注射用整合素配体修饰的载药肿瘤靶向阳离子聚合物
技术领域
本发明属于肿瘤靶向与缓释给药系统技术领域。涉及载药肿瘤靶向阳离子聚合物,特别涉及一种供注射用的整合素配体修饰的载抗癌药物的肿瘤靶向性纳米粒给药系统。
背景技术
临床应用化疗药物治疗恶性肿瘤在许多情况下获得了一定的成功,但是,同时也存在着一些严重的问题。其中主要的问题只之一是化疗药物普遍缺乏选择性,导致严重的剂量依赖性毒副作用的产生,极大地限制了化疗药物的临床治疗效果。另一个问题是肿瘤细胞抗药性的快速出现。因此,对于能特异性靶向肿瘤细胞并造成正常细胞最小损伤的治疗方法的开发,具有非常重要的意义和广阔的应用前景。肿瘤区域的新生毛细血管是肿瘤赖以生长和生存的物质基础,以肿瘤血管为靶标的治疗策略——肿瘤血管靶向治疗已成为当今肿瘤领域研究的主攻方向之一。1999年,癌症生物学家David Lyden、Shahin Rafii和Rober tBenezra以及来自纪念Sloan-Kettering癌症中心、康奈尔大学医学院和纽约ImClone Systems有限公司的一个联合研究小组人员,从阻断肿瘤补充建立血管网络的原材料来阻止肿瘤血管的生长。哈佛大学波士顿医学院的肿瘤血管生成研究人员用“开创性的”一词来形容这项工作。称之为:“这项研究结果可以打开研制新一类有助于抑制肿瘤生长的抗血管生成药物的大门”。
各国科学家围绕整合素途径抑制血管生成进行了大量的尝试,获得了许多有益的经验。研究表明,整合素αvβ3受体在多种恶性肿瘤细胞表面有高水平的表达,尤其在恶性肿瘤组织新生血管内皮细胞膜高表达,而成熟血管内皮细胞和绝大多数正常器官系统则无表达或几乎不能被探及。根据受体理论,含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)序列的配基类似物可作为拮抗剂与αvβ3整合蛋白进行竞争性结合(其与配基的结合是通过RGD氨基酸序列与α、β链进行共价键结合),引起肿瘤新生血管内皮细胞的编程性坏死,从而阻断血管内皮细胞增殖的信使传递,终止细胞增殖,使血管不能生长,导致癌肿组织供养系统中断,细胞萎缩、凋亡。这种受体拮抗剂能导致增生血管细胞的凋亡,但对于原先已存在的血管,则不会造成任何影响。在一定条件下,一些合成的含RGD序列多肽也同样具有识别整合蛋白的活性。
虽然含有RGD序列肽可被各种整合蛋白所识别,但是RGD序列肽在体内不稳定,这些多肽在体内迅速被分解与清除,需要多次注射大剂量来抑制癌细胞转移,这一问题成为该类多肽作为实用性抗肿瘤细胞转移药物的一个极为不利因素。Kok等研究报道,RGD肽与其他物质进行的偶联物的生物活性较其非偶联物强,研究还表明,很小浓度的活性肽就可有显著的生物学影响。国内外许多药物化学家们对含RGD的肽进行了改造,化学修饰,氨基酸改变,与其他药物载体偶联等,藉此提高其生物稳定性和药效。虽然目前这类靶向治疗载体在体外实验和动物实验中也取得了一定的效果,但是目前国内外尚无一种载体能够达到理想的靶向给药的目的,有关RGD修饰的能缓慢控制释放药物的载体材料少有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种载药肿瘤靶向阳离子聚合物,特别涉及一种供注射用的整合素配体修饰的载抗癌药物的肿瘤靶向性阳离子聚合物,可以用于制备载抗癌药物的纳米粒给药系统。该系统是由直链或环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(RGD)或RGD类似物的整合素配体进行修饰得到的一系列阳离子聚合物的纳米粒给药系统。
