CN106822910A - 唾液酸‑聚乙二醇‑地塞米松嫁接物及合成方法和应用 - Google Patents

唾液酸‑聚乙二醇‑地塞米松嫁接物及合成方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种唾液酸‐聚乙二醇‐地塞米松嫁接物，由唾液酸、地塞米松和具有两端羧基的聚乙二醇嫁接而成。先通过聚乙二醇上的一端羧基在N,N'‐二环己基碳二亚胺和4‐二甲氨基吡啶作用下与地塞米松上的羟基发生酯化反应合成聚乙二醇‐地塞米松嫁接物，再通过聚乙二醇上另一端羧基在N,N'‐二环己基碳二亚胺和4‐二甲氨基吡啶作用下与唾液酸上的羟基发生酯化反应合成唾液酸‐聚乙二醇‐地塞米松嫁接物。该嫁接物在水性介质中通过自聚集形成胶团，有效负载水难溶性抗炎药物地塞米松，通过唾液酸介导快速与急性损伤肾脏的血管内皮细胞表面特异性表达的E‐selectin受体结合，实现对急性肾损伤的高效靶向治疗。可作为难溶性抗炎药物载体，应用于生命科学领域与制药领域。所述嫁接物结构式如下。

Description

唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物及合成方法和应用
技术领域
本发明属化合物合成方法，涉及唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物和合成方法，以及唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物作为胶团载体在制备治疗急性肾损伤药物中的应用。
背景技术
聚合物胶团是目前最具应用前景的纳米靶向治疗体系之一。配体介导的聚合物胶团可将药物转运到特定靶位，通过与靶器官受体结合从而发挥控释靶向作用。主要有以下优点：(1)通过增加溶解度来提高药物的生物利用度；(2)可有效防止药物在体内循环运输过程中失活及保持药物自身活性；(3)改变原药药代动力学性质；(4)降低药物抗原活性以使身体的免疫反应显著减少；(5)使药物具有主动或被动靶向作用，能准确地到达病灶部位。亲水性共聚物聚乙二醇具有良好的柔韧性，可在血浆中形成足够密的“构象云”，防止微粒聚集，不易受血浆蛋白和补体的调理，尽可能地避免被网状内皮系统、中性粒细胞、巨嗜细胞吞噬，可在一定程度上延长药物在体内的循环时间。
唾液酸是一类广泛存在于生物系统中的神经氨酸衍生物，参与细胞表面多种生理功能，在调节人体生理、生化功能方面起到非常重要的作用，其生物学活性基本上可以分为3类：(1)唾液酸本身作为被识别的受体作用；(2)细胞之间的信息传递；(3)通过阻止或减弱细胞或分子对其特异性识别部位的接触所起的掩蔽作用；作为被识别的受体，其配体种类繁多，如激素、凝集素、抗体等分子，主要调节炎症和免疫反应中细胞与细胞的黏附过程。近期研究表明，唾液酸可与血管内皮细胞在炎症状态下特异性表达的E-selectin受体结合。
急性肾损伤是一种由多种侵袭因素造成肾功能在短期内急性减退的临床综合征，包括肾功能从微小改变到最终肾衰竭的整个过程，通常表现为尿量减少、氮质血症、体液平衡紊乱、电解质紊乱、代谢性酸中毒、神经及血液系统紊乱等。目前的治疗方式主要集中在药物治疗和血液净化，地塞米松是临床上常用的抗炎药物，但该药物用于急性肾损伤时存在不同程度的肾外效应，靶向性不强，长期使用该药物会引起一系列不良反应。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物，该嫁接物由唾液酸、地塞米松和不同聚合度的两端羧基的聚乙二醇通过化学嫁接而成，其化学结构式如下：
其中聚乙二醇的聚合度(n)为22～220。
本发明的第二个目的是提供唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物的合成方法，分两步进行嫁接，第一步合成聚乙二醇-地塞米松嫁接物，通过聚乙二醇上的一端羧基在N,N'-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶作用下与地塞米松上的羟基发生酯化反应合成聚乙二醇-地塞米松嫁接物。第二步是聚乙二醇上的另外一端羧基在N,N'-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶作用下与唾液酸上的羟基发生酯化反应合成唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物。具体步骤如下：
1.聚乙二醇-地塞米松嫁接物的合成
称取聚乙二醇(5.00g)、N,N'-二环己基碳二亚胺(1.55g)和4-二甲氨基吡啶(0.3g)(三者投料摩尔比为1：3：0.3)置于100mL干燥圆底烧瓶中，加入15mL无水二甲基甲酰胺，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应30min以活化聚乙二醇上的羧基，向圆底烧瓶中加入精密称量的0.98g地塞米松，在氮气保护下继续反应24h，反应结束后，将反应产物置于截留分子量为3500的透析袋中，用纯水持续透析48h，收集透析袋中的混悬液，于4000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，采用柱层析分离法对得到的冻干产物进行纯化：将得到的冻干产物通过Sephadex G-50葡聚糖凝柱，用pH7.4PBS洗脱，分离聚乙二醇-地塞米松嫁接物和地塞米松-聚乙二醇-地塞米松嫁接物及游离地塞米松，收集洗脱液，再次冻干，即得聚乙二醇-地塞米松嫁接物，反应路线如下：
2.唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物的合成
