相比，其总生存时间平均缩短8个月(Murakami Y,Saito H,ShimizuS,et al.Neutrophil-tolymphocyte ratio as a prognostic indicator in patientswith unresectable gastric cancer[J].AnticancerRes,2019,39(5):2583-2589.)。文献报道了14种癌症包括3000个实体瘤组织中免疫细胞群(包括中性粒细胞)的密度及患者生存期，发现肿瘤内高密度中性粒细胞浸润是最不利的预后相关细胞群。中性粒细胞的增多导致癌症患者不良预后的重要原因是因为它们可以抑制抗肿瘤免疫应答(Gentles AJ,Newman AM,Liu CL,et al.The prognostic landscape of genes and infiltratingimmune cells across human cancers[J].NatMed,2015,21(8):938-945.)。
首先，在肿瘤患者中，肿瘤细胞及基质细胞持续分泌粒细胞-集落刺激因子、IL-17等细胞因子，这种病理情况下激活的中性粒细胞进入循环，会发生脱颗粒现象，释放精氨酸酶，它可以将L-精氨酸转化为L-鸟氨酸和尿素，从而在肿瘤微环境中消耗精氨酸(PilatovaK,Bencsikova B,Demlova R,et al.Myeloid-derived suppressor cells(MDSCs)inpatients with solid tumors:considerations for granulocyte colony-stimulatingfactor treatment[J].Cancer Immunol Immunother,2018,67(12):1919-1929.Zhuang Y,Peng LS,Zhao YL,et al.CD8+T cells that produce interleukin-17 regulatemyeloid-derived suppressor cells and are associated with survival time ofpatients with gastriccancer[J].Gastroenterology,2012,143(4):951-962,e958.Romano A,Parrinello NL,La Cava P,et al.PMN-MDSC and arginase areincreased in myeloma and may contribute to resistance to therapy[J].ExpertRev Mol Diagn,2018,18(7):675-683.)。而精氨酸是T细胞活化所必须的氨基酸，精氨酸的缺乏导致T细胞抗原受体无法正常形成，外周血及淋巴系统中的T细胞均失去识别肿瘤抗原信号的功能。其次，中性粒细胞浸润到肿瘤组织后，可以表达PD-L1与T细胞上PD-1结合，抑制T细胞的增殖和γ-干扰素、IL-2等细胞因子产生，导致T细胞功能丧失(Noman MZ,Desantis G,Janji B,et al.PD-L1isa novel direct target of HIF-1α,and itsblockade under hypoxia enhanced MDSC-mediated Tcell activation[J].J Exp Med,2014,211(5):781-790.)；可以在IL-17a的作用下激JAK2/STAT3通路促使上皮-间质转化发生，激活的中性粒细胞会释放丝氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶，引起基底膜降解(Jaaks P,Bernasconi M.The proprotein convertase furin in tumour progression[J].Int JCancer,2017,141(4):654-663.)，释放中性粒细胞弹性蛋白酶降解E-钙粘蛋白，降低肿瘤细胞黏附作用(Bruser L,Bogdan S.Adherens junctions on the movemembranetrafficking of E-cadherin[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2017,9(3).)，使肿瘤细胞更容易脱离原来的部位发生迁移和侵袭。
为了避免中性粒细胞在肿瘤进展中的不利影响，已经探索出许多降低其活性的方法，部分研究已进入临床评估。如CXCR1和CXCR2抑制剂目前处于临床试验阶段，其可以抑制骨髓和循环中性粒细胞向肿瘤组织的迁移，减少肿瘤微环境中性粒细胞密度，解除免疫抑制，并且已经证明在乳腺癌、肾癌及头颈部肿瘤中均有效(DufiesM,GrytsaiO,RoncoC,etal.New CXCR1/CXCR2 inhibitor srepresent an effective treatment for kidney orhead and neck cancers sensitive or refractory to reference treatments[J].Theranostics,2019,9(18):5332-5346.)。另外，秋水仙碱(Colchicine，COLC)也具有抑制中性粒细胞活性的能力，可以大大降低中性粒细胞的趋化、粘附能力。但由于秋水仙碱毒性较强，极易引发强烈的副作用，现已不适用于癌症治疗。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型秋水仙碱衍生物及其制备方法，同时还提供所述秋水仙碱衍生物用于制备治疗肿瘤药物中的应用。具体的，制备一种低毒的秋水仙碱衍生物，然后将其与一种磷脂复合制备磷脂复合物(用以降低药物毒性)，并采用一种唾液酸衍生物修饰于表面赋予该磷脂复合物靶向性，用于制备一种抗肿瘤的更为安全有效的秋水仙碱衍生物注射剂。
