CN110035770A

CN110035770A - 新方法

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Publication number: CN110035770A
Application number: CN201780074868.8A
Authority: CN
Inventors: P.卡拉; V.M.R.亨德里克斯; V.M.德库佩雷; C.B.G.德克泽尔
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2016-12-07
Filing date: 2017-12-05
Publication date: 2019-07-19
Anticipated expiration: 2037-12-05
Also published as: BE1025160B1; WO2018104313A1; JP7136777B2; MX2019006728A; JP2020500891A; BE1025160A1; CA3045952A1; CN110035770B; US20200061186A1; EP3551222A1; BR112019011286A2; US10695424B2

Abstract

本发明提供了组合物、方法和过程，其用于包含脂质、甾醇和皂苷的亚微米脂质体组合物的熟化。

Description

新方法

技术领域

本发明涉及用于生产含有皂苷的脂质体组合物，特别是这种组合物的过滤的改进方法。

发明背景

在过去几十年中，脂质体(也被称为双层脂质囊泡)越来越多地用来包封(encapsulate)和递送药物化合物。脂质体包含一个或多个脂质(诸如磷脂)双层，并且在其结构中可以含有其它分子，例如蛋白质或碳水化合物。脂质体上的脂质层限制和保护所包封(enclosed)的药物化合物直至脂质体到达其目的地并粘附到靶细胞的外膜。通过该过程，对健康细胞的药物毒性被最小化并可增加治疗效力。由于在其结构中存在脂质和水相，除两亲性化合物外，脂质体还可用于包封或包载(entrapment)水溶性和脂溶性物质。

脂质体可用于佐剂组合物的配制中的疫苗/免疫原性组合物中。由于这些佐剂组合物通常经胃肠外施用给人，因此希望这些是无菌的。用作佐剂的脂质体通常是亚微米脂质体，并且足够小以通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。本发明的一个目的是提供用于亚微米脂质体的改进的过滤的方法。

发明概述

本发明人使用涉及使亚微米脂质体制剂熟化的方法改进了含有皂苷的亚微米脂质体的过滤。因此，本发明提供了制备在亚微米脂质体制剂中包含皂苷的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.制备第一亚微米脂质体制剂，其中脂质体含有脂质和甾醇，

b.将皂苷加入第一亚微米脂质体制剂中，

c.使含有皂苷的亚微米脂质体制剂熟化至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16小时，和，

d.通过无菌级过滤器过滤步骤c.的熟化的含有皂苷的亚微米脂质体制剂。

在另一方面，本发明提供了制备在亚微米脂质体制剂中包含皂苷的脂质体组合物的方法，其中脂质体含有脂质和甾醇，所述方法包括以下步骤：

a)使含有皂苷的亚微米脂质体制剂熟化至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、或至少16小时，其中脂质体含有脂质和甾醇，和，

b)通过无菌级过滤器过滤步骤a)的熟化的含有皂苷的亚微米脂质体制剂。

在另一方面，本发明提供了制备疫苗组合物的方法，所述方法包括根据本文所述的方法制备脂质体组合物，其中在该方法的步骤d.的过滤之前或之后将脂质体组合物与抗原组合。

一种用于制备疫苗试剂盒的方法，所述方法包括根据本文所述的方法制备脂质体组合物和将脂质体组合物包装进试剂盒中作为抗原试剂盒组分之外的试剂盒组分。

附图的描述

图1：图解了实施例2和3的含有皂苷的脂质体制剂的配制的流程图。

图2：图解了使用不同的过滤器过滤前Vmax与时间函数的关系： Sartopore20.45/02； Sartopore2 0.35/0.2； Sartopore2 0.8/0.2； Pall EKV；Pall EDF。

图3：图解了在实施例3的不同熟化时间，含有皂苷的脂质体制剂批次1(A)和批次2(B)的粒径(nm)的演变。

图4：图解了在实施例3的不同熟化时间，含有皂苷的脂质体制剂批次1(A)和批次2(B)的PDI的演变。

图5：图解了在实施例3的不同熟化时间，含有皂苷的脂质体制剂批次1(A)和批次2(B)在三个不同批次的过滤器上的Vmax。

图6：图解了在实施例3的不同熟化时间，含有皂苷的脂质体制剂批次1(A)和批次2(B)在三个不同批次的过滤器上过滤之前和之后的胆固醇含量(μg/ml)。

发明详述

脂质体，特别是亚微米脂质体可用于免疫佐剂的配制中。包含所述脂质体与一种或多种抗原的组合的疫苗组合物通常肠胃外施用，因此脂质体组合物合乎需要地是无菌的。本发明人令人惊讶地显示，熟化步骤(如下一部分所定义)解决/避免了脂质体过滤中的问题，例如过滤器的堵塞。

因此，本发明提供了制备在亚微米脂质体制剂中包含皂苷的组合物的方法，其中脂质体含有脂质和甾醇，所述方法包括以下步骤：

b.将皂苷加入第一亚微米脂质体制剂中，

c.使含有皂苷的亚微米脂质体制剂熟化至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或至少16小时，和，

熟化

“熟化(maturation)”或“熟化(maturing)”是指在将皂苷加入第一亚微米脂质体组合物后将含有皂苷的亚微米脂质体组合物储存至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或至少16小时。在一个实施方案中，熟化持续至少4小时，至少6小时或至少8小时。在一个实施方案中，将应用或进行熟化不长于36小时，不长于48小时，或不长于24小时。在另一个实施方案中，应用熟化4-24小时的时间。在进一步的实施方案中，应用或进行熟化16-24小时。熟化可以在任何合适的容器中进行。在一个实施方案中，在不搅拌制剂的情况下进行熟化。在制剂经历一个或多个熟化(maturation)或熟化(maturing)步骤后，可将其描述为“熟化的”。

熟化在任何合适的温度下进行。通常，熟化在室温下，在15-30℃的温度下，或在15-25℃的温度下进行。或者，熟化在约18、19、20、21、22、23、24、25、26或27℃下进行。

