CN102370992A

CN102370992A - 顺铂纳米的生物降解新型医药组合物及制备方法

Info

Publication number: CN102370992A
Application number: CN2010102616946A
Authority: CN
Inventors: 程立华; 林标扬
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2010-08-24
Filing date: 2010-08-24
Publication date: 2012-03-14

Abstract

本发明公开一种顺铂的新型聚乙二醇-聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸(PLA-mPEG或PLGA-mPEG，或写成PLA/PLGA-mPEG)共聚物纳米药物及其制备新方法。该纳米药物载体以高分子材料PLA/PLGA-mPEG为支架，制备应用双乳化法，同时以聚乙二醇维生素E琥珀酸酯(TPGS)为稳定剂，最终冻干得固体形式的纳米顺铂药物，药物可均匀分布于核内。共聚物纳米载体具有安全无毒，符合药物体内应用的要求特征；固体纳米药物可用生理盐水实施再水化形成乳液，可提供一优良稳定性。本发明避免常规制备方法导致的顺铂包封率低与载药量低等问题，可以用到难溶性药物缓释或控释的制备。

Description

顺铂纳米的生物降解新型医药组合物及制备方法

技术领域

本发明涉及顺铂和聚乙二醇-聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸(PLA-mPEG或PLGA-mPEG，以下也一起写成PLA/PLGA-mPEG)纳米颗粒的抗肿瘤制剂，涉及一种用于制备经TPGS稳定的乳液均质化技术。它产生具有缓释作用的且可注射的重制水性混合物，属于医学治疗领域。本发明中阐述的经TPGS稳定的顺铂乳液，可矫正当前市售调配物存在的若干临床上重要的应用缺陷，并且当与市售产品比较时可提供有益的稳定性和有效性。

背景技术

顺铂，即顺-二氨基-二氯铂(CDDP)，是含有中心铂原子的重金属配合物(络合物)，在铂原子周围有两个氯原子和两个顺位的氨分子。顺铂属周期性非特异性抗肿瘤药，具有广谱的抗肿瘤作用。用于治疗各种实体瘤，尤其是睾丸癌、卵巢癌和膀胱瘤。顺铂在细胞内和血液内被巯基灭活。顺铂在细胞低氯环境中迅速解离，以水合阳离子的形式与细胞内生物大分子结合(主要靶点为DNA)形成链间、链内交联或蛋白质DNA交联，从而破坏DNA的结构和功能。静脉给药后迅速分布于全身各组织与瘤组织，无选择性分布。具有一定的肾毒性、神经毒性、消化道反应和骨髓抑制。见例如，A.Rebillard等，Curr.Med.Chem.，2008，26，2656-2663；Y.I.Chirino等，J.Exp.Toxicol.Pathol.，2009，61(3)，223-242；J.Oldenburg等，Pharmacogenomics，2008，9(10)：1521-30。因此，将其包裹在隐形纳米粒中静脉给药，在延长体内半衰期的同时，更好的借助EPR效应实现肿瘤的靶向治疗，降低毒副作用。

美国专利号6,251,355描述了制备易溶的微晶形式的顺铂，无菌顺铂水溶液的制备方法。顺铂以水溶液形式给药对肾、骨髓和耳等具有很高的毒性，肾毒性是主要的剂量限制因素。因为90％顺铂经过肾、通过肾小球过滤和肾小管分泌从体内排出。曾有多种尝试以减少该药物的肾毒性，这些尝试包括适当水合以及在给药前和给药后24小时保持排尿，在开始顺铂治疗前30分钟静脉输注剂量为910mg/m²的Amifostine，然而发现这些方法均是不适当的。其他使顺铂毒性减到最小的尝试包括联合化疗、制备顺铂类似物、将顺铂包埋在脂质体中等。顺铂难于有效的包埋在脂质体中，因为其水溶性低。另外，它难于使脂质体制剂稳定，因为根据报道，在储藏期间顺铂不能保留在脂质体制剂中。

因此，需要一种能够有效地保护顺铂，或是延长其有效性、生物可利用性或药效的药剂和方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种载药物聚合物纳米粒，尤其是包含药物和二嵌段共聚物的纳米粒。

具体来说，载药物聚合物纳米粒包含药物和二嵌段共聚物，所述二嵌段共聚物为聚乳酸-甲氧基聚乙二醇(PLA-mPEG)或聚乙交酯丙交酯-甲氧基聚乙二醇(PLGA-mPEG)，其中，嵌段聚乳酸(PLA)或聚乙交酯丙交酯(PLGA)的分子量为10,000～60,000，嵌段甲氧基聚乙二醇(mPEG)的分子量为2,000～5,000，PLA或PLGA与mPEG的嵌段比为60∶40～90∶10；所述载药物聚合物纳米粒的粒径为60～300nm，包括二嵌段共聚物外壳和所述药物内核；所述药物在自由状态时能够迅速分解或是对体内器官或组织具有毒性，在载药物聚合物纳米粒的重量含量为3～20％，并且基本上均匀分散在聚合物纳米颗粒内。