所述磷脂复合物(Phospholipid Complex)，是指化合物与磷脂以一定化学计量比关系结合而形成的复合物。目前，磷脂复合物的形成机理尚不明确，曾认为是化合物分子与磷脂分子通过化学键形成新化合物，但多数研究者们认为形成磷脂复合物的化合物分子之间是以氢键和范德华力相互作用。
所述的唾液酸(Sialic acid，SA)，是一系列含9个碳原子的羧基化单糖酰化衍生物，主要以糖脂或者糖蛋白的形式广泛分布于哺乳动物组织中，是脊椎动物细胞表面最重要的单糖。SA类物质是L-选择素(L-selectin)的重要配体。相关研究成果证明，所有的血液中性粒细胞表面上均有L-selectin(THEIN K Z,MYINT Z W,TUN A M,et al.CancerAssociated Thrombosis:Focus on Prevention and Treatment of VenousThromboembolism[J].Cardiovascular&Hematological Agents in MedicinalChemistry,2016,14(2):101-12.)，即使是衰老的中性粒细胞，也表达L-selectin，只是数量有所下降(DACHUAN Z,GRACE C,DEEPA M,et al.Neutrophil ageing is regulated bythe microbiome[J].Nature,2015,525(7570):528-32.ZARBOCK A,LEY K.Mechanisms andconsequences of neutrophil interaction with the endothelium[J].AmericanJournal of Pathology,2008,172(1):1-7.)。炎症条件下，活化的中性粒细胞会通过L-selectin对血管内皮细胞低聚糖的识别作用而粘附于血管内皮上(HAMMER D A,APTE SM.Simulation of cell rolling and adhesion on surfaces in shear flow:generalresults and analysis of selectin-mediated neutrophil adhesion[J].BiophysicalJournal,1992,63(1):35-57.)，这是中性粒细胞跨血管趋化进入炎症部位的第一步。
本发明提供的技术方案为：
一种秋水仙碱衍生物，简称BCS，英文名为(S)-N-(1,2,3-trimethoxy-10-(methylamino)-9-oxo-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[a]heptalen-7-yl)acrylamide，中文名为(S)-N-(1,2,3-三甲氧基-10-(甲氨基)-9-氧代-5,6,7,9-四氢苯并[α]-庚搭烯-7-基)丙烯酰胺，其结构为：
Figure BDA0002965922270000031
所述秋水仙碱衍生物BCS的制备方法，具体包括：
步骤1：将起始原料(S)-7-氨基-1,2,3,10-四甲氧基-6,7-二氢苯并[a]-庚搭烯-9(5H)-酮与丙烯酰氯按1:1～1:3摩尔比例溶于有机溶剂中，加入缚酸剂，控制反应温度-20～30℃，发生缩合反应，得到化合物2；
步骤2：化合物2与甲胺在-10～40℃温度下反应，得到BCS。
Figure BDA0002965922270000032
一种磷脂复合物，由所述秋水仙碱衍生物BCS和磷脂构成；其中，BCS与磷脂的摩尔比为1:0.5～1:5；所述磷脂为蛋黄磷脂酰甘油(EPG)、磷脂酸、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰肌醇及心机磷脂中的任一种，优选蛋黄磷脂酰甘油(EPG)。
蛋黄磷脂酰甘油(EPG)，其结构为：
Figure BDA0002965922270000041
蛋黄磷脂酰甘油(EPG)因较低的相变温度、刚性小、呈负电性等特性，其在应用上与二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)等饱和PG类磷脂有所区分，常用于开发难溶性药物等的注射剂。由于其独特的结构和理化性质，在一些制剂的开发中作为关键辅料起了极为重要的作用，其中最有代表性的即是2014年1月富士制药上市的2年保质期前列地尔注射液。正是由于使用了EPG替换原有处方中的油酸从而提高了前列地尔脂肪乳的稳定性，成功实现了将前列地尔注射液的保质期由1年提高到2年，引发行业变革。
