CN114891057B - 唾液酸衍生物修饰的化合物及其合成方法和应用 - Google Patents
唾液酸衍生物修饰的化合物及其合成方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114891057B CN114891057B CN202210581456.6A CN202210581456A CN114891057B CN 114891057 B CN114891057 B CN 114891057B CN 202210581456 A CN202210581456 A CN 202210581456A CN 114891057 B CN114891057 B CN 114891057B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sialic acid
- dexamethasone
- acid derivative
- drug
- derivative modified
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J17/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, having an oxygen-containing hetero ring not condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
- A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
- A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
一种唾液酸衍生物修饰的化合物及其合成方法和应用,属于医药领域。唾液酸衍生物修饰的化合物的结构通式为(I)和(II)所示,A部分为具有炎症靶向性的唾液酸或其衍生物,C部分为药物,B部分为A和C部分的连接基团;其中,R1,R2,R3,R4,R5、R6、X见说明书所示。还提供了其合成方法和其作为小分子药物炎症靶向修饰基团的用途。唾液酸衍生物修饰的化合物中,唾液酸衍生物结构的引入不仅提高了抗炎药物的水溶性,使其满足直接静脉给药的需求;还与炎症血管内皮细胞表面特异性表达的E‑selectin受体特异性结合,将药物递送到炎症部位,实现精准的炎症靶向治疗,从而提高药物疗效或降低药物非特异性分布带来的副作用。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,具体涉及一种唾液酸衍生物修饰的化合物及其合成方法和应用,更特别涉及唾液酸衍生物修饰的化合物在靶向治疗炎症的药物的应用。
背景技术
炎症是机体对于刺激的一种防御反应,表现为红、肿、热、痛和功能障碍。炎症,可以是感染性炎症也可以是非感染性炎症,也分为急性炎症和慢性炎症。通常情况下,炎症是有益的,是人体的自动的防御反应,但是有的时候,炎症也是有害的,例如对人体自身组织的攻击、发生在透明组织的炎症等等。如急性肾炎,会引起人体肾功能下降,如果治疗不及时会导致慢性肾炎甚至肾衰竭,危及生命;类风湿性关节炎,作为一种慢性疾病,长期困扰着人们的生活,影响生活质量;除此之外,长期慢性炎症也可能会诱发细胞癌变,诱发肿瘤。因此,对于炎症的药物治疗是非常有必要的。常用的抗炎药物分为非甾体抗炎药(如阿司匹林,对乙酰氨基酚,吲哚美辛,布洛芬等)和糖皮质激素甾体类抗炎药(如氢化可的松,泼尼松,地塞米松等)。目前市售的这些抗炎药物口服或静脉给药后进入血液循环,并没有特异性递送到炎症部位,因此长期或大剂量使用地塞米松常常会引起一些副作用,如库欣综合征、骨质疏松等,这极大地限制了其在临床的应用。近年来基于纳米技术的许多新型药物递送系统被构建用于抗炎药物的精准递送。其中,有一些已经被用于临床实践中,包括地塞米松棕榈酸酯脂质注射液、地塞米松聚合物前药等。尽管纳米技术极大地改善了药物副作用,但这些新型纳米制剂也存在一些缺陷,包括:载体相关的毒性和免疫原性、载药量低、稳定性差、药物储存过程中易泄露、结晶等。因此,如何设计一种高效低毒的药物递送系统用于抗炎药物的递送仍然是研究的热点。
血管内皮细胞是组成血管内壁的主要成分,当局部发生炎症时,血管内皮细胞表面会过量表达一些粘附因子(如E-selectin受体)来参与白细胞的招募,从而介导一系列炎症反应。唾液酸是一类广泛存在于生物系统中的神经氨酸衍生物,参与细胞表面多种生理功能,在调节人体生理、生化功能方面起到非常重要的作用。更重要的是,唾液酸可与血管内皮细胞在炎症状态下特异性表达的E-selectin受体结合。如何利用唾液酸的这一特性实现对小分子药物的炎症靶向递送,目前并无文献对其进行研究和介绍。
发明内容
针对现有技术提出的问题,本发明提供了一种唾液酸衍生物修饰的化合物及其合成方法和应用。
本发明的一个目的是提供一种唾液酸衍生物修饰的化合物及其合成方法,该唾液酸衍生物修饰的化合物合成工艺简单成熟,制得的化合物水溶性良好,血浆稳定性好。