称取聚乙二醇-地塞米松嫁接物(4.31g)、N,N'-二环己基碳二亚胺(1.11g)和4-二甲氨基吡啶(0.66g)(三者投料摩尔比为1：3：0.3)置于100mL干燥圆底烧瓶中，加入15mL无水二甲基甲酰胺，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应30min以活化聚乙二醇-地塞米松嫁接物的羧基，向圆底烧瓶中加入精密称量的0.61g唾液酸，在氮气保护下继续反应24h，反应结束后，将反应产物置于截留分子量为3500的透析袋中，用纯水持续透析48h，收集透析袋中的混悬液，于4000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，即得唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物固体，反应路线同上。
本发明的第三个目的是提供唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物作为胶团载体在制备治疗急性肾损伤药物中的应用。唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物可在水性介质中通过自聚集形成胶团，该胶团可有效负载水难溶性抗炎药物地塞米松，并可通过唾液酸的介导与急性损伤肾脏的血管内皮细胞表面特异性表达的E-selectin受体结合，实现对急性肾损伤的高效靶向治疗。
本发明合成了唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物，该嫁接物可在水性介质中，通过自聚集形成胶团，负载水难溶性抗炎药物地塞米松，在唾液酸的作用下可快速与血管内皮细胞表面特异性表达的E-selectin受体结合，实现对急性肾损伤的高效治疗。本发明提供的唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物所形成的胶团，可作为难溶性抗炎药物载体，应用于生命科学领域与制药领域。利用这种载体，在室温条件下呈胶团实现对药物的包封，并具有对药物的缓释功能，通过唾液酸的修饰，实现对炎症部位的靶向，从而大幅度提高药物的疗效。
附图说明
图1.唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物载药胶团的体外药物释放曲线。
图2.载荧光标记物吲哚菁绿的唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶团的体内分布照片。
图3.载荧光标记物吲哚菁绿的唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶团的体内分布半定量结果。
图4.唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物载药胶团的体内抗炎效果。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例一
1.唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物的合成
唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物分两步进行嫁接，第一步合成聚乙二醇-地塞米松嫁接物，称取聚合度为44的聚乙二醇(5.00g)、N,N'-二环己基碳二亚胺(1.55g)和4-二甲氨基吡啶(0.3g)(三者投料摩尔比为1：3：0.3)置于100mL干燥圆底烧瓶中，加入15mL无水二甲基甲酰胺，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应30min以活化聚乙二醇的羧基，向圆底烧瓶中加入精密称量的0.98g地塞米松，在氮气保护下继续反应24h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为3500的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于4000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，采用柱层析分离法对得到的冻干产物进行纯化：将得到的冻干产物通过Sephadex G-50葡聚糖凝柱，用pH7.4PBS洗脱，分离聚乙二醇-地塞米松嫁接物和地塞米松-聚乙二醇-地塞米松嫁接物及游离地塞米松，收集洗脱液，再次冻干，即得聚乙二醇-地塞米松嫁接物，反应路线如下所示：
利用核磁共振仪对聚乙二醇-地塞米松嫁接物的结构进行确证。取聚乙二醇-地塞米松嫁接物10mg溶于0.5mL d6-二甲亚砜中，使其最终浓度为20mg/mL，用核磁共振仪记录核磁共振氢谱，并计算聚乙二醇-地塞米松的接枝率。结果显示聚乙二醇-地塞米松的接枝率为1:1，即每个聚乙二醇-地塞米松嫁接物中含有地塞米松结构单元1个。
精密称取聚乙二醇-地塞米松嫁接物10mg，分散于适量去离子水中，用去离子水定容至10mL，探头超声30次(400W，共作2s停3s)，得到1.0mg/mL的胶团溶液。取聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶团溶液适量，用微粒粒度与表面电位测定仪与表面电位测定仪测定胶团的粒径。经测定，聚乙二醇-地塞米松嫁接物的粒径为42.7±3.7nm。
第二步合成唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物，称取聚乙二醇-地塞米松嫁接物(4.31g)、N,N'-二环己基碳二亚胺(1.11g)和4-二甲氨基吡啶(0.66g)(三者投料摩尔比为1：3：0.3)置于100mL干燥圆底烧瓶中，加入15mL无水二甲基甲酰胺，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应30min以活化聚乙二醇-地塞米松嫁接物的羧基，向圆底烧瓶中加入精密称量的0.61g唾液酸，在氮气保护下继续反应24h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为3500的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于4000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，即得唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物固体，反应路线同上。