所述磷脂复合物的制备方法，包括：按1:0.5～1:5的摩尔比将BCS与磷脂溶于溶剂中，在20～60℃温度下搅拌0.5～3小时，然后于20～60℃温度下除去溶剂，即制得磷脂复合物。所述磷脂为蛋黄磷脂酰甘油(EPG)、磷脂酸、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰肌醇及心机磷脂中的任一种，优选蛋黄磷脂酰甘油(EPG)。
一种含有所述磷脂复合物的纳米粒水分散液，其制备方法具体包括：向磷脂复合物中加入预热至20～60℃的5％葡萄糖注射液，搅拌10～20min，依次通过0.80μm、0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤除去未复合的BCS颗粒以及除菌，得到所述磷脂复合物的纳米粒水分散液。加入的5％葡萄糖注射液与BCS的体积质量比以mL/mg计为1:1～5:1。
一种唾液酸衍生物修饰的磷脂复合物，由所述的BCS、磷脂和唾液酸衍生物构成；其中，BCS与磷脂的摩尔比为1:0.5～1:5；唾液酸衍生物的修饰摩尔比例为磷脂摩尔数的5％-10％。所述磷脂为蛋黄磷脂酰甘油(EPG)、磷脂酸、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰肌醇及心机磷脂中的任一种；所述唾液酸衍生物为唾液酸-胆固醇衍生物(SA-CH)、唾液酸甲酯衍生物及唾液酸乙酯衍生物中的任一种。磷脂优选EPG，唾液酸衍生物优选SA-CH，BCS与EPG的摩尔比优选1:2，唾液酸衍生物的修饰摩尔比例优选为磷脂摩尔数的10％。
唾液酸-胆固醇衍生物(SA-CH)，其结构为：
Figure BDA0002965922270000042
一种唾液酸-胆固醇衍生物修饰的磷脂复合物的制备方法，包括：将BCS、EPG和SA-CH溶于一定量的无水乙醇中，在20～60℃温度下搅拌反应一定时间后，除去无水乙醇，得到SA-CH修饰的磷脂复合物，简称为SA-EPG-BCS。其中，BCS与EPG的摩尔比为1:0.5～1:5；SA-CH的修饰摩尔比例为磷脂摩尔数的5％-10％。
本发明还提供了一种含有SA-EPG-BCS的纳米制剂，该纳米制剂的制备方法具体包括：向SA-EPG-BCS中加入预热至20～60℃的5％葡萄糖注射液搅拌10～20min，形成纳米粒水分散液，依次通过0.80μm、0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤除去未复合的BCS颗粒以及除菌，得到SA-EPG-BCS纳米制剂。加入的5％葡萄糖注射液与BCS的体积质量比以mL/mg计为1:1～5:1。
本发明提供的SA-EPG-BCS纳米制剂可以有效靶向血液中的中性粒细胞，抑制中性粒细胞的迁移粘附，并具有良好的抗肿瘤效果。用于制备抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗血栓、免疫治疗药物。
SA-EPG-BCS纳米制剂，其中含有的秋水仙碱衍生物通过与微管蛋白二聚体结合，阻断微管蛋白组装成微管，干扰微管正常功能，抑制中性粒细胞的趋化、黏附，从而降低中性粒细胞在肿瘤处的浸润，减轻肿瘤相关炎症，达到间接抗肿瘤的目的。但由于秋水仙碱衍生物本身水溶性较差，且缺乏靶向性，生物利用度较低。故与磷脂复合，制成磷脂复合物改善其溶解性能，且通过载体结构修饰将药物定向运送至病变部位发挥药效，而不损伤周围的正常细胞、组织和器官的体系，实现主动靶向递药，降低非特异性毒性。
含有SA-EPG-BCS的抗肿瘤药物制剂，还可以制成脂质体、乳剂、微乳或胶束等剂型。
本发明的优点：
本发明通过制备一种新的秋水仙碱衍生物来降低秋水仙碱的毒性，同时将其用于制备治疗肿瘤的主动靶向制剂，进一步降低药物的毒副作用，提高抗肿瘤效果。
本发明将唾液酸衍生物修饰在秋水仙碱衍生物与磷脂复合的磷脂复合物表面，既可以稳定磷脂复合物，又可以赋予纳米载体中性粒细胞靶向性，使所述的秋水仙碱衍生物用于制备治疗肿瘤的主动靶向纳米剂型药物。
附图说明
图1本发明实施例6中各物质红外光谱验证结果；a.BCS b.EPG c.BCS与EPG的物理混合物d.磷脂复合物。
图2本发明实施例6中各物质X-射线衍射分析结果；a.BCS b.EPG c.BCS与EPG的物理混合物d.磷脂复合物。
图3本发明实施例6中各物质差热扫描量热分析结果。
图4本发明实施例9中S A-CH衍生物修饰对中性粒细胞摄取制剂的影响；A.流式细胞术检测结果B.激光共聚焦成像结果(标尺为5μm)。
图5本发明实施例10中中性粒细胞摄取不同制剂后的Transwell实验结果。
图6本发明实施例12中药效结束后早晚期S180肿瘤组织处中性粒细胞募集情况。
具体实施方式
为了更清楚的理解本发明，以下结合具体实施例对本发明技术方案做进一步的详细说明。
实施例1
一种秋水仙碱衍生物BCS的制备方法，具体包括：