本发明的另一个目的在于提供唾液酸衍生物作为小分子药物炎症靶向修饰基团的用途,将其应用于炎症靶向治疗研究,唾液酸衍生物的修饰能够使唾液酸衍生物修饰的化合物具有炎症靶向性,能够显著降低抗炎药物非特异性分布带来的副作用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的:
本发明提供了一个如结构通式(I)或结构通式(II)所示的唾液酸衍生物修饰的化合物,其中A部分为具有炎症靶向性的唾液酸或其衍生物,C部分为药物,B部分为A和C部分的连接基团;
其中,A部分为唾液酸或其衍生物,R1,R2,R3,R4,R5,R6独自表示为氢,C1-C5烷基,乙酸酯基;
B部分为连接基团,根据A部分和C部分是否能够直接反应,X选自无或选自酯基、碳酸酯基、酰胺基、酰胺酯基、醚基、胺基、氨基酸酯基、氨基酸酰胺、硫醚键、二硫键中的一种或多种;
C部分为药物(Drug),选自具有抗炎能力的化学合成或天然的化合物,更优选为非甾体抗炎药或糖皮质激素甾体类抗炎药。
更优选为:非甾体抗炎药为阿司匹林,对乙酰氨基酚,吲哚美辛,布洛芬中的一种。
糖皮质激素甾体类抗炎药选自氢化可的松,泼尼松,地塞米松中的一种。
本发明的目的之一的一种唾液酸衍生物修饰的化合物的合成方法,包括以下步骤:
根据C部分选择对应药物,根据B部分的连接基团的官能团对C部分的对应药物进行修饰,将B部分和C部分连接,再根据B部分和A部分的唾液酸或其衍生物对应的反应基团,进行反应,得到唾液酸衍生物修饰的化合物;
或者当A部分和C部分能直接反应,则直接将A部分和C部分反应,得到唾液酸衍生物修饰的化合物。
优选为,下面将以上述的A部分为唾液酸和C部分为抗炎药物地塞米松通过B部分为腙键连接构建了唾液酸-地塞米松接枝物,对本发明的实施技术路线进行说明,但是整体的方案不限于唾液酸、腙键和地塞米松。
本技术路线中以唾液酸或其衍生物为炎症靶向修饰集团,药物为地塞米松,通过腙键连接制得唾液酸-地塞米松接枝物,作为唾液酸衍生物修饰的化合物,其结构式如下:
唾液酸-地塞米松接枝物结构式
上述唾液酸-地塞米松接枝物的合成方法,包括以下步骤:
步骤(1):叔丁基二甲基硅氧基地塞米松(Dex-TBS)的合成
将地塞米松(Dex)和叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCI),咪唑作为原料,N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂,0~2℃反应1~2h,再置于室温反应3~5h,得到反应液;其中,按摩尔比,地塞米松:叔丁基二甲基氯硅烷:咪唑=1:1:2;按固液比,Dex:DMF=1g:(6~8)mL;
将反应液用乙酸乙酯萃取,水洗后,饱和氯化钠水溶液再萃取,用无水氯化镁干燥乙酸乙酯层,浓缩得到叔丁基二甲基硅氧基地塞米松(Dex-TBS);
步骤(2):3-腙基-21-叔丁基二甲基硅氧基地塞米松(NH2N-Dex-TBS)的合成
将叔丁基二甲基硅氧基地塞米松、体积浓度为80%的水合肼、醋酸作为原料,甲醇为溶剂,室温反应10~12h,得到产物;其中,按摩尔比,叔丁基二甲基硅氧基地塞米松:体积浓度为80%的水合肼:醋酸=1:3:0.5;按固液比,叔丁基二甲基硅氧基地塞米松:甲醇=1g:(8~10)mL;
将产物用乙酸乙酯萃取,水洗后,饱和氯化钠水溶液再萃取,用无水氯化镁干燥乙酸乙酯层,浓缩得到白色固体产物3-腙基-21-叔丁基二甲基硅氧基地塞米松(NH2N-Dex-TBS);
步骤(3):唾液酸-地塞米松接枝物(Dex-SA)的合成
将3-腙基-21-叔丁基二甲基硅氧基地塞米松、唾液酸(SA)、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)、1-羟基苯并三唑(HOBt)作为原料,N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂,室温反应3~5h,加入1mol/L的四丁基氟化铵(TBAF)的四氢呋喃(THF)溶液,再继续反应2~3h,进行柱层析分离,得到唾液酸-地塞米松接枝物(Dex-SA)。其中,按摩尔比,3-腙基-21-叔丁基二甲基硅氧基地塞米松:唾液酸(SA):1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI):1-羟基苯并三唑(HOBt)=1:1:1.1:1.1;按固液比,3-腙基-21-叔丁基二甲基硅氧基地塞米松:DMF=1g:(6~8)mL;3-腙基-21-叔丁基二甲基硅氧基地塞米松:1mol/L的四丁基氟化铵(TBAF)的四氢呋喃(THF)溶液=1g:(2~4)mL。
唾液酸-地塞米松接枝物的合成方法中,整个反应路线如下:
本发明的一种唾液酸衍生物修饰的化合物在靶向治疗炎症的药物的应用。
所述的炎症为各种原因导致的急性或慢性炎症,特别选自急性肾损伤、急性肺损伤、脑卒中、关节炎、狼疮肾炎、结肠炎中的一种或几种。
所述的靶向治疗炎症的药物为注射给药药物、口服给药药物或局部给药药物中的一种。
本发明的唾液酸衍生物修饰的化合物,能够相对提高其在炎症部位的靶向分布。
本发明的一种唾液酸衍生物修饰的化合物及其合成方法和应用,其具有以下有益效果:
(1)设计合成的唾液酸衍生物修饰的化合物,其合成方法简单易行;
