CN104311831A - A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物及制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物，该共聚物由D-葡萄吡喃糖（），D-葡萄吡喃糖-聚乳酸-羟基乙酸（），A54-D-葡萄吡喃糖（
Description
技术领域
本发明属化合物合成方法，涉及A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物和合成方法，以及作为胶束载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
在过去的几十年里，聚合物胶束作为一种潜在的载体，在药物输送系统中得到广泛的关注。 聚合物胶束具有核-壳结构，其疏水性链段构成胶团的内核，可作为难溶性药物的储库；亲水性链段形成胶团的外壳，可以保持胶团在水性环境中的稳定性。另外，可以对聚合物胶束进行理化性质修饰以达到特定的目的，如胶团的主动靶向等。 目前，聚合物胶束主要用作难溶性药物的载体，特别是抗肿瘤药物的载体。由于其粒径一般小于100nm，可通过“增强的透过及滞留效应”聚集于肿瘤部位。
寻靶肽作为靶向制剂的主动靶向修饰物质，在肿瘤治疗中发挥着越来越重要的作用。 在过去的十年中，研究人员成功地使用噬菌体展示技术证明，与细胞表面结合的多肽可应用于肿瘤靶向。这些寻靶肽的优势包括相对分子量小、易于合成，具有较低的细胞毒性和免疫原性、在体内可降解等。 肝癌结合肽AGKGTPSLETTP（A54）是从噬菌体展示随机肽库体内筛选出来的，可有效靶向结合人肝癌细胞系BEL-7402细胞表面。
发明内容
本发明的一个目的是提供A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物，该共聚物由D-葡萄吡喃糖（ ），D-葡萄吡喃糖-聚乳酸-羟基乙酸（），A54-D-葡萄吡喃糖（）三种结构单元无规交替而成。三种结构单元为：
其中，A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物中所使用的葡聚糖的分子量为10kDa-100kDa；结构单元中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为1.5kDa，其乳酸和羟基乙酸的比例（x﹕y）为70﹕30；每个A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物中含有D-葡萄吡喃糖-聚乳酸-羟基乙酸结构单元（）1～3个； A54为多肽，其序列为丙氨酸-甘氨酸-赖氨酸-丙氨酸-苏氨酸-脯氨酸-丝氨酸-亮氨酸-谷氨酸-苏氨酸-苏氨酸-脯氨酸（AGKATPSLETTP）；每个A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物中含有 A54-D-葡萄吡喃糖结构单元（）1~2个。
本发明的第二个目的是提供A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物的制备方法，通过以下方案实现：
1.葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物的合成
称取聚乳酸-羟基乙酸（112.5～1125mg)、N,N'-二环己基碳二亚胺（46.42～464.18mg）和4-二甲氨基吡啶（2.75～27.49mg）（三者投料摩尔比为1：3：0.3）置于100mL干燥圆底烧瓶中，加入15mL无水二甲亚砜，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应30min以活化聚乳酸-羟基乙酸的羧基，向圆底烧瓶中加入精密称量的500mg葡聚糖（10kDa～100kDa），在氮气保护下继续反应24h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为7000的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于4000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥。将得到的冻干产物溶于丙酮（浓度为20mg/mL），减压抽滤以除去体系中水难溶性副产物。减压抽滤后得到的固体物质复溶于去离子水，继续冷冻干燥，即得葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物固体。
2.A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物的合成
取20mg A54多肽，加20mL的无水二甲亚砜并超声溶解。冰浴搅拌下，加入4.90 (Boc)2O（A54：(Boc)2O=1：1.3，mol：mol），十分钟后转至室温下避光搅拌12h。另取葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸（68.23～198.57mg）、N,N'-二环己基碳二亚胺（10.69mg）和4-二甲氨基吡啶（0.63mg），用10mL无水二甲亚砜溶解后加入反应体系，室温搅拌反应24h。反应结束后，向体系中加入25mL去离子水，所得混悬液于4000rpm下离心10min后，取上清液调酸去除Boc保护基。终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48h后冷冻干燥，既得A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
本发明的第三个目的是提供具有快速BEL7402肿瘤细胞特异性摄取的A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物在制备载阿霉素胶团中的应用。A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物可在水性介质中通过自聚集形成胶团的特性，1mg/mL的共聚物水溶液可形成粒径为60～160nm的胶团，并可负载水难溶性抗肿瘤药物阿霉素，所得载药胶团具有在BEL7402肿瘤细胞具有较强的摄取功能，具有对药物的缓释功能；其载药胶团对BEL-7402肿瘤细胞具有特异性靶向转运功能，并增强其细胞毒性。
