CN106994117A - 一种治疗胆系肿瘤的药物纳米复合温敏凝胶剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种治疗胆系肿瘤的药物纳米复合温敏凝胶剂。可由聚合物或者靶向基团修饰的聚合物作为载体材料包裹抗肿瘤活性物质制成纳米粒，再加入温敏高分子材料制成纳米复合温敏凝胶剂；或将抗肿瘤活性物质的纳米粒溶于或混悬于温敏凝胶中制得。本发明的治疗胆系肿瘤的药物纳米复合温敏凝胶剂制备方法简便，适于大规模生产，适合制备治疗及预防术后复发的胆囊癌、肝内胆管癌和肝外胆管癌等胆系肿瘤的药物。

Description

一种治疗胆系肿瘤的药物纳米复合温敏凝胶剂
技术领域
本发明属于一种肿瘤治疗的药物纳米复合温敏凝胶剂的制备方法及其应用,适用于制备治疗胆系肿瘤的药物。
背景技术
近年来，胆管癌的发病率增加。其起病隐匿，生长迅速，临床症状不典型或缺乏特异性，早期不易发现，确诊时往往已达晚期，胆道癌和胆囊癌恶性程度甚高，治疗棘手，预后极差，越来越受到业内的高度关注。目前，手术仍然是唯一可能获得根治的手段，但仅约10％的早期患者可以进行根治性切除术，大多数患者确诊时已处于晚期，失去手术机会；即使患者接受手术切除，术后也容易复发转移，超过80％在确诊后1年内死亡，5年生存率仅为2％-5％，因此，对于胆道癌和胆囊癌特别强调进行多学科综合治疗，内科药物治疗包括化疗和分子靶向治疗等已成为不可或缺的重要治疗手段。
化疗药物用于新辅助治疗或辅助治疗的主要问题是作用普遍缺乏选择性，导致严重的剂量依赖性毒副作用的产生，极大地限制了化疗药物的临床治疗效果。另一个问题是肿瘤细胞抗药性的快速出现。新型分子靶向药物在实体肿瘤中的效果不一，或存在致命的副作用，这很大程度与肿瘤部位聚集程度不高或异位分布相关。因此，对于能特异性靶向肿瘤细胞并造成正常细胞最小损伤的治疗方法的开发，具有非常重要的意义和广阔的应用前景。
局部治疗是解决药物全身毒性的一条捷径，将药物直接给予病灶或其周围部位，可使病灶部位的药物浓度比全身给药提高几百倍以上，而身体其他部位的药物分布很小，植入剂即属于这类制剂。对于局部给药制剂，保证长效缓释和良好的生物相容性至关重要，方便的给药方式也是临床应用时不可或缺的一条因素。目前应用或研发阶段的植入剂大多为固体粉末或颗粒，需特殊的给药器械将药剂植入体内，并且受病人顺应性影响，较深的病灶难于给药到位。而且材料的生物相容性也不乐观，大多数植入剂中应用橡胶类材料作为控释骨架或控释膜，导致植入剂不降解或产生刺激性，反复用药顺应性不好(高仁伟.医用硅橡胶材料改性研究.中国医疗器械杂志，2015,39:122-125)。
温敏高分子材料是一类随外界温度变化，其水溶液可发生溶液-凝胶转变的材料。在药剂学中利用这个性质可在体内形成原位凝胶、栓塞，或在体外固化增加制剂稳定性等。泊洛沙姆是一类生物相容性好，并广泛应用的温敏材料，FDA已批准用于人血管内给药(Official Monographs/Poloxamer.USP38-NF30：1893-1895)。在温度升高时，其水溶液可转变成水凝胶，在体内通过降解和溶蚀来控制药物释放的速度，起到缓释贮库的作用。聚丙烯酰胺类及其与丙烯酸酯类的共聚物也是研究较为广泛的温敏聚合物，在温度升高时，其水溶液形成网状凝胶结构，通过温度变化和骨架内的渗透控制药物的释放速度(李星，束怡，丁明和，娄杰，耿琴，洪春雪，刘立琼，束家有.温度敏感型布洛芬缓释液体栓的制备与体内外评价.中国医院药学杂志，2011，31:1410-1413；苏玉永，刘亚妮，严慧娟，郑思维，李鑫.水飞蓟素固体分散缓释胶囊的研制.中国医院药学杂志，2008，28:2115-2117)。
纳米技术近几十年来应用于医药研究中，取得了初步的成果。微纳米载体系统直径可保持在1nm-10μm。因为正常组织周围的血管没有缝隙，而肿瘤组织周围的血管有100nm左右的缝隙，所以小粒径的纳米粒子就会从这些缝隙中渗透出来，并利用增强的渗透保留效应聚集于肿瘤部位，然后攻击癌细胞，但不会损害正常细胞，从而达到被动靶向的效果。较大粒径的通过骨架的缓慢降解后实现被动靶向。许多像聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸等生物降解材料已经广泛的被用做药物、基因和成像试剂的递送载体，在结构修饰后，如聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸，具有更好的生物相容性。另外，聚乳酸羟基乙酸是可生物降解的载体材料，其降解速度可通过控制乳酸-羟基乙酸的摩尔比例而调节，作为注射用辅料被2015年版《中国药典》所收载。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种治疗胆系肿瘤的药物纳米复合温敏凝胶剂的制备方法及其用途。该纳米复合温敏凝胶剂适合于肌肉注射、皮下注射、皮内注射、瘤内注射、瘤旁注射、经皮给药等方式；适合用于制备治疗胆系肿瘤如胆管癌、胆囊癌等术前新辅助治疗或术后的辅助治疗，预防其复发和转移；制备方法简便，适于大规模生产。
本发明的一种纳米复合温敏凝胶剂，由高分子聚合物作为载体材料包裹抗肿瘤活性物质，制成纳米粒，再加入温敏高分子材料；或将抗肿瘤活性物质的纳米粒直接溶解或混悬于温敏凝胶中，制成纳米复合温敏凝胶剂。