利用核磁共振仪对唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物的结构进行确证。取唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物各10mg溶于0.5mL d6-二甲亚砜中，使其最终浓度为20mg/mL，用核磁共振仪记录核磁共振氢谱，并计算唾液酸的接枝率。结果显示唾液酸的接枝率为1:1，即每个唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物中含有唾液酸结构单元1个。
采用芘荧光法测定唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物的临界胶团浓度。取嫁接物10mg溶解于蒸馏水，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml。将1mg/mL的嫁接物溶液稀释成不同浓度的共聚物溶液各10mL，分别加入定量的芘(芘的终浓度为7×10-7mol/L)，水浴超声(400w，30min)。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定荧光强度，并计算临界胶团浓度。经测定，唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物的临界胶团浓度为63.9μg/mL。
精密称取唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物10mg，分散于适量去离子水中，用去离子水定容至10mL，探头超声30次(400W，共作2s停3s)，得到1.0mg/mL的胶团溶液。取唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶团溶液适量，用微粒粒度与表面电位测定仪与表面电位测定仪测定胶团的粒径。经测定，唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶团的粒径为58.47±8.81nm。
实施例二
1.唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物的合成
唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物分两步进行嫁接，第一步合成聚乙二醇-地塞米松嫁接物，称取聚合度为22的聚乙二醇(2.5g)、N,N'-二环己基碳二亚胺(0.775g)和4-二甲氨基吡啶(0.15g)(三者投料摩尔比为1：3：0.3)置于50mL干燥圆底烧瓶中，加入10mL无水二甲基甲酰胺，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应30min以活化聚乙二醇的羧基，向圆底烧瓶中加入精密称量的0.49g地塞米松，在氮气保护下继续反应24h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为3500的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于4000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥。采用柱层析分离法对对得到的冻干产物进行纯化，即得聚乙二醇-地塞米松嫁接物，反应路线如实施例一所示。
利用核磁共振仪对聚乙二醇-地塞米松嫁接物的结构进行确证。取聚乙二醇-地塞米松嫁接物10mg溶于0.5mL d6-二甲亚砜中，使其最终浓度为20mg/mL，用核磁共振仪记录核磁共振氢谱，并计算聚乙二醇-地塞米松的接枝率。结果显示聚乙二醇-地塞米松的接枝率为1:1，即每个聚乙二醇-地塞米松嫁接物中含有地塞米松结构单元1个。
精密称取聚乙二醇-地塞米松嫁接物10mg，分散于适量去离子水中，用去离子水定容至10mL，探头超声30次(400W，共作2s停3s)，得到1.0mg/mL的胶团溶液。取聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶团溶液适量，用微粒粒度与表面电位测定仪与表面电位测定仪测定胶团的粒径。经测定，聚乙二醇-地塞米松嫁接物的粒径为29.62±4.6nm。
第二步合成唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物，称取聚乙二醇-地塞米松嫁接物(2.15g)、N,N'-二环己基碳二亚胺(0.65g)和4-二甲氨基吡啶(0.33g)(三者投料摩尔比为1：3：0.3)置于50mL干燥圆底烧瓶中，加入10mL无水二甲基甲酰胺，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应30min以活化聚乙二醇-地塞米松嫁接物的羧基，向圆底烧瓶中加入精密称量的0.31g唾液酸，在氮气保护下继续反应24h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为3500的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于4000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，即得唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物固体，反应路线如实施例一所示。