本发明在合成葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物的基础上，进一步A54多肽修饰葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物，合成了A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物，该共聚物可在水性介质中，通过自聚集形成胶团 ，并且可快速被肿瘤细胞所摄取，对人肝癌细胞系BEL-7402具有特异性靶向作用。该材料可有效包封水难溶性抗肿瘤药物，实现对BEL-7402细胞的高效治疗。
本发明提供的A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物所形成的胶团，可作为难容性抗肿瘤药物载体，应用于生命科学领域与制药领域。利用这种载体，在室温条件下呈胶束实现对药物的包封，并具有对药物的缓释功能，通过A54多肽的修饰，实现对BEL7402肝肿瘤的靶向，从而大幅度提高药物的疗效。
附图说明
图1是A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物载药胶团的体外药物释放曲线。
图2是载阿霉素的A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物胶团，与BEL-7402细胞和HepG2细胞共孵育0.5、4、10h后的荧光显微镜照片。
图3是载阿霉素的葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸和A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物胶团，与BEL-7402细胞共孵育2、24h后的荧光显微镜照片。
图4是A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物载阿霉素胶团体外抗肿瘤细胞药效曲线。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例一：
1. 葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物的合成
精密称取聚乳酸-羟基乙酸（300mg）、N,N'-二环己基碳二亚胺（123.78mg）和4-二甲氨基吡啶（7.33mg）（三者投料摩尔比为1：3：0.3）置于100mL干燥圆底烧瓶中，加入15mL无水二甲亚砜，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应30min以活化聚乳酸-羟基乙酸的羧基，向圆底烧瓶中加入精密称量的500mg葡聚糖（10kDa）（葡聚糖与聚乳酸-羟基乙酸的摩尔比为1：4），在氮气保护下继续反应24h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为7000的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于4000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥。将得到的冻干产物溶于丙酮（浓度为20mg/mL），减压抽滤以除去体系中水难溶性副产物。减压抽滤后得到的固体物质复溶于去离子水，继续冷冻干燥，即得葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物固体。
利用核磁共振仪对共聚物葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的结构进行确证。取葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物10mg溶于0.5mLd 6 -二甲亚砜中，使其最终浓度为20mg/mL，用核磁共振仪记录核磁共振氢谱，并计算聚乳酸-羟基乙酸的接枝率。结果显示聚乳酸-羟基乙酸的接枝率为1:1.01，即每个葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物中含有D-葡萄吡喃糖-聚乳酸-羟基乙酸结构单元1.01个。
采用芘荧光法测定葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的临界胶团浓度。取共聚物10mg溶解于蒸馏水，探头超声20次（500w，工作2s停3s），定容至10ml。将1mg/mL的共聚物溶液稀释成不同浓度的共聚物溶液各10mL，分别加入定量的芘（芘的终浓度为7×10-7mol/L），水浴超声（400w，30min）。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定荧光强度，并计算临界胶团浓度。经测定，葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的临界胶团浓度为50.32/mL。
精密称取葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸10mg，分散于适量去离子水中，用去离子水定容至10mL，探头超声30次（400W，共作2s 停3s），得到1.0mg/mL的胶团溶液。取葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物胶团溶液适量，用微粒粒度与表面电位测定仪与表面电位测定仪测定胶团的粒径。经测定，葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的粒径为48.007.92nm。
2.A54-葡聚糖-聚乳酸 -羟基乙酸共聚物的合成
取20mg A54多肽，加10mL的无水二甲亚砜并超声溶解。冰浴搅拌下，加入4.90 (Boc)2O（A54：(Boc)2O=1：1.3，mol：mol），十分钟后转至室温下避光搅拌12h。取上述合成的葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸（68.23mg）、N,N'-二环己基碳二亚胺（10.69mg）和4-二甲氨基吡啶（0.63mg），用10mL无水二甲亚砜溶解后加入反应体系，室温搅拌反应24h。反应结束后，向体系中加入25mL去离子水，所得混悬液于4000rpm下离心10min后，取上清液调酸去除Boc保护基。终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48h后冷冻干燥，既得A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