进一步的说可以分别是二种物质：(1)由聚合物或者靶向基团修饰的聚合物包裹抗肿瘤活性物质制成纳米粒，再加入温敏高分子材料，制成的治疗胆系肿瘤的纳米复合温敏凝胶剂；其中，高分子聚合物的重量百分含量为0.001-5％，抗肿瘤活性物质的重量体积百分含量为0.001-2g/100ml凝胶剂，温敏高分子材料重量体积百分含量为0.001-35g/100ml；其余为水。
(2)或直接将抗肿瘤活性物质制成纳米粒溶于或混悬于温敏凝胶剂中，制成的治疗胆系肿瘤的纳米复合温敏凝胶剂；当所述抗肿瘤活性物质为水溶性时，溶于温敏凝胶剂中；当所述抗肿瘤活性物质为水不溶性时，制成混悬液与温敏凝胶剂混合；该纳米复合温敏凝胶剂中温敏高分子材料的重量体积百分含量为0.001-35g/100ml；所述的抗肿瘤活性物质的纳米粒在复合凝胶中的重量和体积比的含量为0.001-2g/100ml凝胶剂；其余为水。
上述的纳米复合温敏凝胶剂的粒径范围为5nm-1000μm；
所述的纳米粒的平均粒径在10-1000nm，优选30-800nm。
当所述抗肿瘤活性物质为水溶性时，溶于温敏凝胶剂中，所述的纳米粒的平均粒径优选30-500nm；当所述药物为水不溶性时，制成混悬液与温敏凝胶剂混合，粒径范围50nm-1000μm，优选50-800μm。
所述的聚合物为聚-(乳酸-羟基乙酸)共聚物(PLGA)、聚乙二醇单甲醚-聚-(乳酸-羟基乙酸)共聚物mPEG-PLGA、聚乳酸(PLA)、聚乙二醇单甲醚-聚乳酸(mPEG-PLA)、聚乙二醇单甲醚-聚-(乳酸-羟基乙酸)共聚物-聚赖氨酸(PEG-PLGA-PLL)；上述聚合物为均为已知聚合物或市售聚合物。所述的聚合物中，mPEG的分子量为400-10.0×108，PLGA或PLA的分子量为2000-10.0×108，乳酸与羟基乙酸摩尔比为1-100:100-1，PLL分子量为400-10.0×108。推荐采用聚乙二醇单甲醚-聚-(乳酸-羟基乙酸)共聚物mPEG-PLGA。
所述抗肿瘤基因为siRNA、microRNA；
所述抗肿瘤活性物质为紫杉醇、米托蒽醌、阿霉素、表阿霉素、羟基喜树碱、顺铂、奥沙利铂、依托泊苷、米铂、洛铂、甲氨蝶呤或长春瑞宾，尤其是紫杉醇、表阿霉素、顺铂、奥沙利铂、米铂。
所述的分子靶向药物为抗血管内皮生长因子抗体、抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体。
所述温敏高分子材料为泊洛沙姆F-127、F-68、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、海藻酸钠、壳聚糖、PVA、PVP中的一种或几种；推荐泊洛沙姆F-127、羟丙基甲基纤维素或甲基纤维素。
所述的泊洛沙姆分子量为1×103-1×106，其中，聚氧乙烷嵌段分子量为1×102-6×105，聚氧丙烷嵌段分子量为8×102-4×105，两种嵌段的分子量比例为1-80:1-80；
所述的甲基纤维素分子量为1×103-1×106。
所述的羟丙基甲基纤维素分子量为1×103-1×108。
所述的海藻酸钠分子量为1×103-1×108。
所述的纳米复合温敏凝胶剂的制备方法，包括：
(1)采用复乳法、薄膜乳化法、透析法、乳化蒸发法、界面沉淀法或自组装法制得由高分子聚合物作为载体材料包裹抗肿瘤活性物质的纳米粒溶液；
或将水溶性抗肿瘤活性物质溶解于生理盐水中得抗肿瘤活性物质溶液；
或用超微粉碎、薄膜乳化法、透析法、乳化蒸发法或界面沉淀法将水不溶性抗肿瘤活性物质分散为混悬液；
(2)将温敏高分子材料加入以上(1)制备的溶液中，溶解，即得；
或者，将温敏高分子材料加入生理盐水中溶解成溶液，与纳米粒溶液混合，即得；
或者，将温敏高分子材料与纳米粒冻干粉混合，加入生理盐水分散溶解，即得。
所述步骤(1)纳米粒溶液中的高分子聚合物的摩尔浓度为0.001-10000M，抗肿瘤活性物质的摩尔浓度为0.001-10000μM。
采用复乳法制备，取4mg高分子聚合物溶于200μL二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合溶剂中，加入0.2mg活性物质溶液，超声乳化，再加入2.2mL浓度为1％(w/v)的普朗尼克F68水分散介质中，再次超声乳化。然后室温下搅拌0.5-5h除去有机相，即得纳米粒溶液。
采用薄膜乳化法制备,取4mg高分子聚合物和0.2mg活性物质溶于400μL丙酮溶剂中，旋转蒸发成膜，随后加入4mL的水溶液，室温下搅拌0.5-6h，即得纳米粒溶液。
采用透析法制备，取4mg高分子聚合物溶于200μL二甲亚砜溶剂中，加入0.4mg活性物质，将搅拌均匀的溶液在搅拌的条件下滴入2mL水中，之后将溶液装入透析袋(截留分子量为7000)中透析3-72小时，除去有机溶剂，即得纳米粒溶液。
或取5mg药物溶于200μL二甲亚砜溶剂中，将溶液装入透析袋(截留分子量为7000)中透析3-72小时，除去有机溶剂，即得抗肿瘤活性物质混悬液。
采用乳化蒸发法制备，取4mg高分子聚合物和0.2mg活性物质溶于400μL丙酮/二氯甲烷的混合溶剂中，加入2.2mL浓度为2％(w/v)的含聚乙烯醇(PVA)的水分散介质中，超声或高压乳匀乳化，乳液在室温下搅拌2-4h，挥尽有机溶剂，即得纳米粒溶液。