本发明将阳离子聚合物表面用含RGD序列的直链或环状多肽修饰,该直链或环状RGD修饰得到一系列阳离子聚合物,所述的阳离子聚合物可以用于制备载抗癌药物的纳米粒给药系统。含RGD序列的直链或环状多肽能够被肿瘤表面表达的整合素受体所识别,从而靶向到肿瘤新生血管,通过破坏肿瘤新生血管而达到抑制肿瘤生长的作用。而纳米粒本身又可以起到延长药物在体内循环的作用。包封在纳米粒中的抗癌药物可以到达肿瘤细胞内,与靶点结合后发挥细胞毒性作用。本发明结合了纳米粒缓释和RGD的肿瘤靶向性作用,从而增加抗癌药物在肿瘤部位的蓄积,提高药物疗效。
本发明所要解决的技术问题在于选择合适的载体,使生物活性整合素配体如多肽能有效地抑制肿瘤血管的生长。
本发明提供了一种含RGD序列的活性多肽修饰的阳离子聚合物纳米载药材料。其特征在于其由阳离子聚合物和活性多肽两部分结合组成,为一系列不同分子量、不同阳离子聚合物单体比例以及不同活性多肽含量的材料,所述的阳离子聚合物用直链或环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列或其类似物的整合素配体进行修饰;所述的修饰的阳离子聚合物其分子量为1.0×103~9.0×106,直链或环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列含量为0.0001~50%。
本发明所含RGD序列的是含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的任何直链或环状多肽片段,包括含RGD序列的三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽十一肽、十二肽、十三肽、十四肽、十五肽、十六肽、十七肽或十八肽,或含RGD类似物(RGDm)的直链或环状多肽片段。
本发明所述的阳离子聚合物包括任何适合与含RGD序列的多肽片段相结合的阳离子聚合物。优选PLA-PLL(聚乳酸-聚赖氨酸)、PLGA-PLL(羟基乙酸-聚赖氨酸)、PEG-PLL(聚乙二醇-聚赖氨酸)、PEO-PS(聚氧乙烯-聚精胺)、PEG-PEI(聚乙二醇-聚乙烯亚胺)或PAMAM(聚酰胺胺树状分子)。
本发明所述的阳离子聚合物和多肽的连接方法是通过阳离子聚合物和多肽之间的官能团反应形成共价键结合。
本发明所述的包封药物包括任何适合制成纳米粒给药系统的抗肿瘤药物或肿瘤诊断试剂,可为有机药物、水溶性药物或水不溶性药物抗癌药,如抗叶酸类(如甲氨蝶呤)、抗嘌呤类(如巯嘌呤)、抗嘧啶类(如氟尿嘧啶、替加氟)、核苷酸还原酶抑制药(如羟基脲)、脱氧核糖核苷酸多聚酶抑制药(如环胞苷)、直接影响和破坏DNA结构及其功能的药物(如氮芥、环磷酰胺、氮甲、顺铂、丝裂霉素、喜树碱)、抑制蛋白质合成的药(如阿霉素、L—门冬酰胺酶、柔红霉素、光辉霉素)、影响微管蛋白质组装和纺锤丝形成的药物(长春碱、依托泊苷)。
本发明提供的含RGD多肽修饰的阳离子聚合物。该高分子材料是优良的药物载体,利用这种材料包裹药物,在机械搅拌、超声、高压乳匀机作用下制备缓释纳米粒,粒径在10~1000nm以下可控,表面光滑,均匀度好,颗粒规则无粘连,再分散性好,载药量和包封率高,可用于制备静脉或肌肉注射或口服给药的缓释纳米粒,作为癌细胞靶向给药。制备的纳米粒可以分散在固体、半固体或溶液中。优选的是制成注射给药的药物制剂形式,尤其是供静脉注射用。
本发明又一目的是提供多肽修饰的阳离子聚合物在制备纳米级药物中的应用。本发明的直链或环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(RGD)或RGD类似物的整合素配体进行修饰得到的一系列阳离子聚合物的纳米粒可以通过以下方法制备:
复乳法:将合成得到的多肽修饰的阳离子聚合物溶于乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮混合的有机溶剂中,加入药物水溶液,超声或高压乳匀得到初乳,再加入水分散介质,乳化得到复乳后,搅拌或旋转蒸发除去有机相,即得纳米粒混悬液。