(2)唾液酸衍生物修饰的化合物中,唾液酸或其衍生物的修饰不仅提高了抗炎药物的水溶性,使其满足直接静脉给药的需求;还可以通过唾液酸或其衍生物与炎症血管内皮细胞表面特异性表达的E-selectin受体特异性结合,将药物递送到炎症部位,实现精准的炎症靶向治疗,从而提高药物疗效或降低药物非特异性分布带来的副作用。
(3)唾液酸或其衍生物的修饰能够相对提高抗炎药物在炎症性疾病部位的分布,能够调节药物在炎症部位的聚集浓度或延长了其在炎症部位聚集时间或提高了其治疗效果或降低了药物的副作用;
(4)所制备的唾液酸衍生物修饰的化合物具有良好的抗炎效果的同时,显著降低了药物的副作用;
(5)唾液酸衍生物修饰的化合物为炎症靶向药物递送提供了新的思路。
附图说明
图1为本发明实施例1的唾液酸-酯键-地塞米松接枝物的1H-NMR谱图。
图2为本发明实施例2的唾液酸-硫醚键-地塞米松接枝物的1H-NMR谱图。
图3为本发明实施例3的唾液酸-腙键-地塞米松接枝物的1H-NMR谱图。
图4为本发明实施例5的唾液酸-地塞米松接枝物的血浆稳定性实验结果图。
图5为本发明实施例6的唾液酸-地塞米松接枝物对细胞活力的影响结果。
图6为本发明实施例7的唾液酸-地塞米松接枝物抑制大鼠足肿胀结果;(a)为不同给药组足厚度的变化情况,(b)为不同给药组足肿胀度的变化情况,(c)为足肿胀度-时间变化曲线下面积的结果。
图7为本发明实施例8的唾液酸-地塞米松接枝物与地塞米松在急性肾损伤小鼠体内组织分布的结果;(a)为不同时刻药物在心脏中的分布情况,(b)不同时刻药物在肝脏中的分布情况,(c)为不同时刻药物在脾脏中的分布情况,(d)为不同时刻药物在肺中的分布情况,(e)为不同时刻药物在肾脏中的分布情况,(f)为不同时刻药物在血浆中的分布情况,(g)为各药物在各组织中药物浓度-时间曲线下面积结果。
图8为本发明实施例9的唾液酸-地塞米松接枝物的药效试验结果;(a)为血清中肌酐的水平,(b)为血清中尿素氮的水平,(c)为肾脏中肿瘤坏死因子-α的水平,(d)为肾脏白介素-6的水平。
图9为本发明实施例10的唾液酸-地塞米松接枝物的副作用评价结果;(a)为各组小鼠体重变化情况,(b)为各组小鼠的血糖水平,(c)为各组小鼠的红细胞水平,(d)为各组小鼠的血红蛋白水平。
图10为本发明实施例12中唾液酸-布洛芬系列接枝物抑制大鼠足肿胀结果,图为各组大鼠平均足厚度随时间变化结果。
图11为本发明实施例14中唾液酸-吲哚美辛系列接枝物抑制大鼠足肿胀结果,图为各组大鼠平均足厚度随时间变化结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将发明限制在所述的实施例范围内。
实施例1:唾液酸-酯键-地塞米松接枝物的合成
5-乙酰氨基-3,5二脱氧-D-甘油基-β-D-半乳糖-2-吡喃糖醛酸甲酯(唾液酸甲酯)的合成:于250mL三口瓶中加入N-乙酰神经氨酸10.00g(32.36mmoL),甲醇120mL,3.68moL/L的HCl甲醇溶液0.8mL(3.23mmoL)。50℃反应2h,蒸干溶液,40mL甲醇重结晶,抽滤干燥得到白色固体9.00g,即为唾液酸甲酯,收率86.2%,m.p.182-183℃。ESI-MS(m/z):346.1[M+Na]+。
(11β,16α)-9-氟-11,17-二羟基-16-甲基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮-21-氧基-1-氧代丁酸的合成:于100mL的三口瓶加入地塞米松4.00g(8.13mmoL),丁二酸酐2.44g(24.39mmoL),DMAP 1.46g(11.97mmoL),干燥四氢呋喃40mL,60℃Ar保护反应14h,然后蒸去四氢呋喃,加入100mL水,搅拌加入6mol/L盐酸4mL调pH为2。抽滤,水洗滤饼两次,干燥得4.62g白色固体。收率为94%,m.p.210-212℃。
5-乙酰氨基-9-[1-[(11β,16α)-9-氟-11,17-二羟基-16-甲基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮-21-氧基]-1-氧代丁酰氧基]-3,5-二脱氧-D-甘油基-β-D-半乳糖-2-吡喃糖醛酸甲酯的合成:于50mL单口瓶加入(11β,16α)-9-氟-11,17-二羟基-16-甲基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮-21-氧基-1-氧代丁酸0.30g(0.61mmoL),EDCI 0.23g(1.22mmoL),DMAP 0.11g(0.91mmol),三乙胺0.06g(0.61mmoL),干燥二氯甲烷8mL溶解。1h以后加入干燥吡啶溶解的唾液酸甲酯0.40g(1.22mmoL+8mL)。24h后停止反应。60℃蒸除绝大多数溶剂,得到1.20g粘稠状黄色固体。经柱层析分离(洗脱剂二氯甲烷:甲醇=10:1),得到白色固体0.10g,收率20.6%,m.p.171-172℃。ESI-MS(m/z):798.6[M+H]+,820.6[M+Na]+,832.3[M+Cl]-。其在氘代水(D2O)中的核磁共振氢谱结果如图1所示。
实施例2:唾液酸-硫醚键-地塞米松接枝物的合成