或取5mg药物溶于400μL二氯甲烷中，加入2mL浓度为0.5％(w/v)的泊洛沙姆188溶液，超声或高压乳匀乳化，乳液在室温下搅拌2-4h，挥尽有机溶剂，即得抗肿瘤活性物质混悬液。
采用界面沉淀法制备，取4mg高分子聚合物和0.2mg抗肿瘤活性物质溶于400μL丙酮溶剂中，在不断的搅拌条件下，将上述溶液注入2.2mL的浓度为2％(w/v)的PVA水分散介质中，减压挥发去除丙酮，即得纳米粒溶液。
或取5mg药物溶于400μL丙酮中，在不断的搅拌条件下，将上述溶液注入2mL的浓度为0.5％(w/v)的泊洛沙姆188溶液，减压挥发去除丙酮，即得纳米粒溶液。
采用自组装法制备，取4mg高分子聚合物溶于200μL水溶液中，加入0.4mg活性物质，将搅拌均匀的溶液在搅拌的条件下滴入2mL水中，之后将溶液装入透析袋(截留分子量为7000)中透析3-72小时，除去有机溶剂；即得纳米粒溶液。
本发明同时还可将包载不同药物的纳米递送载体制备成不同类型的注射剂、胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、滴丸剂和膜剂等。
本发明所用的超声强度，其范围为10-1000W。
本发明所用的透析袋截留分子量，其范围为100-10000。
本发明所述的水分散介质为普朗尼克F68或聚乙烯醇PVA、聚乙烯吡咯烷酮PVP等各种适合于制备纳米粒的表面活性剂，分散介质浓度为0.01-10％(w/v)。
本发明所述的有机溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙醇、二甲亚砜和二甲基甲酰胺等各种适合于制备纳米粒的有机溶剂。
本发明以制备成冻干剂保存和应用，冻干支架剂包括海藻糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、右旋糖苷、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇等，支架剂含量为0.01-20％(w/v)。
本发明所述的包载的抗肿瘤活性物质包括抗肿瘤药物、基因和抗体。抗肿瘤药物包括任何适合制成纳米粒给药系统的抗肿瘤化疗药物，可为水溶性抗肿瘤药物或水不溶性抗肿瘤药物，如吉西他滨、氟尿嘧啶、替加氟、紫杉醇、阿霉素、表阿霉素、羟基喜树碱、顺铂、卡铂、奥沙利铂、米铂、洛铂、依托泊苷、丝裂霉素。基因包括siRNA、microRNA等用于治疗的基因。抗体包括抗血管内皮生长因子抗体、抗PD-1和抗PD-L1抗体。
本发明通过控制骨架聚合物各嵌段的分子量和组成，可使载体具有较好的生物相容性、较高的载药量和较强的肿瘤靶向的功能。调节温敏高分子的种类和组成可以调节凝胶剂的温敏性质及缓释性质。该凝胶剂在室温下是液体，可通过注射用于机体内，通过温敏作用，在体温下形成凝胶贮库，定位的缓慢释放靶向纳米粒，主动靶向于肿瘤细胞。该纳米凝胶载体系统具有运送活性物质、肿瘤治疗、逆转或降低耐药等功能。可生物降解、缓控释、被动靶向、主动靶向的载体材料，适于抗肿瘤活性物质的递送。
采用本发明的方法获得的抗肿瘤的药物制剂适合于肌肉注射、皮下注射、皮内注射、瘤内注射、瘤旁注射、透皮给药、术后给药等方式，本发明尤其适合制备治疗及预防术后复发的胆囊癌、肝内胆管癌和肝外胆管癌等胆系肿瘤的药物。
附图说明
图1纳米粒粒径图；
图2凝胶流变学表征；
图3纳米粒释药曲线；
图4凝胶纳米粒治疗效果。
其中，size distribution by intensity：强度粒径分布；intensity(percent)：强度(百分含量)；size(d.nm)：粒径(直径.纳米)
上述附图中A表示包载紫杉醇的mPEG-PLGA温敏复合凝胶剂；B表示包载紫杉醇的温敏混悬凝胶剂；C表示包载紫杉醇的mPEG-PLA温敏复合凝胶剂；D表示包载顺铂的温敏凝胶剂；E表示包载米铂的温敏凝胶剂；F表示包载米铂的PLGA温敏复合凝胶剂。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
包载卡铂的温敏凝胶剂的制备和应用
取200mg卡铂溶于2ml纯化水中，加入18％(w/w)F-127和0.5％(w/v)HPMC-E15、1％(w/v)MC溶解，冻干，得到干凝胶剂，流变学性质见图2E。
建立胆管癌裸鼠原位模型，将培养的胆管癌Hucct1细胞用不含血清的DMEM培养基配成浓度为1×107个/ml的细胞悬液备用。裸鼠经1％(w/v)戊巴比妥钠腹腔注射(350mg/kg)麻醉后，常规消毒，于剑突下沿腹白线开腹，将吸有肿瘤细胞悬液的显微注射器针头沿肝门部胆管与门静脉间组织间隙刺入紧贴胆管分叉处，注射肿瘤细胞悬液100μl，压迫止血。MRI显示肿瘤体积在100mm3，开始治疗。实验分为2组，每组6只荷瘤鼠：0.9％NaCl组、游离药全身给药组和凝胶局部给药组。凝胶给药组：超声引导将该凝胶剂水化后注射入肿瘤部位，待其凝固后，撤针。游离药全身给药组：以游离的卡铂160mg尾静脉缓慢注射，每周给药2次，连续给药8周。定期MRI观察。3个月后，与0.9％NaCl组(肿瘤体积>1000mm3)和游离药物全身给药组(>600mm3)相比，凝胶局部给药组肿瘤体积明显更小(体积<300mm3，P均<0.05)，有更高的抑瘤率。
实施例2