利用核磁共振仪对共聚物A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的结构进行确证。取A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物各10mg溶于0.5mLd 6 -二甲亚砜中，使其最终浓度为20mg/mL，用核磁共振仪记录核磁共振氢谱，并计算A54多肽的接枝率。结果显示A54多肽的接枝率为1:1.97，即每个A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物分子中含有A54-D-葡萄吡喃糖结构单元1.97个 。
采用芘荧光法测定A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的临界胶团浓度。取共聚物10mg溶解于蒸馏水，探头超声20次（500w，工作2s停3s），定容至10ml。将1mg/mL的共聚物溶液稀释成不同浓度的共聚物溶液各10mL，分别加入定量的芘（芘的终浓度为7×10-7mol/L），水浴超声（400w，30min）。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定荧光强度，并计算临界胶团浓度。经测定，A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的临界胶团浓度为45.87/mL。
精密称取A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸10mg，分散于适量去离子水中，用去离子水定容至10mL，探头超声30次（400W，共作2s 停3s），得到1.0mg/mL的胶团溶液。取A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物胶团溶液适量，用微粒粒度与表面电位测定仪与表面电位测定仪测定胶团的粒径。 经测定，A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的粒径为113.654.39nm。
实施例二：
1. 葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物的合成
精密称取聚乳酸-羟基乙酸（750mg）、N,N'-二环己基碳二亚胺（309.45mg）和4-二甲氨基吡啶（18.33mg）（三者投料摩尔比为1：3：0.3）置于100mL干燥圆底烧瓶中，加入30mL无水二甲亚砜，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应30min以活化聚乳酸-羟基乙酸的羧基，向圆底烧瓶中加入精密称量的500mg葡聚糖（10kDa）（葡聚糖与聚乳酸-羟基乙酸的摩尔比为1：10），在氮气保护下继续反应24h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为7000的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于4000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥。将得到的冻干产物溶于丙酮（浓度为20mg/mL），减压抽滤以除去体系中水难溶性副产物。减压抽滤后得到的固体物质复溶于去离子水，继续冷冻干燥，即得葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物固体。
利用核磁共振仪对共聚物葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的结构进行确证。取葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物10mg溶于0.5mLd 6 -二甲亚砜中，使其最终浓度为20mg/mL，用核磁共振仪记录核磁共振氢谱，并计算聚乳酸-羟基乙酸的接枝率。结果显示聚乳酸-羟基乙酸的接枝率为1:1.92，即每个葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物分子中含有D-葡萄吡喃糖-聚乳酸-羟基乙酸结构单元1.92个。
采用芘荧光法测定葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的临界胶团浓度。取共聚物10mg溶解于蒸馏水，探头超声20次（500w，工作2s停3s），定容至10ml。将1mg/mL的共聚物溶液稀释成不同浓度的共聚物溶液各10mL，分别加入定量的芘（芘的终浓度为7×10-7mol/L），水浴超声（400w，30min）。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定荧光强度，并计算临界胶团浓度。经测定，葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的临界胶团浓度为42.27/mL。
精密称取葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸10mg，分散于适量去离子水中，用去离子水定容至10mL，探头超声30次（400W，共作2s 停3s），得到1.0mg/mL的胶团溶液。取葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物胶团溶液适量，用微粒粒度与表面电位测定仪与表面电位测定仪测定胶团的粒径。经测定，葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的粒径为41.200.85nm。
2.A54-葡聚糖-聚乳酸 -羟基乙酸共聚物的合成
取20mg A54多肽，加10mL的无水二甲亚砜并超声溶解。冰浴搅拌下，加入4.90 (Boc)2O（A54：(Boc)2O=1：1.3，mol：mol），十分钟后转至室温下避光搅拌12h。取上述合成的葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸（168.50mg）、N,N'-二环己基碳二亚胺（10.69mg）和4-二甲氨基吡啶（0.63mg），用10mL无水二甲亚砜溶解后加入反应体系，室温搅拌反应24h。反应结束后，向体系中加入25mL去离子水，所得混悬液于4000rpm下离心10min后，取上清液调酸去除Boc保护基。终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48h后冷冻干燥，既得A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