3,3'-硫代二丙酸酐的合成:于100mL的三口瓶加入硫代二丙酸20.00g(0.12moL),醋酐160mL。Ar换气两次,110℃反应4h停止反应。加入甲苯60mL,70℃减压蒸除醋酐,2h后补加50mL甲苯,继续70℃减压蒸馏,1h后停止蒸馏,将其置于冰箱下层,呈现浑浊,片刻取出加入100mL乙醚打浆,抽滤得到11.02g白色固体,收率61.1%,m.p.115-117℃。ESI-MS(m/z):183.1[M+Na]+。
(11β,16α)-9-氟-11,17-二羟基-16-甲基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮-21-氧基-1-氧代-3,3'-硫代丙酸的合成:于50mL的单口瓶加入地塞米松0.70g(1.78mmoL),3,3'-硫代二丙酸酐0.30g(1.96mmoL),0.04g(0.36mmoL)DMAP,干燥二氯甲烷20mL,干燥吡啶3mL,室温反应2h。加1mol/L盐酸30mL,二氯甲烷(20mL×3)萃取,合并有机层,水20mL萃取一次,饱和氯化钠萃取一次,无水硫酸镁干燥,过滤,浓缩,经柱层析分离(洗脱剂乙酸乙酯:石油醚=1:3),得到0.51g白色固体,收率50.7%,m.p.133-135℃。ESI-MS(m/z):551.3[M-H]-。
5-乙酰氨基-9-[1-[(11β,16α)-9-氟-11,17-二羟基-16-甲基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮-21-氧基]-1-氧代-3,3'-硫代丙酰氧基]-3,5-二脱氧-D-甘油基-β-D-半乳糖-2-吡喃糖醛酸甲酯的合成:于50mL的单口瓶加入(11β,16α)-9-氟-11,17-二羟基-16-甲基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮-21氧基-1-氧代-3,3'-硫代丙酸0.6g(1.08mmoL),EDCI 0.3g(1.62mmoL),HOBt 0.21g(1.62mmoL),三乙胺0.54g(5.4mmoL),干燥二氯甲烷5mL,活化1h后加入干燥吡啶4mL溶解的唾液酸甲酯0.51g(1.62mmoL),室温反应12h。蒸除绝大多数溶剂,得到1.8g黄色发粘固体。柱层析分离(洗脱剂二氯甲烷:甲醇=20:1),得到白色固体100mg产物。收率10.8%,m.p.138-142℃。ESI-MS(m/z):858.5[M+H]+,880.6[M+Na]+。其在氘代二甲基亚砜(DMSO)中的核磁共振氢谱结果如图2所示。
实施例3:唾液酸-腙键-地塞米松接枝物(Dex-SA)的合成
叔丁基二甲基硅氧基地塞米松(Dex-TBS)的合成:于100mL单口瓶中加入地塞米松1.12g(2.85mmoL),叔丁基二甲基氯硅烷0.47g(3.12mmoL),咪唑0.39g(5.73mmoL),DMF7mL,冰浴反应1h后,移至室温反应4h反应完全。加乙酸乙酯40mL×3萃取,水洗两次,饱和氯化钠萃取一次,无水硫酸镁干燥,过滤,浓缩,得到1.40g,收率97.1%。m.p.214~216℃。ESI-MS(m/z):529.3[M+Na]+。
3-腙基-21-叔丁基二甲基硅氧基地塞米松(NH2NH-Dex-TBS)的合成:于100mL单口瓶中加入Dex-TBS 1.4g(2.76mmoL),80%水合肼0.42g(8.3mmoL),醋酸0.03mg(0.55mmoL),甲醇12mL,室温反应,11h后停止反应。加乙酸乙酯20mL×3萃取,水洗一次,饱和氯化钠萃取一次,无水硫酸镁干燥,过滤,浓缩,得到1.5g,经柱层析分离(洗脱剂乙酸乙酯:石油醚=1:3),得到0.80g白色固体,收率55.7%。m.p.107~111℃。ESI-MS(m/z):521.3[M+H]+。
唾液酸-地塞米松接枝物(Dex-SA)的合成:于25mL单口瓶中加入(11β,16α)-3-腙基-9-氟-11,17-二羟基-21-叔丁基二甲基硅氧基-16-甲基孕甾-1,4-二烯-20-酮0.67g(1.29mmoL),唾液酸0.40g(1.29mmoL),EDCI 0.27g(1.42mmoL),HOBt 0.20g(1.42mmoL),干燥DMF 5mL。室温反应4h后加入1N的TBAF的THF溶液1.6mL(1.2mmoL),反应2h后停止反应。经柱层析分离(洗脱剂二氯甲烷:甲醇=10:1),得到0.50g类白色固体。制备色谱分离,20mL甲醇溶解,进样量1mL,流动相:水:甲醇=70:30,流速10mL/min,得到白色固体0.20g,纯度为96.56%,收率为22.3%,m.p.183~185℃。ESI-MS(m/z):698.2[M+H]+,720.2[M+Na]+。其在氘代二甲基亚砜(DMSO)中的核磁共振氢谱结果如图3所示,总的反应路线图如下所示:
实施例4:溶解度和油水分配系数(logP)的测定
水中溶解度的测定:称取过量的药物于含有2mL纯净水的EP管中,使其过饱和,水浴超声使药物充分分散以后,放入37℃的摇床中震荡72h。72h后,将样品10000rpm离心10min,取上清液,用流动相稀释后,用HPLC分析。经测定唾液酸-地塞米松接枝物在水中的溶解度为4.91±0.54mg/mL,地塞米松水中溶解度为0.084±0.01mg/mL,溶解度提高了约58倍,满足直接静脉注射给药的需求。
