CN107049986B - 一种肝癌靶向脂质纳米粒及制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种肝癌靶向脂质纳米粒，包封抗肿瘤药物奥沙利铂并靶向肝癌细胞BEL‑7402。该脂质纳米粒由A54多肽‑聚乙二醇‑十八碳链嫁接物、单硬脂酸聚乙二醇酯、奥沙利铂磷脂复合物与单硬脂酸甘油酯组成。其中A54多肽‑聚乙二醇‑十八碳链嫁接物的比例为5.3～18.2wt％，单硬脂酸聚乙二醇酯的比例为5.2～18.2wt％，奥沙利铂磷脂复合物的比例为15.2～35.0wt％，单硬脂酸甘油酯的比例为45.6～60.6。本发明提供的脂质纳米粒，可通过表面的A54多肽与肝癌细胞发生特异性结合实现靶向作用，包封奥沙利铂大豆磷脂复合物，增强奥沙利铂抗肿瘤细胞药效。

Description

一种肝癌靶向脂质纳米粒及制备方法与应用
技术领域
本发明属靶向脂质纳米粒及制备方法，主要涉及一种肝癌靶向脂质纳米粒及其制备方法。
背景技术
脂质纳米粒主要以室温下为固态脂质或少量液态油脂为载体，药物分散或包裹于脂质核中，制成粒径约为50～1000nm的固体胶粒给药体系，形成脂质纳米给药系统。脂质纳米粒具有良好的生物相容性，同时可提高不稳定药物的稳定性，具有缓控释、长效作用。可采用一定比例的液态油或混合脂质为组成部分，克服固体脂质材料结晶度高、载药量低等缺点，实现多种药物的有效包封。脂质纳米粒表面亦可进行不同修饰，如聚乙二醇、靶向多肽等，改善动物体内分布，起到肿瘤靶向及增强药效的作用。
靶向载体可提高药物的靶向特异性，减少常规化疗药物由于对癌细胞没有选择性而导致的副作用。一些小分子多肽具备高特异性、高亲和力等优点，能够靶向并作用于特定的受体，因而可被用作靶头修饰药物载体，如脂质纳米粒、聚合物胶束等，将非特异性的药物靶向输送至特定部位，提高抗癌效果并减少毒副作用。
奥沙利铂是继顺铂之后的第三代铂类抗肿瘤药物，以DNA为靶点，与DNA链上鸟嘌呤(G)共价结合，形成链内交联、链间交联以及DNA蛋白交联，损伤DNA，破坏DNA复制，造成肿瘤细胞凋亡。奥沙利铂在水性溶剂中微溶、乙醇中不溶，限制其临床应用及其给药系统的设计。采用物理复合的方法，利用奥沙利铂的氮原子有较强的失电子倾向、大豆磷脂磷脂酰胆碱的磷原子上羟基氧原子有较强得电子倾向，产生静电作用形成复合物。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种肝癌靶向脂质纳米粒，该靶向脂质纳米粒由A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物、单硬脂酸聚乙二醇酯、奥沙利铂磷脂复合物及单硬脂酸甘油酯组成，其组成的重量百分比为：5.3～18.2wt％的A54多肽--聚乙二醇-十八碳链嫁接物、5.2～18.2wt％的单硬脂酸聚乙二醇酯，15.2～35.0wt％的奥沙利铂磷脂复合物、45.6～60.6wt％的单硬脂酸甘油酯。
本发明的第二个目的是提供A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物的合成方法，通过以下步骤实现：
称取A54多肽，溶于无水二甲亚砜，配置成浓度为20mg/mL的溶液。按照A54多肽：二碳酸二叔丁酯的摩尔比1:1～2加入二碳酸二叔丁酯，室温反应12h。分别加入A54多肽3～5倍摩尔量的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应1.5h，得反应液1。
反应液滴加至A54多肽等摩尔的两端氨基聚乙二醇无水二甲亚砜溶液，室温反应12h。加入与多肽等摩尔的N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，室温反应9h。另加入与多肽等摩尔硬脂胺的乙醇溶液，加热超声溶解，室温反应24h，得反应液2。
反应液2加入超纯水，用浓盐酸调pH值至1.0～2.0，室温反应2h，脱二碳酸二叔丁酯保护基。2M氢氧化钠溶液调pH至7.0。反应产物转移至透析袋，超纯水透析72h。透析后反应产物冷冻干燥，得A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物。