在一个实施方案中，熟化在15-25℃的温度下进行8-24小时的时段。

灭菌

“无菌级过滤器”是指在大于或等于1×10 ⁷/cm²的有效过滤面积的攻击水平下被微生物攻击后产生无菌流出物的过滤器。无菌级过滤器对于本发明领域的技术人员来说是公知的，并且通常具有约0.2μm的孔径，并因此包括孔径为约0.22μm的过滤器。出于本发明的目的，无菌级过滤器的孔径为0.1-0.25μm，例如0.18-0.22μm。

无菌级过滤器的膜可以由技术人员已知的任何合适的材料制成，例如但不限于乙酸纤维素、聚醚砜(PES)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)等。在本发明的一个特定实施方案中，本发明的一种或多种或所有过滤膜包含聚醚砜(PES)，特别是亲水性聚醚砜。在本发明的一个特定实施方案中，本文所述方法中使用的过滤器是双层过滤器，特别是具有内置预过滤器的无菌过滤器，所述内置预过滤器具有比末端过滤器的孔径更大的孔径。在一个实施方案中，消毒过滤器是双层过滤器，其中预过滤膜层的孔径为0.3-0.5μm，例如0.35或0.45μm。根据进一步的实施方案，过滤器包含不对称过滤膜（多张），例如不对称亲水性PES过滤膜（多张）。或者，消毒过滤层可以由PVDF制成，例如与不对称亲水性PES预过滤膜层组合。

脂质体

术语“脂质体”是本领域众所周知的并定义一般类别的囊泡，其包含一个或多个围绕水空间的脂质双层。因此脂质体由一种或多种脂质，例如磷脂双层组成，并且在其结构中可以含有其它分子，例如蛋白质或碳水化合物。因为存在脂质和水相，脂质体可以包封或包载水溶性物质、脂溶性物质和/或两亲性化合物。意图用于本发明的脂质体含有大量(脂质体形成)脂质。脂质体形成脂质是本领域可获得的，并且可以是阴离子、阳离子或中性脂质。在一个实施方案中，脂质体形成脂质部分基本上由中性脂质组成。“中性脂质”应理解为脂质的总净电荷为(大约)零。因此，脂质可以是总体上非离子的或者可以是两性离子的。在一个实施方案中，脂质体包含两性离子的脂质。合适的脂质的实例是磷脂，例如磷脂酰胆碱类。在一个实施方案中，脂质体含有磷脂酰胆碱作为脂质体形成脂质，其在室温下合适地是非结晶的。这种非结晶磷脂酰胆碱脂质的实例包括蛋黄磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)或二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)。在一个特定实施方案中，本发明的脂质体含有DOPC或基本上由DOPC组成。

脂质体还可以含有有限量的带电荷的脂质，其增加由饱和脂质组成的脂质体，例如由DLPC组成的脂质体的脂质体-皂苷结构的稳定性。在这些情况中，带电荷的脂质的量合适地为脂质体组合物的1-20% w/w，优选5-10% w/w。这种带电荷的脂质的合适的实例包括脂肪酸，例如月桂酸，或者磷脂酰甘油和磷脂酰丝氨酸。合适地，中性脂质体将含有小于5％w/w的带电荷的脂质，例如小于3％w/w或小于1％w/w。在一个特定实施方案中，脂质体由DLPC和月桂酸组成，例如DLPC：月桂酸的比率为3.5:1至4.5:1，例如约4:1。

意图用于本发明的脂质体还包含甾醇。合适的甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、麦角钙化醇和胆固醇。在一个特定实施方案中，脂质体包含胆固醇作为甾醇。这些甾醇是本领域众所周知的，例如在Merck Index, 第11版, 第341页中将胆固醇公开为在动物脂肪中发现的天然存在的甾醇。甾醇与脂质的比率通常为1:100至1:2(mol/mol)，合适地为1:5至1:4，或约1:4。

在一个特定实施方案中，本发明的脂质体包含1:4比率的DOPC和胆固醇(胆固醇:DOPC)。

Z-平均直径(ZAD)和多分散性指数(PDI)基于通过动态光散射(DLS)获得的数据确定。单色和相干激光束照射用于粒径分析的以合适的浓度分散在液体中的代表性样品。处于给定角度的颗粒散射的光由检测器(雪崩光电二极管)记录，其输出被馈送到相关器。由于分散的颗粒处于连续的布朗运动中，观察到的散射强度沿时间轴波动。因此，作为这些强度波动的时间的函数的分析提供了关于分散的颗粒的运动的信息。在DLS实验中，使用相关器进行时间分析，该相关器构成散射强度的时间自相关函数。衰变速率与颗粒的平移扩散系数D有关。通过所谓的累积量法，以平均粒径和多分散性指数的方式来解释这种衰变。

对于分散在粘度η的介质中的非相互作用的球形颗粒，扩散系数D通过斯托克斯-爱因斯坦方程(Stokes-Einstein equation)与颗粒流体力学直径dH相关:

其中

k是玻尔兹曼常数，

T绝对温度

η 介质的粘度。

累积量法是分析DLS实验产生的自相关函数的简单方法。计算在ISO 13321和ISO22412中定义。在实践中使用该力矩扩展的前两个项，即尺寸的平均值(z-平均尺寸或z-平均均值或z-平均直径)，以及称为多分散性指数(PDI)的宽度参数。

Z-平均尺寸

z-平均尺寸是基于强度的计算值并且不应与通过其它方法产生的质量或数字平均值混淆或直接比较。计算在ISO标准中定义，因此如果使用相同的散射角，则所有按照推荐使用此计算的系统都应给出可比较的结果。

在动态光散射中使用的z-平均尺寸或z-平均均值或z-平均直径是也称为累积量均值的参数。它是该技术产生的主要和最稳定的参数。z-平均均值通常用于质量控制设置，因为它在ISO 13321和更近期的ISO 22412(其将该均值定义为“调和强度平均粒径”)中定义。

如果样品是单峰的(即只有一个峰)、形状呈球形或近球形、单分散的(即分布宽度非常窄)，并且样品在合适的分散剂中制备，则z-平均尺寸将仅与通过其它技术测量的尺寸相当，因为z-平均均值尺寸可以对样品中的甚至小的变化(例如，存在一小部分聚集体)敏感。应注意，z-平均值是流体力学参数并且因此仅适用于分散体中的颗粒或溶液中的分子。