logP的测定:利用摇瓶法测定了地塞米松和唾液酸-地塞米松接枝物的油水分配系数。分别将2mg的药物加入到等体积混合的正辛醇-去离子水两相溶液中,涡旋3min后放入37℃摇床中震荡2h。通过HPLC分别测定两相溶液中的药物浓度,最后用下列公式计算logP值。
logP=log(正辛醇中的药物浓度/水中的药物浓度)
经测定,唾液酸-地塞米松接枝物和地塞米松的logP值分别是-0.91±0.07和1.36±0.06,唾液酸的修饰改变了地塞米松的亲脂性。
实施例5:唾液酸-地塞米松接枝物和地塞米松在血浆中的稳定性
0.5mL唾液酸-地塞米松接枝物和地塞米松溶液(0.1mg/mL)与0.5mL大鼠新鲜血浆在EP管中混合均匀,于37℃水浴摇床中孵育。在预定的时间(0,1,2,4,6,8,12,24h)取一定量混合物,甲醇沉淀蛋白后,用HPLC测定药物的浓度。每份样品一式三份。结果如图4所示,唾液酸-地塞米松接枝物和地塞米松在大鼠血浆中孵育24h后,药物含量仍然大于99%,这表明唾液酸-地塞米松接枝物和地塞米松都有着较好的血浆稳定性,这也保证了唾液酸在靶向到炎症部位之前不会脱离唾液酸-地塞米松接枝物,为靶向治疗奠定了基础。
实施例6:唾液酸-地塞米松接枝物对细胞活力的影响
采用噻唑蓝(MTT)法测定地塞米松(Dex)、地塞米松磷酸钠(DSP)、唾液酸-地塞米松接枝物(Dex-SA)以及唾液酸(SA)对小鼠单核巨噬细胞(Raw-264.7)细胞活力的影响。取对数生长期的Raw-264.7细胞,胰酶消化后用培养液稀释,分散均匀。将Raw-264.7细胞以5×103个/孔接种到96孔板中,置于5%CO2,37℃培养箱中培养24h。弃去原培养液,每孔加入100μL用新鲜培养液稀释后的系列浓度的药物溶液,每组设5个复孔,每板设对照组(加入100μL空白培养液),继续培养24h。孵育完成后,避光条件下每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL的PBS溶液),继续培养4h,弃去培养液,每孔加入100μL DMSO,避光振荡使生成的甲臜结晶溶解完全,用酶标仪于490nm处测定吸光度。细胞存活率的计算公式如下:
细胞活力(%)=(样品的吸光度-空白孔的吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔的吸光度)×100%
由实验结果(图5)可知,各药物浓度在0.01~1mM范围之内,孵育细胞24h,Raw264.7细胞的细胞活力均大于90%,显示未造成明显的细胞毒性,证明各药物生物安全性良好。
实施例7:唾液酸-地塞米松接枝物抑制大鼠足肿胀效果
取大鼠18只,称重,编号,随机分为3组,每组6只。各给药组为造模前单次尾静脉给药,给药剂量相当于1.5mg/kg地塞米松磷酸钠(DSP),对照组静脉注射相应体积生理盐水。直尺测量大鼠左后足造模前正常足跖厚度C0,给药后0.5h,每只大鼠立刻腹腔注射10%水合氯醛3.5mL/kg进行麻醉,麻醉后在大鼠左后肢足跖皮下注射0.1mL蛋清致炎,分别在致炎后15min、30min、45min、60min、120min、180min、240min和360min测定每只大鼠左后足踝关节以下组厚度Ct,按下列公式计算肿胀率%。结果显示(图6),Dex-SA的抑制效果与DSP基本无差异。
肿胀率%=(给药后各点足跖平均厚度Ct-造模前足跖平均厚度C0)/造模前足跖平均厚度C0×100%。
实施例8:唾液酸-地塞米松接枝物在急性肾损伤小鼠体内的分布情况
利用急性炎症模型(缺血再灌注诱导的急性肾损伤小鼠模型)评价了唾液酸-地塞米松接枝物和地塞米松在体内各组织的分布情况。唾液酸-地塞米松接枝物和地塞米松磷酸钠注射液分别以1.78mg/kg和1.32mg/kg的剂量静脉注射给药,给药剂量相当于1.0mg/kg的地塞米松。在给药后预定的时间点(1,2,4,8和12h),每组三只老鼠的血、心、肝、脾、肺和肾组织被收集,储存在-20℃备用。有文献报道地塞米松磷酸钠在血浆中很快转化为地塞米松,因此地塞米松磷酸钠组只监测地塞米松的含量。对于唾液酸-地塞米松接枝物,由于其具有可良好的血浆稳定性,我们监测游离的地塞米松和将唾液酸-地塞米松接枝物在体外盐酸破坏后的总的地塞米松含量。液液萃取法将地塞米松从各组织匀浆液中萃取出来,最后利用超高效液相色谱-质谱联用仪对其含量进行测定。图7(A-F)结果显示唾液酸-地塞米松接枝物组基本未检测到游离的地塞米松,药物以原型形式存在。而且发现唾液酸-地塞米松接枝物与地塞米松相比,在肾脏中分布基本无差异而在体内其他组织中分布较少。在各组织中的累积分布结果图7的(g)也表明唾液酸-地塞米松接枝物有着较高的肾脏靶向能力与地塞米松的非特异性分布相比。唾液酸-地塞米松接枝物在体内代谢较快可能与其亲水亲油的性质有关。
实施例9:唾液酸-地塞米松接枝物的靶向治疗效果