共沉淀法:将合成得到的多肽修饰的阳离子聚合物和药物一起溶于丙酮中,搅拌条件下滴加到水分散介质中,搅拌挥尽有机溶剂,即得纳米粒混悬液。
乳化溶剂扩散法:将合成得到的多肽修饰的阳离子聚合物和药物一起溶于丙酮/二氯甲烷混合溶剂中,加入到水分散介质中,超声或高压乳匀乳化,乳液在室温下挥尽有机溶剂,即得纳米粒混悬液。
本发明所述的水分散介质包括右旋糖苷40、右旋糖苷70、普朗尼克F68等任何适合于制备纳米粒的表面活性剂,其浓度为0.1~10%。
本发明所述的有机溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、乙醇等任何合于制备纳米粒的有机溶剂。
本发明制备方法简便,适于大规模生产,特别适应于制备肿瘤靶向的抗肿瘤药纳米粒给药系统。
附图说明:
图1包载盐酸米托恩醌的PLA-PLL-RGD纳米粒的粒径分布图。
图2包载盐酸米托恩醌的PLA-PLL-RGD纳米粒透射电镜图。
图3包载阿柔比星A的PLGA-PLL-RGD纳米粒的透射电镜图。
图4接种lewis肺癌的C57BL/6J小鼠尾静脉注射盐酸米托恩醌溶液(Free-DHAQ)和盐酸米托恩醌PLA-PLL-RGD纳米粒(RGD-NP)后的组织分布图。
图5接种H22肝癌的ICR小鼠,尾静脉注射盐酸米托恩醌PLA-PLL-RGD纳米粒及PLA-PLL-RGD材料后的细胞凋亡数据图,
其中,001是注射包载盐酸米托恩醌的PLA-PLL-RGD纳米粒72h处死,RGD为环状多肽;
005是注射包载盐酸米托恩醌的PLA-PLL-RGD纳米粒72h处死,RGD为直链肽;
004是注射PLA-PLL-RGD(未包载药物)72h处死,RGD为直链肽。
具体实施方式:
下面以实施例对本发明加以进一步的说明,但是不限制本发明的内容。
实施例1、RGD修饰的聚乳酸-聚赖氨酸的制备(PLA-PLL-RGD)
(1)乳酸与赖氨酸的环状二聚体的制备
烧瓶中加入溶解一定量D-丙氨酸的氢溴酸(酸过量),少量的溴化铜催化,再将一定量的亚硝酸钠溶解在一定比例的水中配成溶液,缓慢滴加到烧瓶中。反应在低温反应浴中进行。反应完成后,乙醚萃取,分别用无水硫酸钠和氯化钙干燥,蒸除溶剂,得中间体产物A。
在中间体A中,滴加一定量的二氯亚砜,室温反应2~6小时。反应结束,蒸除过量的二氯亚砜,得中间体B,烘干备用。
将一定摩尔比例的中间体B和z基团保护的赖氨酸溶解在三氯甲烷中,得到中间体C。
中间体C中加入一定量的三氯甲烷和三乙胺,控制温度30~70℃,反应2~4小时,得产物环状二聚体D。
(2)乳酸与赖氨酸的共聚物PLAL的制备
将环状二聚体D和丙交酯置于聚合管中,适量辛酸亚锡溶液催化,130~160℃熔融状态下搅拌反应。20~28小时后,加二氯甲烷溶解,甲醇中沉析生成含有支链的共聚物E。
共聚物E在氯化钯、三乙胺存在下加入二氯甲烷室温状态下反应3~6天,脱去保护氨基的Z基团,得到PLAL的长链共聚物F。
(3)RGD-NH2的接枝
将RGD溶于蒸馏水中,盐酸调节pH值4.0~5.0,加入共聚物F,再少量加入EDC,搅拌反应24~72小时,随时调节pH值。过滤,滤渣依次用水洗涤20~30小时,丙酮洗15~20小时,再水洗40~55小时,常温烘干20~28小时,密封,备用。
实施例2、RGD修饰的聚羟基乙酸-聚赖氨酸的制备(PLGA-PLL-RGD)
在一定条件下,聚羟基乙酸与聚赖氨酸缩合,得到聚羟基乙酸-聚赖氨酸,再采用如实施例1所示条件与RGD-NH2反应,制备PLGA-PLL-RGD。
实施例3、RGD修饰的聚乙二醇-聚赖氨酸的制备(PEG-PLL-RGD)
聚乙二醇酰化后,与聚赖氨酸聚合,得到聚乙二醇-聚赖氨酸,再采用如实施例1所示条件与RGD-NH2反应,制备PEG-PLL-RGD。