亚微米脂质体的平均直径小于1μm。测量脂质体直径的方法是技术人员公知的，例如动态光散射。出于描述本发明的目的，脂质体的平均直径表示为Z-平均直径(ZAD)。

本发明的脂质体可具有约30-300nm、50-225nm、50-200nm、80-200nm、80-150nm或80-120nm的平均直径。或者，脂质体的平均直径可为约30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275和300nm。在一个实施方案中，通过本发明的方法生产的脂质体具有50-150nm的平均直径。脂质体的平均直径可以受例如通过具有已知孔径的筛或网孔挤出脂质体组合物影响。控制脂质体尺寸的该方法和进一步方法是本领域众所周知的并且描述于例如Mayhew等人(1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169-174或Olson等人(1979)Biochim. Biophys. Acta 557:9-23中。在本发明的一个特定实施方案中，脂质体的平均直径(ZAD)小于约220nm、小于200nm，特别是约50nm至约150nm，特别是约80nm至120nm。

多分散性指数

该指数是从简单的2参数拟合到相关数据(累积量分析)计算的数字。多分散性指数是无量纲的，并且数值范围为0-1。非常小的值(例如，0.05)对应于高度单分散的标准。值越接近1，颗粒的尺寸分布越宽。

脂质体制剂的多分散性指数(PDI)是制剂中脂质体颗粒的异质性的量度。在一个实施方案中，步骤c.的熟化后脂质体制剂的PDI低于0.225。在进一步的实施方案中，PDI低于0.200。

皂苷

在本发明的方法中，提供了在制备亚微米脂质体之后和熟化步骤之前将皂苷加入脂质体制剂中的步骤。

特别适用于本发明的皂苷是Quil A及其衍生物。Quil A是一种从南美洲的树木南美皂皮树（Quillaja Saponaria Molina）分离的皂苷制剂，并且在1974年由Dalsgaard等人首先描述("Saponin adjuvants", Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol.44, Springer Verlag, Berlin, p243-254)具有佐剂活性。已经通过HPLC分离了Quil A的纯化片段，其保留佐剂活性而没有与Quil A相关的毒性(EP 0 362 279)，所述片段例如QS7和QS21 (也称作QA7和QA21)。QS-21是一种源自南美皂皮树的树皮的天然皂苷，其诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTLs)、Th1细胞和占优势的IgG2a抗体应答，并且是本发明的背景下的特定皂苷。

特别地，用于本发明的皂苷是Quil A的免疫活性级分，例如QS-7或QS21，合适的是QS21。在特定的实施方案中，QS21以其更低的反应原性组合物提供，其中其用外源性甾醇诸如胆固醇，例如掺入脂质体制剂中的甾醇诸如胆固醇猝灭(quenched)。QS21:甾醇的比率将通常是在1:100至1:1 (w/w)的量级，适当地为1:10至1:1 (w/w)，且优选地为1:5至1:1 (w/w)。存在适当过量的甾醇，QS21:甾醇的比率为至少1:2(w/w)。在一个实施方案中，QS21:甾醇的比率为1:5(w/w)。所述甾醇适当地是胆固醇。

缓冲剂

脂质体制剂可以含有缓冲剂。而且，本发明的方法可以包括向第一脂质体制剂中加入缓冲剂的另一步骤。用于本发明的缓冲剂包括:磷酸盐缓冲剂(Na/Na₂PO₄、Na/K₂PO₄或K/K₂PO₄)；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸盐缓冲剂。缓冲剂通常以5-20mM的量被包括。在一个特定实施方案中，缓冲剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。参考组合物的治疗组分调节液体混合物的pH。适当地，所述液体混合物的pH是至少4、至少5、至少5.5、至少5.8、至少6。换而言之，所述液体混合物的pH可以小于9、小于8、小于7.5或小于7。在其它实施方案中，所述液体混合物的pH为4-9、5-8、5.5-7.5或5.8-6.4。在一个特定实施方案中，pH为约6.1。

张度

溶液应具有药学上可接受的重量摩尔渗透压浓度以避免细胞变形或裂解。药学上可接受的重量摩尔渗透压浓度通常是指将具有大约等渗或轻度高渗的重量摩尔渗透压浓度的溶液。适当地，本发明的免疫原性组合物将具有在250-750 mOsm/kg的范围内的重量摩尔渗透压浓度，例如，重量摩尔渗透压浓度可以是在250-550 mOsm/kg的范围内，诸如在280-500mOsm/kg的范围内。根据本领域已知的技术，诸如通过使用商购可得的渗透压计，例如可从Advanced Instruments Inc. (USA)得到的Advanced® Model 2020，可以测量重量摩尔渗透压浓度。

可以使用技术人员已知的方法，例如通过提供适量的等渗剂调节组合物的张度。"等渗剂（isotonicity agent或isotonifying agent）"是生理上耐受的并给制剂(例如本发明的免疫原性组合物)赋予合适的张度以防止水穿过与所述制剂接触的细胞膜的净流动的化合物。水性佐剂组合物是已知的，其含有100 mM或更多的氯化钠，例如在WO 2005/112991和WO2008/142133中的佐剂体系A(ASA)，或公开于WO2007/068907中的脂质体佐剂。

在某些实施方案中，用于所述组合物的等渗剂是盐，诸如氯化钠。但是，在其它实施方案中，所述组合物包含非离子等渗剂，且组合物中的氯化钠浓度或离子强度小于100mM，诸如小于80 mM，例如小于30 mM，诸如小于10 mM或小于5 mM。该组合物可包含非离子等渗剂，并且该组合物的电导率小于5mS/cm，例如小于4mS/cm。在一个优选的实施方案中，所述非离子等渗剂是多元醇，诸如山梨醇。山梨醇的浓度可以是例如约3%至约15%(w/v)，诸如约4%至约10%(w/v)。在WO2012/080369和WO2012/080370(其通过引用并入本文)中已经描述了包含免疫学活性的皂苷级分和TLR4激动剂的佐剂，其中等渗剂是盐或多元醇。

亚微米脂质体组合物的制备

步骤a.的用于制备第一亚微米脂质体制剂的方法可在WO2013/041572(也作为US20140234403公开，通过引用以其整体并入本文)，特别是实施例3和4中获得，描述了用于制备进一步含有胆固醇和任选的3D-MPL的DOPC脂质体的脂质体制剂的方法。其中描述的脂质体制剂进一步与QS21混合。