步骤1：于100mL三口瓶中加入(S)-7-氨基-1,2,3,10-四甲氧基-6,7-二氢苯并[a]-庚搭烯-9(5H)-酮(1)(0.95g,2.67mmol)，二氯甲烷15mL溶解后，加入缚酸剂Et3N(0.81g,0.80mmol)，冰盐浴降温至-13℃，滴加丙烯酰氯(0.32mL,3.99mmol)的二氯甲烷(2mL)溶液，温度保持在-5℃以下，冰盐浴反应1h，反应完全，将反应液中缓慢加50mL冷水中淬灭，二氯甲烷萃取三次，每次40mL，合并有机层，有机层用饱和食盐水40mL洗一次，无水硫酸镁干燥8h，抽滤，蒸干滤液得粗品0.98g，柱层析分离纯化，得化合物(2)，棕黄色固体，0.81g，收率74.31％；对化合物(2)进行融点、质谱、核磁检测，具体如下：m.p.118～121℃；ESI-MS(m/z):412.0[M+H]+；1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):7.66(s,1H),7.43(d,J＝10.8Hz,2H),6.94(d,J＝10.9Hz,1H),6.55(s,1H),6.24-6.20(m,2H),5.58(dd,J＝7.8,3.8Hz,1H),4.75(m,J＝12.0,6.3Hz,1H),4.03(s,3H),3.95(s,3H),3.91(s,3H),3.68(s,3H),2.55(dd,J＝13.0,5.7Hz,1H),2.37(m,2H),2.01-1.97(m,1H)。
步骤2：于100mL三口瓶中加入化合物(2)(0.59g,1.43mmol)，甲醇10mL溶解后，加入30％甲胺的乙醇溶液(2.2mL,22.52mmol)，室温反应3h，反应完全。蒸干溶剂得BCS粗品0.53g，柱层析分离纯化，得BCS精制品，棕黄色固体，250mg，收率42.37％，对制得的BCS进行融点、质谱、核磁检测，具体如下：m.p.212～214℃；ESI-MS(m/z):411.2[M+H]+；1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm):7.99(d,J＝7.2Hz,1H),7.59(s,1H),7.53(d,J＝11.2Hz,1H),7.34(d,J＝5.7Hz,1H),6.68-6.60(m,1H),6.54(s,1H),6.32-6.17(m,2H),5.53(dd,J＝9.9,1.9Hz,1H),4.79(m,J＝12.7,6.7Hz,1H),3.95(s,3H),3.90(s,3H),3.66(s,3H),3.11(d,J＝5.2Hz,3H),2.49(dd,J＝13.1,6.2Hz,1H),2.37-2.31(m,2H),2.01(m,J＝11.9,6.4Hz,1H)。
实施例2
一种磷脂复合物及含有该磷脂复合物的纳米粒水分散液的制备方法，具体包括：
将2mg BCS和7.7mg EPG溶于1mL的无水乙醇中，在35℃下搅拌反应15min后，除去无水乙醇得到EPG-BCS磷脂复合物(以下简称磷脂复合物)。向得到的磷脂复合物中加入4mL预热至35℃的5％葡萄糖注射液搅拌10min。依次通过0.80μm、0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤除去未复合的BCS颗粒以及除菌，得到含有该磷脂复合物的纳米粒水分散液。
实施例3
考察BCS与EPG的投料摩尔比对磷脂复合物的纳米粒水分散液性质的影响
将BCS与EPG分别按照1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5的摩尔比投料，选用无水乙醇作为反应溶剂，BCS在乙醇中的质量浓度为0.5mg/mL，反应时间为1h，反应温度设为40℃，制备磷脂复合物。然后挥除乙醇，加入预热至40℃的5％葡萄糖注射液，搅拌10min，依次通过0.80μm、0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤除去未复合的BCS颗粒以及除菌，制得纳米粒水分散液。采用Nicomp-380粒径检测仪测试粒径尺寸，还做了Zeta电位测定以及复合率测定。具体数据如表1所示。
表1 BCS与EPG的投料摩尔比的影响
Figure BDA0002965922270000071
由表1可知，当BCS和EPG的摩尔比为1:0.5时，粒径以及分散系数较其余组最大，复合率最低，表明体系并不稳定。当摩尔比大于等于1:1时，复合率大于90％，但当摩尔比为1:1时，Zeta电位绝对值较低，表明体系容易发生小粒子聚集；当摩尔比为1:2～1:3时，外观为澄清透明液体，粒径均一且稳定；当摩尔比大于1:3时，由于EPG过多，余下的分散在水中，表现出EPG自身的分散性质，即乳状。因此选择1:2作为BCS与EPG的最佳投料摩尔比。
实施例4
考察反应温度对磷脂复合物的纳米粒水分散液性质的影响
将BCS与EPG按1:2的摩尔比投料，选用无水乙醇作为反应溶剂，BCS在乙醇中的质量浓度为0.5mg/mL，反应时间为1h，反应温度分别设为20℃、40℃、60℃，制备磷脂复合物。然后挥除乙醇，加入预热至40℃的5％葡萄糖注射液，搅拌10min，依次通过0.80μm、0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤除去未复合的BCS颗粒以及除菌，制得纳米粒水分散液。具体数据如表2所示。
表2反应温度的影响
Figure BDA0002965922270000081
由表2可知，BCS与EPG的投料摩尔比为1:2时，不同温度下，复合率均在90％左右，且外观均为澄清透明液体。可知，BCS与EPG的复合率受温度影响较小，因此，选择接近人体体温的40℃为最佳反应温度。
实施例5
考察反应时间对磷脂复合物的纳米粒水分散液性质的影响