实施例4、RGD修饰的聚氧乙烯-聚精胺的制备(PEO-PS-RGD)
精胺在一定条件下聚合,再与聚氧乙烯聚合,得到聚氧乙烯-聚精胺,再采用如实施例1所示条件与RGD-NH2反应,制备PEO-PS-RGD。
实施例5、RGD修饰的聚乙二醇-聚乙烯亚胺的制备(PEG-PEI-RGD)
在一定条件下,用聚二醇修饰聚乙烯亚胺,得到聚乙二醇-聚乙烯亚胺,再采用如实施例1所示条件与RGD-NH2反应,制备PEO-PS-RGD。
实施例6、RGD修饰的聚酰胺胺树状分子的制备(PAMAM-RGD)
氨与丙烯酸甲酯、二乙胺反应,聚合得到聚酰胺胺树状分子,再采用如实施例1所示条件与RGD-NH2反应,制备PEO-PS-RGD。
实施例7、包载盐酸米托恩醌的PLA-PLL-RGD纳米粒的制备
采用复乳法制备,取PLA-PLL-RGD溶于二氯甲烷和丙酮(3:2)的混合溶剂中,加入盐酸米托恩醌的水溶液,超声乳化后,再加入到浓度为3%的F68水溶液中,室温下搅拌5小时除去有机相,即得纳米粒混悬液。上述制得的纳米粒粒径应控制在100nm以下。粒径分布图见附图1,透射电镜图见附图2。
实施例8、包载阿柔比星A的PLGA-PLL-RGD纳米粒的制备
采用共沉淀法制备,先将一定量的阿柔比星A和PLGA-PLL-RGD溶于丙酮中,然后再将该丙酮溶液快速滴加到含有3%F68的水溶液中去,室温下搅拌除去有机溶剂,即得纳米粒混悬液。上述制得的纳米粒粒径应控制在100nm以下。透射电镜图见附图3。
实施例9、包载阿柔比星A的PLGA-PLL-RGD纳米粒的制备
采用乳化溶剂扩散法,先将一定量的阿柔比星A和PLGA-PLL-RGD溶于丙酮/二氯甲烷(体积比为2:3)混合溶剂中,加入浓度为3%的F68液中(有机相与水相的体积比为1:6),超声乳化10s×3(360W),乳液在室温下搅拌5小时挥尽有机溶剂,即得纳米粒混悬液。上述制得的纳米粒粒径应控制在100nm以下。
实施例10、包载盐酸米托恩醌的PLA-PLL-RGD纳米粒的组织分布实验
由于本发明是肿瘤靶向来提高抗癌药物的疗效,故要求药物能在肿瘤组织中蓄积。为此有必要对其在肿瘤和其它脏器组织中的分布进行考察。
参比制剂:盐酸米托恩醌溶液
试验制剂:包载盐酸米托恩醌的PLA-PLL-RGD纳米粒
试验动物:接种lewis肺癌的C57BL/6J小鼠,体重12-18g,每个时间点为5只,尾静脉注射给药,给药剂量为2mg·kg-1。
试验结果:不同时间点肿瘤及各脏器组织中的药物浓度见附图4。
结果表明,包载盐酸米托恩醌的PLA-PLL-RGD纳米粒24h肿瘤中药物的含量为游离盐酸米托恩醌的3.2倍,96h则为3.6倍,而在其它脏器中分布较少。表明PLA-PLL-RGD纳米粒具有较好的肿瘤靶向性。
实施例11、包载盐酸米托恩醌的PLA-PLL-RGD纳米粒的细胞凋亡实验
因含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)序列的配基类似物可作为拮抗剂与αvβ3整合蛋白进行竞争性结合,引起肿瘤新生血管内皮细胞的编程性坏死,从而阻断血管内皮细胞增殖的信使传递,终止细胞增殖,使血管不能生长,导致癌肿组织供养系统中断,细胞萎缩、凋亡。在一定条件下,一些合成的含RGD序列多肽也同样具有识别整合蛋白的活性。为此有必要对PLA-PLL-RGD的肿瘤细胞凋亡作用进行测定。
参比制剂:盐酸米托恩醌溶液
试验制剂:包载盐酸米托恩醌的PLA-PLL-RGD纳米粒
试验动物:接种H22肝癌的ICR小鼠,体重16-20g,每个时间点为4只,尾静脉注射给药,给药剂量为2mg·kg-1。
试验结果:给药后肿瘤细胞的凋亡数据图见附图5。
结果表明,PLA-PLL-RGD材料即可导致肿瘤细胞凋亡,环状多肽的效果稍优于直链肽。与盐酸米托恩醌合用效果优于未包载药物的PLA-PLL-RGD材料。