CN102258486A - 一种相思子蛋白纳米粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种相思子蛋白纳米粒及其制备方法。以聚乳酸-羟基乙酸作为载体材料，采用乳化挥发法制备得到的相思子蛋白纳米粒，粒径为50nm～300nm，包封率为30％～90％，载药率为5％～10％，在电镜下观察呈球形，表面规则，粒径分布均匀，在体外具有良好的缓释特征。冻干产品流动性佳，复溶性好，易于稳定保存。本发明针对相思子蛋白毒性较大、体内靶向性较差，作为蛋白类药物易受体内外理化性质干扰等缺点，将毒素载于纳米粒给药系统中，从而实现对毒素的缓释、靶向和高效给药，有望用于肿瘤的临床治疗。

Description

一种相思子蛋白纳米粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域中的蛋白药物新剂型和制剂技术，具体涉及到一种具有抗癌药物开发前景的相思子蛋白纳米粒及其制备方法。

背景技术

相思子蛋白是提取自豆科藤本植物相思子中的一种植物蛋白毒素，为II型核糖体失活蛋白，其作用机制是通过失活细胞核糖体进而抑制蛋白质的合成造成细胞死亡。大量研究发现，相思子蛋白可用于恶性肿瘤的治疗，对大多数肿瘤均具有杀伤作用。相思子蛋白对艾氏腹水瘤、Lweis肺癌、B16黑色素瘤、白血病、纤维肉瘤、卵巢肉瘤、恶性黑色素瘤、Ewing’肉瘤等都具有显著的抑制作用，是一种很有开发前途的抗癌药物。对相思子蛋白原药的一期临床试验结果表明，相思子蛋白与目前使用的大多数抗癌药物相比具有一定的优势，副反应更小，在治疗人类慢性生长肿瘤方面可能尤其有用，或者作为由于骨髓抑制而不能继续使用的化疗药物的代替物方面可能有其独特的使用价值。

但由于相思子蛋白毒性较大，体内受体分布较广，因此要使其能成功的应用于临床，需要考虑提高靶向性，以解决使用安全性问题。此外，采取何种给药途径也是对相思子蛋白进行药物开发时不可忽视的问题，目前临床上对于蛋白药物一般采用的给药方式是注射途径给药，但是临床试验结果已证明直接注射毒素蛋白有较大的风险，故该给药方式不适用于相思子蛋白。上述这些问题长期来一直制约着相思子蛋白的临床开发和应用。

近年来，纳米粒载药系统引起了人们的广泛关注。研究表明，纳米粒载药系统可以通过在体内的长循环和EPR效应实现对药物的被动靶向输送，改变药物的体内分布，对于肿瘤组织有着优良的选择性。因此，纳米粒在作为抗肿瘤药物载体方面的应用尤为引人注目，所涉及的药物包括：紫杉醇、5-氟尿嘧啶、阿霉素、甲氨喋呤、砒霜、米托葱酮、放线菌素D、阿克拉霉素、长春胺、顺铂和碳铂等等。从各种抗肿瘤药物进行的动物实验结果来看，药物结合于纳米粒之后，大多数都可以改变药物的体内过程，使药物在体内滞留时间延长，并提高了对肿瘤组织的靶向选择性，从而提高了对肿瘤细胞的抑制率，显示出了良好的应用前景。目前国内外每年都有很多文献、专利报道了相关的研究工作。

但是到目前为止，有关相思子蛋白纳米粒的研究国内外尚未见文献报道。

发明内容

本发明公开了一种相思子蛋白聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)纳米粒及其制备方法。针对相思子蛋白毒性较大、体内靶向性较差，作为蛋白类药物易受体内外理化性质干扰等缺点，本发明设计将毒素蛋白载于纳米粒中，将相思子蛋白纳米化后，借助纳米载药系统将有望实现相思子蛋白的高效、缓释和靶向给药，从而有助于将相思子蛋白开发成为一种新型、有效的抗癌药物。

本发明采用以下技术方案：

称取一定量的相思子蛋白溶于含有重量百分比0.5～2％的帕洛沙姆188(F68)、0.1～1mol/L的半乳糖的磷酸盐缓冲液中，配成1mg/mL～5mg/mL的溶液，作为内水相；称取适量的PLGA溶于乙酸乙酯或者丙酮或者二者按比例混合溶剂中，配成5mg/mL～20mg/mL的溶液，作为油相。其中，所采用的PLGA粘均分子量在10000～40000之间，乳酸比例不低于50％；重量百分比0.5％～2％的F68水溶液作为外水相。

纳米粒溶胶的制备采用复乳化法。将内水相与油相按照体积比为1∶5～1∶10混合，乳化制备得到初乳。乳化方法为：冰浴条件下，10000rpm～20000rpm乳化1min；或者采用间歇超声法乳化，超声5秒间歇10秒，时间为3min，超声功率40w～100w。

将初乳与外水相按体积比为1∶5～1∶10混合，按照初乳乳化方法乳化，得到复乳。之后，30℃～40℃下水浴真空旋转蒸发30min～90min，除去其中的有机溶剂，使PLGA固化得到纳米粒子。

将该溶液置于4℃下20000g～40000g离心30min，收集沉淀，得到纳米粒用水重新分散、离心，洗涤两到三遍之后，再加入0.5％～2％的甘露醇重新分散，冷冻干燥，即得相思子蛋白PLGA纳米粒。