将BCS与EPG按1:2的摩尔比投料，选用无水乙醇作为反应溶剂，BCS在乙醇中的质量浓度为0.5mg/mL，反应时间分别为0.5h、1.0h、1.5h、2.0h反应温度为40℃，制备磷脂复合物。然后挥除乙醇，加入预热至40℃的5％葡萄糖注射液，搅拌10min，依次通过0.80μm、0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤除去未复合的BCS颗粒以及除菌，制得纳米粒水分散液。具体数据如表3所示。
表3反应时间的影响
Figure BDA0002965922270000082
由表3可知，BCS与EPG的投料摩尔比为1:2、反应温度为40℃时，复合率均在90％左右，且外观均为澄清透明液体。可知，BCS与EPG的复合率受反应时间影响较小。
实施例6
验证磷脂复合物的纳米粒水分散液的优化工艺
根据上述实施例2～5结果，拟定磷脂复合物的纳米粒水分散液的优化工艺为：以无水乙醇为反应溶剂，BCS与EPG的投料摩尔比为1:2，反应时间为1.0h，反应温度设为40℃，挥除乙醇，加入预热至40℃的5％葡萄糖注射液，搅拌10min，依次通过0.80μm、0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤除去未复合的BCS颗粒以及除菌，即得磷脂复合物的纳米粒水分散液。按照上述拟定工艺制备三批磷脂复合物的纳米粒水分散液，分别检测复合率及外观，可知复合率均大于90％，外观为澄清透明液体。
为了进一步验证BCS与EPG复合成功，对各原料组分及产物进行IR、XRD及DSC测试，具体如下所述：
红外光谱特征(IR)
分别取BCS、EPG、BCS与EPG按1:2的摩尔比混合的物理混合物(以下简称物理混合物)和磷脂复合物适量，波长250～4500cm-1范围内，进行红外光谱检测，具体IR扫描图谱见附图1。
由图1c可知，物理混合物的红外光谱图为BCS与EPG峰的叠加，BCS中-NH的伸缩振动峰(3234.5cm-1)、EPG结构中羟基的伸缩振动峰(3423.5cm-1)和脂肪酸酯中羰基的伸缩振动峰(1742.7cm-1)等特征峰均可找到，说明BCS与EPG的物理混合物中二者之间没有相互作用，BCS仍以晶体形式存在。有图1d可知，与物理混合物的图谱相比，磷脂复合物EPG-BCS的的图谱发生细微变化，BCS的-NH伸缩振动峰以及EPG结构中的羟基伸缩振动峰均消失，峰位3000cm-1伸缩振动强度增强，脂肪酸酯中羰基的伸缩振动峰强度明显减弱。可知磷脂复合物中BCS与EPG并非简单的物理混合，推测磷脂复合物中BCS的-NH的氢原子与EPG分子脂肪酸酯羰基上的氧原子或磷原子上的氧原子形成氢键。
X-射线衍射分析(XRD)
分别取BCS、EPG、BCS与EPG按1:2的摩尔比混合的物理混合物(以下简称物理混合物)和磷脂复合物适量进行X-射线衍射测定，设置检测条件：Cu-Kα靶，测定管压40kV，管流30mA，衍射范围为5°<2θ<35°，结果见附图2。
由图2a及2b可知，BCS和EPG存在晶体衍射尖峰，均具有晶体性质。由图2c可知，二者的物理混合物为各自衍射峰的叠加，没有生成新峰，表明二者之间无相互作用。由图2d可知，磷脂复合物中BCS和EPG的晶体衍射峰消失，表明BCS与EPG的相互作用使二者处于高度分散状态，而使各自的晶体特征被抑制，整体表现出无定型特征。
差示扫描量热法(DSC)
以空铝坩埚为参比，另一铝坩埚内放入适量待测样品，待测样品分别为BCS、EPG、BCS与EPG按1:2的摩尔比混合的物理混合物(即图3中的BCS/EPG mixture)和磷脂复合物(即图3中的EPG-BCS)，在氮气保护下，以升温速率10℃/min，温程：30～250℃进行差示扫描量热分析，绘制曲线图见附图3。
在上述IR以及XRD等的验证中，我们可以得出的磷脂复合物是BCS与EPG经过相互作用复合而成的无定形态物质，在此基础上，我们继续通过差热扫描量热法进行了考察。由图3可知，BCS有一个单独吸热峰77.14℃；EPG也有一个单独吸热峰为92.83℃；由于BCS与EPG之间的吸热峰范围有重叠，物理混合后，出现了一个93.00℃的吸热峰，磷脂复合物的吸热峰为83.50℃，进一步表明了物理混合物与磷脂复合物的不同。
实施例7
SA-EPG-BCS纳米制剂的制备
通过上述实施例，确证BCS成功与EPG复合，在此基础上，分别将摩尔比例为5％和10％磷脂摩尔量的SA-CH修饰在EPG-BCS磷脂复合物上，具体方法：以无水乙醇为反应溶剂，取BCS与EPG的投料摩尔比为1:2，分别将摩尔比例为5％和10％磷脂摩尔量的SA-CH与BCS、EPG混合，采用实施例6的优化工艺流程，制备得到SA-EPG-BCS纳米制剂。并以粒径、Zeta电位、复合率等为评价指标。结果见表4。
表4 SA-EPG-BCS纳米制剂的表征
Figure BDA0002965922270000101
由表4可知，在添加SA-CH修饰分子后，磷脂复合物的纳米粒水分散液粒径略增大(未修饰前的磷脂复合物的纳米粒水分散液粒径为30.4±1.2nm)，不同SA-CH修饰比例也并未对磷脂复合物的水分散液造成较大影响，体系较稳定，复合率高。鉴于SA-CH的加入可以有效稳定制剂，选择10％摩尔比作为修饰比例。
实施例8
稀释稳定性
注射给药时，往往需要将磷脂复合物水分散液进行稀释，选择5％葡萄糖注射液作为稀释介质，考察磷脂复合物水分散液的稀释稳定性。
精密移取磷脂复合物水分散液0.5mL至5.0mL无色容量瓶内，以5％葡萄糖注射液稀释至刻度，混匀并避光放置。于稀释后0、3、6、12、24h取适量测定其粒径和BCS含量，结果表明，经5％葡萄糖注射液稀释后24h内，磷脂复合物水分散液的粒径和含量无显著性变化。