利用核磁共振仪对唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物的结构进行确证。取唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物各10mg溶于0.5mL d6-二甲亚砜中，使其最终浓度为20mg/mL，用核磁共振仪记录核磁共振氢谱，并计算唾液酸的接枝率。结果显示唾液酸的接枝率为1:1，即每个唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物中含有唾液酸结构单元1个。
采用芘荧光法测定唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物的临界胶团浓度。取嫁接物10mg溶解于蒸馏水，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml。将1mg/mL的嫁接物溶液稀释成不同浓度的共聚物溶液各10mL，分别加入定量的芘(芘的终浓度为7×10-7mol/L)，水浴超声(400w，30min)。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定荧光强度，并计算临界胶团浓度。经测定，唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物的临界胶团浓度为78.3μg/mL。
精密称取唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物10mg，分散于适量去离子水中，用去离子水定容至10mL，探头超声30次(400W，共作2s停3s)，得到1.0mg/mL的胶团溶液。取唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶团溶液适量，用微粒粒度与表面电位测定仪与表面电位测定仪测定胶团的粒径。经测定唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶团的粒径为31.26±6.71nm。
实施例三
1.唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物的合成
唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物分两步进行嫁接，第一步合成聚乙二醇-地塞米松嫁接物，称取聚合度为220的聚乙二醇(10g)、N,N'-二环己基碳二亚胺(0.618g)和4-二甲氨基吡啶(0.036g)(三者投料摩尔比为1：3：0.3)置于100mL干燥圆底烧瓶中，加入15mL无水二甲基甲酰胺，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应30min以活化聚乙二醇的羧基，向圆底烧瓶中加入精密称量的0.392g地塞米松，在氮气保护下继续反应24h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为3500的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于4000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥。采用柱层析分离法对对得到的冻干产物进行纯化，即得聚乙二醇-地塞米松嫁接物，反应路线如实施例一所示。
利用核磁共振仪对聚乙二醇-地塞米松嫁接物的结构进行确证。取聚乙二醇-地塞米松嫁接物10mg溶于0.5mL d6-二甲亚砜中，使其最终浓度为20mg/mL，用核磁共振仪记录核磁共振氢谱，并计算聚乙二醇-地塞米松的接枝率。结果显示聚乙二醇-地塞米松的接枝率为1:1，即每个聚乙二醇-地塞米松嫁接物中含有地塞米松结构单元1个。
精密称取聚乙二醇-地塞米松嫁接物10mg，分散于适量去离子水中，用去离子水定容至10mL，探头超声30次(400W，共作2s停3s)，得到1.0mg/mL的胶团溶液。取聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶团溶液适量，用微粒粒度与表面电位测定仪与表面电位测定仪测定胶团的粒径。经测定，聚乙二醇-地塞米松嫁接物的粒径为51.35±6.8nm。
第二步合成唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物，称取聚乙二醇-地塞米松嫁接物(8g)、N,N'-二环己基碳二亚胺(0.49g)和4-二甲氨基吡啶(0.039g)(三者投料摩尔比为1：3：0.3)置于100mL干燥圆底烧瓶中，加入15mL无水二甲基甲酰胺，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应30min以活化聚乙二醇-地塞米松嫁接物的羧基，向圆底烧瓶中加入精密称量的0.24g唾液酸，在氮气保护下继续反应24h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为3500的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于4000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，即得唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物固体，反应路线如实施例一所示。
