CN104083321A - 一种纳米复合温敏凝胶剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种纳米复合温敏凝胶剂及其应用。将抗肿瘤活性物质包裹制备纳米粒，再加入温敏高分子材料，制成纳米复合温敏凝胶剂。所述的聚合物为mPEG-PLGA、mPEG-PLGA-PLL或者上述共聚物再连接肿瘤靶向基团人表皮生长因子EGF，抗肿瘤活性物质为替莫唑胺、紫杉醇或它们的混合物，本发明制备方法简便，适于大规模生产，特别适应于制备可生物降解、缓控释、主动靶向、运送活性物质、抗肿瘤的药物，尤其适合制备抑制脑部肿瘤术后复发的药物。

Description

一种纳米复合温敏凝胶剂及其应用

技术领域

本发明属于靶向递送药物载体和应用领域，特别涉及一种纳米复合温敏凝胶剂及其在脑部肿瘤术后复发的应用。

背景技术

实体肿瘤一般都可实现手术切除，但切除后的复发现象很严重。在临床上术后普遍使用化疗、放疗等方式可有效抑制肿瘤复发，但存在着一些严重的问题。一个主要的问题是化疗药物普遍缺乏选择性，导致严重的剂量依赖性毒副作用的产生，极大地限制了化疗药物的临床治疗效果。使用介入的方式可缩小药物的影响范围，提高药效。但由于药物在体内的代谢和排泄，病灶部位的有效浓度维持时间短，药物也不可避免的分布到正常组织中发生毒副反应。多次介入给药也存在病人顺应性差的问题。此外，化疗药物的多次使用也常导致肿瘤耐药性的产生。

因此，抑制肿瘤复发的药物制剂应具有：1)在肿瘤部位具有较高分布，2)克服肿瘤耐药性，3)可控释放的性质。

近几十年来，纳米递送载体由于其独特的优势，能有效的提高治疗效果，而备受国内外关注。与普通化疗制剂相比，可以在一定程度上提高药物在靶器官的分布，降低药物的毒副作用，延迟药物在体内的代谢，改善治疗效果。许多像聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸等生物降解材料已经广泛的被用做药物、基因和成像试剂的递送载体，取得了一定的效果。

给药系统的靶向能力是将活性物质准确递送至靶点的关键，人表皮生长因子(EGF)是一种有效的靶向分子，众多实验已经证实其对肿瘤新生血管具有很好的靶向效果。将纳米粒采用靶向基团修饰后，靶向基团可以与靶点特异性结合，具有受体介导的靶向给药系统形成的主动靶向效应，使抗肿瘤药物比较准确送到肿瘤细胞中，实现恶性肿瘤的靶向治疗。

本课题组运用聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸共聚物mPEG-PLGA(Hyun H,Yang JC,Kim MS,Lee HB,Khang G.Synthesis of methoxy poly(ethyleneglycol)/polyesters diblock copolymers and evaluation of micellar characterization asdrug carrier.POLYMER-KOREA,2006,30(6):464-470)，以及自主设计合成的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸(mPEG-PLGA-PLL)，以及它们连接EGF靶向基团的聚合物mPEG-PLGA-EGF、mPEG-PLGA-PLL-EGF(段友容，孙颖，刘培峰，于晖，亓雪莲，王琪，陈晓炎，李晓昱。聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米递送系统、制备方法及应用。授权公告号：CN 101732723B)，制备包裹抗肿瘤药物的纳米粒，具有较好的抗肿瘤效果。