实施例9
中性粒细胞对制剂摄取实验
昆明小鼠外周血中性粒细胞(PBN)分离纯化：由于各种血细胞的密度存在差异，而PBN的细胞密度介于单核细胞与红细胞之间，因此，我们采用经典的密度梯度离心法分离纯化PBN。首先，通过眼静脉丛取血获取S180荷瘤昆明鼠的外周血液，以全血量10IU·mL-1加入肝素，制备抗凝血。然后，将小鼠外周血中性粒细胞分离液1和分离液2(2:1，v/v；分离液2为80％分离液1溶液)(小鼠外周血分离液由天津灏洋生物制品科技有限公司提供)加入至10mL离心管中，形成梯度界面。接着，将抗凝血液与红细胞沉降液混匀(1:1，v/v)，室温沉降1h后，小心加于分离液梯度界面之上，800g离心20min。离心结束后，血浆层下出现两层白色环状细胞层，取下层白色环状，即PBN层(会有少量红细胞混杂)，加3～5倍体积清洗液混匀，400g离心10min。离心后弃去上层液体，即得PBN。
流式细胞术检测方法：荷瘤小鼠的肿瘤长至约800mm3，并且无坏死区域出现。按照上述方法分离纯化得到中性粒细胞。将PBN细胞悬液以1×106cells/tube的密度转移至无菌1.5mL离心管中，每管加入1mL培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养30min。分别加入共装载荧光探针DiR的DiR-BCS-EPG、DiR-BCS-EPG-SA，DiR终浓度为0.2μg·mL-1。为了考察PBN表面L-selectin受体饱和后对DiR-SAPC摄取的影响，我们将SA溶液(终浓度10mg·mL-1)加入到最后一个试验组，即竞争性抑制实验组。先让游离SA与中性粒细胞结合，使中性粒细胞表面结合受体饱和后，再加入制剂SA-EPG-BCS。将细胞置于5％CO2，37℃下培养1h后，5000rpm离心3min分离细胞和未摄取的制剂，加入1mLPBS重悬细胞后，重复操作清洗3次。随后，采用流式细胞术检测样品的荧光强度，每个样品收集1×104个细胞，通过APC-Cy7-A通道检测，并采用FlowJo 7.6.1软件分析数据。结果见附图4a。
由图4a可知，与EPG-BCS(磷脂复合物)相比，SA修饰的纳米制剂SA-EPG-BCS在中性粒细胞中显现出更强的荧光信号，提示细胞对SA-EPG-BCS摄取量增加。在竞争性抑制实验(SA-EPG-BCS(SA))中，SA溶液预孵育后显著抑制了PBN对BCS制剂的摄取。该结果表明，游离的SA可以作为竞争性抑制剂与PBN表面的L-selectin受体结合，从而显著减少细胞对制剂摄取量。
激光共聚焦显微镜成像方法：荷瘤小鼠的肿瘤长至约800mm3，并且无坏死区域出现。按照上述方法分离纯化得到中性粒细胞。分别将PBN细胞以1×106cells/孔的密度接种到铺有盖玻片的24孔培养板中，每孔加入1mL培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养1h。取出培养板后，弃去孔内培养基，分别加入共装载荧光探针DiR的BCS-EPG-BCS-DIR、SA-EPG-BCS-DIR，DiR终浓度为0.2μg·mL-1。为了考察PBN表面L-selectin受体饱和后对DiR-SAPC摄取的影响，我们将SA溶液(终浓度10mg·mL-1)加入到最后一个试验组。然后，将细胞置于5％CO2，37℃下培养1h，PBS清洗3次洗去未摄取的制剂。之后，按250ng·mL-1加入FITC-Gr-1抗体，于4℃下培养20min，标记PBN，加入4％多聚甲醛溶液固定细胞样品20min，再用PBS冲洗细胞3次。加入DAPI，室温下避光孵育15min，使用PBS冲洗细胞3次。将抗荧光淬灭封片剂滴于载玻片上，从培养板中取出盖玻片，封片，激光共聚焦显微镜下成像并拍照。结果见附图4b。
由图4b可知，与EPG-BCS相比，SA-EPG-BCS显著增强了PBN细胞质中的DiR荧光信号。结果与流式细胞术结果相一致，表明SA的修饰大大促进了PBN对BCS纳米复合物的摄取，对于降低药物的非特异性损伤不良作用具有很大影响。
实施例10
中性粒细胞体外Transwell迁移实验
采用实施例9“中性粒细胞分离纯化”提取PBN，PBN细胞悬液以1×106cells/tube的密度转移至无菌1.5mL离心管中，每管加入1mL培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养30min。分别加入EPG-BCS、SA-EPG-BCS制剂，BCS终浓度为300nM。将细胞置于5％CO2，37℃下培养30min后，5000rpm离心3min分离细胞和未摄取的制剂。用200μL含10％血清的RPMI1640培养基进行重悬。
选择5μm的Corning Transwell PC膜，先在上室铺一层小鼠脐静脉内皮细胞(MUVEC Cell)于CO2培养箱稳定1小时，将上下两室培养基弃掉。在上室分别加入与不同制剂孵育的中性粒细胞悬液，下室加入500μL含10％血清的培养基，孵育4h。迁移结束后，轻轻吹打均匀下室培养液，取10μL液体进行血球计数板计数。结果见附图5。
本次实验设置有调零组、对照组与实验组，具体设计如下：
上室(200μL) 下室(500μL)
调零组 10％空白血清细胞悬液 10％空白血清培养基
对照组 10％空白血清细胞悬液 10％炎症血清培养基