利用核磁共振仪对共聚物A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的结构进行确证。取A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物各10mg溶于0.5mLd 6 -二甲亚砜中，使其最终浓度为20mg/mL，用核磁共振仪记录核磁共振氢谱，并计算A54多肽的接枝率。结果显示A54多肽的接枝率为1:1.26，即每个A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物分子中含有A54-D-葡萄吡喃糖结构单元1.26个 。
采用芘荧光法测定A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的临界胶团浓度。取共聚物10mg溶解于蒸馏水，探头超声20次（500w，工作2s停3s），定容至10ml。将1mg/mL的共聚物溶液稀释成不同浓度的共聚物溶液各10mL，分别加入定量的芘（芘的终浓度为7×10-7mol/L），水浴超声（400w，30min）。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定荧光强度，并计算临界胶团浓度。经测定，A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的临界胶团浓度为38.92/mL。
精密称取A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸10mg，分散于适量去离子水中，用去离子水定容至10mL，探头超声30次（400W，共作2s 停3s），得到1.0mg/mL的胶团溶液。取A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物胶团溶液适量，用微粒粒度与表面电位测定仪与表面电位测定仪测定胶团的粒径。 经测定，A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的粒径为92.371.67nm。
实施例三：
1. 葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物的合成
精密称取聚乳酸-羟基乙酸（1125mg）、N,N'-二环己基碳二亚胺（464.18mg）和4-二甲氨基吡啶（27.49mg）（三者投料摩尔比为1：3：0.3）置于100mL干燥圆底烧瓶中，加入45mL无水二甲亚砜，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应30min以活化聚乳酸-羟基乙酸的羧基，向圆底烧瓶中加入精密称量的500mg葡聚糖（10kDa）（葡聚糖与聚乳酸-羟基乙酸的摩尔比为1：15），在氮气保护下继续反应24h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为7000的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于4000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥。将得到的冻干产物溶于丙酮（浓度为20mg/mL），减压抽滤以除去体系中水难溶性副产物。减压抽滤后得到的固体物质复溶于去离子水，继续冷冻干燥，即得葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物固体。
利用核磁共振仪对共聚物葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的结构进行确证。取葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物10mg溶于0.5mLd 6 -二甲亚砜中，使其最终浓度为20mg/mL，用核磁共振仪记录核磁共振氢谱，并计算聚乳酸-羟基乙酸的接枝率。结果显示聚乳酸-羟基乙酸的接枝率为1:2.15，即每个葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物中含有D-葡萄吡喃糖-聚乳酸-羟基乙酸结构单元2.15个。
采用芘荧光法测定葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的临界胶团浓度。取共聚物10mg溶解于蒸馏水，探头超声20次（500w，工作2s停3s），定容至10ml。将1mg/mL的共聚物溶液稀释成不同浓度的共聚物溶液各10mL，分别加入定量的芘（芘的终浓度为7×10-7mol/L），水浴超声（400w，30min）。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定荧光强度，并计算临界胶团浓度。经测定，葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的临界胶团浓度为27.75/mL。
精密称取葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸10mg，分散于适量去离子水中，用去离子水定容至10mL，探头超声30次（400W，共作2s 停3s），得到1.0mg/mL的胶团溶液。取葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物胶团溶液适量，用微粒粒度与表面电位测定仪与表面电位测定仪测定胶团的粒径。经测定，葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的粒径为24.230.71nm。
2.A54-葡聚糖-聚乳酸 -羟基乙酸共聚物的合成
取20mg A54多肽，加10mL的无水二甲亚砜并超声溶解。冰浴搅拌下，加入4.90 (Boc)2O（A54：(Boc)2O=1：1.3，mol：mol），十分钟后转至室温下避光搅拌12h。取上述合成的葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸（168.14mg）、N,N'-二环己基碳二亚胺（10.69mg）和4-二甲氨基吡啶（0.63mg），用10mL无水二甲亚砜溶解后加入反应体系，室温搅拌反应24h。反应结束后，向体系中加入25mL去离子水，所得混悬液于4000rpm下离心10min后，取上清液调酸去除Boc保护基。终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48h后冷冻干燥，既得A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