由于纳米粒通过胞吞或胞饮形式被细胞摄取，因此能够避免细胞膜上外排蛋白对小分子药物的外排作用，能够在一定程度上克服肿瘤细胞耐药性。

对于静脉给药的靶向药物制剂来说，药物的全身分布和毒副作用仍然不可完全避免。将靶向药物制剂与介入治疗相结合，将大大提高药物在病灶部位的分布，并减轻全身毒副作用。

温敏高分子材料是一类随外界温度变化，其水溶液可发生溶液-凝胶转变的材料。在药剂学中利用这个性质可在体内形成原位凝胶以达到在给药部位的缓释效果，或在体外固化增加制剂稳定性等。泊洛沙姆是一类生物相容性好，并广泛应用的温敏材料，FDA已批准用于人血管内给药。在温度升高时，其水溶液可转变成水凝胶，在体内通过降解和溶蚀来控制药物释放的速度，起到缓释贮库的作用。聚丙烯酰胺类及其与丙烯酸酯类的共聚物也是研究较为广泛的温敏聚合物，在温度升高时，其水溶液形成网状凝胶结构，通过温度变化和骨架内的渗透控制药物的释放速度。羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、海藻酸钠等也具有类似的反向温敏性。

当肿瘤复发时，若不能施行手术，则需迅速控制其发展，这就需要抗肿瘤药物的迅速释放达到较高的局部浓度。原位凝胶和聚合物纳米粒对药物的缓释都是通过聚合物的缓慢降解、溶解以及药物在基质中的低速Fick扩散的形式。低频超声能通过组织吸收及反射形成热能，具有温热效应；超声振荡使组织不断收缩与伸张，具有机械效应。一方面，超声波能增加纳米粒中聚合物基质的降解性和渗透性，从而加快药物释放。另一方面，超声波能使凝胶中的冻结水含量增加以及胶凝温度升高，冷冻水构成的水通道增多导致药物Fick扩散速度加快，胶凝温度升高意味着凝胶更容易溶蚀而释药。也就是说，纳米粒和凝胶中药物的释放以通过超声波处理来加速。

将纳米技术、介入手段、温敏技术和低频超声技术联合，恰好能够满足1)在肿瘤部位具有较高分布，2)克服肿瘤耐药性，3)可控释放三个要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种纳米复合温敏凝胶剂及其用途，可以用于抗肿瘤药物的制备。该纳米复合温敏凝胶剂适合于肌肉注射、皮下注射、皮内注射、瘤内注射、瘤旁注射等方式；尤其适合用于抑制脑部肿瘤术后复发；制备方法简便，适于大规模生产。

本发明的纳米复合温敏凝胶剂是采用聚合物包裹抗肿瘤活性物质制成纳米粒，再加入温敏高分子材料，制成纳米复合温敏凝胶剂。所述的纳米粒的平均粒径在10-1000nm，优选30-900nm。所述的聚合物为聚乙二醇单甲醚-聚-(乳酸-羟基乙酸)共聚物mPEG-PLGA、聚乙二醇单甲醚-聚-(乳酸-羟基乙酸)共聚物连接聚赖氨酸后的共聚物料mPEG-PLGA-PLL或者上述共聚物再连接肿瘤靶向基团；肿瘤靶向基团与聚乙二醇单甲醚-聚-(乳酸-羟基乙酸)共聚物mPEG-PLGA或肿瘤靶向基团与聚乙二醇单甲醚-聚-(乳酸-羟基乙酸)共聚物连接聚赖氨酸后的共聚物料mPEG-PLGA-PLL的摩尔比为0～1：1。

所述的抗肿瘤活性物质为替莫唑胺、紫杉醇或它们的为混合物；所述的纳米粒中抗肿瘤活性物质的重量百分含量为0.001-5％；

所述的纳米粒在复合凝胶中的重量和体积比的含量为0.001-2g/100ml凝胶剂。

如由高分子聚合物mPEG-PLGA或其连接EGF的靶向材料作为载体，包裹抗肿瘤活性物质替莫唑胺，制成纳米粒，再加入温敏高分子材料，制成纳米复合温敏凝胶剂。

本发明的纳米复合温敏凝胶剂中，所述的mPEG-PLGA和mPEG-PLGA-PLL中，mPEG的分子量为1000-10000，PLGA的分子量为5000-50000，PLL的分子量为1000-10000。