利用急性肾损伤模型对唾液酸-地塞米松接枝物的药效学进行了评价,分组如下:(1)假手术组(Sham group);(2)急性肾损伤+生理盐水组(AKI+Saline);(3)急性肾损伤+地塞米松磷酸钠组(AKI+DSP solution);(4)急性肾损伤+唾液酸-地塞米松接枝物(AKI+Dex-SA solution);(5)急性肾损伤+唾液酸组(AKI+SA solution);(6)急性肾损伤+地塞米松磷酸钠和唾液酸物理混合物组(AKI+the mixture of DSP and SA solution.)。以相当于1.0mg/kg地塞米松的剂量尾静脉注射给药,每天给药一次,持续两周。给药周期结束后,各组小鼠被安乐死,其血浆和肾组织被收集备用。我们通过监测血尿素氮(BUN)和肌酐(SCr)对肾功能进行评价,监测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)来评价炎症水平。由图8可知,生理盐水组的尿素氮和肌酐的水平明显提高,唾液酸对改善肾功能并没有帮助,而唾液酸-地塞米松接枝物与地塞米松磷酸钠、地塞米松磷酸钠与唾液酸的物理混合物有着类似的效果。除此之外,唾液酸-地塞米松接枝物的抗炎能力也与地塞米松磷酸钠治疗效果相当。
实施例10:唾液酸-地塞米松接枝物在治疗急性肾损伤过程中的副作用评估
糖皮质激素的使用常常会引起臭名昭著的副作用,如库欣综合征、骨质疏松、糖尿病等。药效实验结束后,我们对治疗过程中药物的相关副作用进行了评价,分别监测了各组小鼠体重的变化,血糖变化以及各类血细胞的变化。由图9可知,体重变化结果显示含有地塞米松磷酸钠的给药组小鼠体重增长缓慢,而唾液酸-地塞米松接枝物给药组小鼠体重未见明显异常。地塞米松磷酸钠给药组与唾液酸-地塞米松接枝物给药组相比,红细胞(RBC)和血红蛋白(HGB)水平的显著提高是地塞米松刺激造血功能的结果。除此之外,血糖水平的显著提高也是地塞米松刺激血糖升高的结果。根据上述实验结果,我们可以看出唾液酸-地塞米松接枝物能够显著降低地塞米松带来的副作用,这主要与其改变了地塞米松的代谢方式与组织分布有关。
实施例11:唾液酸-布洛芬系列接枝物
除了合成糖皮质激素类药物与唾液酸的偶联物,本实施例还进行了唾液酸-布洛芬系列接枝物的合成,唾液酸-布洛芬系列接枝物的结构式分别如下:
实施例12:唾液酸-布洛芬系列接枝物抑制大鼠足肿胀效果
取SD大鼠20只,称重,编号,随机分为4组,每组5只。各给药组为造模前单次尾静脉注射相同剂量的布洛芬、唾液酸-布洛芬接枝物以及唾液酸-乙二胺-布洛芬接枝物,对照组静脉注射相应体积生理盐水。测量大鼠左后足造模前正常足跖厚度C0,给药后0.5h,每只大鼠立刻腹腔注射10%水合氯醛3.5mL/kg进行麻醉,麻醉后在大鼠左后肢足跖皮下注射0.1mL蛋清致炎,分别在致炎后15min、30min、45min、60min、120min、180min、240min和360min测定每只大鼠左后足踝关节以下组厚度Ct,按下列公式计算肿胀率%。结果显示(图10),两种唾液酸-布洛芬系列接枝物的抑制效果与布洛芬基本无差异。
肿胀率%=(给药后各点足跖平均厚度Ct-造模前足跖平均厚度C0)/造模前足跖平均厚度C0×100%。
并且,对本实施例得到的唾液酸-布洛芬系列接枝物,也进行了同唾液酸-地塞米松系列接枝物的相关试验,证明经过唾液酸修饰后,唾液酸-布洛芬系列接枝物均能够明显提高布洛芬在炎症部位的靶向效率,降低药物在非靶向器官的分布,降低药物相关副作用。
实施例13:唾液酸-吲哚美辛系列接枝物
除了合成地塞米松与唾液酸的接枝物、布洛芬与唾液酸的接枝物,在本实施例还进行了唾液酸-吲哚美辛系列接枝物的合成,其结构式如下:
实施例14:唾液酸-吲哚美辛系列接枝物抑制大鼠足肿胀效果
取SD大鼠20只,称重,编号,随机分为4组,每组5只。各给药组为造模前单次尾静脉注射相同剂量的吲哚美辛、唾液酸-吲哚美辛以及唾液酸-乙二胺-吲哚美辛,对照组静脉注射相应体积生理盐水。测量大鼠左后足造模前正常足跖厚度,给药后0.5h,每只大鼠立刻腹腔注射10%水合氯醛3.5mL/kg进行麻醉,麻醉后在大鼠左后肢足跖皮下注射0.1mL蛋清致炎,分别在致炎后15min、30min、45min、60min、120min、180min、240min和360min测定每只大鼠左后足踝关节以下组厚度Ct,按下列公式计算肿胀率%。结果显示(图11),两种唾液酸-吲哚美辛系列接枝物与吲哚美辛相比,其抑制足肿胀效果相当。
肿胀率%=(给药后各点足跖平均厚度Ct-造模前足跖平均厚度C0)/造模前足跖平均厚度C0×100%。
并且,对本实施例得到的唾液酸-吲哚美辛系列接枝物,也进行了同唾液酸-地塞米松系列接枝物的相关试验,证明经过唾液酸修饰后,唾液酸-吲哚美辛系列接枝物能够不同程度地改善药物在炎症部位的分布,提高药物在疾病部位的靶向效率,从而降低药物在非靶向器官的分布,降低副作用。
Claims (5)
1.一种结构通式(I)或结构通式(II)所示的唾液酸衍生物修饰的化合物,
上式中,A部分为唾液酸,R1,R2,R3,R4,R5,R6独自表示为氢,C1-C5烷基,乙酸酯基;B部分为连接基团,选自酯基、硫醚键、腙键;C部分为糖皮质激素甾体类抗炎药,选自氢化可的松,泼尼松,地塞米松中的一种。
2.根据权利要求1所述的唾液酸衍生物修饰的化合物,其特征在于,所述化合物为:
3.权利要求1或2所述的唾液酸衍生物修饰的化合物在制备靶向治疗足肿胀的药物中的应用。
4.权利要求1或2所述的唾液酸衍生物修饰的化合物在制备靶向治疗急性肾损伤药物中的应用。