在一个实施方案中，已经对步骤a.中获得的脂质体进行了均质化，或者说是步骤a.包括脂质体制剂的均质化，特别是高剪切和/或高压均质化。

在另一个实施方案中，步骤a. 使用形成脂质膜的方法进行，所述方法包括以下步骤：(i)将脂质混合物溶解在溶剂中以形成均匀混合物； (ii)除去溶剂以形成脂质膜(例如通过蒸发)； (iii)用水合溶液水合脂质膜以形成脂质体组合物；和(iv)减小脂质体的尺寸以形成亚微米脂质体组合物(特别是通过使用高剪切和/或高压均质化)。

均质化

在本发明的一个实施方案中，首先用高剪切混合器预均质化脂质体。该步骤旨在降低粗脂质体的尺寸。转子或叶轮与被称为定子的固定部件一起，或转子和定子的排列(array)，用在含有待混合溶液的罐(tank)中或在管道(溶液穿过该管道)中，以产生剪切。高剪切混合器可用于产生乳液、悬浮液、水溶胶(气体分散在液体中)和颗粒产品。

在一个实施方案中，预均质化的脂质体进一步用高压均质器均质化。该过程是本领域众所周知的并且通常包括标准的均质器。所述溶液可以在第一反应容器中均质化或在均质化前，所述溶液可以转移到第二反应容器。用作第二反应容器的合适反应容器可容纳一定体积的液体并且包括但不限于罐(例如不锈钢罐)、烧瓶或烧杯。在一个实施方案中，在均质化过程中对脂质体悬浮液加压。

在一个实施方案中，使用串联有高压均质器的高剪切均质器均质化脂质体。这样的技术是本领域众所周知的并且均质化通常发生在5000至30000psi的压力范围下，即5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000或30000 psi。

TLR-4激动剂

在进一步的实施方案中，脂质体制剂还包含TLR-4激动剂。例如，这可以是去毒的脂多糖。脂多糖旨在用作使用本发明的方法产生的脂质体中的免疫刺激剂。在一个实施方案中，脂多糖是脂质A的无毒衍生物，诸如单磷酰脂质A或更具体地3-脱酰基单磷酰脂质A(3D—MPL)。3D-MPL以名称MPL由GlaxoSmithKline Biologicals S.A.销售并且在整个本文件中称为MPL或3D-MPL。参见，例如，美国专利号4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094。3D-MPL主要促进具有IFN-7 (Th1)表型的CD4+ T细胞应答。

3D-MPL可根据GB2220211A中公开的方法制备。化学上，它是3-脱酰基单磷酰脂质A与3、4、5或6个酰化链的混合物。含有大于20％的6个酰化链的混合物是优选的。在本发明的组合物中，可以使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有这样的颗粒尺寸，使得它可以通过消毒过滤器进行无菌过滤，所述消毒过滤器例如是为本发明的目的描述的消毒过滤器之一。此类制备物在WO94/21292中有述。

可以使用的其它TLR-4激动剂是烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯(AGP)，诸如在WO98/50399或美国专利号6,303,347中公开的那些(也公开了AGP的制备方法)，适当地是RC527或RC529或AGP的药学上可接受的盐（如在美国专利号6,764,840中公开的）。一些AGP是TLR-4激动剂，且一些是TLR-4拮抗剂。两者都被认为可用作佐剂。

其它合适的TLR-4配体如WO2003/011223和WO 2003/099195中所述，例如WO2003/011223的第4-5页或WO2003/099195的第3-4页上描述的化合物I、化合物II和化合物III，并且特别是在WO2003/011223中描述的那些化合物，如ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057m ER804058、ER804059、ER804442、ER804680和ER804764。例如，一种合适的TLR-4配体是ER804057。

可用于本发明的其它TLR-4配体包括吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)，如WO2008/153541或WO2009/143457或文献文章Coler RN等人(2011) Development andCharacterization of Synthetic Glucopyranosyl Lipid Adjuvant System as aVaccine Adjuvant. PLoS ONE 6(1): e16333. doi:10.1371/journal.pone.0016333和Arias MA等人(2012) Glucopyranosyl Lipid Adjuvant (GLA), a Synthetic TLR4Agonist, Promotes Potent Systemic and Mucosal Responses to IntranasalImmunization with HIVgp140. PLoS ONE 7(7): e41144. doi:10.1371/journal.pone.0041144中所述。WO2008/153541或WO2009/143457通过引用并入本文，目的是定义可用于本发明的TLR-4配体。

TLR-4配体例如脂多糖例如3D-MPL可以以1-100μg/佐剂组合物的人剂量的量使用。3D-MPL可以以约50μg，例如至少40μg、至少45μg或至少49μg，或小于100μg、小于80μg、小于60μg、小于55μg或小于51μg的水平使用。合适的范围的实例为40-60μg，合适地为45-55μg或49-51μg或50μg。在进一步的实施方案中，所述佐剂组合物的人剂量包含约25μg，例如至少20μg、至少21μg、至少22μg或至少24μg，或小于30μg、小于29μg、小于28μg、小于27μg或小于26μg的水平的3D-MPL。较低范围的实例包括20-30μg，合适地21-29μg或22-28μg或28-27μg或24-26μg或25μg。

包装

无菌过滤后，将无菌亚微米脂质体组合物包装到合适的容器中。亚微米脂质体组合物可以装入小瓶中，特别是单剂量玻璃小瓶中。或者，亚微米脂质体组合物可以装入袋中，例如高密度聚乙烯储存袋。

制备疫苗的方法

本发明进一步提供了用于制备疫苗的方法，所述方法包括通过本文所述的本发明的方法制备亚微米脂质体组合物，并将脂质体组合物与抗原组合。

术语“抗原”是技术人员众所周知的。抗原可以是能够在人或动物中产生免疫应答的蛋白质、多糖、肽、核酸、蛋白质-多糖缀合物、分子或半抗原。抗原可以源自病毒、细菌、寄生虫、原生动物或真菌，与来自病毒、细菌、寄生虫、原生动物或真菌的分子同源或经合成以模拟来自病毒、细菌、寄生虫、原生动物或真菌的分子。在本发明的另一个实施方案中，抗原源自肿瘤细胞或瘤形成、与来自肿瘤细胞或瘤形成的分子同源或经合成以模拟来自肿瘤细胞或瘤形成的分子。在本发明的另一个实施方案中，抗原源自变态反应、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、肥胖和尼古丁依赖中涉及的物质，与来自变态反应、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、肥胖和尼古丁依赖中涉及的物质的分子同源或经合成以模拟来自变态反应、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、肥胖和尼古丁依赖中涉及的物质的分子。