利用核磁共振仪对唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物的结构进行确证。取唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物各10mg溶于0.5mL d6-二甲亚砜中，使其最终浓度为20mg/mL，用核磁共振仪记录核磁共振氢谱，并计算唾液酸的接枝率。结果显示唾液酸的接枝率为1:1，即每个唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物中含有唾液酸结构单元1个。
采用芘荧光法测定唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物的临界胶团浓度。取嫁接物10mg溶解于蒸馏水，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml。将1mg/mL的嫁接物溶液稀释成不同浓度的共聚物溶液各10mL，分别加入定量的芘(芘的终浓度为7×10-7mol/L)，水浴超声(400w，30min)。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定荧光强度，并计算临界胶团浓度。经测定，唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物的临界胶团浓度为37.8μg/mL。
精密称取唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物10mg，分散于适量去离子水中，用去离子水定容至10mL，探头超声30次(400W，共作2s停3s)，得到1.0mg/mL的胶团溶液。取唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶团溶液适量，用微粒粒度与表面电位测定仪与表面电位测定仪测定胶团的粒径。经测定唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶团的粒径为31.26±6.89nm。
实施例四
1.唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物载地塞米松胶团的制备
精密称取地塞米松10mg，溶于乙醇中制备得到1mg/mL地塞米松乙醇溶液，地塞米松：唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物(实施例一)＝10％(w/w)的投药量加入一定量的1mg/mL地塞米松乙醇溶液，快速注入搅拌的水溶液中并持续搅拌10min后，转移入截留分子量为3500的透析袋中，纯水透析24h。将透析后的产物低温离心(4000r/min，10min)以除去未被嫁接物胶团包载的药物，收集上清液，避光低温保存备用。
采用高效液相色谱法测定地塞米松的含量。标准曲线：取1.0mg/mL的地塞米松乙醇溶液，用流动相(甲醇：水＝3：2)稀释成一系列浓度，通过高效液相色谱仪测定仪测定其峰面积(检测波长240nm)，以峰面积为纵坐标，药物浓度为横坐标，绘制地塞米松标准曲线。
采用水解法测定嫁接物载药胶团的药物的载药量。精密称取5mg唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物溶于8mL 0.05mol·L-1NaOH溶液中，在25℃水解20min，取0.5mL水解液用1mol·L-1HCl溶液调至中性，用流动相将溶液稀释至l mL，采用高效液相色谱法测定地塞米松浓度，得到唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物中地塞米松的含量。同法，称取5mg唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物载地塞米松胶团溶于8mL 0.05mol·L-1NaOH溶液中，在25℃水解20min，取0.5mL水解液用1mol·L-1HCI溶液调至中性，用流动相将溶液稀释至l mL，采用高效液相色谱法测定地塞米松浓度，得到唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物载地塞米松胶团中地塞米松的总含量，用胶团负载的地塞米松含量＝总含量减去嫁接的地塞米松含量。按下式分别计算药物载药量。
载药量＝(胶团中的药物量/载药胶团总量)×100％
经测定，唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物载药胶团的载药量为6.28％。
2.唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物载药胶团的体外药物释放行为
为确证药物的释放符合漏槽条件，本研究测定了地塞米松在释放介质pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中的饱和溶解度。实验方法如下：精密称取地塞米松10mg，将其充分分散于10mL磷酸盐缓冲溶液中，将上述溶液转移至释放管中，并将释放管置于37℃，60rpm恒温振荡。分别于24h,48h,72h,96h及120h取样。将样品于8000rpm下离心处理10min，荧光分光光度法测定上清液中地塞米松的浓度，按照标准曲线计算得到地塞米松在pH7.4PBS中的饱和溶解度。
为保证载药胶团体外释放的总药量及释放初始体积相等，分别移取一定体积的载药胶团溶液，用去离子水稀释至终体积为3mL。将载药胶团溶液置于截留分子量为3500的透析袋后放入装有30mL释放介质(pH7.4磷酸盐缓冲溶液)的释放管中。在37℃，60rpm恒温振荡下进行体外释放，在特定时间点(1h，3h，5h，7h，9h，12h，24h及48h)取样，同时更换全部释放介质。用高效液相色谱法测定样品中的药物浓度(检测波长为240nm)，计算药物的累积释放量及累计释放百分率。
经测定，唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物载药胶团的释放行为如图1所示，唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物载药胶团与聚乙二醇-地塞米松嫁接物载药胶团相对比，两者的释放行为相似，表明唾液酸修饰对载药胶团的释放行为没有影响。