本发明的第三个目的是提供所述肝癌靶向脂质纳米粒的制备方法，具体通过以下步骤实现：分别取2～8mg的A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物、2～8mg的单硬脂酸聚乙二醇酯，5～15mg的奥沙利铂磷脂复合物、15～25mg的单硬脂酸甘油酯，精密称定。置于4mL无水乙醇中，水浴50℃溶解，作为有机相。以蒸馏水为分散相，置50℃水浴中，400rpm机械搅拌条件下，将有机相快速注入40mL分散相，继续搅拌5min，得肝癌靶向脂质纳米粒分散液。饱和氯化钠溶液调节离子强度，絮凝纳米粒，得肝癌靶向脂质纳米粒。
本发明的第四个目的是提供所述肝癌靶向脂质纳米粒在制备抗肝癌给药系统中的应用。所述肝癌因BEL-7402细胞引起。BEL-7402细胞是一种重要的组成肝癌的肿瘤细胞，靶向BEL-7402细胞有助于抗肝癌药物的开发和制备应用。
本发明选取对肝癌BEL-7402细胞高亲和力的A54多肽，通过亲水的聚乙二醇化学链接硬脂胺，制备A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物，作为靶头。该嫁接物的十八碳链亲脂性强，可插入脂质纳米粒脂质核；A54多肽-聚乙二醇段，亲水性较强，可分布在脂质纳米粒外围，起到靶向作用。市售奥沙利铂制剂多为药物冻干粉针，而奥沙利铂为水微溶药物，不利于临床应用。本发明中肝癌靶向脂质纳米粒包封奥沙利铂磷脂复合物制备纳米给药系统，应用于肝癌药物制备。修饰有A54多肽的肝癌靶向脂质纳米粒的细胞抗肿瘤药效优于非靶向脂质纳米粒，增强奥沙利铂药效。
附图说明
图1 A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物合成反应原料及产物薄层色谱图。从左到右依次为A54多肽、聚乙二醇(PEG)、硬脂胺(ODA)及反应产物(A54/PEG/ODA)。
图2是肝癌靶向脂质纳米粒及普通脂质纳米粒的BEL-7402细胞摄取荧光照片，标尺20μm。图3肝癌靶向脂质纳米粒分别在BEL-7402细胞、L-02细胞及HepG2细胞的摄取图，标尺20μm。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
一、A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物制备
实施例1：
取A54多肽10mg，精密称定，溶于0.5mL无水二甲亚砜，配成浓度为20mg/mL的溶液。向A54多肽溶液中加入4μL二碳酸二叔丁酯试剂，磁力搅拌(300rpm)，室温避光反应12h。加入5mg的碳二亚胺和和3mg的N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌反应1.5h，得反应液1。另取17.6mg含有两端氨基的聚乙二醇，精密称定，溶于200μL无水二甲亚砜。将反应液1滴加至聚乙二醇溶液，室温搅拌反应12h。加3mg N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，室温搅拌反应9h，得反应液2。取硬脂胺2.36mg，精密称定，水浴超声溶于300μL无水乙醇后，加入反应液2，室温搅拌反应24h。终反应液中加入200μL超纯水，滴加125μL浓盐酸，与pH精密试纸对照，调pH值为1.5，继续搅拌2h脱二碳酸二叔丁酯。2M氢氧化钠溶液调pH至7.0。将反应产物转移至透析袋(MWCO 1000Da)，去离子水透析72h，去除二甲亚砜及水溶性副产物，透析后产物冷冻干燥，得A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物。
实施例2：