利用核磁共振仪对共聚物A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的结构进行确证。取A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物各10mg溶于0.5mLd 6 -二甲亚砜中，使其最终浓度为20mg/mL，用核磁共振仪记录核磁共振氢谱，并计算A54多肽的接枝率。结果显示A54多肽的接枝率为1:1.05，即每个A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物分子中含有A54-D-葡萄吡喃糖结构单元1.05个 。
采用芘荧光法测定A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的临界胶团浓度。取共聚物10mg溶解于蒸馏水，探头超声20次（500w，工作2s停3s），定容至10ml。将1mg/mL的共聚物溶液稀释成不同浓度的共聚物溶液各10mL，分别加入定量的芘（芘的终浓度为7×10-7mol/L），水浴超声（400w，30min）。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定荧光强度，并计算临界胶团浓度。经测定，A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的临界胶团浓度为22.83/mL。
精密称取A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸10mg，分散于适量去离子水中，用去离子水定容至10mL，探头超声30次（400W，共作2s 停3s），得到1.0mg/mL的胶团溶液。取A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物胶团溶液适量，用微粒粒度与表面电位测定仪与表面电位测定仪测定胶团的粒径。经测定，A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的粒径为66.470.59nm。
实施例四：
1. 葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物的合成
精密称取聚乳酸-羟基乙酸（112.5mg）、N,N'-二环己基碳二亚胺（46.42mg）和4-二甲氨基吡啶（2.75mg）（三者投料摩尔比为1：3：0.3）置于100mL干燥圆底烧瓶中，加入15mL无水二甲亚砜，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应30min以活化聚乳酸-羟基乙酸的羧基，向圆底烧瓶中加入精密称量的500mg葡聚糖（100kDa）（葡聚糖与聚乳酸-羟基乙酸的摩尔比为1：15），在氮气保护下继续反应24h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为7000的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于4000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥。将得到的冻干产物溶于丙酮（浓度为20mg/mL），减压抽滤以除去体系中水难溶性副产物。减压抽滤后得到的固体物质复溶于去离子水，继续冷冻干燥，即得葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物固体。
利用核磁共振仪对共聚物葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的结构进行确证。取葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物10mg溶于0.5mLd 6 -二甲亚砜中，使其最终浓度为20mg/mL，用核磁共振仪记录核磁共振氢谱，并计算聚乳酸-羟基乙酸的接枝率。结果显示聚乳酸-羟基乙酸的接枝率为1:1.09，即每个葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物中含有D-葡萄吡喃糖-聚乳酸-羟基乙酸结构单元1.09个。
采用芘荧光法测定葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的临界胶团浓度。取共聚物10mg溶解于蒸馏水，探头超声20次（500w，工作2s停3s），定容至10ml。将1mg/mL的共聚物溶液稀释成不同浓度的共聚物溶液各10mL，分别加入定量的芘（芘的终浓度为7×10-7mol/L），水浴超声（400w，30min）。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定荧光强度，并计算临界胶团浓度。经测定，葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的临界胶团浓度为49.32/mL。
精密称取葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸10mg，分散于适量去离子水中，用去离子水定容至10mL，探头超声30次（400W，共作2s 停3s），得到1.0mg/mL的胶团溶液。取葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物胶团溶液适量，用微粒粒度与表面电位测定仪与表面电位测定仪测定胶团的粒径。经测定，葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的粒径为69.190.52nm。
2.A54-葡聚糖-聚乳酸 -羟基乙酸共聚物的合成
取20mg A54多肽，加10mL的无水二甲亚砜并超声溶解。冰浴搅拌下，加入4.90 (Boc)2O（A54：(Boc)2O=1：1.3，mol：mol），十分钟后转至室温下避光搅拌12h。取上述合成的葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸（125.67mg）、N,N'-二环己基碳二亚胺（10.69mg）和4-二甲氨基吡啶（0.63mg），用10mL无水二甲亚砜溶解后加入反应体系，室温搅拌反应24h。反应结束后，向体系中加入25mL去离子水，所得混悬液于4000rpm下离心10min后，取上清液调酸去除Boc保护基。终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48h后冷冻干燥，既得A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