在本发明的一个特定实施方案中，抗原源自疟原虫属种(Plasmodium spp)，例如恶性疟原虫(P.falciparum)或间日疟原虫(P.vivax)。

在本发明的一个特定实施方案中，抗原源自分枝杆菌属种（Mycobacterum spp），例如结核分枝杆菌（M. tuberculosis）。

源自恶性疟原虫的可能抗原包括环孢子蛋白(CS蛋白)、RTS、PfEMP-I、Pfs 16抗原、MSP-I、MSP-3、LSA-I、LSA-3、AMA-I和TRAP。其它恶性疟原虫抗原包括EBA、GLURP、RAPl、RAP2、钳合蛋白、Pf332、STARP、SALSA、PfEXPl、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs48/45、Pfs230和它们在其它疟原虫属种中的类似物。抗原可以是整个蛋白或其免疫原性片段。

源自恶性疟原虫CS蛋白的抗原可以是杂合融合蛋白的形式。融合蛋白可以含有源自融合至另一蛋白或其片段的恶性疟原虫 CS蛋白的蛋白。融合蛋白可以含有来自恶性疟原虫CS蛋白的N-末端或C-末端片段。或者，或此外，融合蛋白可以包含一个或多个来自恶性疟原虫CS 蛋白中心区的重复单元(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个重复单元)。在一个实施方案中，融合蛋白是包含源自CS蛋白的抗原与来自乙型肝炎的表面抗原(HBsAg)或其免疫原性片段的杂合融合蛋白。通常，来自乙型肝炎的表面抗原包含被称为S 抗原的主要表面蛋白，例如，源自adw血清型的S 抗原。

特别地，融合蛋白可以包含基本上全部的恶性疟原虫CS蛋白的C-末端部分、CS蛋白免疫显性区的4个或更多个串联重复以及来自乙型肝炎的表面抗原(HBsAg)。在一方面，融合蛋白包含含有与CS蛋白C-末端部分基本同源的至少160个氨基酸的序列。特别地，“基本上全部的”CS蛋白的C末端部分包括没有疏水锚序列的C末端。CS蛋白可以没有C末端的最后12-14(例如12)个氨基酸。

在一个实施方案中，用于本发明的融合蛋白是这样的蛋白，其包含恶性疟原虫的CS蛋白的部分，其基本上对应恶性疟原虫3D7克隆的氨基酸207 395，源自通过线性连接体与HBsAg的N末端在框中融合的NF54株(Caspers等人，同上)。连接体可以包含来自HBsAg的部分或全部前S2区。

用于本发明的特定融合蛋白是被称为RTS的融合蛋白，如WO 93/10152和WO 98/05355中所述。RTS可以是RTS,S混合颗粒的形式(其中“S”代表未融合单体)或作为RTS。RTS,S颗粒包含两种多肽RTS和S，其可以同时被合成并自发地形成复合微粒结构(RTS,S)，例如在纯化过程中。这些颗粒还可以被称为病毒样颗粒(VLP)。这样的颗粒可以多种方式，例如通过在合适的宿主例如酵母或细菌中表达融合蛋白来制备。

相信来自来自乙型肝炎的表面抗原的存在和RTS,S颗粒的形成加强了杂合蛋白的CS蛋白部分的免疫原性，有助于稳定性，和/或有助于蛋白的可再现的制造。

CS抗原可以联合另一抗原使用，所述另一抗原选自任何表达于寄生虫生命周期的子孢子或红细胞前期例如肝脏期的抗原，例如肝脏期抗原-1(LSA-1)、肝脏期抗原-3(LSA-3)、血小板反应蛋白相关匿名蛋白(TRAP)、裂殖子表面蛋白-1(MSP1)主要裂殖子表面蛋白和顶端裂殖子抗原-1(AMA-1)。其它适合与CS抗原联合使用的抗原包括PfEMP-I、Pfs 16抗原、MSP-3、LSA-3、AMA-I、TRAP、GLURP、RAPl、RAP2、钳合蛋白、Pf332、STARP、SALSA、PfEXPl、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs48/45、Pfs230。

本文所述的任何抗原的免疫原性片段将含有至少一个抗原表位，并展示出疟疾抗原性，且当在适宜的构建体中存在时(例如当融合至其它疟疾抗原或其它非疟疾抗原时)或在载体上存在时能够产生免疫应答，所述免疫应答是针对天然抗原的。通常，免疫原性片段含有来自疟疾抗原的至少20个，或至少50个，或至少100个连续氨基酸。

来自间日疟原虫(P. vivax)的可能抗原包括基于环孢子蛋白(CS蛋白)的抗原和Duffy抗原结合蛋白及其片段，例如PvRII(参见例如WO02/12292)。

可能的基于CS蛋白的抗原可以包括包含源自间日疟原虫的CS蛋白的序列的融合蛋白。在一个实施方案中，融合蛋白是杂合融合蛋白。本文中的杂合蛋白可以含有源自I型和II型间日疟原虫的蛋白。特别地，杂合融合蛋白可以含有融合至另一蛋白或其片段的源自I型和II型间日疟原虫的蛋白。

在一方面，杂合融合蛋白包含杂合蛋白，其源自间日疟原虫的CS蛋白(CSV)和来自乙型肝炎的表面抗原，通常是被称为S 抗原(例如源自adw血清型的S 抗原)的主要表面蛋白。

优选地，融合蛋白是免疫原性杂合融合蛋白，其包含:a)源自间日疟原虫的I型环孢子蛋白的中央重复部分的至少一个重复单元，b)源自间日疟原虫的II型环孢子蛋白的中央重复部分的至少一个重复单元，和c. 源自乙型肝炎病毒的表面抗原 S。