3.载荧光标记物吲哚菁绿的唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶团的体内分布
采用吲哚菁绿作为荧光标记物考察唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶团载的体内分布情况，按照唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物载地塞米松胶团的制备方法来负载荧光标记物吲哚菁绿。采用脂多糖诱导来小鼠急性肾损伤模型，尾静脉注射载荧光标记物吲哚菁绿的唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶团溶液和聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶团溶液0.2mL，注射后12h处死动物，取各组织脏器用活体荧光成像观察载吲哚菁绿胶团的荧光信号分布。
如图2和图3所示，唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶团在急性肾损伤小鼠肾脏部位的分布要多于其在正常小鼠肾脏部位的分布，同时唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶团在急性肾损伤小鼠肾脏部位的分布也多于聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶团在急性肾损伤小鼠肾脏部位的分布，表明唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物胶团通过靶向肾脏血管内皮细胞实现其对急性肾损伤模型动物的肾脏部位有更好的趋向性。
4.唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物载地塞米松胶团的抗炎效果
采用脂多糖诱导来小鼠急性肾损伤模型后，尾静脉给予唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物载药胶团评价其体内抗炎效果。将ICR小鼠随机分别假手术组、急性肾损伤+生理盐水组、急性肾损伤+地塞米松组、急性肾损伤+聚乙二醇-地塞米松嫁接物载地塞米松胶团组和急性肾损伤+唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物载地塞米松胶团组，在给药后第2和第7天评价动物肾脏的炎症因子水平。结果如图4所示，唾液酸-聚乙二醇-地塞米松嫁接物载地塞米松胶团可显著降低炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)的表达。

Claims (4)

1.一种唾液酸‐聚乙二醇‐地塞米松嫁接物，该嫁接物由唾液酸、地塞米松和不同聚合度的两端羧基的聚乙二醇通过化学嫁接而成，其特征在于，其化学结构式如下：
其中聚乙二醇的聚合度(n)为22～220。
2.一种唾液酸‐聚乙二醇‐地塞米松嫁接物的合成方法，其特征在于，分两步进行嫁接，第一步合成聚乙二醇‐地塞米松嫁接物，通过聚乙二醇上的一端羧基在N,N'‐二环己基碳二亚胺和4‐二甲氨基吡啶作用下与地塞米松上的羟基发生酯化反应合成聚乙二醇‐地塞米松嫁接物。第二步是聚乙二醇上的另外一端羧基在N,N'‐二环己基碳二亚胺和4‐二甲氨基吡啶作用下与唾液酸上的羟基发生酯化反应合成唾液酸‐聚乙二醇‐地塞米松嫁接物，具体步骤如下：
(1)聚乙二醇‐地塞米松嫁接物的合成
称取聚乙二醇、N,N'‐二环己基碳二亚胺和4‐二甲氨基吡啶，三者投料摩尔比为1：3：0.3，置于干燥圆底烧瓶中，加入15mL无水二甲基甲酰胺，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应30min以活化聚乙二醇上的羧基，向圆底烧瓶中加入精密称量的0.98g地塞米松，在氮气保护下继续反应24h，反应结束后，将反应产物置于截留分子量为3500的透析袋中，用纯水持续透析48h，收集透析袋中的混悬液，于4000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，采用柱层析分离法对得到的冻干产物进行纯化，即得聚乙二醇‐地塞米松嫁接物，反应路线如下：
(2)唾液酸‐聚乙二醇‐地塞米松嫁接物的合成
称取聚乙二醇‐地塞米松嫁接物、N,N'‐二环己基碳二亚胺和4‐二甲氨基吡啶，三者投料摩尔比为1：3：0.3，置于干燥圆底烧瓶中，加入15mL无水二甲基甲酰胺，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应30min以活化聚乙二醇‐地塞米松嫁接物的羧基，向圆底烧瓶中加入精密称量的0.61g唾液酸，在氮气保护下继续反应24h，反应结束后，将反应产物置于截留分子量为3500的透析袋中，用纯水持续透析48h，收集透析袋中的混悬液，于4000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，即得唾液酸‐聚乙二醇‐地塞米松嫁接物固体，反应路线同步骤(1)。
3.根据权利要求2所述的一种唾液酸‐聚乙二醇‐地塞米松嫁接物的合成方法，其特征在于，步骤(1)所述的采用柱层析分离法对得到的冻干产物进行纯化是将得到的冻干产物通过Sephadex G‐50葡聚糖凝柱，用pH7.4PBS洗脱，分离聚乙二醇‐地塞米松嫁接物和地塞米松‐聚乙二醇‐地塞米松嫁接物及游离地塞米松，收集洗脱液，再次冻干。
4.权利要求1所述的一种唾液酸‐聚乙二醇‐地塞米松嫁接物作为胶团载体在制备治疗急性肾损伤药物中的应用。
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