利用核磁共振仪对共聚物A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的结构进行确证。取A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物各10mg溶于0.5mLd 6 -二甲亚砜中，使其最终浓度为20mg/mL，用核磁共振仪记录核磁共振氢谱，并计算A54多肽的接枝率。结果显示A54多肽的接枝率为1:1.12，即每个A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物中含有A54-D-葡萄吡喃糖结构单元1.12个 。
采用芘荧光法测定A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的临界胶团浓度。取共聚物10mg溶解于蒸馏水，探头超声20次（500w，工作2s停3s），定容至10ml。将1mg/mL的共聚物溶液稀释成不同浓度的共聚物溶液各10mL，分别加入定量的芘（芘的终浓度为7×10-7mol/L），水浴超声（400w，30min）。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定荧光强度，并计算临界胶团浓度。经测定，A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的临界胶团浓度为45.94/mL。
精密称取A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸10mg，分散于适量去离子水中，用去离子水定容至10mL，探头超声30次（400W，共作2s 停3s），得到1.0mg/mL的胶团溶液。取A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物胶团溶液适量，用微粒粒度与表面电位测定仪与表面电位测定仪测定胶团的粒径。 经测定，A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的粒径为156.170.29nm。
实施例五：
1. 葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物的合成
精密称取聚乳酸-羟基乙酸（1125mg）、N,N'-二环己基碳二亚胺（464.18mg）和4-二甲氨基吡啶（27.49mg）（三者投料摩尔比为1：3：0.3）置于100mL干燥圆底烧瓶中，加入45mL无水二甲亚砜，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应30min以活化聚乳酸-羟基乙酸的羧基，向圆底烧瓶中加入精密称量的500mg葡聚糖（10kDa）（葡聚糖与聚乳酸-羟基乙酸的摩尔比为1：15），在氮气保护下继续反应24h。反应结束后，将反应产物置于截留分子量为7000的透析袋中，用纯水持续透析48h。收集透析袋中的混悬液，于4000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥。将得到的冻干产物溶于丙酮（浓度为20mg/mL），减压抽滤以除去体系中水难溶性副产物。减压抽滤后得到的固体物质复溶于去离子水，继续冷冻干燥，即得葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物固体。
利用核磁共振仪对共聚物葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的结构进行确证。取葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物10mg溶于0.5mLd 6 -二甲亚砜中，使其最终浓度为20mg/mL，用核磁共振仪记录核磁共振氢谱，并计算聚乳酸-羟基乙酸的接枝率。结果显示聚乳酸-羟基乙酸的接枝率为1:3.02，即每个葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物中含有D-葡萄吡喃糖-聚乳酸-羟基乙酸结构单元3.02个。
采用芘荧光法测定葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的临界胶团浓度。取共聚物10mg溶解于蒸馏水，探头超声20次（500w，工作2s停3s），定容至10ml。将1mg/mL的共聚物溶液稀释成不同浓度的共聚物溶液各10mL，分别加入定量的芘（芘的终浓度为7×10-7mol/L），水浴超声（400w，30min）。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定荧光强度，并计算临界胶团浓度。经测定，葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的临界胶团浓度为25.32/mL。
精密称取葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸10mg，分散于适量去离子水中，用去离子水定容至10mL，探头超声30次（400W，共作2s 停3s），得到1.0mg/mL的胶团溶液。取葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物胶团溶液适量，用微粒粒度与表面电位测定仪与表面电位测定仪测定胶团的粒径。经测定，葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的粒径为52.190.52nm。
2.A54-葡聚糖-聚乳酸 -羟基乙酸共聚物的合成
取20mg A54多肽，加10mL的无水二甲亚砜并超声溶解。冰浴搅拌下，加入4.90 (Boc)2O（A54：(Boc)2O=1：1.3，mol：mol），十分钟后转至室温下避光搅拌12h。取上述合成的葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸（198.57mg）、N,N'-二环己基碳二亚胺（10.69mg）和4-二甲氨基吡啶（0.63mg），用10mL无水二甲亚砜溶解后加入反应体系，室温搅拌反应24h。反应结束后，向体系中加入25mL去离子水，所得混悬液于4000rpm下离心10min后，取上清液调酸去除Boc保护基。终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48h后冷冻干燥，既得A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