取A54多肽10mg，精密称定，溶于0.5mL无水二甲亚砜，配成浓度为20mg/mL的溶液。向A54多肽溶液中加入6μL二碳酸二叔丁酯试剂，磁力搅拌(300rpm)，室温避光反应12h。加入5mg的碳二亚胺和和3mg的N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌反应1.5h，得反应液1。另取17.6mg含有两端氨基的聚乙二醇，精密称定，溶于200μL无水二甲亚砜。将反应液1滴加至聚乙二醇溶液，室温搅拌反应12h。加3mg N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，室温搅拌反应9h，得反应液2。取硬脂胺2.36mg，精密称定，水浴超声溶于300μL无水乙醇后，加入反应液2，室温搅拌反应24h。终反应液中加入200μL超纯水，滴加120μL浓盐酸，pH精密试纸对照，调pH值约为2.0，继续搅拌2h脱二碳酸二叔丁酯。2M氢氧化钠溶液调pH至7.0。将反应产物转移至透析袋(MWCO 1000Da)，去离子水透析72h，去除二甲亚砜及水溶性副产物，透析后产物冷冻干燥，得A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物。
实施例3：
取A54多肽10mg，精密称定，溶于0.5mL无水二甲亚砜，配成浓度为20mg/mL的溶液。向A54多肽溶液中加入6μL二碳酸二叔丁酯试剂，磁力搅拌(300rpm)，室温避光反应12h。加入6mg的碳二亚胺和和3.6mg的N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌反应1.5h，得反应液1。另取17.6mg含有两端氨基的聚乙二醇，精密称定，溶于200μL无水二甲亚砜。将反应液1滴加至聚乙二醇溶液，室温搅拌反应12h。加3mg N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，室温搅拌反应9h，得反应液2。取硬脂胺2.36mg，精密称定，水浴超声溶于300μL无水乙醇后，加入反应液2，室温搅拌反应24h。终反应液中加入200μL超纯水，滴加130μL浓盐酸，pH精密试纸对照，调pH值约为1.0，继续搅拌2h脱二碳酸二叔丁酯。2M氢氧化钠溶液调pH至7.0。将反应产物转移至透析袋(MWCO 1000Da)，去离子水透析72h，去除二甲亚砜及水溶性副产物，透析后产物冷冻干燥，得A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物。
实施例4：
取A54多肽10mg，精密称定，溶于0.5mL无水二甲亚砜，配成浓度为20mg/mL的溶液。向A54多肽溶液中加入8μL二碳酸二叔丁酯试剂，磁力搅拌(300rpm)，室温避光反应12h。加入8.5mg的碳二亚胺和和5.1mg的N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌反应1.5h，得反应液1。另取17.6mg含有两端氨基的聚乙二醇，精密称定，溶于200μL无水二甲亚砜。将反应液1滴加至聚乙二醇溶液，室温搅拌反应12h。加3mg N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，室温搅拌反应9h，得反应液2。取硬脂胺2.36mg，精密称定，水浴超声溶于300μL无水乙醇后，加入反应液2，室温搅拌反应24h。终反应液中加入200μL超纯水，滴加120μL浓盐酸，pH精密试纸对照，调pH值约为2.0，继续搅拌2h脱二碳酸二叔丁酯。2M氢氧化钠溶液调pH至7.0。将反应产物转移至透析袋(MWCO 1000Da)，去离子水透析72h，去除二甲亚砜及水溶性副产物，透析后产物冷冻干燥，得A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物。
实施例5：
取A54多肽10mg，精密称定，溶于0.5mL无水二甲亚砜，配成浓度为20mg/mL的溶液。向A54多肽溶液中加入8μL二碳酸二叔丁酯试剂，磁力搅拌(300rpm)，室温避光反应12h。加入8.5mg的碳二亚胺和和5.1mg的N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌反应1.5h，得反应液1。另取17.6mg含有两端氨基的聚乙二醇，精密称定，溶于200μL无水二甲亚砜。将反应液1滴加至聚乙二醇溶液，室温搅拌反应12h。加3mg N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，室温搅拌反应9h，得反应液2。取硬脂胺2.36mg，精密称定，水浴超声溶于300μL无水乙醇后，加入反应液2，室温搅拌反应24h。终反应液中加入200μL超纯水，滴加125μL浓盐酸，pH精密试纸对照，调pH值约为1.5，继续搅拌2h脱二碳酸二叔丁酯。2M氢氧化钠溶液调pH至7.0。将反应产物转移至透析袋(MWCO 1000Da)，去离子水透析72h，去除二甲亚砜及水溶性副产物，透析后产物冷冻干燥，得A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物。薄层色谱法根据反应原料及产物的极性不同，确证嫁接物生成(附图1)。