所述靶向基团为人表皮生长因子EGF。

所述的抗肿瘤活性物质中替莫唑胺和紫杉醇的重量比为0:1～1:0，优选为4:1-150:1。

所述的抗肿瘤活性物质中替莫唑胺和紫杉醇的重量比为4:1～150:1。

所述温敏高分子材料为泊洛沙姆、聚N-异丙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺与甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的共聚物中的一种或几种；所述温敏高分子材料为普朗尼克F-127、F-68和羟丙基甲基纤维素的组合物(权利要求书中描述)；其中F-127的含量为15-20g/100ml凝胶剂，F-68的含量为0.001-1g/100ml凝胶剂，羟丙基甲基纤维素的含量为0.001-1g/100ml凝胶剂。

本发明是一种以高分子聚合物为骨架，以温敏高分子为基质的纳米给药载体系统。通过控制骨架聚合物各嵌段的分子量和组成，可使载体具有较好的生物相容性、较高的载药量和可控的释药速度。调节靶向基团的接枝率可以达到较强的肿瘤靶向功能。调节温敏高分子的种类和组成可以调节凝胶剂的温敏性质。该凝胶剂在室温下是液体，可通过注射用于机体内，通过温敏作用，在体温下形成凝胶贮库，定位的缓慢释放靶向纳米粒，或在低频超声下速释，于肿瘤细胞。该纳米载体系统具有运送活性物质、肿瘤治疗、逆转或降低耐药等功能。其主要应用于(1)制备抗肿瘤药物靶向制剂；(2)制备逆转或降低肿瘤耐药制剂，从而抑制肿瘤复发。

有益效果

本发明制备方法简便，适于大规模生产，特别适应于制备具有可生物降解、缓控释、主动靶向、运送活性物质、抗肿瘤的药物。采用本发明的方法获得的抗肿瘤的药物适合于静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、瘤内注射、瘤旁注射或经皮给药等方式，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为TMZ-mPEG-PLGA纳米粒(A)、PTX-mPEG-PLGA纳米粒(B)、TMZ-mPEG-PLGA-EGF纳米粒(C)、PTX-mPEG-PLGA-EGF纳米粒(D)、TMZ-PTX-mPEG-PLGA纳米粒(E)、TMZ-PTX-mPEG-PLGA-EGF(F)粒径分布图。

图中，TMZ表示替莫唑胺，PTX表示紫杉醇，EGF表示人表皮生长因子。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

包载替莫唑胺(TMZ)的mPEG-PLGA温敏复合凝胶剂的制备和应用

采用复乳法制备：取8mg mPEG-PLGA溶于400μL二氯甲烷，加入40μL浓度为4mg/mL的TMZ溶液，超声乳化后，再加入5mL2％的泊洛沙姆F68水溶液中，再次超声。然后室温下搅拌3h除去有机相，即得纳米粒混悬液。上述制得的纳米粒粒径控制在10-1000nm(图1A)。

在以上纳米粒水分散体中加入F-127使F-127的浓度为15％，即得复合凝胶剂。

建立大鼠脑肿瘤原位癌模型，开颅手术，切除肿瘤，将该复合凝胶剂加入切除部位，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合伤口。定期MRI观察，6个月内未发现肿瘤复发及转移。

实施例2

包载紫杉醇(PTX)的mPEG-PLGA温敏复合凝胶剂的制备和应用

采用乳化蒸发法制备：取8mg mPEG-PLGA溶于400μL二氯甲烷，加入0.4mgPTX，超声乳化后，再加入5mL1％的泊洛沙姆F68水溶液中，再次超声。然后室温下搅拌3h除去有机相，即得纳米粒混悬液。上述制得的纳米粒粒径控制在10-1000nm(图1B)。

将F-127加入以上纳米粒水分散体中，使其浓度为18％，冻干，即得复合干凝胶剂。

建立大鼠脑肿瘤原位癌模型，开颅手术，切除肿瘤，将该复合凝胶剂水化后加入切除部位，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合伤口。定期MRI观察，6个月内未发现肿瘤复发及转移。建立脑肿瘤裸鼠原位模型，将该复合凝胶剂水化后加入切除部位，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合伤口。定期MRI观察，9个月内未发现肿瘤复发及转移。