利用核磁共振仪对共聚物A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的结构进行确证。取A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物各10mg溶于0.5mLd 6 -二甲亚砜中，使其最终浓度为20mg/mL，用核磁共振仪记录核磁共振氢谱，并计算A54多肽的接枝率。结果显示A54多肽的接枝率为1:1.01，即每个A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物中含有A54-D-葡萄吡喃糖结构单元1.01个 。
采用芘荧光法测定A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的临界胶团浓度。取共聚物10mg溶解于蒸馏水，探头超声20次（500w，工作2s停3s），定容至10ml。将1mg/mL的共聚物溶液稀释成不同浓度的共聚物溶液各10mL，分别加入定量的芘（芘的终浓度为7×10-7mol/L），水浴超声（400w，30min）。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定荧光强度，并计算临界胶团浓度。经测定，A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的临界胶团浓度为10.27/mL。
精密称取A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸10mg，分散于适量去离子水中，用去离子水定容至10mL，探头超声30次（400W，共作2s 停3s），得到1.0mg/mL的胶团溶液。取A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物胶团溶液适量，用微粒粒度与表面电位测定仪与表面电位测定仪测定胶团的粒径。 经测定，A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸的粒径为149.170.37nm。
3、 A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物载阿霉素胶团的制备
精密称取阿霉素10mg，溶于二甲基亚砜中制备得到1mg/mL阿霉素二甲亚砜溶液，阿霉素：A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸＝5 %（w/w）的投药量加入一定量的1mg/ml的阿霉素二甲亚砜溶液，冰浴下探头超声30次（400w，工作2s，停3s）后，转移入截留分子量为3500的透析袋中，避光条件下纯水透析24h。将透析后的产物低温离心（4000r/min，8min）以除去未被嫁接物胶团包载的药物，收集上清液，避光低温保存备用。
采用荧光分光光度法测定阿霉素的含量。标准曲线：取1.0 mg/mL的阿霉素二甲基亚砜溶液，用混合溶剂（去离子水：二甲基亚砜 = 1：9，v/v）稀释成一系列浓度，通过荧光分光光度计检测其荧光值（激发波长为505nm，发射波长为565nm，狭缝为5.0nm，工作电压为700V），以荧光强度为纵坐标，药物浓度为横坐标，绘制阿霉素标准曲线。
采用超滤离心-有机溶剂提取法测定嫁接物载药胶团的药物包封率及载药量。精密移取A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物载药胶团溶液100μL，用 二甲基亚砜稀释至1mL（相当于稀释10倍），冰水浴下超声30min后用荧光分光光度法测定并得出药物总浓度。另移取载药胶团溶液400μL，置于超滤离心管中，10000r/min高速离心20min，用荧光分光光度法测定滤液中游离药物的浓度。按下式分别计算药物包封率及载药量。
包封率＝(胶束中的药物量／总投药量)×100％
载药量＝(胶束中的药物量／载药胶束总量)×100％
经测定，A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物载药胶团的包封率及载药量分别为75.31% 和3.59%。
4、A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物载药胶团的体外药物释放行为
为确证药物的释放符合漏槽条件，本研究测定了阿霉素在释放介质pH7.2的磷酸盐缓冲溶液中的饱和溶解度。实验方法如下：精密称取阿霉素10mg，将其充分分散于20mL磷酸盐缓冲溶液中，将上述溶液转移至释放管中，并将释放管置于37℃，60rpm恒温振荡。分别于24h, 48h, 72h, 96h 及120h取样。将样品于8000rpm下离心处理10min，荧光分光光度法测定上清液中阿霉素的浓度，按照标准曲线计算得到阿霉素在pH7.2 PBS中的饱和溶解度。
为保证载药胶团体外释放的总药量及释放初始体积相等，分别移取一定体积的载药胶团溶液，用去离子水稀释至终体积为3mL。将载药胶团溶液置于截留分子量为7000的透析袋后放入装有20mL释放介质（pH7.4磷酸盐缓冲溶液）的释放管中。在37°C，65rpm恒温振荡下进行体外释放，在特定时间点（0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，36h，48h及72h）取样，同时更换全部释放介质。用荧光分光光度法测定样品中的药物浓度（激发波长为505nm，发射波长为565nm，狭缝为5nm，工作电压为700V），计算药物的累积释放量及累计释放百分率。
经测定，A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物载药胶团的释放行为参见图1， 载药胶束与阳性对照相对比，药物的释放速度变慢，而且A54修饰对载药胶团的释放行为没有影响。
5、A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物胶团细胞摄取
采用肝癌细胞BEL-7402和HepG2为模型细胞，考察A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸胶团进入细胞的能力。将肝癌细胞BEL-7402和HepG2细胞以5×104个/mL的密度接种于24孔细胞培养板中，每孔1mL，置于37，含5%CO2孵箱中培养24h。待细胞贴壁生长后，分别加入100μL的阿霉素/A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸溶液，使其最终浓度为100μg/mL。继续分别孵育0.5、4和10h后，加入核染料物质Hoechst33342，再用PBS冲洗细胞三次以除去细胞表面吸附的物质，在荧光倒置显微镜下观察共聚物胶团在细胞内的分布情况。结果体现了A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸胶团对BEL-7402细胞具有较强的靶向转运功能（参见图2、图3）。