EPG-BCS组 10％空白血清细胞悬液 10％炎症血清培养基
SA-EPG-BCS组 10％空白血清细胞悬液 10％炎症血清培养基
由图5可知，与空白血清组相比，对照组中性粒细胞迁移至下室的数量明显增多；给药组则有效抑制了中性粒细胞的迁移，其中SA-EPG-BCS组迁移数目少于EPG-BCS组，且二者具有显著性差异(**p<0.05)。
实施例11
体内早晚期S180荷瘤小鼠抗肿瘤实验
将接种过S180细胞后三天的30只昆明小鼠定为早期肿瘤小鼠，随机分为5组，每组6只，即5％葡萄糖注射液组(Control)、Colchicine溶液组(COL-S)、BCS溶液组(BCS-S)、EPG-BCS组(EPG-BCS)、SA-EPG-BCS组(SA-EPG-BCS)；各组的单次给药剂量均为0.5mg BCS·kg-1。接种后三天开始给药，记为第一次给药。分别于接种后第3、5、7、9、11d尾静脉注射给药共5次，药效期间记录体重、肿瘤体积。药效结束后完整剥离皮下肿瘤，称重，计算抑瘤率。为了更好地体现SA-EPG-BCS纳米制剂的有效性与靶向性，兼顾纳米制剂对肿瘤细胞的抑制和对机体非特异性的损伤，计算“抑瘤指数(Tumor-inhibition index,TI index)”，即体重/瘤重。
将接种过S180细胞后十天且肿瘤体积长至约2500cm3的30只昆明小鼠定为晚期肿瘤小鼠，随机分为5组，每组6只，即5％葡萄糖注射液组(对照组)、秋水仙碱溶液组(COLC-S)、BCS溶液组(BCS-S)、EPG-BCS组(EPG-BCS)、SA-EPG-BCS组(SA-EPG-BCS)；各组的单次给药剂量均为0.5mg BCS·kg-1。接种后第11天开始给药，记为第一次给药。分别于接种后第11、13、15、17、19d尾静脉注射给药共5次，药效期间记录体重、肿瘤体积等。药效结束后完整剥离皮下肿瘤，称重，计算重量抑瘤率和抑瘤指数。结果见表5。
表5各制剂的早晚期S180肿瘤抑瘤率及抑瘤指数
Figure BDA0002965922270000131
由表5可知，SA-EPG-BCS组的抑瘤率及抑瘤指数在早晚期模型中都有较好的结果，抗肿瘤能力远大于其他给药组，且BCS组的抑瘤效果高于秋水仙碱组，对机体造成的脱靶损伤小，表明BCS相比于秋水仙碱毒性降低，疗效增强。SA-CH的修饰可以大大提高药物的抗肿瘤能力，而且对机体的非特异性毒性较小，综合疗效最佳。
实施例12
S180小鼠肿瘤组织免疫组化
髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)作为中性粒细胞的特异性标记物，是评价中性粒细胞在组织中浸润程度地一个可靠指标。通过对各组小鼠肿瘤组织的石蜡切片作免疫组织化学分析，测定中性粒细胞在肿瘤组织中的募集情况。待测样本经4％多聚甲醛固定，固定状态良好后，严格按照本单位病理实验检测SOP程序进行修剪、脱水、包埋、切片、染色、封片最后镜检合格的样片。使用Eclipse Ci-L拍照显微镜选取组织的目的区域进行200倍成像，成像时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0分析软件，统一以像素面积pixel作为标准单位，分别测量每个视野阳性的累积光密度值(IOD)，记做A；以及对应的组织像素面积(Area)，记做B，并计算出面密度(AREAL DENSITY)＝A/B，记做C。结果见附图6。
由图可知，肿瘤早晚期给药对于中性粒细胞在肿瘤组织的募集是有一定的影响的，晚期肿瘤组织浸润的中性粒细胞占比较大。BCS组对于中性粒细胞的阻断是优于秋水仙碱组的，且SA-EPG-BCS组阻断中性粒细胞能力最强，阻断效果最佳。
实施例13
4T-1乳腺癌模型小鼠抗肿瘤实验
将4T1细胞混悬液接种于小鼠第三对乳房垫上，共接种30只，随机分成5组，即5％葡萄糖注射液组(对照组)、秋水仙碱溶液组(COLC-S)、BCS溶液组(BCS-S)、EPG-BCS组(EPG-BCS)、SA-EPG-BCS组(SAEPG-BCS)。待小鼠均于肿瘤体积到达100mm3后开始给药，每2天给药1次，共计给药5次。单次剂量为0.5mg BCS·kg-1，对照组给予等体积的5％葡萄糖注射液。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、体质量等数据。药效结束后完整剥离皮下肿瘤，称重，计算重量抑瘤率和抑瘤指数。同时采用Bouin's固定液对小鼠肺组织转移灶进行染色，观察肿瘤转移灶并计数，并以中位数为结果。结果见表6。
表6 4T-1乳腺癌小鼠药效指标结果
Figure BDA0002965922270000141
由以上结果可知，该SA修饰的磷脂复合物对于秋水仙碱类主要的临床适用症-乳腺癌具有优异的治疗效果。不仅具有最高的抑瘤指数，对机体带来的非特异性损伤最小；而且具有更优的肿瘤转移抑制效果。此外相比于BCS，秋水仙碱注射液的抑瘤指数几乎与对照组相似，说明秋水仙碱注射液对机体造成的非特异性毒性抵消了部分抗肿瘤效果，对机体造成了较大的脱靶损伤。在肺部转移实验中发生了明显的肿瘤转移现象，肺部转移灶甚至超过了对照组，再次体现了本发明提供的秋水仙碱衍生物BCS优于秋水仙碱化合物，可有效降低毒性。同时，SA的修饰赋予该化合物良好的靶向中性粒细胞能力，使制剂拥有显著的抑制肿瘤转移能力和理想的抗肿瘤效果。
