CN101961314A - 一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统及其制备方法,主要用以标准蛋白质模型药物牛血清白蛋白等为药物模型,制备出了蛋白质药物的纳米乳载药系统。其组合特征在于:0.1%~15%的蛋白质药物、10%~30%的表面活性剂、5%~25%的助表面活性剂、3%~20%的油相、0%~10%的稳定剂,20%~70%的水相。本发明的蛋白质药物纳米乳载药系统可较大提高蛋白质药物的稳定性,保留良好免疫学与生物学活性,载药量大、包封率高、制备工艺简单、成本低廉、安全无毒、无有机溶剂残留、便于运输和储存,较好地解决目前蛋白质药物存在的稳定性差、药效容易丧失、载药量和包封率低、制备工艺复杂和有机溶剂残留、毒性大等问题。
Description
技术领域
本发明属于医药制药领域,涉及蛋白质和基因工程药物的纳米乳新型载药系统,具体涉及一种蛋白质药物新型纳米乳载药系统及其制备方法。
背景技术
随着生物科技及分子生物学的发展,越来越多的高纯度蛋白质药物出现并开始应用于医药领域。蛋白质药物与其他药物相比,具有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明确、成本低廉、成功率高、安全可靠等优点,从而成为医药产品中的重要组成部分。自1982年美国Lilly公司将第一个重组蛋白质药物-重组胰岛素投放市场来,以蛋白质药物研发为主的全球生物技术公司总数已近5000家,上市公司600余家。到目前为止,全球已批准适应症多达220种的150个蛋白质药物上市,其产值和销售额已超过400亿美元。虽蛋白质药物发展迅速,但其研发方面还面临着严峻和巨大挑战,这根本原因在于以下自身特点与不足:(1)结构复杂,影响因素多,理化性质不稳定,质量不易控制和检测,稳定性差,使其保存、运输过程均需低温或冻干,使用也不方便;(2)一些蛋白质药物的分子量大,口服给药易受胃肠道pH、菌群及酶系统破坏,生物膜穿透性差,吸收困难,生物利用度低,非注射给药一般仅为百分之几;(3)扩散差、分配系数小使其难通过生物屏障及脂质膜,传递效率与靶向性较低;(4)显著的肝、胃肠首过效应,经过首过效应后仅保留2~3%;(5)生物半衰期短,体内清除率高。由于蛋白质药自身特点,用药方式大多只能用频繁地注射给药,但这往往会对患者造成费用高、顺应差、安全性差、治疗率低等问题。蛋白质药物和其他药物一样都要理想、合适的载药系统,才能发挥出最佳的药物效果。由于载药系统是蛋白质药物研发是非常关键和重要环节,用药物载药系统来改变蛋白质药物自身不足,成为当前研发的热点。
由于蛋白质药物不稳定性和成本原因,在研究中通常先要用蛋白质模型药物进行研究。因此,国内外蛋白质药物研发中,通常用具有性质稳定,在多数生化反应中不发生作用,价格低廉,蛋白分子量较小、溶解度较大、稳定性较好且容易较大量、高纯度的制备的人和牛血清白蛋白作为蛋白质药物研发中标准的蛋白质模型药物。同时,它还常被作为生物相容性和水溶性的生物大分子被广泛研究。
由于蛋白质药物的载药系统是蛋白质药物研发中重要和关键的环节,因此标准的蛋白质模型药物牛和人血清白蛋白的载药系统也成为国内外蛋白质药物研究的热点。以BSA为蛋白质药物模型,国外内研究主要有:胡凯莉(2009)制备的乳铁蛋白修饰聚乳酸-聚羟基乙酸和乳铁蛋白修饰聚乳酸纳米粒载药系统[1];张慧芳(2009)以丙烯酸和N-乙烯基吡咯烷酮为反应单体,用原位聚合法制备BSA纳米囊和微球[2]。薛璇(2008)制备出粒径为2.0~3.0um,载药量为14.72%,包封率为92.07%的BSA凝胶[3];王黎(2007)制备的BSA多囊脂质体[4]。Byung Soo Kim(2009)用聚乳酸-聚乙二醇酸(PLGA)和聚乙烯醇为材料,制备的用FITC标记的BSA微球[5];Yunqing Kang(2009)以聚L-丙交酯(PLLA)材料,制备1.22um的BSA微球[6];Marcilene M.A(2009)制备的直径170~520nm的BSA纳米球[7];Yujun Wang(2009)用壳聚糖为材料,制备直径为10~20nm的磁性BSA纳米粒[8];J.C.Gayet(1996)制备出BSA-PEG凝胶[9];Tse-Ying Liu(2005)制备含缺钙性羟基磷灰石BSA控释系统[10];M.Igartua(1998)用PLGA材料制备出粒径在0.6~2um的BSA微球[11];曹金娜(2009)制备的包封率为46.82%的N-三甲基壳聚糖BSA脂质体[12];夏洪男(2009)用生物可降解材料PLG607材料,用溶剂挥发法制备了粒径为40~70un,包封率为46.3%的BSA微球[13];黄婉丹(2009)以PLGA为材料,制备复乳-溶剂挥发法制备BSA-PLGA微球[14];张良珂(2005)用Ca2+,Ba2+为交联剂,制备果胶BSA凝胶微丸[15];梁晓晖(2008)制得平均粒径为284.1nm,包封率为34.21%,Zeta电位为+27.1mV的肝靶向BSA脂质体[16]。国内专利主要有:戴传云以磷脂和海藻酸钠为材料,制备的BSA多泡脂质体[CN1727001A];张阳德的BSA纳米粒[CN1736489A];张丽娜以壳聚糖和海藻酸钠为材料,制备BSA微囊[CN1546557A];王身国制备亲水性药物BSA释放体系[CN1393217A]、脂肪族内酯共混物释药体系[CN1393267A]和生物可降解持续释药体系[CN1393218A];张政朴以四臂型聚乙烯丙交酯为材料,制备BSA微球[CN1927906];王荣民制备纳米级BSA微球及纳米囊[CN101401490A];杜予民制备羧甲基壳聚糖纳米粒[CN100393782C]。以人血清白蛋白(HAS)为药物模型的主要有:孟慧(2009)用PLGA、N-甲基-2-吡咯烷酮、苯甲酸苄酯为材料制备可注射HSA凝胶[17]。刘世芸(2009)以用聚乳酸为材料,用复乳法制备出粒径在10~40μm,包封率为85.25%,负载率为14.52%的复合HSA微球[18]。
总之,以牛和人血清白蛋白作为标准蛋白质模型药物的蛋白质药物载药系统研究主要集中在纳米粒、纳米囊、纳米微球、微囊、多泡脂质体、脂质体;药用辅料主要是:PLA、PLAG、PLG607、三甲基壳聚糖、壳聚糖、聚乳酸-聚羟基乙酸、聚3-羟基丁酸酯、磷脂和海藻酸钠、PVP、PLLA等;制备方法多用复乳-溶剂挥发法、原位包合法、乳化交联法、吸附法等。这些载药系统或药用辅料、制备方法存在以下问题:(1)药物包封率及载药量低;(2)使用材料毒副作用较大,制备过程中有机溶媒残余量大,毒性大;(3)制造工艺复杂、条件要求高、工艺操作时间长;(4)制备过程易破坏药物;(5)具有突释效应;(6)生物相容性不理想,产率低、不易灭菌、稳定性和重复性差,难大规模生产;(7)原料价格昂贵,生产成本高。用纳米乳载药系统可较好地解决。
纳米乳(Nanoemulsion),曾称微乳状液、微乳液或微乳剂,现又称纳米乳液、纳米乳状液、纳米乳剂,是一个由油、水、表面活性剂、助表面活性剂四个组分组成的、粒径为1~100nm、液滴多为球形,大小比较均匀,透明或半透明、具热力学稳定和各向同性、热压灭菌或高速离心稳定不分层的胶体分散系统。其具有的显著特点有:各向同性的透明液体,热力学稳定,经热压灭菌或高速离心不分层;自发形成、工艺简单,易于制备、制备过程不需特殊设备、制剂质量稳定;在一定程度上能保护药物在胃肠、肝脏内免遭酶解,避免药物首过效应;粒径小,增强药物在胃肠道吸收,提高生物利用度;改变药物在体内分布,具有一定的组织与器官靶向性;对于易水解药物保护作用,有缓释作用。由于纳米乳以上的显著优势,因此在国内外研究如火如荼,尤其是在蛋白质药物方面。研究主要有:葛伟(2009)制备了胃癌特异性(MAGE1-HSP70/SEA)纳米乳疫苗,可明显提高细胞的免疫应答,具有明显抗肿瘤活性[19,20];Makidon(2009)制备了洋葱伯克氏菌17kDa的外膜蛋白纳米乳疫苗。免疫后,可明显提高CD-1小鼠血清的IgG和SIgA水平,增强抗体交叉中和反应水平[21];Bielinska(2008)制备HIV gp120重组抗原水包油纳米乳[22];Paul E(2008)用大豆油、酒精为材料,制备出粒径小于400nm无需注射的纳米乳乙肝疫苗。实验证实该疫苗无毒、免疫效果好、可产生长久的免疫力[23];葛伟(2008)制备了肿瘤基因工程(MAGE-1/HSP70/SEA)纳米乳疫苗,口服、皮下、静脉和腹腔注射4种途径免疫C57BL/6小鼠后,都能有效地抑制肿瘤生长[24]。Bielinska(2007)用非离子表面活性剂为原料,制备含炭疽芽孢杆菌保护性抗原(rPA)纳米乳[25];孙玉静(2005)包裹含肿瘤特异性抗原MAGE-1-HSP70融合蛋白与适量超抗原SEA配比组成的复合抗原,制备出肿瘤基因工程纳米乳疫苗。体内实验表明能显著激活针对MAGE-1的细胞免疫反应,对小鼠肿瘤模型能产生明显的治疗效果[26]。师瑞(2005)研制出胃癌MG7基因特异性纳米乳疫苗具有将强的免疫原性和较强的抗肿瘤作用[27]。Hamoudal(2001)制备I型单纯性疱疹、流感病毒A和牛痘的纳米乳疫苗[28]。上述用纳米乳作为蛋白质药物的载药系统成功研究为本发明提供坚实的理论基础和可行性。
发明内容
理想药物及其制剂应遵循“三效”、“三小”和“五便”原则,“三效”:高效、速效、长效;“三小”:剂量小、副作用小、毒性小;“五便”:生产、储藏、运输、携带、使用。而理想载药系统的则应具有:(1)所用全部辅料均是药用辅料,符合药典标准、生物相容性好,安全无毒副作用;(2)载药量大,能满足用药要求;(3)包封率高,至少80%以上;(4)生产过程和工艺简单,易推广、无有积溶剂残留;(5)制剂质量稳定、安全,有效;(6)粒径小,吸收快,在体内维持时间长,且具有一定的缓释和靶向作用。
设计思路:由于蛋白质药物在医药制药领域非常重要地位,其载药系统成为研究热点。针对蛋白质药物本身特点及载药系统中存在不足与缺陷,根据药物所遵循的三原则和理想载药系统的要求,利用现代纳米乳技术对蛋白质药物进行包裹,提出一种包封率高和载药量大、制备过程和工艺简单、使用药用辅料安全且无有机溶剂残留,且可极大提高蛋白质药物的稳定性、成本低廉、便于应用和推广的,粒径在1~100nm范围,符合纳米乳质量要求的蛋白质药物新型纳米乳载药系统。