实施例3

包载TMZ的mPEG-PLGA-EGF温敏复凝胶剂的制备和应用

采用复乳法制备：取10mg mPEG-PLGA-EGF溶于400μL二氯甲烷，加入20μL浓度为4mg/mL的TMZ溶液，超声乳化后，再加入5mL0.5％的泊洛沙姆F68水溶液中，再次超声。然后室温下搅拌3h除去有机相，即得纳米粒混悬液。上述制得的纳米粒粒径控制在10-1000nm(图1C)。其中EGF是人表皮生长因子。

在以上溶液中加入13％F-127、1％HPMC-100M使其成为凝胶剂，冻干，即得复合凝胶干剂。

将该复合凝胶剂用生理盐水水化后加入脑肿瘤裸鼠原位模型切除部位，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合伤口。定期MRI观察，9个月内未发现肿瘤复发及转移。

实施例4

包载PTX的mPEG-PLGA-EGF温敏复合凝胶剂的制备和应用

采用乳化蒸发法制备：取10mg mPEG-PLGA-EGF溶于400μL二氯甲烷，加入0.5mg PTX，超声乳化后，再加入5mL1％的泊洛沙姆F68水溶液中，再次超声。然后室温下搅拌3h除去有机相，即得纳米粒混悬液。上述制得的纳米粒粒径控制在10-1000nm(图1D)。

将F-127加入以上纳米粒水分散体中，使其浓度为18％，冻干，即得复合干凝胶剂。

建立大鼠脑肿瘤原位癌模型，开颅手术，切除肿瘤，将该复合凝胶剂水化后加入切除部位，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合伤口。定期MRI观察，6个月内未发现肿瘤复发及转移。

实施例5

包载PTX和TMZ的mPEG-PLGA纳米粒混合温敏凝胶剂的应用

将实施例1和2中的纳米粒以1:1、1:2、1:3、1:4的比例混合，加入17％F-127、0.5％HPMC-100M使成凝胶剂，加于大鼠脑肿瘤切除部位，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合伤口。定期MRI观察，6个月内未发现肿瘤复发及转移。

实施例6

包载PTX和TMZ的mPEG-PLGA-EGF纳米粒混合温敏凝胶剂的应用

将实施例3和4中的纳米粒以1:1、1:2、1:3、1:4的比例混合，加入20％F-127使成凝胶剂，加于大鼠脑肿瘤切除部位，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合伤口。定期MRI观察，6个月内未发现肿瘤复发及转移。

实施例7

TMZ和PTX共载的mPEG-PLGA复合温敏凝胶剂的制备和应用

采用复乳法制备：取8mg mPEG-PLGA溶于含PTX0.5mg/ml的700μL二氯甲烷中，加入80μL浓度为4mg/mL的替莫唑胺溶液，超声乳化后，再加入5mL1％的泊洛沙姆F68水溶液中，再次超声。然后室温下搅拌3h除去有机相，即得纳米粒混悬液。上述制得的纳米粒粒径控制在10-1000nm(图1E)。

加入18％F-127、0.5％HPMC-100M、0.3％PVP K90使成凝胶剂，冻干，即得复合干凝胶剂。

将该凝胶剂用生理盐水水化后加入小鼠脑肿瘤切除处，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合伤口。定期MRI观察，4个月内未发现肿瘤复发及转移。

实施例8

TMZ和PTX共载的mPEG-PLGA-EGF复合温敏凝胶剂的制备和应用

采用复乳法制备：取10mg mPEG-PLGA-EGF溶于含PTX0.5mg/ml的700μL二氯甲烷中，加入80μL浓度为4mg/mL的替莫唑胺溶液，超声乳化后，再加入5mL0.25％的泊洛沙姆F68水溶液中，再次超声。然后室温下搅拌3h除去有机相，即得纳米粒混悬液。上述制得的纳米粒粒径控制在10-1000nm(图1F)。