二、肝癌靶向脂质纳米粒的制备及特征
采用溶剂挥发法制备奥沙利铂磷脂复合物。取10mg奥沙利铂，精密称定，加入10mL甲醇，水浴超声溶解，配成1.0mg/mL的奥沙利铂/甲醇溶液。另取大豆磷脂，溶于二氯甲烷，配成40.0mg/mL的磷脂/二氯甲烷溶液。奥沙利铂/甲醇溶液于30℃水浴锅中预热。量取0.625mL的二氯甲烷溶液，滴加至奥沙利铂/甲醇溶液，30℃磁力搅拌(400rpm)2h。35℃水浴真空旋蒸，形成磷脂薄膜，5mL乙醇分散薄膜。分散液于1000rpm离心10min，除去未溶解固体，上清烘干，得奥沙利铂磷脂复合物。复合物中奥沙利铂与大豆磷脂的质量比为0.21±0.04。
实施例1：
分别取2mg的A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物、4mg的单硬脂酸聚乙二醇酯、12mg奥沙利铂磷脂复合物、20mg单硬脂酸甘油酯，置于4mL无水乙醇，水浴50℃加热溶解，作为有机相。以超纯水为分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力搅拌条件下，将有机相快速注入40mL分散相，继续搅拌5min，得到肝癌靶向脂质纳米粒分散液。饱和氯化钠溶液1mL调节离子强度，絮凝纳米粒，得肝癌靶向脂质纳米粒。经测定肝癌靶向脂质纳米粒的粒径为63.6nm，电位为-19.0mV。
实施例2：
分别取4mg的A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物、4mg的单硬脂酸聚乙二醇酯、12mg奥沙利铂磷脂复合物、20mg单硬脂酸甘油酯，置于4mL无水乙醇，水浴50℃加热溶解，作为有机相。以超纯水为分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力搅拌条件下，将有机相快速注入40mL分散相，继续搅拌5min，得到肝癌靶向脂质纳米粒分散液。饱和氯化钠溶液1mL调节离子强度，絮凝纳米粒，得肝癌靶向脂质纳米粒。经测定肝癌靶向脂质纳米粒的粒径为64.1nm，电位为-18.5mV。
实施例3：
分别取6mg的A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物、4mg的单硬脂酸聚乙二醇酯、12mg奥沙利铂磷脂复合物、20mg单硬脂酸甘油酯，置于4mL无水乙醇，水浴50℃加热溶解，作为有机相。以超纯水为分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力搅拌条件下，将有机相快速注入40mL分散相，继续搅拌5min，得到肝癌靶向脂质纳米粒分散液。饱和氯化钠溶液1mL调节离子强度，絮凝纳米粒，得肝癌靶向脂质纳米粒。经测定肝癌靶向脂质纳米粒的粒径为62.5nm，电位为-18.0mV。
实施例4：
分别取8mg的A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物、4mg的单硬脂酸聚乙二醇酯、12mg奥沙利铂磷脂复合物、20mg单硬脂酸甘油酯，置于4mL无水乙醇，水浴50℃加热溶解，作为有机相。以超纯水为分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力搅拌条件下，将有机相快速注入40mL分散相，继续搅拌5min，得到肝癌靶向脂质纳米粒分散液。饱和氯化钠溶液1mL调节离子强度，絮凝纳米粒，得肝癌靶向脂质纳米粒。经测定肝癌靶向脂质纳米粒的粒径为65.6nm，电位为-17.8mV。
实施例5：