实现上述目的的技术方案是:一种蛋白质药物新型纳米乳载药系统,由下列部分组成:0.1%~15%蛋白质药物、10%~30%的表面活性剂、5%~25%的助表面活性剂、3%~20%的油相、0%~10%的稳定剂,20%~70%的水相,所述表面活性剂为聚山梨酯或聚氧乙烯脂肪酸酯,助表面活性剂为失水山梨醇脂肪酸酯或者C2~C4的一元醇或多元醇,所述油相为食用药用液体石蜡、食用色拉油或有机酸酯,所述水相为蒸馏水,生理盐水,pH为6.5~7.5磷酸盐缓冲液中的一种或几种,所述稳定剂为甘露醇、甘氨酸和丙氨酸。
所述的蛋白质药物包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、胰岛素、肌红蛋白,或者水溶性或难溶性蛋白质类似药物,所述蛋白质药物浓度范围:牛血清白蛋白:1~10%;胰岛素:1~5%;肌红蛋白1~10%;人血清白蛋白:1~10%。
所述聚山梨酯为吐温-80、吐温-85、吐温60中的一种或几种,所述聚氧乙烯脂肪酸酯为聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油中任一种及一种以上组合;其有效量为吐温-80:10~30%、吐温-85:10~30%、吐温60:5~30%、聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH40):10~30%、聚氧乙烯蓖麻油(EL35):10~30%。
所述失水山梨醇脂肪酸酯是司盘-85、司盘80和司盘60中的任一种及一种以上组合;其有效量为司盘-85:5~15%、司盘80:5~15%、司盘60:5~10%。
所述C2-C4的一元醇或多元醇为无水乙醇、正丁醇、甘油、1,3-丁二醇、1,3-丙二醇中的任一种,其有效量为:无水乙醇:5~10%;甘油:5~10%;1,3-丙二醇:5~10%;1,3-丁二醇:5~10%,正丁醇:5~10%。
较优选组合:表面活性剂与助表面活性剂的互配为吐温80/司盘80、吐温85/司盘85、RH40/丙二醇、EL35/丙二醇。
所述有机酸酯为肉豆蔻酸异丙酯(IPM)、油酸乙酯、乙酸乙酯、GTCC中的任一种,其中油相的有效量分别为IPM:10~20%、油酸乙酯:5~20%、乙酸乙酯:10~20%、GTCC:3~15%。
所述稳定剂的有效量为甘露醇:1~10%、甘氨酸:1~10%、丙氨酸:1~10%。
优选:EL35∶丙二醇∶IPM(27%∶9%∶3%),蛋白质药物浓度4.5%和生理盐水56.5%,丙氨酸5%。
所述纳米乳的粒径为1~100nm。
所述纳米乳载药系统可以是上述纳米乳的水和缓冲液无限稀释液。
本发明的另一目的是提供一种蛋白质药物新型纳米乳载药系统的制备方法,具体包括下列步骤:
1)按配方称取蛋白质药物、溶剂、表面活性剂、助表面活性剂、油相、稳定剂、水相备用;
2)将所述量的表面活性剂与蛋白质药物混匀且使牛血清白蛋白部分溶解;
3)再加入所述量的助表面活性剂让蛋白质药物完全溶解,得到澄清的溶液;
4)再加入所述量的油相和稳定剂,搅拌下缓慢加入处方量70%水相,得到澄清的溶液;
5)最后再加入余量水相,混匀,得到澄清透明的纳米乳。
所述步骤(2)的混匀为4℃下,转速为50~100r/m搅拌。
所述步骤(4)中的搅拌为在25℃~37℃恒温水浴下,转速为100~200r/m搅拌。
所述制备方法还包括纳米乳的除菌、检测和包装步骤,所述除菌为采用0.2μm微孔滤膜过滤。
本发明的蛋白质药物新型纳米乳载药系统是由:表面活性剂、助表面活性剂、油相、水相及稳定剂组成。制备出的该纳米乳是粒径在1~100nm间的乳滴分散在另一种液体中形成的具有各向同性的热力学稳定的胶体分散系统。
处方设计原则:纳米乳作为药物载体,首先应在国家食品药品卫生药用辅料目录,并符合药物载体基本要求,即无毒、无刺激、无不良药理作用、具有良好的生物相容性、不影响主药的药效和稳定性;另外由于纳米乳自身特性,它对各处方组成还有特殊的要求,在用滴定法绘制伪三元相图的基础上,筛选出形成稳定的纳米乳区的较大区域作为其最优化处方。
表面活性剂是纳米乳形成所必需的物质,其主要作用是降低界面张力形成界面膜,促使纳米乳形成;增加主药的溶解性,确保制剂的稳定性。表面活性剂分为非离子型表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、嵌段共聚物、两性离子表面活性剂、氟化表面活性剂6类。目前较常用的脂肪酸山梨坦(亲油性)、聚山梨酯(吐温类,亲水性)、聚氧乙烯脂肪酸酯类(商品名Myrj,亲水性)、聚氧乙烯脂肪醇醚类(商品名Brij,亲水性)、聚氧乙烯、聚氧丙烯共聚物类(聚醚型,商品名Poloxamer或Pluronic)、蔗糖脂肪酸酯类和单硬脂酸甘油酯、琥珀酸甘油酯/Brii类和EmLphor、Labrasol。但是表面活性剂的选择决定于所形成的纳米乳的特性和使用目的。HLB值在4~7的表面活性剂可制备W/O型纳米乳,HLB值在8~18内的表面活性剂可制备O/W型纳米乳。本发明采用高HLB值的表面活性剂吐温类和聚氧乙烯脂肪酸酯类,这些表面活性剂,无毒无刺激,生物相容性好,有一定的营养作用,是制备各种纳米乳的较好辅料。优选:吐温60、吐温80、吐温85、聚氧乙烯蓖麻油(EL35)、聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH-40)。
纳米乳的形成还要求有短暂的负表面张力。因此,常需要有助表面活性剂的参与。助表面活性剂有三方面作用:协助表面活性剂降低界面张力,降低表面活性剂分子间的排斥力;增加界面流动性,减少纳米乳形成时的界面弯曲能,使纳米乳自发形成;调节表面活性剂的HLB值,使表面活性剂在油-水界面有较大的吸附。最常用的是适宜HLB值的非离子表面活性剂。本发明用目前最常用的司盘类(85、60、80)为其主要的助表面活性剂,同时还加入具有增强助表面活性剂的作用的低链醇类溶剂(乙醇、甘油、1,3-丁醇、正丁醇,丙二醇),可让纳米乳中所使用的油相与界面膜上表面活性剂分子之间保持渗透和联系,并易于与表面活性剂形成界面膜,从而更有利于纳米乳的形成。
本发明采用的油相有色拉油、肉豆蔻酸异丙酯、油酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸/葵酸三甘油脂(GT℃C)、药用液体石蜡中等,这些油相材料均可食用,无毒无刺激,生物相容性好,有一定的营养作用,是制备各种纳米乳的主要医药辅料。
本发明还加入少量的稳定剂0~10%,可让本发明的剂型稳定性更好,便于储存。
本发明与其它现有技术相比,具有以下的有益效果:
1.解决蛋白质和基因工程药物的稳定性差,制备蛋白质的纳米乳可极大蛋白质提高其稳定性。
2.制备的蛋白质药物新型纳米乳载药系统可进一步加入任意比例的水分稀释,热力学性质稳定,可用微孔滤膜过滤除菌,易于制备、运输和储存、澄清透明的纳米乳;
3.解决目前蛋白质的药物存在的药物包封率及载药量低,本发明制备的蛋白质药物新型纳米乳载药系统的载药量大,包封率高,提高药效。
4.本发明所选择的原料均是药用辅料,制备过程不涉及任何有机溶剂,无残留,安全无毒,制备过程温和,对蛋白质无破坏作用。
5.本发明采用的配方和方法简单可行、成本低廉,可以便于大规模工业化生产。
附图说明:
1.部分蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳外观图,
图中主要处方依次为:1号为:吐温80、司盘80、IPM;2号为:吐温85、司盘85、IPM、3号为:PMH40/丙二醇、吐温85、司盘85、IPM、4号为:EL35、丙二醇、IPM。
2.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳透射电镜图,
3.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳粒径与粒度分布图,
4.BCA法检测蛋白含量的标准曲线方程图,
5.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的稳定性部分研究结果图,
图中1和2号处方质量稳定,3号发生明显絮凝,4、5号变成半透明,有明显破乳和乳析。
6.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳室温放置不同时间的SDS-PAGE图,
图6从做左到右条带次依次为:最优含4.5%的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳在室温放置30、60、180、360d;而相同质量比的牛血清白蛋白的溶液室温放置30和60d。
7.不同pH下的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的电位,
8.不同温度下的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的粒径,
9.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的电泳分析其完整性图,
从左到右的顺序依次为:空白纳米乳剂未破乳上清,空白纳米乳剂未破乳沉淀,空白纳米乳剂破乳上清,空白纳米乳剂破乳沉淀,蛋白分子Marker、蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳剂未破乳上清,蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳剂未破乳沉淀,蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳剂破乳上清,蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳剂破乳沉淀、牛血清白蛋白水溶液。
10.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的免疫印迹分析其特异性图,
从左到右的顺序依次为牛血清白蛋白水溶液,蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳剂破乳沉淀,蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳剂破乳上清,蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳剂未破乳沉淀,蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳剂未破乳上清,蛋白分子预染Marker、空白纳米乳剂破乳沉淀、空白纳米乳剂破乳上清、空白纳米乳剂未破乳沉淀、空白纳米乳剂未破乳上清。