本发明的源自CSV的抗原组分通常被融合至S蛋白的氨基末端。更特别地，CSV片段的C-末端与所述S抗原的N-末端融合。例如，合适的融合蛋白是如WO2008/009652中所述的CSV-S。

在酵母细胞中，一旦表达，杂合融合蛋白(包含S抗原)能够自发地装配为由所述蛋白的多种单体组成的脂蛋白结构/颗粒(或VLPs)。这样的颗粒可通过在合适的宿主例如酵母或细菌中表达融合蛋白来制备。

当选择的受体酵母菌株在其基因组中还携带乙型肝炎S表达盒的一个或多个整合拷贝时，所生成的菌株合成作为融合蛋白的杂合蛋白，以及非融合的S抗原。这些可自发地装配为包含杂合融合蛋白的单体和S抗原的单体的脂蛋白颗粒。

还提供了包含CSV-S和/或RTS单元的VLP。颗粒可以基本上由CSV-S和RTS单元组成。或者，所生产的颗粒包含CSV-S、RTS和S单元或基本上由CSV-S、RTS和S单元组成。这样混合的颗粒描述于例如WO2008/009650中。

在结核领域中感兴趣的抗原包括Mtb72f及其变体，例如在WO2006/117240中公开的。尤其感兴趣的抗原是M72，其多肽序列以WO2006/117240的SEQ ID No:4提供并且编码所述多肽的多核苷酸序列以WO2006/117240的SEQ ID No:3提供。

在结核病领域中的感兴趣的另一抗原是Rv1753及其变体，例如在WO2010/010180中公开的，例如选自WO2010/010180的SEQ ID Nos:1和2-7的Rv1753 序列，特别是SEQ IDNo:1。在结核病领域中的感兴趣的另一抗原是Rv2386及其变体，例如在WO2010/010179中公开的，例如选自WO2010/010179的SEQ ID Nos:1和2-7的Rv2386 序列，特别是SEQ ID No:1。在结核病领域中的感兴趣的其它抗原包括Rv3616及其变体，例如在WO2011092253中公开的，例如选自WO2011/092253的SEQ ID Nos:1和2-7的天然Rv3616 序列或例如选自WO2011092253的SEQ ID Nos:161-169、179和180的那些的修饰的Rv3616 序列，特别是SEQID No:167。感兴趣的另外的抗原是HBHA，例如在WO97/044463、WO03/044048和WO2010/149657中公开的。

结核病抗原适合以多肽的形式利用，但也可以编码所述多肽的多核苷酸的形式提供。

在一个特定实施方案中，本发明的方法使用源自水痘带状疱疹病毒(VZV)的抗原。用于本发明的VZV抗原可以是任何合适的VZV抗原或其免疫原性衍生物，适当地是纯化的VZV抗原。术语‘免疫原性衍生物’包括在施用于人类之后保留诱导对VZV的免疫应答的能力的任何分子。

适合于产生衍生物的方法是本领域众所周知的，并且包括例如在 Sambrook等人[Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第三版，2000， Cold Spring HarborLaboratory Press]中公开的标准分子生物学技术，例如用于添加、删除、取代或重排氨基酸或对其化学修饰的技术。在一方面，衍生物包括例如截短形式或其它片段。

在一方面，在本发明上下文中的衍生物是包含表位的氨基酸序列，即，实质上负责多肽的免疫原性并能够引发免疫应答的抗原决定簇，在一方面是T细胞表位。

在一方面，所述免疫原性衍生物的免疫原活性的水平为衍生其的多肽的免疫原性的至少约50%，在一方面为至少约70%以及在一方面为至少或大于约90%，适当地通过上述免疫测定技术进行评估。在本发明的一些方面，免疫原性部分可以被鉴定为具有大于相应的全长多肽的免疫原活性水平，例如，具有大于约100%或150%或更多的免疫原活性。在一方面，所述VZV 抗原为糖蛋白，在一方面，为gE 抗原(也被称为gp1)或其免疫原性衍生物。

所述gE抗原、其无锚(anchorless)衍生物(其也是免疫原性衍生物)及其生产描述于EP0405867及其中的参考文献中[也参见Vafai A. Antibody binding sites ontruncated forms of varicalla-zoster virus gpI (gE) glycoprotein Vaccine 199412:1265-9]。EP192902 也公开了gE及其生产。

在一方面，gE是具有本文Seq ID No. 1序列的截短的gE，并如Virus research，vol 40，1996 p199 ff中所公开，通过引用全部并入本文中。除非上下文另有明示，下文中提及gE包括提及截短的gE。

试剂盒

本发明进一步提供了用于制备疫苗试剂盒的方法，所述方法包括制备如本文所述的本发明的亚微米脂质体组合物，并将脂质体组合物包装进试剂盒中作为抗原试剂盒组分之外的试剂盒组分。

抗原和/或脂质体可以在递送时临时制备。因此，本发明提供了用于制备疫苗试剂盒的方法，所述疫苗试剂盒包括做好混合准备的抗原和脂质体组合物。该试剂盒允许抗原和脂质体组合物分开保存直至使用时。

这些组分在试剂盒内彼此物理分离，并且这种分离可以以各种方式实现。例如，两种组分可以存在于两个单独的容器，例如小瓶中。然后可以将两个小瓶的内容物混合，例如通过移除一个小瓶的内容物并将它们加入另一个小瓶中，或者通过分别移除两个小瓶的内容物并将它们混合在第三个容器(例如小瓶)中。

在一个特定实施方案中，试剂盒组分之一在注射器中，且另一个在容器如小瓶中。可以使用注射器(例如用针)将其内容物插入第二容器中进行混合，并且然后可以将混合物取出到注射器中。然后可以通常通过新的无菌针将注射器的混合内容物施用给患者。将一个组件包装在注射器中消除了使用单独的注射器进行患者给药的需要。在另一个优选的布置中，将两个试剂盒组分保持在一起但是分开地存在于同一注射器，例如双室注射器中。当注射器被致动时(例如在给患者施用期间)，两个腔室的内容物混合。这种布置避免了在使用时需要单独的混合步骤。