加入18％F-127、0.5％HPMC-100M、0.3％PVP K90使成凝胶剂，冻干，即得复合干凝胶剂。

将该凝胶剂用生理盐水水化后加入小鼠脑肿瘤切除处，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合伤口。定期MRI观察，4个月内未发现肿瘤复发及转移。

实施例9

包载替莫唑胺(TMZ)的mPEG-PLGA-PLL温敏复合凝胶剂的制备和应用

采用复乳法制备：取8mg mPEG-PLGA-PLL溶于300μL二氯甲烷，加入40μL浓度为4mg/mL的TMZ溶液，超声乳化后，再加入5mL0.1％的泊洛沙姆F68水溶液中，再次超声。然后室温下搅拌3h除去有机相，即得纳米粒混悬液。上述制得的纳米粒粒径控制在10-1000nm。

将纳米粒悬液冻干，加入F-127和生理盐水，使纳米粒浓度为2％，F-127浓度为18％，即得复合凝胶剂。

建立脑肿瘤裸鼠原位癌模型，开颅手术，切除肿瘤，将该复合凝胶剂加入切除部位，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合伤口。定期MRI观察，6个月内未发现肿瘤复发及转移。

实施例10包载紫杉醇(PTX)的mPEG-PLGA-PLL温敏复合凝胶剂的制备和应用

采用乳化蒸发法制备：取8mg mPEG-PLGA-PLL溶于500μL二氯甲烷，加入0.4mg PTX，超声乳化后，再加入5mL0.2％的泊洛沙姆F68水溶液中，再次超声。然后室温下搅拌3h除去有机相，即得纳米粒混悬液。上述制得的纳米粒粒径控制在10-1000nm。

将纳米粒混悬液冻干，加入F-127、HPMC和生理盐水，使纳米粒浓度为1.5％，F-127浓度为20％，HPMC浓度为0.1％。

建立大鼠脑肿瘤原位癌模型，开颅手术，切除肿瘤，将该复合凝胶剂加入切除部位，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合伤口。定期MRI观察，6个月内未发现肿瘤复发及转移。

建立脑肿瘤裸鼠原位模型，将该复合凝胶剂水化后加入切除部位，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合伤口。定期MRI观察，6个月内未发现肿瘤复发及转移。

实施例11

包载TMZ的mPEG-PLGA-PLL-EGF温敏复凝胶剂的制备和应用

采用复乳法制备：取10mg mPEG-PLGA-PLL-EGF溶于400μL二氯甲烷，加入20μL浓度为4mg/mL的TMZ溶液，超声乳化后，再加入5mL0.1％的泊洛沙姆F68水溶液中，再次超声。然后室温下搅拌3h除去有机相，即得纳米粒混悬液。上述制得的纳米粒粒径控制在10-1000nm。

在以上溶液中加入2.6％F-127、0.2％HPMC-100M使其成为凝胶剂，冻干，即得复合凝胶干剂。加1ml生理盐水复溶，即得含纳米粒1％、F-12713％、HPMC1％的复合凝胶剂。

将该干复合凝胶剂用生理盐水水化后加入脑肿瘤裸鼠原位模型切除部位，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合伤口。定期MRI观察，9个月内未发现肿瘤复发及转移。

实施例12

包载PTX的mPEG-PLGA-PLL-EGF温敏复合凝胶剂的制备和应用

采用乳化蒸发法制备：取10mg mPEG-PLGA-PLL-EGF溶于400μL二氯甲烷，加入0.5mg PTX，超声乳化后，再加入5mL0.1％的泊洛沙姆F68水溶液中，再次超声。然后室温下搅拌3h除去有机相，即得纳米粒混悬液。上述制得的纳米粒粒径控制在10-1000nm。

将纳米粒混悬液冻干，将F-127加入以上纳米粒水分散体中，使其浓度为9％，冻干，即得复合干凝胶剂。加2.5ml生理盐水复溶，得含纳米粒0.4％、F-12718％的复合凝胶剂。