11.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳在体外抗腐蚀图,
从右到左的顺序依次为:条带1和2分别为牛血清白蛋白水溶液放入水中0.5h,1h,条带3和4分别为牛血清白蛋白水溶液放入人工胃液中0.5h,1h,条带5、6、7分别为蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳处方1水溶液放入人工胃液中0.5h、1h、3h,条带8、9、10分别为蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳处方2水溶液放入人工胃液中0.5h、1h、3h。
12.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳对正常小鼠口服后,IgG效价柱形图,
13.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳对正常小鼠口服后,IgG效价变化折线图。
具体实施方式
下面结合具体试验例中选择目前常用的两种比较标准蛋白质模型药物人和牛血清白蛋白、肌肉红蛋蛋白和胰岛素共4种蛋白质药物为本发明的纳米乳载药系统的药物有效成分;在实施例来用目前用的最多的蛋白质模型药物牛血清白蛋白为药物载体,进一步对阐述和证实蛋白质药物的新型纳米乳载药系统的有益效果。由于蛋白质药物种类繁多,不可能一一举例,因此并不意味着本发明仅仅限于此。
实施例:
实施例1:蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳载药系统(100g)
1)称取牛血清白蛋白5g、正丁醇5g、吐温-8030g、司盘-8010g、药用IPM 10g、蒸馏水39g.
2)将所述量的表面活性剂与牛血清白蛋白混匀,并在转速为50~100r/m恒温磁力搅拌器搅拌,温度在4℃下先让牛血清白蛋白部分溶解;
3)再加入所述量的助表面活性剂和溶剂让牛血清白蛋白完全溶解,得到澄清的溶液;
4)再加入所述量的油相和稳定剂1g甘露醇,25℃~37℃恒温水浴,并在转速为100~200r/m恒温磁力搅拌器搅拌,缓慢加入约70%处方量蒸馏水,得到澄清的溶液;5)最后再加入余量的蒸馏水,混匀,得到澄清透明的溶液。
6)最后用微孔滤膜过滤除菌,检测质量合格后,灌装、密封、保存。
制备的蛋白质药物牛血清白蛋白的纳米乳载药系统外观黄色、澄清透明、粒径在1~100nm间,12000rpm,10min高速离心后不分层,载药量为4.5%,包封率为93%,室温和4℃放置半年后,纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。
实施例2:蛋白质药物人血清白蛋白纳米乳载药系统
1)称取人血清白蛋白1g、甘油5g、吐温-8010g、司盘-805g、药用液体石蜡5g、生理盐水69g,备用;步骤2)、3)同实施例1相同;
4)再加入所述量的油相和稳定剂5g甘露醇,25℃~37℃恒温水浴,并在转速为100~200r/m恒温磁力搅拌器搅拌,缓慢加入蒸馏水,得到澄清的溶液;
5)最后再加入余量的蒸馏水,混匀,得到澄清透明的溶液。
6)最后用微孔滤膜过滤除菌,检测质量合格后,灌装、密封、保存。
制备的蛋白质药物人血清白蛋白的纳米乳载药系统外观澄清透明、粒径在1~100nm间,12000rpm,10min高速离心后不分层,载药量为1.9%,包封率为93%,室温和4℃放置半年后,纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。
实施例3蛋白质药物胰岛素纳米乳载药系统
1)称取胰岛素0.5g、无水乙醇5g、吐温-6010g、司盘-805g、色拉油5g、甘氨酸5g、蒸馏水69g,备用;步骤2)、3)、4)、5)、6)同实施例1相同。
制备的蛋白质药物胰岛素纳米乳载药系统外观澄清透明、粒径在1~100nm间,12000rpm,10min高速离心后不分层,载药量为0.49%,包封率为99%,室温和4℃放置半年后,纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。
实施例4蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳载药系统
1)称取牛血清白蛋白8g、丙二醇5g、吐温-6030g、司盘-6010g、GTCC 10g、pH6.80.01M磷酸盐缓冲液32g,备用;步骤2)、3)同实施例1相同;、
4)再加入所述量的油相和稳定剂5g丙氨酸,25℃~37℃恒温水浴,并在转速为100~200r/m恒温磁力搅拌器搅拌,缓慢加入蒸馏水,得到澄清的溶液;
5)最后再加入余量的磷酸盐缓冲液,混匀,得到澄清透明的溶液。
6)最后用微孔滤膜过滤除菌,检测质量合格后,灌装、密封、保存。
制备的蛋白质药物胰岛素纳米乳载药系统外观深黄色、澄清透明、粒径在1~100nm间,12000rpm,10min高速离心后不分层,载药量为7.2%,包封率为90%,室温和4℃放置半年后,纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。
实施例5:蛋白质模型药物人血清白蛋白纳米乳载药系统
1)称取人血清白蛋白4.5g、1,3丁二醇10g、EL3520g、司盘-8015g、GTCC10g、pH7.40.01M磷酸盐缓冲液37.5g,备用;步骤2)、3)同实施例1相同。
4)再加入所述量的油相和稳定剂3g甘氨酸,25℃恒温水浴,并在转速为100~200r/m恒温磁力搅拌器搅拌,缓慢加入蒸馏水,得到澄清的溶液;
5)最后再加入余量的磷酸盐缓冲液,混匀,得到澄清透明的溶液。
6)最后用微孔滤膜过滤除菌,检测质量合格后,灌装、密封、保存。
制备的蛋白质药物人血清白蛋白纳米乳载药系统外观澄清、透明、粒径在1~100nm间,12000rpm,10min高速离心后不分层,实际载药量4.1%,包封率91%,室温和4℃放置半年后,纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。
实施例6:蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳载药系统
1)称取牛血清白蛋白10g、1,3丁二醇5g、RH4027g、GTCC 3g、甘露醇10g、pH7.40.05M磷酸盐缓冲液45g,备用;步骤2)、3)、4)、5)、6)同实施例1相同。
制备的蛋白质药物牛血清白蛋白纳米乳载药系统外观深黄色、澄清、透明、粒径在1~100nm间,12000rpm,10min高速离心后不分层,载药量为9.1%,包封率为91%,室温和4℃放置三个月后,纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。
实施例7:蛋白质药物胰岛素蛋白纳米乳载药系统
1)称取胰岛素2g、甘油10g、EL3530g、液体石蜡15g、甘氨酸10g pH7.40.1M磷酸盐缓冲液33g,备用;步骤2)、3)、4)、5)、6)同实施例1相同。
制备的蛋白质药物牛血清白蛋白纳米乳载药系统外观澄清、透明、粒径在1~100nm间,12000rpm,10min高速离心后不分层,载药量为1.76%,包封率为88%,室温和4℃放置半年后,纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。
实施例8:蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳载药系统
1)称取牛血清白蛋白15g、甘油10g、EL3530g、乙酸乙酯10g、0.9%生理盐水35g,备用;步骤2)、3)、4)、5)、6)同实施例1相同。
制备的蛋白质药物牛血清白蛋白纳米乳载药系统外观深黄色、澄清、透明、粒径在1~100nm间,12000rpm,10min高速离心后不分层,载药量为13.8%,包封率为92%,室温和4℃放置三个月后,纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。
实施例9:蛋白质模型药物人血清白蛋白纳米乳载药系统
1)称取人血清白蛋白10g、甘油5g、RH-4030g、司盘-855g、色拉油15g、pH6.80.1M磷酸盐缓冲液30g,备用;步骤2)、3)、4)、5)、6)同实施例1相同。
制备的蛋白质药物人血清白蛋白纳米乳载药系统外观澄清、透明、粒径在1~100nm间,12000rpm,10min高速离心后不分层,载药量为8.7%,包封率为87%,室温和4℃放置三个月后,纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。
实施例10:蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳载药系统
1)称取牛血清白蛋白1g、无水乙醇10g、RH-4014g、司盘-605g、油酸乙酯5g、甘氨酸10g、蒸馏水55g,备用;步骤2)、3)、4)、5)、6)同实施例1相同。
制备的蛋白质药物牛血清白蛋白纳米乳载药系统外观澄清、透明,粒径在1~100nm间,12000rpm,10min高速离心后不分层,载药量为0.96%,包封率为96%,室温和4℃放置一年后,纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。
实施例11:蛋白质药物肌红蛋白纳米乳载药系统
1)称取肌红蛋白10g、正丁醇10g、吐温8020g RH-40 10g、司盘-80 5g、乙酸乙酯20g、丙氨酸1g、蒸馏水24g,备用;步骤2)、3)、4)、5)、6)同实施例1相同。
制备的蛋白质药物肌红蛋白纳米乳载药系统外观澄清、透明、粒径在1~100nm间,12000rpm,10min高速离心后不分层,载药量为4.25%,包封率为85%,室温和4℃放置一年后,纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。
实施例12:蛋白质药物肌红蛋白纳米乳载药系统