包载顺铂(DDP)的温敏凝胶剂的制备和应用
采用溶剂-非溶剂法制备：取20mg DDP溶于5mL pH10的KOH溶液中，搅拌下加酸调中性，得DDP混悬液。上述制得的平均粒径为153.7nm(图1D)，释放曲线(图3D)。再加入16％(w/w)F-127、0.5％(w/v)HPMC-K100M得混悬温敏凝胶剂，流变学性质见图2D。
建立胆囊癌裸鼠原位模型，参考实施例1，手术切除肿瘤，将该凝胶剂加入切除部位，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合伤口。对照组为静脉全身给药组(DDP：尾静脉给药2mg/kg，每周2次，治疗5周)和0.9％NaCl组。定期MRI观察。6个月时，0.9％NaCl组复发率83.3％，且有肿瘤复发的裸鼠腹腔内均有种植病灶；游离DDP治疗组复发率为50％。相比，凝胶局部给药组均未发现肿瘤复发及转移(P均<0.05)。
实施例3
包载奥沙利铂(ELO)的温敏凝胶剂的制备和应用
取200mg ELO溶于2ml纯化水中，加入20％(w/w)F-127和0.5％(w/v)HPMC-E15、0.5％(w/v)HPMC-K100M溶解，冻干，得干凝胶剂。
建立胆囊癌裸鼠皮下瘤模型，取30只4-6周的BALB/C裸鼠，15只于右后肢腋下皮下分别接种6X106人胆管癌细胞RBE/只，建立人胆管癌QBC939细胞裸鼠肿瘤模型15只于右后肢腋下皮下分别接种6X106人胆囊癌细胞GBC-SD/只，建立人胆囊癌GBC-SD细胞裸鼠肿瘤模型将该凝胶剂水化后注射入瘤周部位，待其凝固后，撤针。对照组为静脉全身给药组(ELO：尾静脉给药6mg/kg，每周2次，治疗5周)和0.9％NaCl组。定期测量。3个月后，与0.9％NaCl组(肿瘤体积>1000mm3)和游离药物全身给药组(>500mm3)相比，凝胶局部给药组肿瘤体积明显更小(体积<200mm3，P均<0.05)。
实施例4
包载PTX的mPEG-PLA温敏复合凝胶剂的制备和应用
采用乳化蒸发法制备：取10mg mPEG-PLA溶于400μL二氯甲烷，加入0.6mg PTX，超声乳化后，再加入5mL 0.5％(w/v)的泊洛沙姆F68水溶液中，再次超声。然后室温下搅拌3h除去有机相，即得纳米粒混悬液。上述制得的纳米粒平均粒径为162.3nm(图1C)，释放曲线(图3C)。
将20％(w/w)F-127、1％(w/v)HPMC-E15加入以上纳米粒水分散体中溶解，冻干，即得复合干凝胶剂，流变学性质见图2C。
建立胆管癌裸鼠原位模型，将培养的胆管癌QBC939细胞用不含血清的DMEM培养基配成浓度为1×107个/ml的细胞悬液备用。裸鼠经1％戊巴比妥钠腹腔注射(350mg/kg)麻醉后，常规消毒，于剑突下沿腹白线开腹，将吸有肿瘤细胞悬液的显微注射器针头沿肝门部胆管与门静脉间组织间隙刺入紧贴胆管分叉处，注射肿瘤细胞悬液100μl，压迫止血。MRI显示肿瘤体积在100mm3后，超声引导下将该复合凝胶剂水化后穿刺注射入切除部位，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合。对照组为游离药静脉给药组(PTX：15mg/kg，每周2次，治疗5周)和0.9％NaCl组。定期MRI观察。0.9％NaCl组复发率83.3％，且有肿瘤复发的裸鼠腹腔内均有种植病灶；游离PTX治疗组复发率为66.7％。相比，凝胶局部给药组均未发现肿瘤复发及转移(P均<0.05)。
实施例5
包载紫杉醇(PTX)的mPEG-PLGA温敏复合凝胶剂的制备和应用
采用乳化蒸发法制备：取10mg mPEG-PLGA溶于500μL二氯甲烷，加入0.5mgPTX，超声乳化后，再加入5mL 1％(w/v)的泊洛沙姆F68水溶液中，再次超声。然后室温下搅拌3h除去有机相，即得纳米粒混悬液。上述制得的纳米粒平均粒径为132.9nm(图1A)，流变学性质见图2A，释放曲线见3A。
将F-127加入以上纳米粒水分散体中，使其浓度为18％(w/w)，即得复合凝胶剂。
建立胆管癌裸鼠原位模型，参考实施例1。手术切除肿瘤，将该复合凝胶剂加入切除部位，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合伤口。对照组为游离药静脉给药组(PTX：15mg/kg，每周2次，治疗5周)和0.9％NaCl组。定期MRI观察。0.9％NaCl组复发率83.3％，且有肿瘤复发的裸鼠腹腔内均有种植病灶；游离PTX治疗组复发率为66.7％。相比，凝胶局部给药组均未发现肿瘤复发及转移(P均<0.05)。
实施例6
包载PTX的温敏混悬凝胶剂的制备和应用
采用乳化蒸发法制备：取5mg PTX溶于400μL二氯甲烷，加入5mL 0.5％(w/v)的泊洛沙姆F68水溶液中，超声乳化。室温下搅拌3h除去有机相，即得PTX混悬液。
在以上溶液中加入23％(w/w)F-127、0.5％(w/v)HPMC-k4M使其成为凝胶剂，冻干，即得混悬凝胶干剂。上述制得的纳米粒平均粒径为146.5nm(图1B)，流变学性质见图2B，释放曲线见3B。