建立大鼠脑肿瘤原位癌模型，开颅手术，切除肿瘤，将该复合凝胶剂水化后加入切除部位，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合伤口。定期MRI观察，6个月内未发现肿瘤复发及转移。

实施例13

TMZ和PTX共载的mPEG-PLGA-PLL-EGF复合温敏凝胶剂的制备和应用

采用复乳法制备：取10mg mPEG-PLGA-PLL-EGF溶于含PTX0.5mg/ml的600μL二氯甲烷中，加入80μL浓度为4mg/mL的替莫唑胺溶液，超声乳化后，再加入5mL0.1％的泊洛沙姆F68水溶液中，再次超声。然后室温下搅拌3h除去有机相，即得纳米粒混悬液。上述制得的纳米粒粒径控制在10-1000nm(图1F)。

加入4.5％F-127、0.1％HPMC-100M、0.06％PVP K90使成凝胶剂，冻干，即得复合干凝胶剂。加1ml生理盐水复溶，得含纳米粒1％、F-12718％、HPMC-100M0.5％、PVP K900.6％的复合凝胶剂。

将该干凝胶剂用生理盐水水化后加入小鼠脑肿瘤切除处，待其凝固后，用生物胶封闭，缝合伤口。定期MRI观察，4个月内未发现肿瘤复发及转移。

Claims (8)

1.一种纳米复合温敏凝胶剂，其特征在于：聚合物包裹抗肿瘤活性物质制成纳米粒，再加入温敏高分子材料，制成纳米复合温敏凝胶剂，所述的聚合物为聚乙二醇单甲醚-聚-(乳酸-羟基乙酸)共聚物mPEG-PLGA、聚乙二醇单甲醚-聚-(乳酸-羟基乙酸)共聚物连接聚赖氨酸后的共聚物mPEG-PLGA-PLL或者上述共聚物再连接肿瘤靶向基团；肿瘤靶向基团与聚乙二醇单甲醚-聚-(乳酸-羟基乙酸)共聚物mPEG-PLGA或聚乙二醇单甲醚-聚-(乳酸-羟基乙酸)共聚物连接聚赖氨酸后的共聚物料mPEG-PLGA-PLL的摩尔比为0～1：1；

所述的抗肿瘤活性物质为替莫唑胺、紫杉醇或它们的为混合物；所述的纳米粒中抗肿瘤活性物质的重量百分含量为0.001-5％；

所述的纳米粒在复合凝胶中的重量和体积比的含量为0.001-2g/100ml凝胶剂。

2.根据权利要求1所述的纳米复合温敏凝胶剂，其特征在于所述的mPEG-PLGA和mPEG-PLGA-PLL中，mPEG的分子量为1000-10000，PLGA的分子量为5000-50000，PLL的分子量为1000-10000。

3.根据权利要求1所述的纳米复合温敏凝胶剂，其特征在于所述靶向基团为人表皮生长因子EGF。

4.根据权利要求1所述的纳米复合温敏凝胶剂，其特征在于所述的抗肿瘤活性物质中替莫唑胺和紫杉醇的重量比为0:1～1:0，优选为4:1-150:1。

5.根据权利要求1所述的纳米复合温敏凝胶剂，其特征在于所述的抗肿瘤活性物质中替莫唑胺和紫杉醇的重量比为4:1～150:1。

6.根据权利要求1所述的一种纳米复合温敏凝胶剂，其特征在于：所述温敏高分子材料为普朗尼克F-127、F-68、羟丙基甲基纤维素或它们的混合物。

7.根据权利要求1所述的一种纳米复合温敏凝胶剂，其特征在于：纳米复合温敏凝胶剂中F-127的重量为15-20g/100ml凝胶剂、F-68的含量为0.001-1％g/100ml凝胶剂、羟丙基甲基纤维素的含量为0.001-1％g/100ml凝胶剂。

8.如权利要求1所述的纳米复合温敏凝胶剂用于制备抗肿瘤。