6、 A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物载阿霉素胶团体外抗肿瘤细胞药效
采用四唑蓝比色法评价A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物载阿霉素胶团的体外抗肿瘤细胞药效。取对数生长期的肝癌细胞BEL-7402，经胰酶消化后，用含10%新生牛血清的1640培养基调整细胞密度为5×104个/mL，接种于96孔培养板，每孔0.2mL，37、5%CO2孵箱中培养24小时，待细胞完全贴壁后，加入不同浓度的葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸和A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸载药胶团溶液，以未处理的空白细胞为对照，每孔设3个平行组。继续培养72h后，每孔加入20μL的四唑蓝溶液（浓度为5.0mg/mL），于孵箱中继续培养4h，弃去上清液，每孔加入100μL二甲亚砜溶液，恒温振荡20min，用酶标仪测定570nm处吸光度，按下述公式计算细胞抑制率：
式中：I%——细胞抑制率；
Acontrol——空白对照组570nm处的吸光度；
Atreat——样品组570nm处的吸光度。
实验结果参见图4：相比于葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸载阿霉素胶团，A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸载阿霉素胶团对BEL-7402细胞的毒性显著提高。
<110>浙江大学
<120>一种整合酶抑制肽及其在艾滋病药物制备中的应用
<160> 1
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 根据氨基酸序列设计，用于A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物的制备。
<400> 12
AGKATPSLETTP
Claims (6)
1.一种A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物，其特征在于，该共聚物由D-葡萄吡喃糖（ ），D-葡萄吡喃糖-聚乳酸-羟基乙酸（），A54-D-葡萄吡喃糖（）三种结构单元无规交替而成，三种结构单元分别为：
其中，A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物中所使用的葡聚糖的分子量为10kDa-100kDa；结构单元中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为1.5kDa，其乳酸和羟基乙酸的比例为70﹕30；每个A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物中含有D-葡萄吡喃糖-聚乳酸-羟基乙酸结构单元（）1～3个； A54为多肽，其序列为丙氨酸-甘氨酸-赖氨酸-丙氨酸-苏氨酸-脯氨酸-丝氨酸-亮氨酸-谷氨酸-苏氨酸-苏氨酸-脯氨酸（AGKATPSLETTP）；每个A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物中含有 A54-D-葡萄吡喃糖结构单元（）1~2个。
2.权利要求1所述的A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物，具体通过以下方法实现：
（1）葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物的合成
称取聚乳酸-羟基乙酸、N,N'-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，三者投料摩尔比为1：3：0.3，置于100mL干燥圆底烧瓶中，加入15mL无水二甲亚砜，60℃搅拌使反应物完全溶解，反应30min以活化聚乳酸-羟基乙酸的羧基，向圆底烧瓶中加入10kDa～100kDa的 500mg葡聚糖，在氮气保护下继续反应24h。
3.反应结束后，将反应产物置于截留分子量为7000的透析袋中，用纯水持续透析48h，收集透析袋中的混悬液，于4000rpm离心10min，取其上清液进行冷冻干燥，将得到的冻干产物溶于浓度为20mg/mL的丙酮，减压抽滤，得到的固体物质复溶于去离子水，继续冷冻干燥，即得葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物固体；
（2）A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物的合成
取20mg A54多肽，加20mL的无水二甲亚砜并超声溶解，冰浴搅拌下，加入4.90 (Boc)2O，十分钟后转至室温下避光搅拌12h，另取葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸、N,N'-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，用10mL无水二甲亚砜溶解后加入反应体系，室温搅拌反应24h，反应结束后，向体系中加入25mL去离子水，所得混悬液于4000rpm下离心10min后，取上清液调酸去除Boc保护基，终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48h后冷冻干燥，既得A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
4.根据权利要求1所述的A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物，其特征是：步骤（2）中A54多肽与(Boc)2O 的摩尔比为A54：(Boc)2O=1：1.3。
5.根据权利要求1所述的A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物在制备负载阿霉素胶团中的应用。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，A54-葡聚糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物在水性介质中通过自聚集形成胶团，1mg/mL的共聚物水溶液形成粒径为60～160nm的胶团，负载水难溶性抗肿瘤药物阿霉素。
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