试剂盒组分可以为含水形式。在一些实施方案中，组分(例如抗原)是干燥形式(例如以冻干形式)，而其它组分(脂质体组合物)是含水形式。可以混合两种组分以再活化干燥组分并得到用于给患者施用的含水组合物。冻干组分通常位于小瓶而不是注射器内。

干燥的组分可包括稳定剂，例如乳糖、蔗糖或甘露醇，以及它们的混合物，例如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。一种可能的布置使用预填充注射器中的含水佐剂组分和小瓶中的冻干的抗原组分。

本文中涉及本发明的"疫苗组合物"的实施方案也适用于涉及本发明的"免疫原性组合物"的实施方案，并且反之亦然。

单数术语"一种"、"一个"和"该"包括复数指示物，除非上下文清楚地另外指示。类似地，词语"或(or)"意在包括"和(and)"，除非上下文清楚地另外指示。术语"复数"是指两种/个或更多种/个。术语“包含”表示“包括”。因此，除非上下文另外需要，将理解词语"包含(comprises)"及变体诸如"包含(comprise)"和"包含(comprising)"意指包括陈述的化合物或组合物(例如核酸、多肽或抗原)或步骤，或化合物或步骤的组，但不排除任何其它的化合物、组合物、步骤、或其的组。缩写"例如(e.g.)"源自拉丁文exempli gratia，并且在本文中被用于指示非限制性实例。因此，缩写"例如(e.g.)"与术语"例如(for example)"同义。在每种情况下，发明人意图将开放的过渡短语“包含(comprising)”、“包含(comprise)”和“包含(comprises)”表示分别任选地可替换为封闭的过渡短语“由......组成(consistingof)”、“由...组成(consist of)”和“由...组成(consists of)”。

另外，就物质(诸如组合物)的温度、百分比、浓度或水平而言给出的数字界限旨在是近似值。因此，在温度指示为15℃至25℃的情况下，意图将温度理解为大约(或“”或“〜”)15℃至大约(或“”或“〜”)25°C。同样地，浓度指示为至少(例如)200pg，意指浓度被理解为至少约(或“”或“〜”)200pg。与数值x相关的术语"约"意指x±5%或x±10%。

尽管与本文所述那些类似或等同的方法和物质可用于实践或测试本公开，但仍然在下文中描述了合适的方法和物质。下列实施例例示本发明。

实施例

实施例1. 制备浓缩脂质体本体(bulk)

浓缩的脂质体本体如WO2013/041572(通过引用以其整体并入本文)的实施例3中所述制备。简而言之，浓缩的脂质体本体已经分2步制备。第一步是脂质膜制备。将DOPC(二油酰磷脂酰胆碱)、3D-MPL和胆固醇依次溶解在异丙醇中。然后在搅拌和减压梯度条件下在55℃的温浴中除去异丙醇，得到膜残余物。然后逐渐降低压力并应用最后的干燥以获得脂质膜。第二步是制备浓缩的脂质体本体。为此，将脂质膜在PBS中再水合以形成脂质体的粗悬浮液。然后用与高压均化器串联的高剪切混合器将脂质体悬浮液均质化，以产生所需的纳米尺寸的脂质体。将得到的浓缩脂质体本体(其不包含QS21)通过0.22μm PES膜过滤。用于实施例的浓缩的脂质体本体在10mM磷酸盐缓冲剂(pH6.1)和150mM NaCl中含有40 mg/mlDOPC、10mg/ml胆固醇、2mg/ml MPL。

实施例2. 含有皂苷的脂质体的制备 – 可滤性

该测试的目的是评估含有QS21的脂质体制剂在不同的熟化时间(0小时、1/2小时、4小时和24小时)后和不同的过滤器(Sartopore2 0.45-0.2µm、Sartopore 2 XLI 0.35-0.2 µm、Sartopore XLG 0.8-0.2 µm、Pall EKV和Pall EDF)上的可滤性。按照如图1的流程图所示的方案制备脂质体制剂。总之，在适当的缓冲剂中向如实施例1中制备的浓缩的脂质体本体中加入QS21，得到待进行可滤性评估的含有QS21的脂质体制剂（如上所述）。对于本测试，用于过滤的脂质体制剂具有以下组成:

MPL 100 µg/ml

胆固醇 500 µg/ml

DOPC 2000 µg/ml

QS21 100 µg/ml

NaCl 150 mM

Na₂HPO₄ 2.1 mM

KH₂PO₄ 7.9 mM。

在0.8巴的压强下测试可滤性并测量为Vmax，即在阻塞过滤器之前可通过过滤器的最大体积。得到的结果列于表1中并图解于图2中。

结果

不管所用过滤器的类型如何，含有QS21的脂质体组合物的可滤性随熟化时间而增加，如通过根据熟化时间的Vmax的增加所显示的那样。脂质体熟化越久，Vmax越高。

实施例3. 含有皂苷的脂质体的制备 - 粒径、PDI、Vmax、MPL/QS21/DOPC/胆固醇含量

按照图1的流程图还制备两批含有QS21的脂质体制剂，其具有如实施例2详述的组成。测试了三批Pall EKV过滤器(Pall 1、Pall 2和Pall 3)，未熟化(T0)和熟化2或4小时后(T2H和T4H)。测量了以下参数:

-熟化之前和之后的平均粒径(nm)(ZAD)

-熟化之前和之后的PDI

-过滤时的Vmax(ml/m²)

-过滤之前和之后的MPL、QS21、DOPC和胆固醇含量

ZAD和PDI根据ISO 13321和ISO 22412标准测量。

表2列出了在不同批次的Pall EKV过滤器上过滤后在T0、T2H和T4H处测量的指示含量。在过滤之前还收集了样品以用作参考含量。

结果

不管过滤器批次如何，对于两批含有QS21的脂质体制剂，与过滤前测量的含量相比，在2小时或4小时的熟化时间后(和过滤后)测量的含量没有实质性变化。这表明熟化后没有发生关于MPL、QS21、DOPC和胆固醇的含量损失。

关于粒径(图3)、PDI(图4)、Vmax(图5)和胆固醇含量(图6)的结果显示在图3至6中。图3(3A和3B)显示脂质体尺寸随熟化时间而增加。图4(4A和4B)显示，并行地，多分散性(PDI)随熟化时间而降低，这是因为较小尺寸的脂质体消失。不希望受理论束缚，据信在含有QS21的脂质体熟化后可滤性得到改善(如图5A和5B中再次显示的那样，其中Vmax随熟化时间而增加)，这是因为在没有熟化步骤的情况下，较小的脂质体的存在可能逐渐积聚到过滤器的孔中并最终导致过滤器堵塞。

序列表

<110> GlaxoSmithKline Biologicals SA

<120> 新方法

<130> VB66068 FF

<150> GB1620758.1

<151> 2016-12-07

<150> GB1708734.7

<151> 2017-06-01

<160> 1

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 546

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 来自水痘带状疱疹病毒的截短的gE

<400> 1

Met Gly Thr Val Asn Lys Pro Val Val Gly Val Leu Met Gly Phe Gly

1 5 10 15

Ile Ile Thr Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala Ser Val

20 25 30

Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn

35 40 45

Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp

50 55 60

Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro

65 70 75 80

Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His

85 90 95

Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu

100 105 110

Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp

115 120 125

Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His

130 135 140

Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly

145 150 155 160

Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val

165 170 175

Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg Ile Tyr

180 185 190

Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu Thr Cys

195 200 205

Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys His Thr

210 215 220

Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu Asn Thr

225 230 235 240

Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly Lys Lys

245 250 255

Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu Phe Asp

260 265 270

Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu Lys Val

275 280 285

Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn Met Arg

290 295 300

Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr Trp Lys

305 310 315 320

Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro Gln Pro

325 330 335

Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val Phe Ser

340 345 350

Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys Ile His

355 360 365

Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro Ile Asp

370 375 380

Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr His Pro

385 390 395 400

Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr Phe Thr

405 410 415

Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln Asn Cys

420 425 430

Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser His Met

435 440 445

Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr Leu Lys

450 455 460

Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Val

465 470 475 480

Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val Ser Thr

485 490 495

Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro Pro Thr

500 505 510

Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr Pro Val

515 520 525

Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Ile Arg Tyr Ala Ala Trp Thr Gly Gly

530 535 540

Leu Ala

545

Claims

1.一种制备脂质体组合物的方法，所述脂质体组合物在亚微米脂质体制剂中包含皂苷，其中所述脂质体含有脂质和甾醇，所述方法包括以下步骤:

a) 制备第一亚微米脂质体制剂，其中脂质体含有脂质和甾醇，

b) 将皂苷加入第一亚微米脂质体制剂中，

c) 使含有皂苷的亚微米脂质体制剂熟化至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16小时，和，

d) 通过无菌级过滤器过滤步骤c)的熟化的含有皂苷的亚微米脂质体制剂。

2.根据权利要求1的方法，其中所述第一亚微米脂质体制剂还含有TLR-4激动剂。

3.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述脂质是中性脂质。

4.根据权利要求3的方法，其中所述中性脂质是选自蛋黄磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)或二月桂酰磷脂酰胆碱的磷脂酰胆碱。

5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述中性脂质是DOPC。

6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述甾醇是胆固醇。

7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中脂质与甾醇的比率为3:1至5:1，例如约4:1。

8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述皂苷是QS21。

9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述TLR-4激动剂是脂多糖。

10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述TLR-4激动剂是3D-MPL。

11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述脂质体制剂在5-7，例如在6.1的pH下缓冲。

12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤d)的过滤后的脂质体具有80-120nm的Z-平均直径。

13.根据前述权利要求中任一项的方法，还包括通过另外的无菌级过滤器过滤步骤d)的亚微米脂质体制剂的步骤e)。

14.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法还包括向步骤a)的亚微米脂质体制剂中加入缓冲剂的步骤。

15.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤d)的过滤在15-25℃的温度下进行。

16.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤c)的熟化在低于15℃的温度下，例如在2-8℃进行，并且步骤d)的过滤在15℃-25℃的温度下进行。

17.根据权利要求1-15中任一项的方法，其中步骤c)的熟化和步骤d)的过滤在15-25℃的温度下进行。

18.根据前述权利要求中任一项的方法，其中熟化进行至少6小时。

19.根据前述权利要求中任一项的方法，其中熟化进行不长于48小时、不长于36小时或不长于24小时。

20.根据前述权利要求中任一项的方法，其中熟化进行16-24小时。

21.根据权利要求1-19中任一项的方法，其中熟化是在15-25℃的温度下进行8-24小时。

22.根据前述权利要求中任一项的方法，其中过滤在1-1.5巴的压强下进行。

23.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤c)中熟化后含有皂苷的亚微米脂质体制剂的多分散性指数(PDI)低于0.225，或低于0.200。

24.根据前述权利要求中任一项的方法，其中，所述或至少一个无菌级过滤器是双层过滤器，其第一层具有大于第二层过滤器的孔径。

25.根据前述权利要求中任一项的方法，其中将所述过滤的组合物包装到无菌玻璃小瓶或袋中。

26.一种用于制备疫苗组合物的方法，所述方法包括权利要求1-25中任一项的方法和将过滤的组合物与抗原组合。

27. 根据权利要求26的方法，其中所述疫苗用于预防、减轻或治疗疟疾、带状疱疹、慢性阻塞性肺病(COPD)、CMV感染、老年人RSV感染、HBV感染、HIV感染、结核病(TB)、 HSV感染、HPV感染、Staph、艰难梭状芽胞杆菌(C Difficile)、社区获得性肺炎(CAP)。

28.一种制备疫苗试剂盒的方法，所述方法包括根据权利要求1-25中任一项制备脂质体组合物和将脂质体组合物包装进试剂盒中作为抗原试剂盒组分之外的试剂盒组分。

29.根据权利要求28的方法，其中将所述抗原在小瓶中冻干并且所述脂质体组合物是在注射器中。

30.一种制备脂质体组合物的方法，所述脂质体组合物在亚微米脂质体制剂中包含皂苷，其中所述脂质体含有脂质和甾醇，所述方法包括以下步骤:

a) 使含有皂苷的亚微米脂质体制剂熟化至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16小时，其中所述脂质体含有脂质和甾醇，和，

b) 通过无菌级过滤器过滤步骤a)的熟化的含有皂苷的亚微米脂质体制剂。

31.根据权利要求30的方法，其中步骤a)的熟化应用16-24小时。