在本发明的载药物聚合物纳米粒的一些实施方案中，所述嵌段聚乳酸PLA或聚乙交酯丙交酯PLGA的分子量为10,000～40,000，所述嵌段甲氧基聚乙二醇mPEG的分子量为2,000～5,000，所述PLA或PLGA与mPEG的嵌段比为70∶30～85∶15。

在本发明的载药物聚合物纳米粒的一些实施方案中，所述二嵌段共聚物基本上呈球形。

在本发明的载药物聚合物纳米粒的一些实施方案中，所述二嵌段共聚物为基本上实心的结构。

在本发明的载药物聚合物纳米粒的另外一些实施方案中，所述药物为金属铂类络合物。在本发明中提及的金属铂类络合物是指由一定数量的配位体(有孤电子或电子对的负离子或分子)通过配位键(由成键一方单独提供电子而形成的共价键)结合于中心离子或中心原子(即铂离子或铂原子)的周围而形成的一个复杂离子(或分子)，并与原来各组分的性质不同。

作为使用于本发明的金属铂类络合物其中的一例，所述金属铂类络合物为顺铂。顺铂，即顺-二氨基-二氯铂(CDDP)，是指CDDP分子内的2个氯离子之一或者两者被共聚物的羧基阴离子交换得到的配位化合物，但不一定限于全部CDDP分子和该共聚物形成配位键。换言之，CDDP分子的一部分可以通过配位键以外的任何物理键担载在该共聚物上。但是，优先担载的全部CDDP分子，通过CDDP分子内的2个氯离子之一或者两者，与聚合物的羧基形成配位键。

作为一例，在本发明的载药物聚合物纳米粒中所述药物的重量含量为5～20％、5～18％、8～20％或8～13％。

又作为一例，本发明的载药物聚合物纳米粒的粒径小于200nm(例如，80～200nm或60～80nm)。

本发明的载药物聚合物纳米粒，除了所载药物之外，还可包含药用辅料。所述的药用辅料可以为小糖类、多羟基类化合物、多糖类化合物、氨基酸化合物、无机盐类物质的一种、或它们的任意组合。其中，小糖类可以是蔗糖、海藻糖、葡萄糖、麦芽糖或乳糖的一种或它们的任意组合；多羟基化合物可以是甘露醇、山梨醇、甘油、1，2-丙二醇、聚乙二醇或聚乙烯醇的一种或它们的任意组合；多糖类化合物可以是葡聚糖、海藻酸钠、壳聚糖、淀粉或纤维素物质的一种或它们的任意组合；氨基酸化合物可以是甘氨酸、精氨酸、谷氨酸或组氨酸的一种或它们的任意组合；无机盐类物质可以是氯化钠、钙盐、铜盐或镁盐的一种或它们的任意组合。

本发明的载药物聚合物纳米粒还可以包含稳定剂，例如聚乙二醇维生素E琥珀酸酯(TPGS)。稳定剂在纳米粒的重量含量可以为0.01～5％(例如，0.01～2％、0.01～1％或0.05～1％)。

本发明的载药物聚合物纳米粒可以以纳米冻干粉剂或浓缩推注制剂的形式存在。例如，本发明的载药物聚合物纳米粒以浓缩推注制剂形式存在时，浓缩推注制剂可以为含有浓度为0.5～2.5mg/mL的所述载药物聚合物纳米粒的注射制剂。制成药物的初期浓度可以用0.1～10mg/mL的稀释剂如灭菌等渗水溶液，通常进行快速浓注达到0.5～50mg/kg体重。

本发明的另一个目的是提供一种制备本发明的载药物聚合物纳米粒的方法。具体来说，作为本发明的制备载药物聚合物纳米粒的方法包括以下步骤：

(1)将所述药物溶解于包含至少可注射的水溶性聚合物中形成所述药物水相；

(2)将形成的所述药物水相加入到二嵌段共聚物的有机溶液中，有机溶液与适宜浓度IPTG溶液混合，应用适当方法使之均匀分散形成均匀的混悬液；

(3)将生成的所述混悬液的有机溶剂挥发完全，得到载药物聚合物纳米粒。

在本发明的载药物聚合物纳米粒的制备方法的步骤(2)中，有机溶剂可以是二氯甲烷、丙酮、乙醇、乙酸乙酯或氯仿或是它们的任意组合；所述二嵌段共聚物的重量占该有机溶剂的百分比浓度为0.5～10％(w/v)(例如，2～5％(w/v))。在本发明的制备方法的具体实施中，可以使用相同的有机溶剂也可以使用不同的有机溶剂或是混合溶剂。

在本发明的载药物聚合物纳米粒的制备方法中，所述药物可以为金属铂类络合物(例如顺铂)。在本发明的具体实施中，将药物加入到含二嵌段共聚物的有机相中，通过搅拌或涡旋等使之均匀分散形成均匀的悬液。因此，通过本发明制得的载药物聚合物纳米粒中，所述药物和二嵌段共聚物可以基本上均匀地分散存在。