分别取4mg的A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物、2mg的单硬脂酸聚乙二醇酯、12mg奥沙利铂磷脂复合物、20mg单硬脂酸甘油酯，置于4mL无水乙醇，水浴50℃加热溶解，作为有机相。以超纯水为分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力搅拌条件下，将有机相快速注入40mL分散相，继续搅拌5min，得到肝癌靶向脂质纳米粒分散液。饱和氯化钠溶液1mL调节离子强度，絮凝纳米粒，得肝癌靶向脂质纳米粒。经测定肝癌靶向脂质纳米粒的粒径为65.8nm，电位为-18.2mV。
实施例6：
分别取4mg的A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物、6mg的单硬脂酸聚乙二醇酯、12mg奥沙利铂磷脂复合物、20mg单硬脂酸甘油酯，置于4mL无水乙醇，水浴50℃加热溶解，作为有机相。以超纯水为分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力搅拌条件下，将有机相快速注入40mL分散相，继续搅拌5min，得到肝癌靶向脂质纳米粒分散液。饱和氯化钠溶液1mL调节离子强度，絮凝纳米粒，得肝癌靶向脂质纳米粒。经测定肝癌靶向脂质纳米粒的粒径为63.2nm，电位为-18.6mV。
实施例7：
分别取4mg的A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物、8mg的单硬脂酸聚乙二醇酯、12mg奥沙利铂磷脂复合物、20mg单硬脂酸甘油酯，置于4mL无水乙醇，水浴50℃加热溶解，作为有机相。以超纯水为分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力搅拌条件下，将有机相快速注入40mL分散相，继续搅拌5min，得到肝癌靶向脂质纳米粒分散液。饱和氯化钠溶液1mL调节离子强度，絮凝纳米粒，得肝癌靶向脂质纳米粒。经测定肝癌靶向脂质纳米粒的粒径为62.0nm，电位为-17.8mV。
实施例8：
分别取4mg的A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物、4mg的单硬脂酸聚乙二醇酯、5mg奥沙利铂磷脂复合物、20mg单硬脂酸甘油酯，置于4mL无水乙醇，水浴50℃加热溶解，作为有机相。以超纯水为分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力搅拌条件下，将有机相快速注入40mL分散相，继续搅拌5min，得到肝癌靶向脂质纳米粒分散液。饱和氯化钠溶液1mL调节离子强度，絮凝纳米粒，得肝癌靶向脂质纳米粒。经测定肝癌靶向脂质纳米粒的粒径为68.3nm，电位为-19.0mV。
实施例9：
分别取4mg的A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物、4mg的单硬脂酸聚乙二醇酯、10mg奥沙利铂磷脂复合物、20mg单硬脂酸甘油酯，置于4mL无水乙醇，水浴50℃加热溶解，作为有机相。以超纯水为分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力搅拌条件下，将有机相快速注入40mL分散相，继续搅拌5min，得到肝癌靶向脂质纳米粒分散液。饱和氯化钠溶液1mL调节离子强度，絮凝纳米粒，得肝癌靶向脂质纳米粒。经测定肝癌靶向脂质纳米粒的粒径为62.8nm，电位为-17.8mV。
实施例10：
分别取4mg的A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物、4mg的单硬脂酸聚乙二醇酯、15mg奥沙利铂磷脂复合物、20mg单硬脂酸甘油酯，置于4mL无水乙醇，水浴50℃加热溶解，作为有机相。以超纯水为分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力搅拌条件下，将有机相快速注入40mL分散相，继续搅拌5min，得到肝癌靶向脂质纳米粒分散液。饱和氯化钠溶液1mL调节离子强度，絮凝纳米粒，得肝癌靶向脂质纳米粒。经测定肝癌靶向脂质纳米粒的粒径为59.6nm，电位为-19.6mV。
实施例11：
分别取4mg的A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物、4mg的单硬脂酸聚乙二醇酯、10mg奥沙利铂磷脂复合物、15mg单硬脂酸甘油酯，置于4mL无水乙醇，水浴50℃加热溶解，作为有机相。以超纯水为分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力搅拌条件下，将有机相快速注入40mL分散相，继续搅拌5min，得到肝癌靶向脂质纳米粒分散液。饱和氯化钠溶液1mL调节离子强度，絮凝纳米粒，得肝癌靶向脂质纳米粒。经测定肝癌靶向脂质纳米粒的粒径为63.4nm，电位为-18.7mV。
实施例12：
分别取4mg的A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物、4mg的单硬脂酸聚乙二醇酯、10mg奥沙利铂磷脂复合物、20mg单硬脂酸甘油酯，置于4mL无水乙醇，水浴50℃加热溶解，作为有机相。以超纯水为分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力搅拌条件下，将有机相快速注入40mL分散相，继续搅拌5min，得到肝癌靶向脂质纳米粒分散液。饱和氯化钠溶液1mL调节离子强度，絮凝纳米粒，得肝癌靶向脂质纳米粒。经测定肝癌靶向脂质纳米粒的粒径为67.6nm，电位为-17.2mV。
实施例13：
分别取4mg的A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物、4mg的单硬脂酸聚乙二醇酯、10mg奥沙利铂磷脂复合物、25mg单硬脂酸甘油酯，置于4mL无水乙醇，水浴50℃加热溶解，作为有机相。以超纯水为分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力搅拌条件下，将有机相快速注入40mL分散相，继续搅拌5min，得到肝癌靶向脂质纳米粒分散液。饱和氯化钠溶液1mL调节离子强度，絮凝纳米粒，得肝癌靶向脂质纳米粒。经测定肝癌靶向脂质纳米粒的粒径为65.9nm，电位为-18.8mV。
三、肝癌靶向脂质纳米粒作为药物载体在制备抗肿瘤药物中的应用
实施例1：
分别取4mg的单硬脂酸聚乙二醇酯、12mg大豆磷脂、20mg单硬脂酸甘油酯、0.4mg异硫氰酸荧光素-硬脂胺，精密称定，置于4mL无水乙醇，水浴50℃加热溶解，作为有机相。以蒸馏水为分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力搅拌条件下，将有机相快速注入40mL分散相，继续搅拌5min，得异硫氰酸荧光素标记未的普通脂质纳米粒。
分别称取4mg的A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物、4mg的单硬脂酸聚乙二醇酯、12mg大豆磷脂、20mg单硬脂酸甘油酯、0.4mg异硫氰酸荧光素-硬脂胺，精密称定，置于4mL无水乙醇中，水浴50℃加热溶解，作为有机相。以蒸馏水为分散相，置50℃水浴中，在400rpm磁力搅拌条件下，将有机相快速注入40mL分散相，继续搅拌5min，得到异硫氰酸荧光素标记未包封奥沙利铂的肝癌靶向脂质纳米粒。
取生长状态良好的肝癌BEL-7402细胞，以5×104/mL密度接种于覆有盖玻片的24孔细胞培养板中，37℃、5％CO2条件下孵育。细胞贴壁后，加入异硫氰酸荧光素标记的普通脂质纳米粒及肝癌靶向脂质纳米粒，培养液中终浓度均为20μg/mL。孵育0.5、2、6h后，PBS清洗除去细胞表面吸附的纳米粒。4％多聚甲醛固定15min，甘油封片，激光共聚焦显微镜观察并拍照。摄取图参见图2，A54多肽修饰可促进肝癌BEL-7402细胞对纳米粒的摄取。
实施例2：
正常肝细胞L-02、肝癌细胞HepG2及BEL-7402细胞，以相同的密度(2×105个/mL)分别接种于置有方形玻片的24孔板中。细胞贴壁后，将细胞染料PKH67加入培养有BEL-7402细胞的培养孔内，染料终浓度50μg/mL，37℃孵育10min，培养液清洗去除游离染料。将覆有BEL-7402细胞的方形玻片分别与覆有L-02细胞或HepG2细胞的方形玻片置于六孔板的同一孔中。加入异硫氰酸荧光素标记的肝癌靶向脂质纳米粒，37℃孵育1h。核染试剂Hoechst33342染色10min，PBS冲洗细胞3次，4％甲醛固定。甘油封片后，激光共聚焦显微镜观察细胞摄取，并拍摄荧光照片。
摄取结果参见图3，与共孵育的L-02及HepG2细胞相比，BEL-7402细胞的荧光强度更高。表明经A54多肽修饰的肝癌靶向脂质纳米粒，对细胞具有较明显的选择性，优先被BEL-7402细胞摄取，正常细胞及其他肝癌细胞摄取较少。
实施例3：
分别取10mg奥沙利铂磷脂复合物、30mg单硬脂酸甘油酯，置于4mL无水乙醇，水浴50℃加热溶解，作为有机相。以超纯水为分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力搅拌条件下，将有机相快速注入40mL分散相，继续搅拌5min，得到非靶向脂质纳米粒分散液。饱和氯化钠溶液1mL调节离子强度，絮凝纳米粒，得非靶向脂质纳米粒。
分别取4mg的A54多肽-聚乙二醇-十八碳链嫁接物、4mg的单硬脂酸聚乙二醇酯、10mg奥沙利铂磷脂复合物、22mg单硬脂酸甘油酯，置于4mL无水乙醇，水浴50℃加热溶解，作为有机相。以超纯水为分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力搅拌条件下，将有机相快速注入40mL分散相，继续搅拌5min，得到肝癌靶向脂质纳米粒分散液。饱和氯化钠溶液1mL调节离子强度，絮凝纳米粒，得肝癌靶向脂质纳米粒
MTT法考察肝癌靶向脂质纳米粒及非靶向脂质纳米粒的的肿瘤细胞细胞药效。BEL-7402细胞分别以1×104个/孔的密度接种于96孔板，细胞贴壁后，按预先设计的药物浓度梯度分别加入两种脂质纳米粒。以未加药处理的空白细胞为对照，每个浓度设定三个平行组。孵育后，照MTT法，测定570nm处吸光度，按式(1)计算细胞存活率。
细胞存活率(％)＝A570(样品)/A570对照品100％(1)
其中A570(样品)为加入纳米混悬液的细胞吸收度，A570(对照)为空白对照的细胞吸收度。
经测定，肝癌靶向脂质纳米粒及的非靶向脂质纳米粒BEL-7402细胞IC50值分别为16.0±1.2μg/mL及22.5±3.7μg/m，A54多肽修饰脂质纳米粒可增强奥沙利铂的肝癌肿瘤细胞治疗效果。

Claims (3)

1.一种肝癌靶向脂质纳米粒，其特征在于，由A54多肽−聚乙二醇−十八碳链嫁接物、单硬脂酸聚乙二醇酯、奥沙利铂磷脂复合物及单硬脂酸甘油酯组成，其组成的重量百分比为:5.3~18.2wt%的A54多肽−聚乙二醇−十八碳链嫁接物、5.2~18.2wt%的单硬脂酸聚乙二醇酯，15.2~35.0wt%的奥沙利铂磷脂复合物、45.6~60.6wt%的单硬脂酸甘油酯；
所述肝癌靶向脂质纳米粒通过以下步骤实现：分别取2~8mg的A54多肽−聚乙二醇−十八碳链嫁接物、2~8mg的单硬脂酸聚乙二醇酯，5~15mg的奥沙利铂磷脂复合物、15~25mg的单硬脂酸甘油酯，置于4mL无水乙醇中，水浴50℃溶解，作为有机相，以蒸馏水为分散相，置50℃水浴中，在400rpm的机械搅拌条件下，将有机相注入40mL分散相中，搅拌5min，得肝癌靶向脂质纳米粒分散液，饱和氯化钠溶液调节离子强度，絮凝纳米粒，得靶向肝癌靶向脂质纳米粒。
2.根据权利要求1所述的一种肝癌靶向脂质纳米粒，其特征在于，A54多肽−聚乙二醇−十八碳链嫁接物通过以下步骤实现：称取A54多肽，溶于无水二甲亚砜，按照A54多肽：二碳酸二叔丁酯的摩尔比1:1~2加入二碳酸二叔丁酯，室温反应12小时，分别加入A54多肽3~5倍摩尔量的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应 1.5小时，反应液滴加至A54多肽等摩尔的两端氨基聚乙二醇无水二甲亚砜溶液，室温反应12小时，加入与多肽等摩尔的N, N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，室温反应9小时，另加入与多肽等摩尔硬脂胺的乙醇溶液，室温反应24小时，加入超纯水，用浓盐酸调pH值至1.5~2.0，室温反应2小时，2M氢氧化钠溶液调pH至7.0，反应产物转移至透析袋，超纯水透析72小时，透析后反应产物冷冻干燥，得A54多肽−聚乙二醇−十八碳链嫁接物。
3.根据权利要求1所述的肝癌靶向脂质纳米粒作为给药系统在制备抗肝癌药物中的应用。
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