本发明制备得到的相思子蛋白纳米粒包封率为30％～90％，载药率为5％～10％。通过粒度仪测定结果表明，粒度分布集中，粒径在50～300nm左右，电镜下粒子颗粒分布均匀，粒子表面光滑。二者表征结果一致。纳米粒表面呈现负性电荷，zeta电位值为-10mV～-40mV。

本发明制备得到的相思子蛋白纳米粒在体外释药曲线平缓，可持续释药达96小时以上，表现出良好的缓释特征，无突释效应。

附图说明

附图1相思子蛋白PLGA纳米粒粒径分布图

附图2相思子蛋白PLGA纳米粒电镜观测图

附图3相思子蛋白PLGA纳米粒体外释放曲线

具体实施例

本发明的内容，通过以下实施例作具体说明，但是不限制本发明的内容。

实施例1：相思子蛋白PLGA纳米粒的制备：

准确称取3mg的相思子蛋白溶于1mL含有1％的帕洛沙姆188(F68)、0.1mol/L的半乳糖的磷酸盐缓冲液(0.005mol/L，pH 7.4)中，配成3mg/mL的溶液，作为内水相；称取适量的PLGA(粘均分子量为40000，乳酸和羟基乙酸比例为75∶25)溶于乙酸乙酯中，配成5mg/mL的溶液，作为油相；1％的F68水溶液作为外水相。

纳米粒溶胶的制备采用水包油包水法。取1mL的内水相，加入到5mL油相中，冰浴条件下16000rpm乳化1min，制备得到初乳，将初乳迅速转移到25mL外水相中，乳化2min，得到复乳，35℃下水浴真空旋转蒸发1h，除去其中的乙酸乙酯，使PLGA固化得到纳米粒子。将该溶液置于4℃下25000g离心30min，收集沉淀，得到纳米粒用水重新分散、离心，洗涤两遍之后，再加入3mL0.5％的甘露醇重新分散，冷冻干燥，即得相思子蛋白PLGA纳米粒。

实施例2：相思子蛋白PLGA纳米粒包封率、载药率测定

将除去有机溶剂离心后得到的相思子蛋白PLGA纳米粒上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，取样，用凝胶高效液相色谱法分析其中相思子蛋白的含量，计算包封率。并根据冻干得到的纳米粒质量，计算毒素的载药率。

经测定，实验所制得的相思子蛋白PLGA纳米粒平均包封率为(82.3±5.1)％，平均载药率为(7.05±0.93)％。

实施例3：相思子蛋白PLGA纳米粒粒度、表面电位测定

将制备好的相思子蛋白PLGA纳米粒胶体溶液加适量注射用水分散，用粒度分析仪/zeta电位仪测定其粒度和zeta电位。

用激光粒度仪测定其粒度及表面电位，测得其粒径为217.8nm，多分散指数值为0.102，表面电位为-14.72mV。相思子蛋白PLGA纳米粒粒度分布图见附图1.

实施例4：相思子蛋白PLGA纳米粒电镜表征

取适量相思子蛋白PLGA纳米粒纳米粒胶体溶液，经充分稀释后，置于硅片上挥干溶剂，真空喷金后，在扫描电子显微镜(SEM)下观察所制备的纳米粒子形态。

电镜观察结果见附图2.

实施例5：相思子蛋白PLGA纳米粒体外释药曲线测定

本研究中释放介质采用文献中通常采用pH＝7.4磷酸盐缓冲液作为人工模拟体液。磷酸盐缓冲溶液根据中华人民共和国药典2000年版二部附录XV缓冲液配制方法配制。配制方法如下：取磷酸二氢钾1.36g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液79mL，用水稀释至200mL，即得pH7.4的磷酸盐缓冲液。取1mg冻干后的相思子蛋白PLGA纳米粒，溶解在该磷酸盐缓冲液中，密封防止挥发，置37℃下空气浴摇床中，转速100r/min振摇。分别于不同时刻取样，每次取样200μL，4℃下25000g离心30min，用高效液相法测定上清中的相思子蛋白含量，计算累计释放率。将沉淀补充等量的释放介质后重新分散，转移回原释放体系。

相思子蛋白PLGA纳米粒体外释药曲线见附图3.

Claims (1)

1.一种相思子蛋白纳米粒及其制备方法，其特征在于该纳米粒由相思子蛋白与可生物降解的聚合物聚乳酸-羟基乙酸组成，相思子蛋白被聚合物交联组成的球状纳米粒结构包裹于粒子内部或中间孔屑结构中；纳米粒的粒径范围在50～300nm之间，包封率为30％～90％，载药率为5％～10％，纳米粒表面电荷呈负性，范围在-10mV～-40mV之间；纳米粒的制备方法如下：先将相思子蛋白溶于含有0.1mol/L～1mol/L的半乳糖作为保护剂的磷酸盐缓冲液中，按照体积比为1∶5～1∶10的比例转移至浓度为5mg/mL～20mg/mL的聚乳酸-羟基乙酸有机溶剂溶液中，采用高速乳匀法或者超声法制备油包水型乳化液，然后再按照体积比为1∶5～1∶10的比例转移至重量百分比为1～2％的帕洛沙姆188水溶液中继续乳化，制备得到水包油包水型复乳，挥发除去油相中的有机溶剂使纳米粒固化，最后通过高速离心分离纳米粒，经纯水反复洗涤后，加入重量百分比为0.5％～2％的甘露醇作为冻干支持剂冷冻干燥得到纳米粒；所制备得到的相思子蛋白纳米粒在体外释药曲线平缓，可持续释药达96小时以上，具有良好的缓释特征，无突释效应。

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