综合以上实验结果，可以得出结论：本发明提供的新型秋水仙碱衍生物BCS具有降低毒性增强疗效的改良意义。在此基础上，该衍生物被应用于主动靶向制剂后，极大地提高了抗肿瘤能力，对身体造成的非特异性损伤大大降低。此外，需要引起注意的是本发明基于载体靶向中性粒细胞，抑制中性粒细胞向肿瘤炎性环境的迁移而发挥的药物抗肿瘤作用，与普遍研究的秋水仙碱类化合物抗有丝分裂的杀伤机制不同。研究结果提示SA类物质具有良好的靶向中性粒细胞能力，且通过阻断中性粒细胞在肿瘤处的募集实现抗肿瘤目标的这一策略是可行的。

Claims (9)

1.一种秋水仙碱衍生物，其特征在于，所述秋水仙碱衍生物的英文名为(S)-N-(1,2,3-trimethoxy-10-(methylamino)-9-oxo-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[a]heptalen-7-yl)acrylamide，中文名为(S)-N-(1,2,3-三甲氧基-10-(甲氨基)-9-氧代-5,6,7,9-四氢苯并[α]-庚搭烯-7-基)丙烯酰胺，其结构为：
Figure FDA0002965922260000011
2.权利要求1所述的一种秋水仙碱衍生物的制备方法，其特征在于，具体包括：
步骤1：将起始原料(S)-7-氨基-1,2,3,10-四甲氧基-6,7-二氢苯并[a]-庚搭烯-9(5H)-酮与丙烯酰氯按1:1～1:3摩尔比例溶于有机溶剂中，加入缚酸剂，控制反应温度-20～30℃，发生缩合反应，得到化合物2；
步骤2：化合物2与甲胺在-10～40℃温度下反应，得到所述的秋水仙碱衍生物BCS；
Figure FDA0002965922260000012
3.一种磷脂复合物，其特征在于，所述磷脂复合物由权利要求1～2任一项所述秋水仙碱衍生物和磷脂构成；其中，所述秋水仙碱衍生物与磷脂的摩尔比为1:0.5～1:5；所述磷脂为蛋黄磷脂酰甘油、磷脂酸、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰肌醇及心机磷脂中的任一种。
4.权利要求3所述的一种磷脂复合物的制备方法，其特征在于，包括：按1:0.5～1:5的摩尔比将所述秋水仙碱衍生物与磷脂溶于溶剂中，在20～60℃温度下搅拌0.5～3小时，然后于20～60℃温度下除去溶剂，即制得磷脂复合物；所述磷脂为蛋黄磷脂酰甘油、磷脂酸、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰肌醇及心机磷脂中的任一种。
5.一种磷脂复合物的纳米粒水分散液的制备方法，采用权利要求3～4任一项所述的一种磷脂复合物，其特征在于，具体包括：向磷脂复合物中加入预热至20～60℃的5％葡萄糖注射液，搅拌10～20min，依次通过0.80μm、0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤除去未复合的秋水仙碱衍生物颗粒以及除菌，得到所述磷脂复合物的纳米粒水分散液；其中，加入的5％葡萄糖注射液与秋水仙碱衍生物的体积质量比以mL/mg计为1:1～5:1。
6.一种唾液酸衍生物修饰的磷脂复合物，其特征在于，由权利要求1～2任一项所述秋水仙碱衍生物、磷脂和唾液酸衍生物构成；其中，秋水仙碱衍生物与磷脂的摩尔比为1:0.5～1:5；唾液酸衍生物的修饰摩尔比例为磷脂摩尔数的5％-10％；磷脂为蛋黄磷脂酰甘油、磷脂酸、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰肌醇及心机磷脂中的任一种；唾液酸衍生物为唾液酸-胆固醇衍生物、唾液酸甲酯衍生物及唾液酸乙酯衍生物中的任一种。
7.根据权利要求6所述的一种唾液酸衍生物修饰的磷脂复合物，其特征在于，由秋水仙碱衍生物、蛋黄磷脂酰甘油和唾液酸-胆固醇衍生物构成；其中，秋水仙碱衍生物与蛋黄磷脂酰甘油的摩尔比为1:2，唾液酸-胆固醇衍生物的修饰摩尔比例为蛋黄磷脂酰甘油摩尔数的10％。
8.一种唾液酸-胆固醇衍生物修饰的磷脂复合物的制备方法，采用权利要求3～4任一项所述的一种磷脂复合物，其特征在于，包括：将秋水仙碱衍生物、蛋黄磷脂酰甘油和唾液酸-胆固醇衍生物溶于一定量的无水乙醇中，在20～60℃温度下搅拌反应一定时间后，除去无水乙醇，得到唾液酸-胆固醇衍生物修饰的磷脂复合物；其中，秋水仙碱衍生物与蛋黄磷脂酰甘油的摩尔比为1:0.5～1:5；唾液酸-胆固醇衍生物的修饰摩尔比例为磷脂摩尔数的5％-10％。
9.一种纳米制剂的制备方法，采用权利要求8所述的一种唾液酸-胆固醇衍生物修饰的磷脂复合物，其特征在于，具体包括：向唾液酸-胆固醇衍生物修饰的磷脂复合物中加入预热至20～60℃的5％葡萄糖注射液搅拌10～20min，形成纳米粒水分散液，依次通过0.80μm、0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤除去未复合的秋水仙碱衍生物颗粒以及除菌，得到所述的纳米制剂；其中，加入的5％葡萄糖注射液与秋水仙碱衍生物的体积质量比以mL/mg计为1:1～5:1；所述纳米制剂有效靶向血液中的中性粒细胞，抑制中性粒细胞的迁移粘附，用于制备抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗血栓、免疫治疗药物。
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