1)称取肌红蛋白5g、吐温8530g、司盘-8515g、IPM20g、蒸馏水30g,备用;步骤2)、3)、4)、5)、6)同实施例1相同。
制备的蛋白质药物肌红蛋白纳米乳载药系统外观澄清、透明、粒径在1~100nm间,12000rpm,10min高速离心后不分层,载药量为4.35%,包封率为87%,室温和4℃放置半年后,纳米乳无明显的絮凝、分层和药物析出。
实施例13:蛋白质药物肌红蛋白纳米乳载药系统
1)称取肌红蛋白1g、甘油5g、吐温8520g、EL3510g、司盘-855g、GTCC 15g、甘氨酸1g、蒸馏水43g,备用;步骤2)、3)、4)、5)、6)同实施例1相同。
制备的蛋白质药物人血清白蛋白的纳米乳载药系统外观澄清透明、粒径在1~100nm之间,12000rpm,10min高速离心后不分层,实际载药量4.5%,包封率92%,室温和4℃放置半年后,纳米乳不发生明显的絮凝、分层和药物析出。
实施例14:蛋白质模型药物人血清白蛋白纳米乳载药系统
1)称取人血清白蛋白5g、丙二醇10g、吐温6010g、吐温8015g、司盘-8515g、油酸乙酯15g、甘氨酸5g、甘露醇5g、蒸馏水20g,备用;步骤2)、3)、4)、5)、6)同实施例1相同
制备的蛋白质药物人血清白蛋白的纳米乳载药系统外观澄清透明、粒径在1~100nm之间,12000rpm,10min高速离心后不分层,实际载药量4.5%,包封率92%。室温和4℃放置半年后,纳米乳不发生明显的絮凝、分层和药物析出。
实施例15:蛋白质药物胰岛素蛋白纳米乳载药系统
1)称取胰岛素5g、吐温8510g、吐温8015g、司盘-8515g、液体石蜡10g、甘氨酸5g、甘露醇5g、蒸馏水35g,备用;步骤2)、3)、4)、5)、6)同实施例1相同
制备的蛋白质药物胰岛素纳米乳载药系统外观澄清透明、粒径在1~100nm之间,12000rpm,10min高速离心后不分层,实际载药量4.5%,包封率91%。
试验例:在以下的试验例,主要用标准蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳为蛋白质药物的代表进行证明本发明蛋白质药物的新型纳米乳载药系统及其制备方法所带来的效果。
试验材料与仪器设备
试验材料:牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,Fraction V,>98%),Sigma公司生产;吐温80、吐温85、吐温60、司盘80、司盘85、司盘60购至中国上海国药集团;BCA试剂盒,购至武汉博士德公司;聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH40)、聚氧乙烯蓖麻油(EL35),德国BASF公司生产,购至北京凤礼精求商贸有限责任公司;GTCC英国CRODA公司生产,购至北京凤礼精求商贸有限责任公司;乙酸乙酯、油酸乙酯均购至北京凤礼精求商贸有限责任公司。低分子蛋白Marker和预染蛋白Ladder Marker均购至Fermentas公司。
仪器设备:透射电镜(荷兰PHILIPS公司);NanoZS90Zeta电位及粒度分析仪(英国马尔文公司);SDS-PAGE电泳装置电泳仪(Mini-Protein III)、半干电转仪、酶标仪、洗板机均是BIO-RAD公司;ND-1000紫外分光光度计(美国NanoDrop公司)、药物稳定检测箱等国家免疫制剂技术工程研究中心现有仪器。
试验例1:蛋白质模型药物牛血清白蛋白的纳米乳制备及其理化性质检测
1.蛋白质模型药物牛血清白蛋白的纳米乳最优处方的筛选
油相的筛选:
选择IPM(C14)、色拉油(C17~22)、乙酸乙酯(C4)、油酸乙酯(C20)、GTCC(C18)、液体石蜡(C16~C20)等6种不同碳链长短的油,20℃黏度大小依次为液体石蜡(110~230mPas)、GTCC(25.0~33.0mPas)、色拉油(8.5mPas)、IPM(5~6mPas)、油酸乙酯(5.15mPas)、乙酸乙酯(0.449mPas)。分别取上述6种油适量,分别置具塞锥形瓶中,加入过量的牛血清白蛋白,4℃水浴,震摇24h到达平衡。用BCA法测定牛血清白蛋白在各种油相中的溶解度。
结果表明:IPM(C14)、色拉油、乙酸乙酯、油酸乙酯、GTCC、液体石蜡分别为0.35mg/g、0.15mg/g、0.14mg/g、0.13mg/g、0.12mg/g、0.08mg/g,在IPM的溶解度最大,为0.35mg/g。这可能与IPM的碳链长短与黏度有关,有利于药物在油相中的分布和溶解。因此,选择IPM作为蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的最优化油相。
表面活性剂和助表面活性剂的筛选:用筛选蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳油相的方法对表面活性剂吐温80、吐温85、吐温60、聚氧乙烯蓖麻油(EL35)、聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH40)和助表面活性剂(CoSF),即司盘80、司盘85、司盘60、以及乙醇、甘油、丙二醇的同样方法筛选牛血清白蛋白的饱和浓度。在用其较大浓度的表面活性剂和助表面活性剂,全面设计实验组,按9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9,(SF和CoSF的质量比),称取SF-CoSF,加入所选择的油相,涡旋震荡,滴加水,观察各组的变化,以离心(13,000rpm,30min)稳定性和乳滴粒径为主要的评价标准,从而确定出形成纳米乳的SF和CoSF。以表面活性剂/助表面活性剂(混合表面活性剂)、油相和去离子水作为等边三角形的3个顶点,绘制伪三元相图,相图每条边上的点分别表示相应两组分之间的比例关系,相图任意一点表示相应体系中各组分的质量百分含量。根据油、水、混合表面活性剂在临界点的质量分数,绘制伪三元相图,确定最大的纳米乳区。
纳米乳的评价标准评价标准为:制备的液体呈澄清透明或半透明;有蓝色乳光;高速离心(13000r/m,30min)离心后,稳定不分层;平行光入射后有丁达尔现象;通过透射电子显微镜和激光粒度仪,检测出乳滴在1~100nm之间。若制备的混合液体呈乳白色,平行光入射后有散射现象,则为乳剂;若澄清透明、稠厚,则为凝胶。同时在相转变过程还会产生液晶。利用液晶有折光存在,在偏光显微镜检测中,会出现明暗变化,所以往往用其来区分液晶和凝胶,如发亮为液晶,不发亮的凝胶。
对上述表面活性剂与助表面活性剂的溶解度测定结果是:牛血清白蛋白在吐温80、吐温85、聚氧乙烯蓖麻油(EL35)、聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH40)、司盘80、司盘85、正丁醇、丙二醇均有较大的溶解度(大于0.2mg/ml),符合可以制备纳米乳要求。但是根据其最大的伪三元相图区域,最终确定其表面活性剂与助表面活性剂互配较优组合为:吐温80/司盘80、吐温85/司盘85、RH40/丙二醇、EL35/丙二醇。
2.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳制备
根据序贯设计思想,以水、油、SF/CoSF为三相,采用滴定法绘制伪三元相图。选择离心(13,000rpm,30min)稳定,直径在1~100nm的纳米乳区为处方候选区。精确称取处方量的牛血清白蛋白,处方量的表面活性剂与助表面活性剂(表面活性剂与助表面活性剂为上述筛选出来的4种较优互配组合),处方量的油相,先加入大约70%的水溶液或缓冲液,搅拌均匀,最后逐步加入水或缓冲液,即得澄清透明的纳米乳液,部分结果见图1。从图1可看出,制备的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳外观淡黄色澄清透明液体。根据绘制伪三元相图的最终表明制备的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的最优化处方为:EL35∶丙二醇∶IPM(27%∶9%∶3%),牛血清白蛋白浓度4.5%和生理盐水56.5%,丙氨酸5%。以下性能检测如无表明处方均采用的该最优化处方。
3.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的形态
少量纳米乳适量,用水稀释100倍后,滴在覆有支持膜的铜网上,静止10min后用滤纸片吸干,再滴加2%磷钨酸(pH为7.4)溶液于铜网上负染3min,自然挥干,用透射电子显微镜观察并摄制照片,结果见图2。
结果表明,纳米乳在电镜下均呈圆球形,内部为油相,见图2从电镜下,随机选取不少于500个液滴测量粒径,得纳米乳液滴粒径范围在1~100nm,平均粒径为21.8nm。
4.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的溶液颜色
用蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳最优化处方制备的纳米乳液均为淡黄色澄清、均一、透明液体,根据《中国药典》(2005年版)II部附录IXA溶液颜色检查法,配制黄绿色调标准比色液。纳米乳液颜色与黄绿色调1号比色液相比,不得更深。
5.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的澄清度
根据《中国药典》(2005年版)II部附录IXB澄清度检查法下检查,为澄清的溶液。经蒸馏水稀释后,即出现明显的淡黄色的乳光。
6.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的粒径和粒度分布
取模型蛋白质药物牛血清白蛋白纳米乳适量,用适量蒸馏水稀释后用激光粒度测定仪进行测定,纳米乳的粒径与粒度分布见图3。测定结果图3表明,实验制备的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳平均粒径21.81nm。小于50nm的粒子占75%;小于60nm的粒子占90%,可见制得的纳米乳载药系统的粒径分布范围窄,粒径比较均匀。
7.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的理化性质检测
考察了空白纳米乳和模型蛋白质药物牛血清白蛋白纳米乳的黏度(旋转式黏度计)、折光率(25℃、阿贝折光仪)、电导率(电导率仪)、Zeta电位(电势显微电泳仪)。结果见表1。从表1结果表明,药物的加入使纳米乳的电导率增加,Zeta电位减小,而黏度和折光率无明显变化(p>0.05)。
表1纳米乳的理化性质测定n=3(x±s)
试验例2:蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的质量检测
1.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的载药量和包封率和测定
1)绘制标准曲线
①实验方法参照BCA蛋白试剂盒进行:根据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积试剂B配制适量BCA工作液,充分混匀。
②稀释标准品溶液:将冻干的标准品用0.9%NaCl稀释成2000ug/mL的储存液,让后0.9%NaCl用将其稀释成浓度分别为:0、25、125、250、500、750、1000、1500、2000ug/mL。分别取25u L的稀释不同浓度的标准品溶液的样品分别添加到96孔的微孔中。
③各孔加入200u L BCA工作液,充分混匀,盖上96孔板盖,37℃放置30min。
④用Nanodrop ND-1000C紫外分光光度计,选择562nm为测定波长,根据吸光度值与蛋白浓度之间的关系绘制标准曲线。
绘制的标准曲线方程,见图4,线性关系良好,标准曲线方程为Y=0.0008X+0.1637(R2=0.9951,线性方程范围25-1000ug/mL),具有较高的相关性和较宽的检测范围,因该检测方法此可用于BCA检测BSA的包封率和载药量。
2)蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳蛋白浓度的测定
称取制备好的模型蛋白质药物牛血清白蛋白纳米乳和空白的纳米乳各三份,每份1g(体积约1ml)。将其分别放置在无菌的3mlPE管中,用0.9%NaCl稀释稀释到牛血清白蛋白的理论值为250~500mg/ml,然后分别将稀释好的牛血清白蛋白直接用无水乙醇按照体积比为(1∶2)加入后,摇匀使其破乳后,高速离心(13000,30min),离心后取其上清和沉淀,其中沉淀用上清液体中相同的体积的0.9%NaCl进行稀释,用BCA法测定破乳前的上清液(C游上)和沉淀中的牛血清白蛋白的浓度(C游沉)、破乳后的上清液(C破上)和沉淀中的牛血清白蛋白的浓度(C破沉)。根据稀释倍数和体积量,各取25uL溶液,添加到96孔板中,用BSA标准试剂盒检测方法,测定其吸光度值,并将吸光度值代入标准曲线方程,分别计算出破乳前牛血清白蛋白的在上清液中的质量(M游上)和沉淀中的质量(M游沉)、破乳后的牛血清白蛋白在上清液(M破上)和沉淀中的牛血清白蛋白的质量(M破沉)。
载药量=[(M破沉)+(M破上)]/M总×100%。
包封率=[(M破沉)+(M破上)-(M游上)-(M游沉)]/[(M破沉)+(M破上)]×100%
其中M总为称取的纳米乳总质量。
试验测定三批纳米乳剂的载药量分别为:4.5%、4.3%、4.4%平均值为4.4%;包封率分别为98.3%、97.5%、93.5%,其平均值为96.4%。制备出的牛血清白蛋白具有较大的载药量,且包封率高达96.4%,完全符合纳米乳的质量要求,且解决了目前牛血清白蛋白的载药量和包封率低的最大问题。
2.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的稳定性检测
按照《中华人民共和国药典》2000年版附录197页相关规定进行,纳米乳稳定性试验分为加速稳定性试验及长期稳定性试验两部分。
加速稳定性试验:取蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳适量3份,分别放置在4℃、25℃、40℃、60℃条件下,分别于5、10、30、45、60、90d取样考察,首先对其外观是否发生明显絮凝、分层、沉淀、乳析、破乳等及载药量、包封率情况进行考察;分别将纳米乳样品适量装于离心管中,高速离心(13000,30min),用上述相同的指标观察进行考察。将纳米乳熔封于5ml安瓿瓶中,放置在自然光照射条件下,分别于1、3、7、10d取样,对其进行外观考察,观察是否有浑浊、破乳、分层等现象。
长期稳定性试验:取蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳适量3份,分别分别放置在4℃、25℃、40℃、60℃条件下,分别于30d、60d、90d、180d、360d取样考察对其进行外观考察,观察是否有浑浊、破乳、分层等现象。同时放置室温的30d、60d、180d、360d的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳和牛血清白蛋白水溶液的样品按照载药量和包封率检测制备的方法进行处理后的上清液用SDS-PAGE观察牛血清白蛋白降解情况。
见图5和图6,制备的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的外观无明显絮凝、分层、沉淀、乳析、破乳,且其载药量和包封率为发生明显的改变。这表明制备的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳具有良好的稳定性。从图6可看出,蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳在室温放置30、60、180、360d均有明显的一条带;而牛血清白蛋白的溶液在30和60d有明显一条带,且在60d的条带,蛋白质虽然为一条带,但浓度减少,表明蛋白质明显降解。从图6可看出,制备的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的稳定性得到较高的提高。
3.用电位及粒度分析仪检测蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的稳定性
取用蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳最优化处方制备的纳米乳适量,用适量蒸馏水稀释后用激光粒度测定仪,测定牛血清白蛋白的纳米乳在不同温度下的纳米乳的粒径,其粒径变化图,见图7和表2。从图7的不同温度下的纳米乳粒径图可看出,随着温度升高,蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的平均粒径增大,但是当温度大于80℃,其平均粒径小于30nm,当温度高于80℃,其平均粒径增大变化趋势非常明显,当温度到90℃,其平均粒径还是小于100nm。图7结果表明,蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳非常稳定,可以室温保存。
表2不同温度下的纳米乳粒径
取蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳适量,用适量蒸馏水稀释后用激光粒度测定仪,测定牛血清白蛋白的纳米乳在不同pH下的电位,其电位变化图,见图8。从不同pH下的电位图8可以看出,pH变化从1~13的过程,其电位均在-40mV~20mV之间,平均粒径在20~30nm。电位是纳米乳稳定性的重要指标,根据电位如在-40mV~40mV的范围内,制剂的质量非常稳定。由于牛血清白蛋白的纳米乳的所有不同pH的电位均在此范围内,因此结果表明,蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳非常稳定,同时其平均粒径在不同pH下的均为20~30nm。图7和图8结果充分表明,制备的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳质量非常稳定。
4.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳体外生物学活性分析
制备样品:分别将牛血清白蛋白水溶液、蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳、空白纳米乳和水溶液,除将0.9%NaCl换成0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液,其余均按照载药量和包封率检测制备的方法,牛血清白蛋白水溶液、蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳将稀释成终浓度为25ug/ml,空白纳米乳为不含牛血清白蛋白的相同体积,相同稀释倍数,相同处理方法的溶液。
ELISA反应检测的体外生物学活性:将所有样品,每孔加入200uL到96孔板中,每孔蛋白含量为5ug,包被酶标板,每孔加入1%脱脂奶粉,每孔100ul,4℃过夜。弃包被液PBST洗板5次。每孔加入200ul 1%BSA,37℃封闭2h,PBST洗5次后,加入稀释的从武汉博士德公司购买的小鼠BSA单克隆抗体(1∶1000),相应稀释倍数的阴性鼠血清及PBS各100ul,37℃温育30min,洗板5次。加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶10000)100uL,37℃温育30min,洗板5次。每孔加入100ul新鲜配制的底物液,室温避光显色10min。2mol/L H2SO4终止反应。酶标仪492nm下检测吸光度值(OD值)。均设复孔,结果取平均值。抗原反应性以实验孔OD值与阴性孔OD值比(P/N比值)表示,P/N>2.1则认为抗原反应阳性。用以下公式:生物学活性相对率={[破乳后上清的活性效价+破乳后沉淀的活性效价]*100/[牛血清白蛋白水溶液上清的活性效价+牛血清白蛋白水溶液沉淀的活性效价]。包封率={[破乳后上清的活性效价+破乳后沉淀的活性效价]-[未破乳后上清的活性效价+未破乳后沉淀的活性效价]}*100/[破乳后上清的活性效价+破乳后沉淀的活性效价]。
体外生物学活性结果,见表3,蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳具有较高的效价,虽然其效价低于牛血清白蛋白溶液。表3结果表明制备的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳在制备过程中,由于配方和生产工艺的影响,可以使极少的牛血清白蛋白的生物活性丧失,但丧失极低,仍旧至少有90%以上相对牛血清白蛋白溶液的生物学活性。同时,未破乳的纳米乳具有极低效价的结果表明,制备的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的溶液中,含有极少游离BSA。且破乳后效价明显高于未破乳,结果充分表明,制备的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳,已经包裹了极大部分的牛血清白蛋白,再次证实其包封率价高。用ELISA检测牛血清蛋白纳米乳包裹后仍具有较高效价,表明蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳制备后其生物活性免疫原性良好。同时从表2,还可以看出其包封率至少为90%,与用BCA法检测的牛血清白蛋白的包封率基本一致,再次证明制备的蛋白质模型药物蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳具有较高的包封率,同时还保留了较高的相对生物学活性,不仅可满足纳米乳剂的质量要求还解决了目前所有蛋白质药物的包封率低的缺陷。
表3蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳体外生物学活性结果n=3(x±s)
5.蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳体外完整性和特异性检测
样品的制备:分别将牛血清白蛋白水溶液、蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳、空白纳米乳和水溶液,除将0.9%NaCl换成水外,其余均按照载药量和包封率检测制备的方法,牛血清白蛋白水溶液、蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳将稀释成含牛血清白蛋白终浓度为1mg/ml,空白纳米乳为不含牛血清白蛋白的相同体积,相同稀释倍数,相同处理方法的溶液。
检测方法:SDS-PAGE电泳及Western blotting测定牛血清白蛋白中牛血清白蛋白的成份降解程度及抗原反应性,实验方法按《精编分子生物学实验指南》和文献[11]进行。
蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳体外完整性和特异性检测的结果,分别见图9,图10。图9从左到右的顺序依次为:空白纳米乳剂未破乳上清,空白纳米乳剂未破乳沉淀,空白纳米乳剂破乳上清,空白纳米乳剂破乳沉淀,蛋白分子Marker、蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳剂未破乳上清,蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳剂未破乳沉淀,蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳剂破乳上清,蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳剂破乳沉淀、牛血清白蛋白水溶液。图10的从右到左的条带顺序和图9的一致。
从图9的SDS-PAGE电泳图可以看出,制备的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳和破乳后牛血清白蛋白溶液上清液均只有一条带,其蛋白条带在蛋白质分子量为67KD位置,这充分表明制备的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳后,其完整性未遭到明显破坏。破乳后的牛血清白蛋白沉淀中有极暗的条带,说明破乳后,纳米乳的表面活性剂、助表面活性剂对牛血清白蛋白有部分沉淀作用。但是牛血清白蛋白在水溶液和破乳的牛血清白蛋白中主要集中在上清液中。图9结果表明,制备的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳体外完整性良好。从图10特异性检测结果,蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳和破乳后牛血清白蛋白溶液上清液在预染蛋白分子Marker 67KD位置具有明显的条带,说明制备的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的特异性良好。图9和图10空白水溶液和空白的纳米乳溶液中无论破乳和未破乳的上清和沉淀中均无蛋白条带,说明用SDS-PAGE和免疫印迹方法检测体外完整性和特异性检测无干扰。
6.体外人工胃液和人工肠液对纳米乳的降解作用
样品的制备:同蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳体外完整性和特异性检测。人工胃液的制备参照,用中国药典(2005)第二版进行。处方1为蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳为用蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳最优化处方制备的纳米乳,处方2为:RH40、丙二醇、GTCC(30%∶10%∶10%)、牛血清白蛋白4.5%和0.05M pH6.8磷酸盐缓冲液45.5%。最后将处方1和处方2用蒸馏水稀释成含牛血清白蛋白45mg/ml的纳米乳。
检测方法:参照文献[29]和蛋白质药物纳米乳体外完整性和特异性检测。
试验方法:称取1ml的4.5%两个不同蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳处方1和处方2和相同浓度的牛血清白蛋白水溶液,置于3ml人工胃液中混匀。37℃分别放置0.5h、1h、3h后将混合液置于5mL中,按1∶2体积比立即加入胃酸中和液,后按照其余均按照载药量和包封率检测制备的方法处理样品,装入离心管中12,000rpm,30min离心,分别取上清液,用SDS-PAGE观察其降解情况。对照取1ml相同浓度的牛血清白蛋白水溶液放置在3ml人工胃液和水溶液中混匀,放置37℃分别放置0.5h、1h后,用牛血清白蛋白相同的处理方法进行处理样品,装入心管中12,000rpm,30min离心,分别取上清液,最终将牛血清白蛋白浓度调整为0.1%,在用SDS-PAGE观察其降解情况。
体外人工胃液对纳米乳的降解作用见图11。从图11右到左的顺序依次为:条带1和2分别为牛血清白蛋白水溶液放入水中0.5h,1h,条带3和4分别为牛血清白蛋白水溶液放入人工胃液中0.5h,1h,条带5、6、7分别为蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳处方1水溶液放入人工胃液中0.5h、1h、3h,条带8、9、10分别为蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳处方2水溶液放入人工胃液中0.5h、1h、3h。从图11可以看出,牛血清白蛋白在除去条带3和4无明显条带,表明牛血清白蛋白已明显完全降解,而制备的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳处方1和2在人工胃液中放入0.5h、1h、3h仍有明显的一条带,表明蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳中的牛血清白蛋白未降解,这表明,制备的牛血清白蛋白对人工胃液具有明显的抗腐蚀作用。同时条带1和2有明显一条带,表明牛血清白蛋白对温度37℃放置时间关系不大。
试验例3:蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的安全性评价
1.小鼠急性毒性评价
取体重18-22g、3~4周,雌雄各半昆明小鼠20只,随机分成2组,每组10只。每组分别用为用蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳最优化处方制备的纳米乳和同处方的空白纳米乳。每只灌胃药液0.5ml(2250mg/kg),连续给药7d,给药后观察7d,自由饮水和进食,记录各组动物给药后的症状、体征及其死亡数目和时间,记录其死亡数,根据用Bliss法计算LD50软件程序(华西医科大学编制)进行处理。毒性测定结果是,连续给药7d后,小鼠均无死亡,最大耐受量均为2625mg/kg。是人临床剂量的10500倍,结果属于无毒性药物。结果表明制备蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳安全。
2.体外细胞毒性评价
试验参照标准和分组:细胞毒性试验采用参照中国国家标准GB/T1688615-1997“医疗器械生物学评价第五部分:细胞毒性试验体外法”进行的MTT比色法。细胞毒试验用小鼠GES细胞。试验分为5组,每组重复3次,即:正常对照组、空白阴性PBS组、空白纳米乳组和蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳组,阳性对照组(二甲基亚砜)。
试验方法:取对数生长期的细胞悬液,分别以1.5×105个/L的密度接种于96孔培养板,每孔200μL,置于37℃、5%CO2培养,每隔4h用倒置显微镜观察细胞形态。待细胞长至80%融合,每组加入相同体积100μL的溶液,空白阴性PBS组加无菌的PBS,阳性对照组加入二甲基亚砜微孔滤膜除菌的原液,正常对照组加培养液,空白纳米乳组和蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳组,分别加已微孔滤膜除菌的原液,每个样品3个平行。继续观察至48h后,将培养的96孔板细胞,每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL,37℃继续孵育4h,小心吸弃孔内培养基上清液,每孔加入150μLDMSO,振荡10min,使结晶物充分溶解,酶标仪上490nm波长处测定各孔OD值。根据测定的吸光度值计算其相对的增殖度(RGR)。RGR(%)=(试样组吸光度值-空白对照组吸光度值)/(正常对照组光度值-空白对照组吸光度值)×100%。根据细胞相对增殖度,将纳米乳的毒性反应分级:0级:RGR≥100;1级:75≤RGR<100;2级:50≤RGR<75;3级:25≤RGR<50;4级:1<RGR<25;5级:RGR=0。结果为0或1级反应,为合格;结果为2级反应,应结合细胞形态分析综合评价;结果为3~5级反应,为不合格。
蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳原液在48小时细胞毒性的吸光度值为0.85±0.03,空白纳米乳剂为0.89±0.13。用纳米乳剂的毒性标准判断,制备的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳和空白纳米乳的细胞毒性均属于1级,为无明显的毒性作用,符合纳米乳质量要求。
试验例4:蛋白质模型药物牛血清白纳米乳对正常小鼠口服免疫后的血清中Ig G效价检测
免疫程序、检测方法和给药剂量:参照文献[30]中试验方法和试验结果。
试验分组:蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳、牛血清白蛋白水溶液、空白纳米乳、PBS溶液组、正常组共5组。
试验方法:雌性BABL/C小鼠25只,3~4周龄,随机分为5组,每组5只。试验前,所有动物禁食禁水过夜,每组动物灌胃酸中和液0.4ml。灌胃酸中和液0.5h后,灌胃给含牛血清白蛋白为500ug/只剂量的牛血清白蛋白溶液和蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳,空白纳米乳组灌胃给灌与蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳相同稀释倍数的相同体积的空白纳米乳溶液,PBS组灌与牛血清白蛋白相同体积的PBS。连续给药3天。给药后第3周至11周,每2周定期小鼠尾部取血,分离血清100倍稀释后,用检测的体外生物学活性的ELISA法检测血清IgG效价。
试验结果,当小鼠免疫牛血清白蛋白后,小鼠血清中IgG效价柱形图和效价变化折线图,见图12和图13。从图12中可以看出,制备的蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳比牛血清白蛋白水溶液对正常小鼠口服免疫后产生血清中IgG的效价高。从图13可看出,蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳比牛血清白蛋白水溶液给正常小鼠口服免疫后在一定时间段内随着时间的变化,逐渐升高。但是纳米乳比牛血清的纳米乳效价明显变高,这充分说明蛋白质模型药物牛血清白蛋白纳米乳的吸收增强,可以使其血清中IgG效价升高,且维持效价的时间明显变长。
参考文献:
[1]胡凯莉.乳铁蛋白修饰生物可降解纳米粒的脑内递药研究,复旦大学,2009年博士论文:1-182
[2]张慧芳.白蛋白基生物高分子载体的制备及其性能研究,西北师范大学,2009年硕士论文:1-98
[3]薛璇.新型pH敏感水凝胶应用于蛋白类药物口服给药的研究,天津大学,2008年硕士论文:1-66
[4]王黎.基于多囊脂质体技术的蛋白质类药物缓释传递系统的研究,2007年重庆大学硕士论文:1-79
[5]Byung Soo Kim.BSA-FITC-loaded microcapsules for in vivo delivery,Biomaterials,2009(30):902-909
[6]Yunqing Kang,The preparation of BSA-PLLA microparticles in a batch supercritical anti-solvent process,Carbohydrate Polymers 77(2009)244-249
[7]Marcilene M.A.Preparation,characterizationand in vitro cytotoxicityof BSA-based nanospheres containing nanosized magneticparticles and/orphotosensitizer Journal of Magnetism and Magnetic Materials 321(2009)1600-1603
[8]Yujun Wang.Adsorption of bovin serum albumin(BSA)onto the magnetic chitosan nanoparticlesprepared by a microemulsion system,Bioresource Technology,2008(99):3881-3884
[9]J.C.Gayet C.Ga.High water content BSA-PEG hydrogel for controlled release device:Evaluation of the drug release propertiesyet,Journal of Controlled Release 38(1996)177-184
[10]Tse-Ying Liu.On the study of BSA-loaded calcium-deficient hydroxyapatite nano-carriers forcontrolled drug delivery,Journal of Controlled Release 107(2005)112-121
[11]M.Igartua.Stability of BSA encapsulated into PLGA microspheres using PAGE and capillary electrophoresis,International Journal of Pharmaceutics 169(1998)45-54
[12]曹金娜.N-三甲基壳聚糖包覆牛血清白蛋白脂质体的制备及质量影响因素研究,中国药房,2009,20(10):764-767
[13]夏洪男.采用S/W/O/法制备BSA,PLG微球,吉林大学学报(理学版),2009,47(5):1086-1090
[14]黄婉丹.BSA-PLGA缓释微球的制备及优化条件的探索,解剖学研究,2008,30(4):241-244
[15]张良珂.牛血清白蛋白从不同果胶凝胶微丸中的释放,中国药学杂志,2008,43(18):1407-1411
[16]梁晓晖.肝靶向牛血清白蛋白脂质体的制备及理化性质研究,南京医科大学学报(自然科学版),2008,10:1229-1233
[17]孟慧.人血清白蛋白注射用凝胶的处方工艺研究,药学实践杂志,2009,27(4):254-258
[18]刘世芸.白蛋白聚乳酸缓释微球的制备及体外释放研究.合肥工业大学学报(自然科学版).2006,29(12):1584-1587
[19]Ge W,Hu PZ,Huang Y,et al.The antitumor immune responses induced by nanoemulsion-encapsulated MAGE1-HSP70/SEA complex protein vaccine following different administration routes[J].Oncol Rep.2009,22(4):915-920.
[20]Ge W,Li Y,Li ZS et al.The antitumor immune responses induced by nanoemulsion-encapsulatedMAGE1-HSP70/SEA complex protein vaccine following peroral administration route[J].Cancer Immunol Immunother.2009,58(2):201-208
[21]Paul E.Makidon,Shraddha S,Anna U.Bielinska.Characterization of Stability and Nasal Delivery Systems for Immunization with Nanoemulsion-Based Vaccines[J].Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery,doi:10.108/jamp.2009.0766
[22]Bielinska AU,Janczak KW,Landers JJ,et al.Nasal immunization with a recombinant HIV gp120and nanoemulsion adjuvant produces Th1polarized responses and neutralizing antibodies to primary HIV type 1isolates[J].AIDS Res Hum Retroviruses,2008,24(2):271-281
[23]Makidon PE,Bielinska AU,Nigavekar SS,et al.Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine[J].PLoS One,2008,3(8):2954
[24]葛伟,孙玉静,李源,等.NE(MHS)纳米乳剂疫苗的抗肿瘤免疫学效应研究[J].细胞与分子免疫学杂志,2008,25(5):457-460
[25]Anna U.Bielinska.Mucosal Immunization with a Novel Nanoemulsion-Based Recombinant Anthrax Protective Antigen Vaccine Protects against Bacillus anthracis Spore Challenge,INFECTION ANDIMMUNITY,Aug.2007,4020-4029
[26]孙玉静,隋延仿,等.肿瘤特异性抗原纳米乳剂的制备及抗肿瘤免疫效应[J].中国药理学通报,2005,21(3):288-291.
[27]师瑞.胃癌特异性纳米疫苗的制备及其生物学活性的研究[D].第四军医大学硕士学位论文,2005.
[28]Tarek Hamoudal.A novel surfactant nanoemulsion with a unique non-irritant topical antimicrobial activity against bacteria,enveloped viruses and fungi.Microbiol.Res.(2001)156,1-7
[29]M.Igartua.Stability of BSA encapsulated into PLGA microspheres using PAGE and capillaryelectrophoresis,International Journal of Pharmaceutics,169(1998)45-54
[30]I.Gutierro.Influence of dose and immunization route oa the serum IgG antibody response to BSA loaded PLGA microspheres,Vaccine,Vaccine 20(2002)2181-2190
在发明中提及的所有参考文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样,无需进一步详细阐述,相信采用前面所公开的内容,本领域技术人员可最大限度地应用,这些等价形式除纳米乳参考文献外的蛋白质药物制剂稳定性、药物载药量、包封率、制备工艺和有机溶剂残留方面均不可能同时到达本申请所附权利要求书所限定的范围。此外,前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明,而非以任何方式限制本发明的范围。
致谢:本发明中的牛血清白蛋白纳米乳载药系统粒径和电位检测由英国马尔文上海实验室用Nano ZS90Zeta电位及粒度分析仪免费检测。
Claims (10)
1.一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统,其载药系统组合特征在于:0.1%~15%的蛋白质药物、10%~30%的表面活性剂、5%~25%的助表面活性剂、3%~20%的油相、0%~10%的稳定剂,20%~70%的水相;所述表面活性剂为聚山梨酯或聚氧乙烯脂肪酸酯,助表面活性剂为失水山梨醇脂肪酸酯或者C2~C4的一元醇或多元醇,所述油相为食用药用液体石蜡、食用色拉油或有机酸酯,所述水相为蒸馏水,等渗的生理盐水、pH为6.5~7.5磷酸盐缓冲液中的一种或几种,所述稳定剂为甘露醇、甘氨酸和丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统,所述的蛋白质药物包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、胰岛素、肌红蛋白,或者水溶性或难溶性蛋白质类似药物,所述蛋白质药物浓度范围:牛血清白蛋白:1~10%;胰岛素:1~5%;肌红蛋白1~10%;人血清白蛋白:1~10%。
3.根据权利要求1所述的一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统,所述表面活性剂为:聚山梨酯为吐温-80、吐温-85、吐温60中的一种或几种,聚氧乙烯脂肪酸酯为聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油中任一种或其组合;其有效量分别为吐温-80:10~30%、吐温-85:10~30%、吐温60:5~30%、聚氧乙烯氢化蓖麻油:10~30%、聚氧乙烯蓖麻油:10~30%。
4.根据权利要求2所述的一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统,所述助表面活性剂为:失水山梨醇脂肪酸酯是司盘85、司盘80和司盘60中的任一种及一种以上组合;C2~C4的一元醇或多元醇为无水乙醇、正丁醇、甘油、1,3-丁二醇、1,3-丙二醇中的任一种;其有效量分别为司盘-85:5~15%、司盘80:5~15%、司盘60:5~10%;无水乙醇:5~10%;甘油:5~10%;1,3-丙二醇:5~10%;1,3-丁二醇:5~10%,正丁醇:5~10%。
5.根据权利要求3所述的一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统,表面活性剂与助表面活性剂的互配组合为吐温80/司盘80、吐温85/司盘85、聚氧乙烯氢化蓖麻油/丙二醇、聚氧乙烯蓖麻油/丙二醇。
6.根据权利要求1~4任一所述的一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统,所述的有机酸酯是IPM、油酸乙酯、乙酸乙酯、GTCC中的任一种,其中油相的有效量分别为IPM:10~20%、油酸乙酯:5~20%、乙酸乙酯:10~20%、GTCC:3~15%、药用液体石蜡:5~15%、食用色拉油:5~15%;所述稳定剂的有效量分别为:甘露醇:1~10%、甘氨酸:1~10%、丙氨酸:1~10%。
7.根据权利要求6所述的一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统,蛋白质模型药物牛血清白蛋白4.5%、聚氧乙烯蓖麻油27%、丙二醇9%、肉豆蔻酸异丙酯3%、等渗的生理盐水56.5%,丙氨酸5%。
8.根据权利要求1~7任一所述的一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统,用水或缓冲液无限稀释,粒径在1~100nm范围。
9.权利要求1~7任一所述的一种蛋白质药物的新型纳米乳载药系统的制备方法,具体包括下列步骤:
1)按配方称取蛋白质药物、表面活性剂、助表面活性剂、油相、稳定剂、水相备用;
2)将所述量的表面活性剂与蛋白质药物混匀且使蛋白质药物部分溶解;
3)再加入所述量的助表面活性剂让蛋白质药物在4℃下完全溶解,得到澄清的溶液;
4)再加入所述量的油相和稳定剂,搅拌下缓慢加入处方量70%水相,得到澄清的溶液;
5)最后再加入余量水相,混匀,得到澄清透明的纳米乳。
10.根据权利要求9所述的制备方法,所述步骤(2)的混匀为4℃下,转速为50~100r/m;所述步骤(4)中的搅拌是25℃~37℃下恒温水浴,转速为100~200r/m;所述制备方法中还包括纳米乳的除菌、检测和包装步骤,所述除菌为用0.2μm微孔滤膜过滤。
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102258486A (zh) * | 2011-07-04 | 2011-11-30 | 中国人民解放军63975部队 | 一种相思子蛋白纳米粒及其制备方法 |
CN106924730A (zh) * | 2017-02-14 | 2017-07-07 | 商丘美兰生物工程有限公司 | 猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗及其制备方法 |
CN113545996A (zh) * | 2020-02-29 | 2021-10-26 | 西安曼特思生物科技有限公司 | 一种可固定目标物并可按需清除的蛋白质产品 |
CN113952301A (zh) * | 2021-11-17 | 2022-01-21 | 胡振华 | 中链脂肪酸作为促吸收剂制备药物组合物乳剂的应用 |
CN115317448A (zh) * | 2022-09-05 | 2022-11-11 | 贵州医科大学 | 一种用于负载挥发油类药物的纳米乳剂及其制备方法 |
CN116813458A (zh) * | 2023-06-26 | 2023-09-29 | 广东省科学院生物与医学工程研究所 | 一种提高牛血清白蛋白共聚物负载性能的方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101422431A (zh) * | 2007-12-28 | 2009-05-06 | 上海医药工业研究院 | 胰岛素经鼻给药制剂 |
CN101428009A (zh) * | 2008-04-09 | 2009-05-13 | 上海医药工业研究院 | 胰岛素经鼻吸入粉雾剂 |
-
2010
- 2010-09-26 CN CN2010102920857A patent/CN101961314B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101422431A (zh) * | 2007-12-28 | 2009-05-06 | 上海医药工业研究院 | 胰岛素经鼻给药制剂 |
CN101428009A (zh) * | 2008-04-09 | 2009-05-13 | 上海医药工业研究院 | 胰岛素经鼻吸入粉雾剂 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 20090315 王建磊 微乳液、囊泡体系的制备及其在胰岛素制剂中的应用 第1-53页 1-10 , 第3期 2 * |
《精细化工》 20060930 王建磊等 胰岛素W/O型微乳液的制备及体外释药性能 867-872 1-10 第23卷, 第09期 2 * |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102258486A (zh) * | 2011-07-04 | 2011-11-30 | 中国人民解放军63975部队 | 一种相思子蛋白纳米粒及其制备方法 |
CN106924730A (zh) * | 2017-02-14 | 2017-07-07 | 商丘美兰生物工程有限公司 | 猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗及其制备方法 |
CN106924730B (zh) * | 2017-02-14 | 2019-11-08 | 商丘美兰生物工程有限公司 | 猪伪狂犬病毒芦荟胶纳米乳佐剂灭活苗及其制备方法 |
CN113545996A (zh) * | 2020-02-29 | 2021-10-26 | 西安曼特思生物科技有限公司 | 一种可固定目标物并可按需清除的蛋白质产品 |
CN113545996B (zh) * | 2020-02-29 | 2023-11-17 | 西安曼特思生物科技有限公司 | 一种可固定目标物并可按需清除的蛋白质产品 |
CN113952301A (zh) * | 2021-11-17 | 2022-01-21 | 胡振华 | 中链脂肪酸作为促吸收剂制备药物组合物乳剂的应用 |
CN115317448A (zh) * | 2022-09-05 | 2022-11-11 | 贵州医科大学 | 一种用于负载挥发油类药物的纳米乳剂及其制备方法 |
CN115317448B (zh) * | 2022-09-05 | 2024-03-15 | 贵州医科大学 | 一种用于负载挥发油类药物的纳米乳剂及其制备方法 |
CN116813458A (zh) * | 2023-06-26 | 2023-09-29 | 广东省科学院生物与医学工程研究所 | 一种提高牛血清白蛋白共聚物负载性能的方法 |
CN116813458B (zh) * | 2023-06-26 | 2024-06-14 | 广东省科学院生物与医学工程研究所 | 一种提高牛血清白蛋白共聚物负载性能的方法 |
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