5.根据权利要求3或4所述的应用,其特征在于,所述的靶向治疗急性肾损伤药物和足肿胀的药物为注射给药药物、口服给药药物或局部给药药物中的一种。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210581456.6A CN114891057B (zh) | 2022-05-26 | 2022-05-26 | 唾液酸衍生物修饰的化合物及其合成方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210581456.6A CN114891057B (zh) | 2022-05-26 | 2022-05-26 | 唾液酸衍生物修饰的化合物及其合成方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114891057A CN114891057A (zh) | 2022-08-12 |
CN114891057B true CN114891057B (zh) | 2023-10-17 |
Family
ID=82727066
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210581456.6A Active CN114891057B (zh) | 2022-05-26 | 2022-05-26 | 唾液酸衍生物修饰的化合物及其合成方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114891057B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116270549A (zh) * | 2023-03-21 | 2023-06-23 | 沈阳药科大学 | 一种靶向结肠炎的氧化苦参碱的纳米粒及其制备方法和应用 |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993021198A1 (en) * | 1992-04-13 | 1993-10-28 | Mect Corporation | Novel sialylsteroid |
WO1995009177A1 (fr) * | 1993-09-29 | 1995-04-06 | Nissin Shokuhin Kabushiki Kaisha | Compose steroide substitue en position 21 |
CN101475484A (zh) * | 2009-01-05 | 2009-07-08 | 东南大学 | 骨靶向抗炎药物合成方法及其应用 |
CN106188169A (zh) * | 2016-07-07 | 2016-12-07 | 沈阳药科大学 | 一种含有唾液酸基团的脂质衍生物的合成及其在药物制剂中的应用 |
CN106822910A (zh) * | 2017-01-18 | 2017-06-13 | 浙江大学 | 唾液酸‑聚乙二醇‑地塞米松嫁接物及合成方法和应用 |
CN110354076A (zh) * | 2019-06-24 | 2019-10-22 | 浙江大学 | 一种唾液酸修饰复合纳米给药系统及制备与应用 |
CN110577557A (zh) * | 2018-06-08 | 2019-12-17 | 沈阳药科大学 | 唾液酸脂质衍生物及其制备方法和应用 |
CN113024400A (zh) * | 2021-03-08 | 2021-06-25 | 沈阳药科大学 | 一种秋水仙碱衍生物及其制备方法和应用 |
CN113827738A (zh) * | 2020-06-08 | 2021-12-24 | 沈阳药科大学 | 唾液酸修饰地塞米松棕榈酸酯脂质体及其制备和应用 |
-
2022
- 2022-05-26 CN CN202210581456.6A patent/CN114891057B/zh active Active
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993021198A1 (en) * | 1992-04-13 | 1993-10-28 | Mect Corporation | Novel sialylsteroid |
WO1995009177A1 (fr) * | 1993-09-29 | 1995-04-06 | Nissin Shokuhin Kabushiki Kaisha | Compose steroide substitue en position 21 |
CN101475484A (zh) * | 2009-01-05 | 2009-07-08 | 东南大学 | 骨靶向抗炎药物合成方法及其应用 |
CN106188169A (zh) * | 2016-07-07 | 2016-12-07 | 沈阳药科大学 | 一种含有唾液酸基团的脂质衍生物的合成及其在药物制剂中的应用 |
CN106822910A (zh) * | 2017-01-18 | 2017-06-13 | 浙江大学 | 唾液酸‑聚乙二醇‑地塞米松嫁接物及合成方法和应用 |
CN110577557A (zh) * | 2018-06-08 | 2019-12-17 | 沈阳药科大学 | 唾液酸脂质衍生物及其制备方法和应用 |