在本发明的另外一些具体实施中，在将所述混悬液的有机溶剂挥发(即步骤(3))之前，可以先将混悬液加入到一个含稳定剂的水溶液中进行稳定并形成混合物，微射流均质化所述混合物以生成所述复乳液。在一些例子中，所述稳定剂为聚乙二醇维生素E琥珀酸酯(TPGS)，其重量百分比占载药物聚合物纳米粒的0.01-2.5％。

在本发明的另外一些具体实施中，所述水相中还包含氯化物，其重量百分比为5～10％；所述有机溶液和所述水相的体积比为1∶20～1∶4。

在本发明的制备方法中，可将所述纳米粒混悬液在10,000～16,000psi的压力下，经微射流仪均质化后再蒸除溶剂即可得载药物聚合物纳米粒。例如，可以使用微射流均质仪循环5～20次，以形成亚微米乳液，从而减小载药物聚合物纳米粒粒径。如此得到的载药物聚合物纳米粒可以直接或与药用辅料(例如赋型剂或稳定剂，如葡萄糖、甘露糖、低聚糖等)混合后，冻干形成冻干粉剂。例如，可以将如此得到的所述的载药物聚合物纳米粒制成浓度为0.5～2.5mg/mL的所述载药物聚合物纳米粒的注射制剂。

在本发明的一些例子中，所述的载药物聚合物纳米粒粒径为80～200nm。在本发明的另外一些例子中，所述药物的包封率大于65％(例如达到了70％、80％或更高)。其中所述包封率是指包裹在所述二嵌段共聚物中的药物占所述纳米粒混悬液中药物总量的比例，它是评价纳米颗粒质量优劣的重要指标，也是其能否发挥较普通制剂高效低毒特点的关键。本发明通过如下方法测定包封率：取制备好的聚合物纳米粒(已透析除去游离药物，过0.22μm滤膜除去未溶解的药物)适量，加三倍其体积的乙腈使纳米粒破坏，通过高效液相色谱仪测定聚合物中药物的含量。依公式包封率EE％＝W包/W药×100％。

本发明的另外一方面还提供了一种有效地保护顺铂或是延长其有效性或药性、增加其生物可利用性、或是降低其对生物体内器官或组织毒性的方法。本方法的特征在于：将顺铂和聚乳酸-甲氧基聚乙二醇(PLA-mPEG)或聚乙交酯丙交酯-甲氧基聚乙二醇(PLGA-mPEG)做成根据本发明所提供的载顺铂聚合物纳米粒。

在本发明的有效地保护顺铂或是延长其有效性、生物可利用性或药效的方法的例子中，可以将顺铂和所述二嵌段共聚物纳米粒的有机溶液加入到含聚乙二醇维生素E琥珀酸酯(TPGS)的水溶液中乳化，形成纳米粒混悬液。在另外的一些例子中，将所述纳米粒混悬液的溶剂除去，直接或与药用辅料(例如赋型剂或稳定剂，如葡萄糖、甘露糖、低聚糖等)混合后冻干得到载疏水性药物的聚合物纳米粒。

本发明的又一个目的是提供本发明的载药物聚合物纳米粒在制备治疗卵巢癌或乳腺癌的药物中的应用。在本发明的一个具体例子中，将本发明的载顺铂聚合物纳米粒用于制备治疗卵巢癌或乳腺癌的药物。在本发明的具体实施时，本发明的由顺铂和生物可降解的纳米材料构成的抗肿瘤制剂，可以制备成医用的冻干粉针和浓缩推注制剂，也可用生理溶液重组成可注射的混合物。

本文所用术语“或”的意思包含了“或”和“和”的意思。

本文所用术语“聚合物纳米粒”(polymer nanoparticles，PNP)是指粒径小于1,000nm的聚合物颗粒，是以聚合物作为药物载体的一种纳米给药系统，具有防止药物降解、降低药物毒性、控制药物释放和提高的药物生物利用度的特点。

本文所用术语“PLA-mPEG”或“PLGA-mPEG”是一种两性嵌段聚合物分子，是由乳酸LA(lactic acid)或乙醇酸GA(glycolic acid)按一定摩尔比例在聚乙二醇(PEG)存在的情况下开环聚合而成的。

本文所用术语“基本上均匀分散”是指药物在有机溶剂或聚合物纳米粒中分布的数量与比例基本相同(分布状态呈均一性，保证药物释放的控制速率)(？)。

本文所用术语“均质化”是指通过使用在一定的压力范围内(例如，10,000～18,000psi)的预设压力下工作的微射流均质机处理，以形成具有在约60～200nm范围内的微粒。

本文所用术语“生物可利用性”(bioavailability)是指药物被机体吸收进入循环的相对量和速率，用F表示，F＝(A/D)·100％，其中A为进入体循环的量，D为口服剂量。影响生物利用度的因素较多，包括药物颗粒的大小、晶型、填充剂的紧密度、赋型剂及生产工艺等，生物利用度是药物制剂质量的一个重要指标。

本文所用术语“有效地保护顺铂或是延长其有效性或药性”是指通过聚合物纳米粒将适用于本发明的药物(如金属铂类络合物，再如顺铂)通过物理或化学作用临时地保护起来，等到在特殊环境下(例如通过聚合物的分解或溶解)再释放出来的机制。

本文所用术语“降低其对生物体内器官或组织的毒性”是指通过形成药载聚合物纳米粒，药物在自由状态时对体内器官(例如肾脏)或组织具有的毒性被临时地屏蔽起来，因此在通过或接触该组织或器官是不再体现出毒性。

本发明的纳米顺铂有益效果在于：本发明的纳米粒制备方法简化、易于操作，顺铂药物包封率和载药量测定表明，共聚物纳米粒具有良好的载药能力，符合药典的基本要求；本发明使用的材料为一种FDA批准的药用生物降解高分子材料，具有组织相容性好、无免疫原性、安全性好等特征，在体内可降解为二氧化碳和水排出体外，保证了体内应用的安全性；本发明的纳米粒粒径经静脉注射可通过被动靶向集中于肿瘤部位；本发明的载药物聚合物纳米粒的制备方法大大简化，产品成本降低而产品质量提高，适合于工业化生产；本发明的载药物聚合物纳米粒的制备方法解决了传统方法不能制备药物领域所需要的药物粒径、形貌特征、有机溶媒残留等缺点；本发明的顺铂纳米药物具有显著大于在现有制备技术中可能的稳定性，特别是超过24小时的稳定性。

具体实施方式

本发明目的之一是提供一种顺铂和PLA/PLGA-mPEG共聚物的纳米颗粒构成的抗肿瘤制剂，它可以用生理溶液重组成可注射的混合物。

根据本发明目的，纳米顺铂药物的具体制备操作步骤如下：

在带有搅拌的反应器上，调控转速为50～1,500rpm，将0.6重量份顺铂溶解于1.3重量份的羧甲基纤维素钠溶液中，形成顺铂-络合物溶液；在20～30℃条件下，将顺铂-络合物水溶液加入0.30重量份PLA/PLGA-mPEG的二氯甲烷/丙酮复合溶液中(复合溶液中含有0.09重量份的斯盘80)，旋涡或超声形成混悬液，即初乳；初乳液与4～10倍量的TPGS溶液混合，微射流均质乳化，形成复乳；复乳挥发尽有机溶液后，加入适宜辅料，冷冻干燥得到冻干粉针。

本发明使用的水溶性聚化物可以是羧甲基纤维素钠，海藻酸钠等；

本发明使用的初乳乳化剂为符合体内应用要求的斯盘类物质，可选择斯盘40、斯盘60、斯盘65、斯盘80、斯盘83、斯盘85中任一种；

本发明使用的PLA/PLGA-mPEG有机溶液可以为二氯甲烷、乙酸乙酯、或丙酮中一种或它们的任意组合；

本发明使用的PLA/PLGA-mPEG的有机溶液浓度为，PLA-mPEG和/或PLGA-mPEG的重量占总油相的百分比浓度为0.01～10％(w/w)，例如0.2～2％(w/w)；

本发明使用的稳定剂为TPGS，可应用浓度范围为0.01～2.5％，其中以0.02～1％最佳，或含0.5～10％(w/w)氯化钠等盐溶液。

通过冷冻干燥粉末构成的制剂达到了本发明的目的，在制剂中顺铂量在1～8％之间，PLA/PLGA-mPEG共聚物的量在2～20％之间；纳米颗粒的平均粒径小于0.2微米，所述冷冻干燥的粉末含有70～90％的生物相容性附加剂。

可以注意到的是，本发明人使用的顺铂-络合物水溶液不仅大大简化了制备流程本身，也使此方法与现有技术相比，在匀化处理前完成各组分的混合所需时间大大缩短，而且也能得到更好的最终纳米药物产率，优化了为得到所需的无菌冷冻干燥粉末所遵循的条件。

为阐明对本发明特征的理解，现在描述其实施的一些非限定性的实施例。

实施例1

在本实施例中，主要操作是以无菌软化水将符合FDA规范的可注射羧甲基纤维素钠聚合物溶解于水中，配制的浓度为1.3％；然后加入顺铂(0.6％)于溶液中溶解，37℃反应数小时，形成源于下式表示的共聚物与顺铂的络合物；顺铂的Pt原子和该共聚物的羧基阴离子的当量比(Pt/COO^-)为0.3以上。在本实施例中，顺铂当处于未结合形式时是难溶于水的，而经过结合之后，则表现出在溶解度上的大大改善。

化学反应过程：

羧甲基纤维素钠分子结构I：

本发明所述的络合物是指CDDP分子内的2个氯离子之一或者两者被该共聚物的羧基阴离子交换得到所谓配位化合物，但不一定限于全部CDDP分子和该嵌段共聚物形成配位键。换言之，CDDP分子的一部分可以通过配位键以外的任何物理键担载在该共聚物上。但是，优选担载的全部CDDP分子，通过CDDP分子内的2个氯离子之一或两者，与该共聚物的羧基形成配位键。按照本发明，对高分子溶液没有限制，但典型的是指在水性介质中，在CDDP的共存下，共聚物自动多分子缔合而形成络合物质。对于本发明中使用的共聚物，用上述式I表示，只要是遵循本发明的目的，任何共聚物都可以。反应中的R代表除羧基基团外的所有羧甲基纤维素钠的结构部分。

实施例2

600.1mg PLGA-mPEG两嵌段共聚物，两嵌段分子量分别为60,000和5,000溶于20mL二氯甲烷/丙酮中，复合有机相中溶有937.2mg斯盘80，把有机相溶液和顺铂络合物溶液混合，形成初乳；将初乳液加入到100mL 0.3％的聚乙二醇维他命E琥珀酯溶液中，然后将均匀分散的混合物溶液在高压下(9,000～16,000psi)微射流均质机内(适当的灭菌)处理直至得到纳米乳剂(粒径小于0.2微米)；挥发2～6个小时，使该亚微米乳液穿过一0.2微米过滤器以对该乳液进行除菌。将其在无菌条件下冷冻到-80℃，并且冻干58小时，同时升温至30℃。

将得到的含有5.7％(w/w)顺铂粉末，用0.9％氯化钠水溶液重制，形成顺铂浓度为2.0mg/mL，得到的制剂具有0.18微米的平均粒径，pH 7.1～7.6，稳定性大于24小时。

实施例3

600.3mg PLGA-mPEG两嵌段共聚物，两嵌段分子量分别为30,000和5,000溶于20mL二氯甲烷/丙酮中，复合有机相中溶有937.5mg斯盘80，把有机相溶液和顺铂络合物溶液混合，形成初乳；将初乳液加入到100mL 0.3％的聚乙二醇维他命E琥珀酯溶液中，然后将均匀分散的混合物溶液在高压下(9,000～16,000psi)微射流均质机内(适当的灭菌)处理直至得到纳米乳剂(粒径小于0.2微米)；挥发2～6个小时，使该亚微米乳液穿过一0.2微米过滤器以对该乳液进行除菌。将其在无菌条件下冷冻到-80℃，并且冻干58小时，同时升温至30℃。

将得到的含有5.7％(w/w)顺铂颗粒粉末，用0.9％氯化钠水溶液重制形成顺铂浓度为2.0mg/mL，得到的制剂具有0.17微米的平均粒径，pH 7.1～7.6，稳定性大于24小时。

实施例4

600.2mg PLGA-mPEG两嵌段共聚物，两嵌段分子量分别为20,000和5,000溶于20mL二氯甲烷/丙酮中，复合有机相中溶有937.3mg斯盘80，把有机相溶液和顺铂络合物溶液混合，形成初乳；初乳液加入到100mL 0.3％的聚乙二醇维他命E琥珀酯溶液中，然后将均匀分散的混合物溶液在高压下(9,000～16,000psi)微射流均质机内(适当的灭菌)处理直至得到纳米乳剂(粒径小于0.2微米)；挥发2～6个小时，使该亚微米乳液穿过一0.2微米过滤器以对该乳液进行除菌。将其在无菌条件下冷冻到-80℃，并且冻干58小时，同时升温至30℃。

将得到的含有5.7％(w/w)顺铂粉末，用0.9％氯化钠水溶液重制，形成顺铂浓度为2.0mg/mL，得到的制剂具有0.15微米的平均粒径，pH 7.1～7.6，稳定性大于24小时。

实施例5

600.3mg PLA-mPEG两嵌段共聚物，两嵌段分子量分别为40,000和3,000溶于20mL二氯甲烷/丙酮中，复合有机相中溶有937.8mg斯盘80，把有机相溶液和顺铂络合物溶液混合，形成初乳；将初乳液加入到100mL 0.3％的聚乙二醇维他命E琥珀酯溶液中，然后将均匀分散的混合物溶液在高压下(9,000～16,000psi)微射流均质机内(适当的灭菌)处理直至得到纳米乳剂(粒径小于0.2微米)；挥发2～6个小时，使该亚微米乳液穿过一0.2微米过滤器以对该乳液进行除菌。将其在无菌条件下冷冻到-80℃，并且冻干58小时，同时升温至30℃。

将得到的含有5.7％(w/w)顺铂粉末，用0.9％氯化钠水溶液重制形成顺铂浓度为2.0mg/mL，得到的制剂具有0.18微米的平均粒径，pH 7.1～7.6，稳定性大于24小时。

实施例6

600.6mg PLA-mPEG两嵌段共聚物，两嵌段分子量分别为30,000和3,000溶于20mL二氯甲烷/丙酮中，复合有机相中溶有937.4mg斯盘80，把有机相溶液和顺铂络合物溶液混合，形成初乳；将初乳液加入到100mL 0.3％的聚乙二醇维他命E琥珀酯溶液中，然后将均匀分散的混合物溶液在高压下(9,000～16,000psi)微射流均质机内(适当的灭菌)处理直至得到纳米乳剂(粒径小于0.2微米)；挥发2～6个小时，使该亚微米乳液穿过一0.2微米过滤器以对该乳液进行除菌。将其在无菌条件下冷冻到-80℃，并且冻干58小时，同时升温至30℃。

将得到的含有5.7％(w/w)顺铂颗粒粉末，用0.9％氯化钠水溶液重制，形成顺铂浓度为2.0mg/mL，得到的制剂具有0.17微米的平均粒径，pH 7.1～7.6，稳定性大于24h。

实施例7

600.2mg PLA-mPEG两嵌段共聚物，两嵌段分子量分别为20,000和3,000溶于20mL二氯甲烷/丙酮中，复合有机相中溶有937.8mg斯盘80，把有机相溶液和顺铂络合物溶液混合，形成初乳；将初乳液加入到100mL 0.3％的聚乙二醇维他命E琥珀酯溶液中，然后将均匀分散的混合物溶液在高压下(9,000～16,000psi)微射流均质机内(适当的灭菌)处理直至得到纳米乳剂(粒径小于0.2微米)；挥发2～6个小时，使该亚微米乳液穿过一0.2微米过滤器以对该乳液进行除菌。将其在无菌条件下冷冻到-80℃，并且冻干58小时，同时升温至30℃。

将得到的含有5.7％(w/w)顺铂粉末，用0.9％氯化钠水溶液重制，形成顺铂浓度为2.0mg/mL，得到的制剂具有0.16微米的平均粒径，pH 7.1～7.6，稳定性大于24小时。

在某些实施例中，均质化过程可通过使用在10,000psi高至40,000psi范围内的预设压力下工作的微射流均质机处理，以形成具有在约100～300nm范围内的微粒。

实施例8：长循环纳米粒包封率和载药量的测定

1.5mL载药纳米悬液10,000rpm离心1小时取上清1mL加入试管中，再加入2.0mL 4.0M HCl-0.4M SnCl₂，混匀，测Abs，得到游离顺铂量，按下面公式计算包封率，载药率：

包封率＝[(Wa-Ws)/Wa]×100％

载药量＝[(Wa-Ws)/W_PLGA-mPEG]×100％

Wa：初始投药量；Ws：上清液中含药量；W_PLGA-mPEG：纳米粒总质量

包封率是评价纳米粒的一个重要指标，但用二次乳化法制备隐形纳米粒时，影响粒径和包封率的因素是比较复杂的。本发明能够导致PLGA-mPEG小粒径的药物包封率为68％以上(例如70.9％)。

实施例9：顺铂纳米粒稳定性评价

(1)纳米粒的稳定性评价

纳米粒在电解质中的稳定性通过加入等量、但不同浓度的Na₂SO₄溶液进行评价。将0.5mL的纳米粒混悬液加入到2.5mL(浓度从0～0.9mol/L)的Na₂SO₄溶液中，摇匀，15分钟后，用紫外可见分光光度计在400nm处测试溶液的浑浊度。临界絮凝点(CFPT)为浑浊度突然增加时的电解质浓度。

(2)纳米粒蛋白吸附粒径变化

配制含有5％(w/v)的牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液，将载有顺铂的纳米粒冻干粉溶解其中，纳米粒的浓度为2mg/mL，载药量为3.8％。在生理温度(37℃)下监测纳米粒的粒径随时间的变化。每组设两个样品，每个样品重复测试三次取平均值。

(3)纳米粒的酶降解

用蒸馏水配制浓度为0.01％和0.02％的脂肪酶水溶液。取纳米粒混悬液2mL，加入1.5uL脂肪酶水溶液，用ALV-5000/E光散射测定仪，观察散射光强随浓度的变化情况，每隔一定时间记录一次光强。同时观察粒子尺寸变化情况，测试条件角度30度，温度25℃。

PLGA-mPEG纳米粒在不同电解质浓度下的稳定性，可以通过在纳米粒水溶液中加入电解质Na₂SO₄来表征。纳米粒的稳定性和临界絮凝点CFPT时的电解质Na₂SO₄浓度大于0.65mol/L。

测定载药纳米粒在血清中的稳定性是一个简单有效的方法来预测其在体内的药物代谢规律和药效。负载顺铂的纳米粒在含有5％BSA(W/V)展现出了良好的稳定性。在37℃时观察的60小时，顺铂纳米粒粒径变化不大，其吸光度值基本保持不变。这说明纳米粒的PEG壳在37℃仍然是亲水的，它可以避免纳米粒对血清蛋白的吸附。稳定性实验初步预示着负载顺铂的PLGA-mPEG纳米粒应该能在体内的环境中有较长的循环时间，达到靶器官。

实施例10：顺铂纳米粒体外释药实验

复乳法制备载顺铂的聚合物纳米粒，用移液枪吸取5mL该载顺铂的聚合物纳米粒置于截留相对分子质量为3,500的透析袋内(MWD 3,500)，将透析袋浸入250mL含十二烷基磺酸钠(SDS，0.3％)的PBS溶液中，于37℃，100r/min磁力搅拌下进行体外释放实验。于12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、120h取样，每次取1mL释药介质，并补充1mL含0.3％十二烷基磺酸钠的PBS溶液。用显色法检测取出的释药介质中顺铂含量，并计算释药量和累积释药百分比，同一个时间点取三个样品，取平均值，绘制体外释药曲线。

在所测定的浓度范围内，顺铂的吸收度与浓度呈现良好的线性关系，R²＝1，因而利用显色反应确定顺铂浓度的方法准确可靠。在药物体外释放试验中，为了保持良好的漏槽条件，向释放介质中加入与人体生理环境等同浓度的氯化钠，98～106mmol/L。

纳米粒包裹的顺铂释放量经过24小时之后，在氯化钠溶液中释放量接近21％，顺铂的释放随着释药时间的增加，逐渐缓慢，72小时之后释放量则为60％以上，说明该体系可以起到缓释的效果。

实施例11：MTT法考察载顺铂聚合物纳米粒和空白纳米粒的细胞毒性

采用MTT法测细胞增殖抑制率。细胞传代培养2～3天，取处于对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化后，用含10％胎牛血清的RPM1-1640培养基稀释细胞至约1×10⁴个/mL的细胞浓度，加入96孔板上，每孔200uL。培养板置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养24小时，根据实验需要分别加入稀释好的顺铂注射液及载有顺铂的PLGA-mPEG纳米粒样品，每个浓度3孔，每孔10uL，培养到预定的时间(72小时)后，每孔加入20μLMTT(5mg/mL)和180μLPBS，继续在37℃、5％CO₂培养箱中培养4小时，小心吸弃上清，再加入100μL二甲亚砜，微型摇床上振荡15min，酶标仪测定吸收度(测定波长490nm)。同时设立空白组，即不加细胞及药液；对照组即无药物处理的细胞。以空白组调零，在酶标仪上测定波长490nm处的吸光度值OD₄₉₀nm。

细胞增殖抑制率＝(1-实验组OD值)/对照组OD值×100％。

空白的PLGA-mPEG纳米用RPM1-1640培养液分散，配制成与载药纳米同样的浓度，同样用MTT法测定空白纳米粒子的细胞毒性。

本发明的纳米粒随着剂量的加大及时间的延长而毒性增加。纳米粒对癌细胞表现出较低的毒性，即使纳米粒达到较高剂量，对癌细胞的毒性也比较有限，72小时后超过80微克每毫升的剂量才使得细胞活度减少10％。顺铂注射液及载顺铂PLGA-mPEG长循环纳米粒对癌细胞的抑制效果用细胞增殖抑制率表示，载顺铂的纳米粒子对卵巢癌细胞系IGROV1的生长抑制作用与顺铂近同；有着类似的剂量-效应曲线，其IC₅₀也非常接近；纳米粒包裹后的顺铂对癌细胞的杀伤作用随着剂量的加大而效果增强。

实施例12：动物急性毒性实验

将健康雌性小鼠40只，随机分为四组，每组10只；将顺铂纳米制剂按85mg/kg用15mL生理盐水稀释后尾静脉注射；观察给药后两周鼠体重变化、精神、饮食、行动状态及有无死亡。

在小鼠中，对按照实施例所述方法制备的顺铂纳米药物和常规方法制备的顺铂水溶液的毒性进行研究。接受顺铂注射液10.62mg/kg尾静脉注射后，所有小鼠饮食、行动均异常，出现体重减轻，有动物死亡，小鼠显示62.5％的死亡率。当纳米顺铂剂量增加到84.96mg/kg后，部分动物出现精神萎靡，有轻度的体重减轻，动物死亡，小鼠仅显示37.5％的死亡率。进行血液学参量检测结果如下表所示。这些结果证明了本发明的顺铂纳米粒具有的安全低毒特点。

本发明的经TPGS稳定的顺铂纳米制剂可矫正当前市售调配物存在的若干临床上重要的缺陷，并且当与市售产品比较时相关分析证明可提供有益的安全性效力曲线。以上例子仅仅作为参考其到解释和表述作用，对于本发明的权利要求的范围不具有限制作用。

本说明书所引用的所有文献或出版物的全文都以引文的形式成为本说明书的一部分，不再重复。

以上详细描述了本发明的一些具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本实用新型的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本实用新型的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一种载药物聚合物纳米粒，包含药物和二嵌段共聚物，其中：

所述二嵌段共聚物为聚乳酸-甲氧基聚乙二醇(PLA-mPEG)或聚乙交酯丙交酯-甲氧基聚乙二醇(PLGA-mPEG)，其中，嵌段聚乳酸(PLA)或聚乙交酯丙交酯(PLGA)的分子量为10,000～60,000，嵌段甲氧基聚乙二醇(mPEG)的分子量为2,000～5,000，PLA或PLGA与mPEG的嵌段比为60∶40～90∶10；

所述载药物聚合物纳米粒的粒径为60～300nm，包括二嵌段共聚物外壳和所述药物内核；

所述药物在自由状态时能够迅速分解或是对体内器官或组织具有毒性，在载药物聚合物纳米粒的重量含量为3～20％，并且基本上均匀分散在聚合物纳米颗粒内。

2.如权利要求1所述的载药物聚合物纳米粒，其中：所述嵌段聚乳酸PLA或聚乙交酯丙交酯PLGA的分子量为10,000～40,000，所述嵌段甲氧基聚乙二醇mPEG的分子量为2,000～5,000，所述PLA或PLGA与mPEG的嵌段比为70∶30～85∶15。

3.如权利要求1所述的载药物聚合物纳米粒，其中：所述二嵌段共聚物制备的纳米粒基本上呈球形。

4.如权利要求1所述的载药物聚合物纳米粒，其中：所述二嵌段共聚物制备的纳米粒为基本上实心的结构。

5.如权利要求1所述的载药物聚合物纳米粒，其中：所述药物为金属铂类络合物。

6.如权利要求5所述的载药物聚合物纳米粒，其中：所述药物为顺铂。

7.如权利要求1所述的载药物聚合物纳米粒，其中：所述药物的重量含量为3～20％。

8.如权利要求1所述的载药物聚合物纳米粒，其中：所述载药物聚合物纳米粒的粒径为80～200nm。

9.如权利要求1所述的载药物聚合物纳米粒，其中：还包含药用辅料，所述的药用辅料为小糖类、多羟基类化合物、多糖类化合物、氨基酸化合物、或无机盐类物质的一种或它们的任意组合。

10.如权利要求9所述的载药物聚合物纳米粒，其中：

所述小糖类为蔗糖、海藻糖、葡萄糖、麦芽糖或乳糖的一种或它们的任意组合；

所述多羟基化合物为甘露醇、山梨醇、甘油、1，2-丙二醇、聚乙二醇或聚乙烯醇的一种或它们的任意组合；

所述多糖类化合物为葡聚糖、海藻酸钠、壳聚糖、淀粉或纤维素物质的一种或它们的任意组合；

所述氨基酸化合物为甘氨酸、精氨酸、谷氨酸或组氨酸的一种或它们的任意组合；

所述无机盐类物质为氯化钠、钙盐、铜盐或镁盐的一种或它们的任意组合。

11.如权利要求1-10之一所述的载药物聚合物纳米粒，其中：还包含聚乙二醇维生素E琥珀酸酯(TPGS)，其重量含量为0.05～1％。

12.如权利要求11所述的载药物聚合物纳米粒，其中：所述纳米粒以纳米冻干粉剂或浓缩推注制剂的形式存在。

13.如权利要求12所述的载药物聚合物纳米粒，其中：所述浓缩推注制剂为含有药物浓度为0.5～2.5mg/mL的所述载药物聚合物纳米粒的注射制剂。

14.权利要求1-13之一所述的载药物聚合物纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

(2)将形成的所述药物水相加入到二嵌段共聚物的有机溶液中，再将此有机溶液与适宜浓度的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯溶液混合，微射流仪分散形成均匀的混悬液；

15.如权利要求14所述的制备方法，其中：在所述步骤(2)中，所述有机溶剂为二氯甲烷、丙酮、乙醇、乙酸乙酯或氯仿或其任意组合；所述二嵌段共聚物的重量占有机溶剂的百分比浓度为0.5～10％(w/v)。

16.如权利要求14所述的制备方法，其中：所述药物为金属铂类络合物。

17.如权利要求16所述的制备方法，其中：所述药物为顺铂。

18.如权利要求14所述的制备方法，其中：在所述步骤(1)中，使所述药物和二嵌段共聚物基本上均匀分散在所述有机溶剂中。

19.如权利要求14所述的制备方法，其中：在步骤(3)之前，先将混悬液加入到含一种稳定剂的水溶液中进行稳定并形成混合物，微射流均质化所述混合物以生成所述复乳液。

20.如权利要求19所述的制备方法，其中：所述稳定剂为聚乙二醇维生素E琥珀酸酯(TPGS)，其重量百分比占载药物聚合物纳米粒的0.01～5％。

21.如权利要求14所述的制备方法，其中：在所述水相中还包含氯化物，其重量百分比为0.9～2.0％；所述有机溶液和所述水相的体积比为1∶20～1∶4。

22.如权利要求14所述的制备方法，其中：将所述纳米粒混悬液在10,000～16,000psi的压力下，经微射流仪均质化后再蒸除溶剂。

23.如权利要求22所述的制备方法，其中：将步骤(3)得到的所述载药物聚合物纳米粒直接或与药用辅料混合后，冻干形成冻干粉剂。

24.如权利要求22所述的制备方法，其中：将步骤(3)得到的所述载药物聚合物纳米粒制成药物浓度为0.5～2.5mg/mL的所述载药物聚合物纳米粒的注射制剂。

25.如权利要求14所述的制备方法，其中：所述的载药物聚合物纳米粒粒径为80～200nm。

26.如权利要求14所述的制备方法，其中：所述药物的包封率大于75％。

27.一种有效地保护顺铂或是延长其有效性或药性、增加其生物可利用性、或是降低其对生物体内器官或组织毒性的方法，其中：将顺铂和聚乳酸-甲氧基聚乙二醇(PLA-mPEG)或聚乙交酯丙交酯-甲氧基聚乙二醇(PLGA-mPEG)做成根据权利要求1-13之一所述的载顺铂聚合物纳米粒。