建立胆管癌裸鼠原位模型，参考实施例3。将该凝胶剂用生理盐水水化后注入到肿瘤部位，待其凝固后，撤针。对照组为游离药静脉给药组(PTX：15mg/kg，每周2次，治疗5周)和0.9％NaCl组。定期测量。3个月后，与0.9％NaCl组(肿瘤体积>1000mm3)和游离PTX全身给药组(>300mm3)相比，凝胶局部给药组肿瘤体积明显更小(体积<200mm3，P均<0.05)(图4)；0.9％NaCl组和游离PTX组荷瘤鼠死亡率分别为50％和33.3％，凝胶局部给药组无鼠死亡(P均<0.05)。
实施例7
包载表阿霉素(EPB)的温敏凝胶剂的制备和应用
取100mg EPB溶于水中，加入F-127使F-127的浓度为24％(w/w)，即得EPB凝胶剂。
建立胆管癌裸鼠原位癌模型，将培养的胆管癌QBC939细胞用不含血清的DMEM培养基配成浓度为1×107个/ml的细胞悬液备用。裸鼠经1％(w/v)戊巴比妥钠腹腔注射(350mg/kg)麻醉后，常规消毒，于剑突下沿腹白线开腹，将吸有肿瘤细胞悬液的显微注射器针头沿肝门部胆管与门静脉间组织间隙刺入紧贴胆管分叉处，注射肿瘤细胞悬液100μl，压迫止血。MRI显示肿瘤体积在100mm3后开始治疗。在超声导向下，将该复合凝胶剂注射入肿瘤部位，待其凝固后，撤针。对照组为游离药腹腔给药组(EPB：2mg/kg，每周2次，治疗4周)和0.9％NaCl组。3个月后，与0.9％NaCl组(肿瘤体积>1000mm3)和游离EPB全身给药组(>500mm3)相比，凝胶局部给药组肿瘤体积明显更小(体积<300mm3，P均<0.05)。
实施例8
包载盐酸米托蒽醌(MIT)的温敏凝胶剂的制备和应用
取250mg MIT溶于5ml纯化水中，加入25％(w/w)F-127和0.5％(w/v)SA溶解，冻干，得干凝胶剂。
建立胆管癌裸鼠原位模型，参考实例1。手术切除，将该凝胶剂水化后注射入瘤周部位，待其凝固后，生物胶封闭，缝合伤口。对照组为游离药腹腔给药组(MIT：2mg/kg，每周2次，治疗4周)和0.9％NaCl组。定期MRI观察。3个月后，0.9％NaCl组复发率66.7％，且有肿瘤复发的裸鼠腹腔内均有种植病灶；游离MIT治疗组复发率为50％。相比，凝胶局部给药组均未发现肿瘤复发及转移(P均<0.05)。
实施例9
包载米铂的温敏凝胶剂的制备和应用
取200mg米铂溶于2ml无水乙醇中，搅拌下加0.5％F-68溶液10ml，减压除有机溶剂，得混悬液。加入20％(w/w)F-127、0.5％(w/v)SA、0.5％(w/v)HPMC-K4M溶解，得凝胶剂。
建立胆管癌裸鼠原位模型，参考实例1。手术切除，将该凝胶剂注射入瘤周部位，待其凝固后，生物胶封闭，缝合伤口。对照组为游离药腹腔给药组(米铂：20mg/kg，每周2次，治疗5周)和0.9％NaCl组。定期MRI观察。3个月后，0.9％NaCl组复发率83.3％，且有肿瘤复发的裸鼠腹腔内均有种植病灶；游离米铂治疗组复发率为50％。相比，凝胶局部给药组均未发现肿瘤复发及转移(P均<0.05)。
建立肝癌裸鼠原位模型，参考实施例1。超声引导下将该凝胶剂注射入肿瘤部位，待其凝固后，撤针。对照组为游离药腹腔给药组(米铂：20mg/kg，每周2次，治疗5周)和0.9％NaCl组。定期MRI观察。2个月后，与0.9％NaCl组(肿瘤体积>800mm3)和游离米铂全身给药组(>300mm3)相比，凝胶局部给药组肿瘤体积明显更小(体积<200mm3，P均<0.05)；0.9％NaCl组和游离5-Fu组荷瘤鼠死亡率分别为33.3％和33.3％，凝胶局部给药组无鼠死亡(P均<0.05)。
实施例10
包载羟基喜树碱(HDC)的温敏凝胶剂的制备和应用
取20mg HDC溶于2ml纯化水中，加入20％(w/w)F-127、0.5％(w/v)MC溶解，流变学性质见图2D。冻干，得干凝胶剂。
建立胆管癌裸鼠原位模型，参考实施例1。手术切除，将该凝胶剂注射入瘤周部位，待其凝固后，生物胶封闭，缝合伤口。对照组为游离药腹腔给药组(HDC：10mg/kg，每周2次，治疗4周)和0.9％NaCl组。定期MRI观察。3个月后，0.9％NaCl组复发率83.3％，且有肿瘤复发的裸鼠腹腔内均有种植病灶；游离HDC治疗组复发率为66.7％。相比，凝胶局部给药组均未发现肿瘤复发及转移(P均<0.05)。
实施例11
包载米铂的PLA温敏复合凝胶剂的制备和应用
用乳化蒸发法制备：取10mg PLA溶于400μL乙酸乙酯中，加入5mg米铂溶解，加入5ml 0.5％(w/v)F-68溶液，超声乳化，室温搅拌3h除有机溶剂，得纳米粒混悬液。上述制得的纳米粒平均粒径为125.4nm(图1E)，释放曲线(图3E)。
在纳米粒混悬溶液中加入17％(w/w)F-127、1％(w/v)MC、0.5％(w/v)HPMC-K100溶解，得温敏复合凝胶剂。
建立胆管癌裸鼠皮下瘤模型，参考实施例3。将该凝胶剂注射入肿瘤部位，待其凝固后，撤针。对照组为游离药腹腔给药组(米铂：15mg/kg，每周2次，治疗4周)和0.9％NaCl组。定期测量观察。3个月后，与0.9％NaCl组(肿瘤体积>1000mm3)和游离米铂全身给药组(>400mm3)相比，凝胶局部给药组肿瘤体积明显更小(体积<200mm3，P均<0.05)；0.9％NaCl组和游离PTX组荷瘤鼠死亡率分别为50％和33.3％，凝胶局部给药组无鼠死亡(P均<0.05)。
实施例12
包载米铂的PLGA温敏复合凝胶剂的制备和应用
用溶剂-非溶剂法制备：取10mg PLA溶于400μL丙酮中，加入5mg米铂溶解，搅拌下加入5ml 0.5％(w/v)F-68溶液，室温搅拌3h除有机溶剂，得纳米粒混悬液。上述制得的纳米粒平均粒径为110.3nm(图1F)，释放曲线见3F。
在纳米粒混悬溶液中加入15％(w/w)F-127、1％(w/v)HPMC-E5、1％(w/v)HPMC-K100M溶解，得温敏复合凝胶剂。
建立胆囊癌裸鼠皮下瘤模型，参考实施例3。将该凝胶剂注射入肿瘤部位，待其凝固后，撤针。对照组为游离药腹腔给药组(米铂：15mg/kg，每周2次，治疗4周)和非干预组。定期测量观察。3个月后，与0.9％NaCl组(肿瘤体积>1000mm3)和游离米铂全身给药组(>400mm3)相比，凝胶局部给药组肿瘤体积明显更小(体积<200mm3，P均<0.05)；0.9％NaCl组和游离PTX组荷瘤鼠死亡率分别为50％和33.3％，凝胶局部给药组无鼠死亡(P均<0.05)。
实施例13
包载长春瑞滨(NVB)的温敏凝胶剂的制备和应用
取20mg NVB溶于2ml纯化水中，加入23％(w/w)F-127、2％(w/v)壳聚糖溶解，冻干，得干凝胶剂。
建立胆管癌裸鼠皮下瘤模型，参考实施例3。将该凝胶剂水化后注射入瘤周部位，待其凝固后，撤针。对照组为游离药腹腔给药组(NVB：9mg/kg，每周2次，治疗4周)和0.9％NaCl组。定期测量观察。3个月后，与0.9％NaCl组(肿瘤体积>1000mm3)和游离NVB全身给药组(>600mm3)相比，凝胶局部给药组肿瘤体积明显更小(体积<300mm3，P均<0.05)；0.9％NaCl组和游离NVB组荷瘤鼠死亡率分别为50％和50％，凝胶局部给药组无鼠死亡(P均<0.05)。
实施例14
包载ABCG2-siRNA的mPEG-PLGA联合EPB温敏复合凝胶剂的制备和应用
用复乳法制备纳米粒：取10mg mPEG-PLGA溶于1mL二氯甲烷中溶解，加入5nmol RNA溶液100μl，超声乳化，加入5ml 1％(w/v)F-68溶液，再次超声，室温搅拌3h除有机溶剂，得纳米粒混悬液。
在纳米粒混悬溶液中加入2％(w/v)EPB、25％(w/w)F-127、1％(w/v)HPMC-K100M溶解，得温敏复合凝胶剂。
建立胆囊癌裸鼠皮下瘤模型，参考实施例3。将该凝胶剂注射入肿瘤部位，待其凝固后，撤针。对照组为游离药腹腔给药组(EPB：2mg/kg，每周2次，治疗4周)和0.9％NaCl组。6个月后，与0.9％NaCl组(肿瘤体积>1000mm3)和游离EPB全身给药组(>600mm3)相比，凝胶局部给药组肿瘤体积明显更小(体积<100mm3，P均<0.05)；0.9％NaCl组和游离EPB组荷瘤鼠死亡率分别为50％和50％，凝胶局部给药组无鼠死亡(P均<0.05)。
实施例15
共载干扰Gab1的siRNA的mPEG-PLGA联合米铂温敏复合凝胶剂的制备和应用
用复乳法制备纳米粒：取10mg mPEG-PLGA、米铂100mg溶于1mL乙酸乙酯中溶解，加入10nmol RNA溶液100μl，超声乳化得初乳；将初乳加入1％F-68溶液中再次超声，室温搅拌3h除有机溶剂，得共载纳米粒。
加入27％(w/w)F-127、0.7％(w/v)HPMC-K100M溶解，得温敏复合凝胶剂。
建立胆管癌裸鼠原位模型，参考实施例1。手术切除，将该凝胶剂注射入切除部位，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合。对照组为游离药腹腔给药组(米铂：20mg/kg，每周2次，治疗4周)和0.9％NaCl组。定期MRI观察。3个月后，0.9％NaCl组复发率83.3％，且有肿瘤复发的裸鼠腹腔内均有种植病灶；游离米铂治疗组复发率为66.7％。相比，凝胶局部给药组均未发现肿瘤复发及转移(P均<0.05)。
实施例16
共载miRNA-21、PTX的mPEG-PLGA温敏复合凝胶剂的制备和应用
用复乳法制备纳米粒：取10mg mPEG-PLGA溶于1mL乙酸乙酯中溶解，加入PTX 10mg溶解，加入10nmol RNA溶液100μl，超声乳化得初乳，加入1％(w/v)F-68溶液中再次超声，室温搅拌3h除去有机溶剂，得纳米粒混悬液。
在纳米粒混悬溶液中加入15％(w/w)F-127、1％(w/v)HPMC-K4M，0.5％(w/v)SA，0.5％(w/v)MC，0.5％(w/v)PVP K90溶解，得温敏复合凝胶剂。
建立胆管癌裸鼠原位模型，参考实施例1。手术切除，将该凝胶剂注射入切除部位，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合。对照组为游离药腹腔给药组(PTX：15mg/kg，每周2次，治疗4周)和非干预组。2个月后，0.9％NaCl组复发率66.7％，且有肿瘤复发的裸鼠腹腔内均有种植病灶；游离PTX治疗组复发率为50％。相比，温敏凝胶局部给药组均未发现肿瘤复发及转移(P均<0.05)。
实施例17
包载抗VEGF抗体的温敏凝胶剂的制备和应用
取50mg抗VEGF抗体溶于5ml生理盐水中，加入22％(w/w)F-127得温敏凝胶剂。
建立胆囊癌裸鼠原位模型，参考实施例1，裸鼠随机分为3组，手术切除肿瘤后给药。凝胶局部给药组：将该凝胶剂加入切除部位，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合伤口。对照组为静脉全身给药组(抗VEGF抗体：尾静脉给药5mg/kg，每周2次，治疗5周)和0.9％NaCl组。6个月后，0.9％NaCl组复发率83.3％，且有肿瘤复发的裸鼠腹腔内均有种植病灶；游离抗VEGF抗体治疗组复发率为33.3％。相比，温敏凝胶局部给药组均未发现肿瘤复发及转移(P均<0.05)。
实施例18
包载抗PD-1抗体的温敏凝胶剂的制备和应用
取100mg抗PD-1抗体溶于5ml生理盐水中，加入22％(w/w)F-127得温敏凝胶剂。
建立胆囊癌裸鼠原位模型，参考实施例1，裸鼠随机分为3组，手术切除肿瘤后给药。凝胶局部给药组：将该凝胶剂加入切除部位，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合伤口。对照组为静脉全身给药组(抗PD-1抗体：尾静脉给药10mg/kg，每周2次，治疗5周)和0.9％NaCl组。定期MRI观察。6个月后，0.9％NaCl组复发率83.3％，且有肿瘤复发的裸鼠腹腔内均有种植病灶；游离抗PD-1抗体治疗组复发率为50％。相比，温敏凝胶局部给药组均未发现肿瘤复发及转移(P均<0.05)。
实施例19
包载抗PD-L1抗体的温敏凝胶剂的制备和应用
取100mg抗PD-L1抗体溶于5ml生理盐水中，加入22％(w/w)F-127得温敏凝胶剂。
建立胆囊癌裸鼠原位模型，参考实施例1，裸鼠随机分为3组，手术切除肿瘤后给药。凝胶局部给药组：将该凝胶剂加入切除部位，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合伤口。对照组为静脉全身给药组(抗PD-1抗体：尾静脉给药10mg/kg，每周2次，治疗5周)和0.9％NaCl组。6个月后，0.9％NaCl组复发率83.3％，且有肿瘤复发的裸鼠腹腔内均有种植病灶；游离抗PD-L1治疗组复发率为33.3％。相比，温敏
凝胶局部给药组均未发现肿瘤复发及转移(P均<0.05)。实施例20包载洛铂的温敏凝胶剂的制备和应用
取250mg洛铂溶于5ml纯化水中，加入25％(w/w)F-127和0.5％(w/v)SA溶解，冻干，得干凝胶剂。
建立胆管癌裸鼠原位模型，参考实例1。手术切除，将该凝胶剂水化后注射入瘤周部位，待其凝固后，生物胶封闭，缝合伤口。对照组为游离药腹腔给药组(洛铂：2mg/kg，每周2次，治疗4周)和0.9％NaCl组。定期MRI观察。3个月后，0.9％NaCl组复发率71.6％，且有肿瘤复发的裸鼠腹腔内均有种植病灶；游离洛铂治疗组复发率为42.5％。相比，凝胶局部给药组均未发现肿瘤复发及转移(P均<0.05)。

Claims (9)

1.一种治疗胆系肿瘤的药物纳米复合温敏凝胶剂，其特征在于是下述二种物质：
(1)由聚合物或者靶向基团修饰的聚合物包裹抗肿瘤活性物质制成纳米粒，再加入温敏高分子材料，制成的治疗胆系肿瘤的纳米复合温敏凝胶剂；其中，高分子聚合物的重量百分含量为0.001-5％，抗肿瘤活性物质的重量体积百分含量为0.001-2g/100ml凝胶剂，温敏高分子材料重量体积百分含量为0.001-35g/100ml；其余为水；
(2)或直接将抗肿瘤活性物质制成纳米粒溶于或混悬于温敏凝胶剂中，制成的治疗胆系肿瘤的纳米复合温敏凝胶剂；当所述抗肿瘤活性物质为水溶性时，溶于温敏凝胶剂中；当所述抗肿瘤活性物质为水不溶性时，制成混悬液与温敏凝胶剂混合；该纳米复合温敏凝胶剂中温敏高分子材料的重量体积百分含量为0.001-35g/100ml；所述的抗肿瘤活性物质的纳米粒在复合凝胶中的重量体积百分含量为0.001-2g/100ml凝胶剂；其余为水；
上述的纳米复合温敏凝胶剂的粒径范围为5nm-1000nm；
所述的聚合物为聚-(乳酸-羟基乙酸)共聚物PLGA、聚乙二醇单甲醚-聚-(乳酸-羟基乙酸)共聚物mPEG-PLGA、聚乳酸PLA、聚乙二醇单甲醚-聚乳酸mPEG-PLA、聚乙二醇单甲醚-聚-(乳酸-羟基乙酸)-聚赖氨酸mPEG-PLGA-PLL中的一种或几种；
所述的抗肿瘤活性物质为抗肿瘤药物、抗肿瘤基因、抗肿瘤化疗药物或分子靶向药物；
所述的抗肿瘤基因为siRNA、microRNA、piRNA、IncRNA、circRNA；例如：下调NF-κB p65基因表达的siRNA、干扰Gab1的siRNA、沉默蛋白激酶Cε基因的siRNA、miRNA-21、miRNA-605、miRNA-376c、miRNA-200b/c、miR-NA-101；
所述的抗肿瘤药物为：奥沙利铂、顺铂、卡铂、米铂、洛铂、紫杉醇、米托蒽醌、阿霉素、表阿霉素、羟基喜树碱、依托泊苷、长春瑞宾或甲氨蝶呤；
所述的分子靶向药物为抗血管内皮生长因子抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体；
所述温敏高分子材料为普朗尼克F-127、F-68、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、海藻酸钠、壳聚糖、PVA、PVP或它们的混合物。
2.根据权利要求1所述的治疗胆系肿瘤的药物纳米复合温敏凝胶剂，其特征在于所述的mPEG-PLGA或mPEG-PLA中，mPEG的分子量为400-10.0×106，PLGA或PLA的分子量为2000-10.0×106，乳酸与羟基乙酸摩尔比为1-100:100-1，PLL分子量为400-10.0×105。
3.根据权利要求1所述的治疗胆系肿瘤的药物纳米复合温敏凝胶剂，其特征在于：所述的聚合物为聚乙二醇单甲醚-聚-(乳酸-羟基乙酸)共聚物mPEG-PLGA；所述抗肿瘤基因为siRNA和microRNA；所述抗肿瘤活性物质为、表阿霉素、顺铂、米铂、洛铂、依托泊苷；所述的抗肿瘤分子靶向药物为抗血管内皮生长因子抗体、抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体；
所述温敏高分子材料为为泊洛沙姆F-127、羟丙基甲基纤维素或甲基纤维素。
4.根据权利要求3所述的治疗胆系肿瘤的药物纳米复合温敏凝胶剂，其特征在于纳米复合温敏凝胶剂中温敏高分子材料与凝胶剂的重量和体积比分别为F-127的重量为10-35g/100ml凝胶剂、F-68的含量为0.001-5％/100ml凝胶剂、羟丙基甲基纤维素的含量为0.001-1g/100ml凝胶剂、甲基纤维素的含量为0-2g/100ml凝胶剂、海藻酸钠的含量为0-1g/100ml凝胶剂、壳聚糖的含量为0-5g/100ml凝胶剂、PVA的含量为0-2g/100ml凝胶剂或者PVP的含量为0-1g/100ml凝胶剂。
5.根据权利要求1所述的治疗胆系肿瘤的药物纳米复合温敏凝胶剂，其特征在于所述的抗肿瘤活性物质在复合凝胶中的重量和体积比为0.001-10g抗肿瘤活性物质/100ml凝胶剂。
6.一种如权利要求1所述的治疗胆系肿瘤的药物纳米复合温敏凝的制备方法，其特征在于采用如下方法获得：
(1)采用复乳法、薄膜乳化法、透析法、乳化蒸发法、界面沉淀法或自组装法制得由聚合物作为载体材料包裹抗肿瘤活性物质的纳米粒溶液；纳米粒溶液中的高分子聚合物的重量百分含量为为0.001-5％，抗肿瘤活性物质的重量体积百分含量为0.001-2g/100ml凝胶剂；
或将水溶性抗肿瘤活性物质溶解于生理盐水中得抗肿瘤活性物质溶液；
或用超微粉碎、薄膜乳化法、透析法、乳化蒸发法或界面沉淀法将水不溶性抗肿瘤活性物质分散为混悬液；
(2)将温敏凝胶剂加入(1)制备的溶液中，溶解；
或者，将温敏凝胶剂加入生理盐水中溶解成溶液，再与(1)制备的纳米粒溶液混合；
或者，将(1)制备的纳米粒溶液经冻成干粉与温敏高分子材料混合，加入生理盐水分散溶解；所述的聚合物、温敏凝胶剂、抗肿瘤活性物质的定义如权利要求1所述。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：分别采用如下方法获得：
所述的复乳法制备是取4mg聚合物溶于200μL二氯甲烷或二氯甲烷，和丙酮的混合溶剂中，加入0.2mg抗肿瘤活性物质，超声乳化，再加入2.2mL浓度为1％w/v的普朗尼克的F68水分散介质中，再次超声乳化，然后室温下搅拌0.5-5h除去有机相，即得纳米粒溶液；
所述的薄膜乳化法是取4mg聚合物和0.2mg抗肿瘤活性物质溶于400μL丙酮溶剂中，旋转蒸发成膜，随后加入4mL的水溶液，室温下搅拌0.5-6h，即得纳米粒溶液；
所述的透析法是取4mg聚合物溶于200μL二甲亚砜溶剂中，加入0.4mg抗肿瘤活性物质，将搅拌均匀的溶液在搅拌的条件下滴入2mL水中，之后将溶液装入透析袋中，截留分子量为7000，透析3-72小时，除去有机溶剂，即得纳米粒溶液；
或取5mg抗肿瘤活性物质药物溶于200μL二甲亚砜溶剂中，将溶液装入透析袋中，截留分子量为7000，透析3-72小时，除去有机溶剂，即得混悬液；
所述的乳化蒸发法是取4mg聚合物和0.2mg抗肿瘤活性物质溶于400μL丙酮/二氯甲烷的混合溶剂中，加入2.2mL浓度为2％(w/v)的含聚乙烯醇PVA的水分散介质中，超声或高压乳匀乳化，乳液在室温下搅拌2-4h，除有机溶剂，即得纳米粒溶液；
或取5mg抗肿瘤活性物质药物溶于400μL二氯甲烷中，加入2mL浓度为0.5％(w/v)的泊洛沙姆188溶液，超声或高压乳匀乳化，乳液在室温下搅拌2-4h，除有机溶剂，即得混悬液；
所述的界面沉淀法是取4mg高分子聚合物和0.2mg抗肿瘤活性物质溶于400μL丙酮溶剂中，在搅拌下，将上述溶液注入2.2mL的浓度为2％(w/v)的PVA水分散介质中，减压去除丙酮，即得纳米粒溶液；
或取5mg抗肿瘤活性物质药物溶于400μL丙酮中，在搅拌下，将上述溶液 注入2mL的浓度为0.5％w/v的泊洛沙姆188溶液，减压去除丙酮，即得纳米粒溶液；
所述的自组装法是取4mg高分子聚合物溶于200μL水溶液中，加入0.4mg抗肿瘤活性物质，搅拌均匀，在搅拌下滴入2mL水中，之后将溶液装入透析袋中，截留分子量为7000，透析3-72小时，除去有机溶剂；即得纳米粒溶液。
8.一种如权利要求1、2、3、4或5所述的治疗胆系肿瘤的药物纳米复合温敏凝胶剂的应用，其特征在于制备治疗胆系肿瘤的药物或抑制胆系肿瘤复发和转移的药物。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的胆系肿瘤是胆囊癌、肝内胆管癌和肝外胆管癌。
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