CN110354076A (zh) * | 2019-06-24 | 2019-10-22 | 浙江大学 | 一种唾液酸修饰复合纳米给药系统及制备与应用 |
CN113827738A (zh) * | 2020-06-08 | 2021-12-24 | 沈阳药科大学 | 唾液酸修饰地塞米松棕榈酸酯脂质体及其制备和应用 |
CN113024400A (zh) * | 2021-03-08 | 2021-06-25 | 沈阳药科大学 | 一种秋水仙碱衍生物及其制备方法和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114891057A (zh) | 2022-08-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR20110010753A (ko) | 트레프로스티닐 일수화물 | |
US8435962B2 (en) | Triacetyl-3-hydroxyphenyladenosine and its use for regulating blood fat | |
CN114891057B (zh) | 唾液酸衍生物修饰的化合物及其合成方法和应用 | |
Hwang et al. | Orally active desulfated low molecular weight heparin and deoxycholic acid conjugate, 6ODS-LHbD, suppresses neovascularization and bone destruction in arthritis | |
CN111333692B (zh) | 一种白桦脂酸衍生物及其制备方法和应用 | |
WO2001079302A1 (fr) | Combinaison d'acide folique et de polysaccharide, son procede de preparation et composition pharmaceutique contenant cette combinaison agissant comme principe actif | |
CN108164512B (zh) | 一类具有生物粘附作用的马来酰亚胺型前药及其在口服药物传递中的应用 | |
CZ291612B6 (cs) | Deriváty Ara-C, farmaceutické kompozice, které je obsahují a jejich použití | |
CN106631957B (zh) | 一种靶向FAP-alpha酶的抗肿瘤化合物及其制备方法与应用 | |
CN113181186A (zh) | 3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪类化合物在药物制备中的应用 | |
WO2023221320A1 (zh) | 一种改进的低毒高效原酸酯混溶物药用辅料、制备方法、包含该辅料的局部缓释给药制剂 | |
CN101518654B (zh) | 一种可携带糖皮质激素作为炎症靶向药物制剂的合成方法 | |
CN110183459A (zh) | α-倒捻子素衍生物及其制备方法和应用 | |
EP3431478B1 (en) | Micromolecular lung-targeting drug | |
EP4071141A1 (en) | Weak alkaline cabazitaxel derivative and formulation thereof | |
CN112979667A (zh) | 二氧六环修饰的四氢咔啉-3-甲酰-The,其合成,活性和应用 | |
CN110028544B (zh) | 11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯、衍生物、斑蝥素脂质体、制备方法和应用 | |
EP2259785B1 (en) | Fullerene therapies for inflammation | |
CN107998403B (zh) | Peg修饰的三十烷醇水溶性前药 | |
WO2023109563A1 (zh) | 一种卡巴他赛前药抗肿瘤制剂 | |
US20160038439A1 (en) | Use of 7-a-[9-(4,4,5,5,5-pentafluoropentylsulfinyl)nonyl]-estra-1,3,5(10)- triene-3,17B-diol and derivatives thereof | |
CN111606909B (zh) | 吡唑并嘧啶类化合物及其药物组合物及制备方法和应用 | |
CN102977175B (zh) | 氨基葡萄糖衍生物作为小分子药物肾靶向修饰基团的用途 | |
CN114262299B (zh) | 一种抗神经炎性化合物及其制备方法和医药用途 | |
WO2023016075A1 (zh) | 一种二氢-2h-异吲哚酯类化合物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |